Tabela 9 Nuacutemero de genes do plasmiacutedeo pXF51 contabilizados por faixa de valores de FPKM e porcentagem de genes expressos em cada transcritoma da cepa 9a5c
A partir das listas de genes e seus respectivos valores de expressatildeo gecircnica
condiccedilotildees e reacuteplicas das cepas 9a5c (Tabela 10) e Temecula1 (Tabela 11)
codifica o ncRNA que eacute componente da Bacterial RNase P class A RNase P eacute uma
ribonucleoproteiacutena envolvida principalmente no processamento da extremidade 5rsquo de
tRNAs mas que tambeacutem atua em outras moleacuteculas de RNA Ela eacute encontrada em todos
os domiacutenios da vida sendo considerada uma ribonucleoproteiacutena housekeeping o que
justifica os altos valores de expressatildeo do ncRNA observados em todos os transcritomas
e condiccedilotildees analisadas Aleacutem do ncRNA de 350-400 nucleotiacutedeos a RNaseP eacute
2011 Mondragon 2013) Altos niacuteveis de expressatildeo deste ncRNA tambeacutem foram
verificados em um estudo com o fitopatoacutegeno Xanthomonas campestris atingindo
valores proacuteximos de um milhatildeo de sequecircncias mapeadas para este transcrito (Liu et al
Resultados e Discussatildeo
108
Outro ncRNA que tambeacutem estaacute entre os transcritos mais abundantes em todos os
transcritomas eacute o RNA 6S Ele foi observado nas primeiras dez primeiras posiccedilotildees dos
rankings em 19 dos 24 transcritomas analisados enquanto que nos demais eacute encontrado
entre os 15 genes mais expressos O RNA 6S desempenha um papel regulador na
transcriccedilatildeo pela interaccedilatildeo com a RNA polimerase ligada ao σ70 em resposta agrave mudanccedila
da fase exponencial de crescimento para a fase estacionaacuteria (Wassarman e Storz 2000)
Aleacutem disso o 6S mostrou-se essencial para a sobrevivecircncia celular durante a fase
estacionaacuteria (Trotochaud e Wassarman 2004) Mesmo durante a fase estacionaacuteria
tardia na qual a maioria das moleacuteculas de RNA polimerase-σ70 estaacute complexada com o
RNA 6S nem todos os promotores por ela reconhecidos estatildeo inibidos
Consequentemente agrave ligaccedilatildeo do RNA 6S a RNA polimerase-σ70 a expressatildeo de genes
regulados pela RNA polimerase-σS importante durante a fase estacionaacuteria e condiccedilotildees
de estresse eacute aumentada (Wassarman 2007) Interessantemente o RNA 6S estaacute entre
os mais expressos nos transcritomas de todas as reacuteplicas de 9a5c e Temecula1 extraiacutedas
proacuteximas da fase estacionaacuteria tanto em meio PIM6 (3 dias para ambas) como em meio
PWG (10 dias para 9a5c e 7 dias para Temecula1) Por outro lado para ambas as cepas
o 6S parece ligeiramente menos abundante nos transcritomas de amostras extraiacutedas de
PWG no iniacutecio da fase exponencial Observamos que para algumas reacuteplicas do
crescimento em PIM6 em sua fase exponencial inicial o 6S eacute encontrado em altos
niacuteveis Isto pode ser devido ao fato de que o meio miacutenimo constituiria uma situaccedilatildeo de
estresse nutricional o que poderia estimular a expressatildeo deste ncRNA para inibir a
expressatildeo de genes regulados pelo σ70 e consequentemente liberar a expressatildeo de
genes de resposta a estresses X fastidiosa possui trecircs fatores sigma alternativos σ32 σE
e σ54 sendo que os dois primeiros estatildeo relacionados a resposta a estresses (Koide et al
2006 da Silva Neto et al 2007 da Silva Neto et al 2008)
Diversos trabalhos de anaacutelise de transcritomas por meio de RNA-Seq jaacute
reportaram a presenccedila destes dois ncRNAs (RNase P e 6S) em algumas condiccedilotildees
sendo altamente expressos em diversas espeacutecies bacterianas tais como Helicobacter
pylori (Sharma et al 2010) Vibrio splendidus (Toffano-Nioche et al 2012) Yersinia
pestis (Yan et al 2013) Neisseria gonorrhoeae (McClure et al 2014) e Pseudomonas
aeruginosa (Dotsch et al 2012 Wurtzel et al 2012) Aleacutem disso essas moleacuteculas
tambeacutem foram encontradas em transcritomas de fitopatoacutegenos como Pseudomonas
syringae (Filiatrault et al 2010) Xanthomonas oryzae patovar oryzae (Liang et al
2011) e Pectobacterium atrosepticum (Kwenda et al 2016)
Resultados e Discussatildeo
109
Outro destaque entre os dez genes mais expressos nos 24 transcritomas
analisados satildeo os genes de diversas bacteriocinas Dentre elas estatildeo as trecircs colicinas V
descritas no genoma de X fastidiosa (XF0262 XF0263 e XF0264) (Simpson et al
2000 Pashalidis et al 2005) e novas microcinas previamente anotadas como proteiacutenas
hipoteacuteticas para quais haacute evidencia de funccedilatildeo e expressatildeo em X fastidiosa (Rodrigo R
Duarte e Aline M da Silva dados natildeo publicados) Em conjunto as observaccedilotildees
indicam que mesmo em um crescimento in vitro estas cepas ainda continuam a
produzir toxinas que supostamente tem papel de controlar populaccedilotildees bacterianas de
outras cepas de Xylella e de outras espeacutecies endofiacuteticas no xilema (Pashalidis et al
2005 Koide et al 2006 Zaini et al 2008 Fogaca et al 2010)
Observamos entre os genes com maiores valores de FPKM o que codifica a
proteiacutena Ax21 primeiramente descrita em Xanthomonas oryzae pv oryzae Nesta
bacteacuteria foi sugerido que Ax21 estaacute relacionada agrave percepccedilatildeo de quoacuterum e com a
regulaccedilatildeo da expressatildeo de genes ligados a motilidade virulecircncia e formaccedilatildeo de
biofilme A proteiacutena estaria diretamente interagindo com o sistema Rax o qual seria
responsaacutevel por sulfatar Ax21 e formar um poro atraveacutes das duas membranas por onde a
proteiacutena seria lanccedilada ao meio extracelular Outras proteiacutenas deste mesmo sistema
teriam a funccedilatildeo de sensor e de regulador de resposta de acordo com as alteraccedilotildees de
concentraccedilatildeo de Ax21 Aleacutem disso esta proteiacutena seria responsaacutevel pela ativaccedilatildeo da
resposta imune inata de seu hospedeiro vegetal uma vez que interagiria com o receptor
XA21 em arroz (Han et al 2011) Entretanto natildeo haacute interaccedilatildeo comprovada de Ax21
com o sistema Rax o que indica que ela natildeo seria sulfatada (Bahar et al 2014) Aleacutem
disso esses autores sugerem que Ax21 natildeo seria difusiacutevel e secretada para o meio
extracelular mas sim transportada para o periplasma pelo sistema Sec e localizada na
membrana externa Ela somente seria secretada atraveacutes de vesiacuteculas de membrana
externa (Bahar et al 2014) Ax21 foi renomeada como Omp1X sendo confirmada
como uma proteiacutena de membrana externa mais especificamente um tipo uacutenico de
porina com domiacutenio estrutural de barril-β possuindo diversos papeacuteis em X oryzae
incluindo motilidade e formaccedilatildeo de biofilme (Park et al 2014) Em um trabalho
posterior foi mostrado que a verdadeira elicitora da resposta imune da planta
dependente do receptor XA21 eacute a forma sulfatada da proteiacutena RaxX (Pruitt et al
2015) Em X fastidiosa o gene PD1063 na cepa Temecula1 ortoacutelogo do gene que
codifica para Omp1XAx21 tambeacutem foi encontrado em vesiacuteculas de membrana externa
Anaacutelises com a cepa mutante para este gene mostraram uma diminuiccedilatildeo da agregaccedilatildeo
Resultados e Discussatildeo
110
celular embora natildeo foram observadas diferenccedilas no crescimento celular formaccedilatildeo de
biofilme e virulecircncia em ensaios de infecccedilatildeo em planta em comparaccedilatildeo com a cepa
selvagem (Pierce et al 2014)
A lista de transcritos mais abundantes inclui ainda as chaperonas GroEL e
GroES e tambeacutem Hfq que eacute uma chaperona de RNA Estes transcritos codificam
proteiacutenas reconhecidamente abundantes nas ceacutelulas de um modo geral mas sua
presenccedila pode indicar que estas condiccedilotildees de cultivo in vitro satildeo estressantes para X
fastidiosa Aleacutem disso transcritos de bacterioferritina e peroxiredoxina tambeacutem estatildeo
entre os mais abundantes reforccedilando esta hipoacutetese Genes de proteiacutenas de choque frio e
os fatores σ70 e σ32 (RpoH) tambeacutem apresentaram alta expressatildeo Outros genes
encontrados abundantemente expressos codificam proteiacutenas para pilinas como FimA
proteiacutenas de membrana como OmpW peptidases e proteases como Clp entre outros
(Tabelas 10 e 11) Interessantemente os genes com funccedilatildeo hipoteacutetica XF9a_01460
XF9a_01737 XF9a_01177XFTem_00614 tambeacutem aparecem altamente expressos em
vaacuterios dos transcritomas e portanto satildeo bons candidatos para futuros estudos
posteriores para caracterizaccedilatildeo de suas respectivas funccedilotildees
Quanto aos genes do plasmiacutedeo pXF51 de 9a5c observamos que em todos os
transcritomas analisados e em todas as condiccedilotildees e reacuteplicas o transcrito mais abundante
codifica para uma phage-related protein (pXF51_00036) (Tabela S5) Buscas em
bancos de dados mostraram que essa proteiacutena teria similaridade com a toxina RelE a
qual faz parte de um sistema de toxinaantitoxina de manutenccedilatildeo de plasmiacutedeos na
ceacutelula (Lee et al 2014) Em X fastidiosa o sistema DinJRelE codificado no
cromossomo da cepa Temecula1 controla a proliferaccedilatildeo e a populaccedilatildeo bacteriana na
colonizaccedilatildeo da planta e o nocaute deste sistema resulta em um fenoacutetipo de
hipervirulecircncia (Burbank e Stenger 2017)
Resultados e Discussatildeo
111
Tabela 10 Lista dos dez genes mais expressos nos transcritomas da cepa 9a5c baseando-se em valores de FPKM Meio de cultivo
Tempo (dias)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
PIM6
1
RNase P (0973)
Colicina V (XF0263)
Ax21 (XF1803)
Colicina V (XF0264)
Omp (XF0872)
PilA (XF2542)
Hipoteacutetica (1460)
GroEL (XF0615)
Omp (XF0343)
Hipoteacutetica (XF1840)
RNase P (0973)
Colicina V (XF0263)
Hipoteacutetica (1460)
6S RNA (1899)
Omp (XF0872)
Colicina V (XF0264)
Ax21 (XF1803)
GroEL (XF0615)
Omp (XF0343)
Cold shock proteins
(XF2622)
RNase P (0973)
Omp (XF0872)
Colicina V (XF0263)
Hipoteacutetica (1460)
Ax21 (XF1803)
GroEL (XF0615)
Colicina V (XF0264)
PilA (XF2542)
6S RNA (1899)
Fimbrial precursor (XF0083)
3
RNase P (0973)
6S RNA (1899)
Colicina V (XF0263)
Hipoteacutetica (1737)
Hipoteacutetica (1460)
PilA (XF2542)
Cold shock proteins
(XF2622)
Ax21 (XF1803)
Omp (XF0872)
Bacteriocina (XF1217)
RNase P (0973)
Colicina V (XF0263)
6S RNA (1899)
Hipoteacutetica (1737)
PilA (XF2542)
Hipoteacutetica (1460)
Cold shock proteins
(XF2622)
Bacteriocina (XF1217)
Bacterio-ferritina
(XF0395)
Ax21 (XF1803)
RNase P (0973)
6S RNA (1899)
Hipoteacutetica (1737)
Colicina V (XF0263)
PilA (XF2542)
Hipoteacutetica (1460)
Omp (XF0872)
Ax21 (XF1803)
Cold shock proteins
(XF2622)
Bacteriocina (XF1217)
PWG
3
RNase P (0973)
Colicina V (XF0264)
Colicina V (XF0263)
Ax21 (XF1803)
Hipoteacutetica (1737)
Hipoteacutetica (1460)
Omp (XF0872)
Bacteriocina (XF1217)
Bacterio-ferritina
(XF0395)
Bacteriocina (XF1218)
RNase P (0973)
Colicina V (XF0264)
Ax21 (XF1803)
Colicina V (XF0263)
Cold shock proteins
(XF2622)
Hipoteacutetica (1460)
Peptidase (XF0531)
Bacteriocina (XF1217)
6S RNA (1899)
Bacteriocina (XF1218)
RNase P (0973)
Omp (XF0872)
Colicina V (XF0263)
Ax21 (XF1803)
Hipoteacutetica (1737)
Hipoteacutetica (XF1287)
Hipoteacutetica (1460)
Colicina V (XF0264)
Omp precursor (XF1024)
Bacteriocina (XF1217)
10 RNase P (0973)
Colicina V (XF0263)
6S RNA (1899)
Hipoteacutetica (1737)
Colina V (XF0264)
Bacterio-ferritina
(XF0395)
Hsp20 (XF2234)
Ax21 (XF1803)
Omp (XF0872)
Hipoteacutetica (1460)
RNase P 6S RNA Colicina V Cold shock Bacteriocina Colicina V Hipoteacutetica Bacterio- Hipoteacutetica Bacteriocina
Resultados e Discussatildeo
112
(0973) (1899) (XF0263) proteins (XF2622)
(XF1217) (XF0264) (1737) ferritina (XF0395)
(1460) (XF1307_2)
RNase P (0973)
6S RNA (1899)
Colicina V (XF0263)
Omp (XF0872)
Ax21 (XF1803)
Hipoteacutetica (1737)
Colicina V (XF0264)
Bacterio-ferritina
(XF0395)
Bacteriocina (XF1306)
Hipoteacutetica (XF1287)
Genes anotados utilizando a plataforma IMGER (httpsimgjgidoegov) Tabela 11 Lista dos dez genes mais expressos nos transcritomas da cepa Temecula1 baseando-se em valores de FPKM Meio de cultivo
Tempo (dias)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
PIM6
1
RNase P (0379)
Ax21 (PD1063)
Omp (PD1807)
PilA (PD1926)
Cold shock proteins
(PD1993)
6S RNA (0904)
Colicina V (PD0216)
Bacteriocina (0632)
GroEL (PD1538)
Proteiacutena ribossomal (PD0460)
RNase P (0379)
6S RNA (0904)
Omp (PD1807)
Ax21 (PD1063)
GroES (PD1537)
Hsp20 (PD1280)
GroEL (PD1538)
PilA (PD1926)
Cold shock proteins
(PD1993)
Colicina V (PD0216)
RNase P (0379)
Ax21 (PD1063)
6S RNA (0904)
Omp (PD1807)
PilA (PD1926)
Colicina V (PD0216)
Fimbrial precursor (PD0062)
Cold shock proteins
(PD1993)
Omp (PD1709)
Hipoteacutetica (PD0540)
3
RNase P (0379)
6S RNA (0904)
Omp (PD1807)
Hipoteacutetica (PD0312)
Omp (PD1709)
Colicina V (PD0215)
Clp protease subunit ClpP
(PD0472)
Hsp20 (PD1280)
RNA chaperone
Hfq (PD0066)
Peroxire-doxina
(PD1040)
RNase P (0379)
6S RNA (0904)
Colicina V (PD0215)
Omp (PD1807)
Membrane protein
(PD1295)
RNA chaperone Hfq
(PD0066)
Clp protease subunit ClpP
(PD0472)
Omp (PD1709)
Hsp20 (PD1280)
Hipoteacutetica (PD0312)
RNase P (0379)
6S RNA (0904)
Competen-ce protein (PD1558)
Colicina V (PD0215)
Omp (PD1807)
Membrane protein
(PD1295)
RNA chaperone Hfq
(PD0066)
Hipoteacutetica (PD0540)
Cold shock proteins
(PD1993)
Hipoteacutetica (PD0312)
PWG 3 RNase P (0379)
Omp (PD1807)
Colicina V (PD0216)
Ax21 (PD1063)
Cold shock Proteins
(PD1993)
Bacteriocina (PD0497)
Bacteriocina (0632)
Colicina V (PD0217)
Bacteriocina (0560)
Bacteriocina (PD0556)
RNase P Omp Ax21 Hipoteacutetica Colicina V Hipoteacutetica Bacteriocina Cold shock Membrane 6S RNA
Resultados e Discussatildeo
113
(0379) (PD1807) (PD1063) (PD0312) (PD0216) (PD0540) (PD0497) proteins (PD1993)
protein (PD1295)
(0904)
RNase P (0379)
Omp (PD1807)
Hipoteacutetica (PD0540)
Ax21 (PD1063)
Fimbrial precursor (PD0062)
Bacteriocina (PD0497)
Colicina V (PD0216)
Hipoteacutetica (PD0312)
Cold shock proteins
(PD1993)
Competence protein
(PD1558)
7
RNase P (0379)
Colicina V (PD0216)
Hsp20 (PD1280)
6S RNA (0904)
Colicina V (PD0217)
Fator sigma RpoH
(PD2048)
Membrane protein
(PD1295)
Clp protease subunit ClpP
(PD0472)
Bacterio-ferritina
(PD1672)
Proteiacutena ribossomal (PD0460)
RNase P (0379)
6S RNA (0904)
Hsp20 (PD1280)
Fator sigma RpoH
(PD2048)
Bacterio-ferritina
(PD1672)
Clp protease subunit ClpP
(PD0472)
Peroxire-doxina
(PD1040)
GroES (PD1537)
DNA-binding protein H-NS
(PD0708)
Fator Sigma 70
(PD0593)
RNase P (0379)
Colicina V (PD0216)
Omp (PD1807)
Colicina (PD0217)
Ax21 (PD1063)
Hipoteacutetica (PD0540)
6S RNA (0904)
Bacteriocina (0632)
Bacteriocina (PD0497)
Cold shock proteins
(PD1993)
Genes anotados utilizando a plataforma IMGER (httpsimgjgidoegov)
Resultados e Discussatildeo
114
473 Anaacutelise de rotas metaboacutelicas expressas
Os rankings de genes gerados a partir de dados de expressatildeo gecircnica
normalizados por FPKM tambeacutem foram usados para uma anaacutelise global de quais rotas
metaboacutelicas estariam ativas nas condiccedilotildees utilizadas no presente trabalho Para esta
anaacutelise foi utilizado o software MinPath (Minimal set of Pathways) (Ye e Doak 2009)
o qual utiliza um meacutetodo de parcimocircnia para reconstruccedilatildeo de rotas bioloacutegicas a partir de
prediccedilotildees de famiacutelias proteicas Desta forma eacute obtida uma estimativa mais conservativa
e confiaacutevel das rotas bioloacutegicas de um grupo de dados especiacutefico
Foram analisados todos os transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1 sendo
considerados efetivamente expressos os genes que apresentaram valores de expressatildeo de
FPKM maiores que 10 Os resultados foram obtidos com a notaccedilatildeo de que ldquo1rdquo significa
presenccedila da rota naquele transcritoma e ldquo0rdquo significa ausecircncia da mesma (Tabela S6)
Analisando os dados com mais detalhes pode-se observar a presenccedila de rotas
essenciais para crescimento e proliferaccedilatildeo Dentre elas rotas do metabolismo
energeacutetico como glicoacutelisegliconeogecircnese ciclo do aacutecido tricarboxiacutelico (TCA) via das
pentoses-fosfato e glioxilato fosforilaccedilatildeo oxidativa metabolismo de piruvato e
ubiquinona entre outras O metabolismo de outros carboidratos tambeacutem foi observado
como amido sacarose frutose e manose embora natildeo tenha sido encontrada a rota de
metabolismo de galactose
Todas as rotas de manutenccedilatildeo e transmissatildeo da informaccedilatildeo geneacutetica como
replicaccedilatildeo do DNA transcriccedilatildeo traduccedilatildeo siacutentese de aminoacil-tRNAs estatildeo presentes
em todos os transcritomas Aleacutem disso os sistemas de reparo do DNA por excisatildeo de
bases ou nucleotiacutedeos e por mismatch tambeacutem estatildeo presentes assim como a rota de
recombinaccedilatildeo homoacuteloga O metabolismo de purinas e pirimidinas tambeacutem foi
encontrado em ambas as cepas Poreacutem a rota de metabolismo de nucleotiacutedeos de accediluacutecar
para siacutentese de precursores de gliconjugados estaacute ausente
As rotas de exportaccedilatildeo de proteiacutenas e dos sistemas de secreccedilatildeo do tipo II e IV
estatildeo ativas em todos os transcritomas Outras rotas de transporte tambeacutem foram
observadas como transportadores ABC sistema de dois componentes e sistema de
fosfotransferase de accediluacutecar (PTS)
Rotas relacionadas agrave siacutentese de membranas e parede celular como o metabolismo
de glicerofosfolipiacutedeos biossiacutentese de peptidioglicano e lipopolissacariacutedeo (LPS)
Resultados e Discussatildeo
115
tambeacutem estatildeo ativas Por outro lado as rotas de biossiacutentese de aacutecidos graxos saturados
e insaturados e esteroacuteides tambeacutem estatildeo ativas nas duas cepas Jaacute as rotas de
metabolismo de aacutecidos graxos e glicerolipiacutedeos estatildeo presentes em 9a5c mas ausentes
em Temecula1
Diversas vitaminas e coenzimas como tiamina riboflavina vitamina B6 biotina
porfirinas aacutecido lipoacuteico nicotinato e nicotinamida pantotenato e co-enzima A tambeacutem
tiveram suas rotas representadas nos transcritomas Entretanto o metabolismo de
ascorbato (vitamina C) natildeo foi encontrado em Temecula1 somente em 9a5c e a rota de
metabolismo de inositol natildeo foi encontrado em nenhuma delas
Interessantemente rotas para a biossiacutentese de antibioacuteticos e poliquetiacutedeos foram
encontradas ativas como as de vancomicina ansamicina tetraciclina e estreptomicina
Natildeo foram encontradas as rotas para biossiacutentese de penicilina cefalosporinas e de
resistecircncia a beta-lactacircmicos
Finalmente as rotas de metabolismo de nitrogecircnio enxofre glutationa e grupos amino
atraveacutes do ciclo da ureacuteia foram encontradas ativas Entretanto nem todas as rotas de
biossiacutentese e metabolismo de aminoaacutecidos estatildeo presentes nos transcritomas As rotas
para o metabolismo de alanina aspartato glicina serina treonina arginina prolina
histidina fenilalanina e metionina estatildeo ativas Poreacutem as rotas de metabolismo de
glutamato cisteiacutena tirosina glutamina e glutamato seleno e cianoaminoaacutecidos estatildeo
inativas Para os aminoaacutecidos lisina valina leucina e isoleucina somente estatildeo ativas as
rotas de biossiacutentese ao contraacuterio de suas rotas de degradaccedilatildeo O metabolismo de
triptofano foi encontrado ativo somente nas duas primeiras reacuteplicas dos transcritomas do
iniacutecio da fase exponencial em PIM6 e PWG e na segunda reacuteplica do final do
crescimento em PWG todos na cepa 9a5c Nos outros transcritomas esta rota estaacute
inativa Coincidentemente a rota de metabolismo de metano foi encontrada inativa
nestes mesmos transcritomas acima mencionados poreacutem ativa nos demais Ainda natildeo eacute
possiacutevel especular qualquer relaccedilatildeo entre essas duas observaccedilotildees A provaacutevel
inatividade de rotas de siacutentese de alguns aminoaacutecidos talvez seja uma justificativa para
esta bacteacuteria ter crescimento lento e dependente da suplementaccedilatildeo destes aminoaacutecidos
no meio de cultivo
Em resumo os transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1 mostraram poucas
divergecircncias em relaccedilatildeo agraves suas rotas metaboacutelicas ativas e mostraram que as rotas
essenciais para seu crescimento e sobrevivecircncia estatildeo presentes
Resultados e Discussatildeo
116
48 Anaacutelises de expressatildeo gecircnica diferencial
481 Comparaccedilotildees entre os transcritomas
Apoacutes a descriccedilatildeo dos genes mais expressos em um mesmo transcritoma baseada
em valores de FPKM foram realizadas comparaccedilotildees entre valores de expressatildeo de um
mesmo gene entre transcritomas distintos Para tal foi usado o pacote DESeq2 (Love et
al 2014) o qual exige como dados de entrada valores de contagem brutos de quantas
sequecircncias foram mapeadas para determinado gene Natildeo eacute recomendado utilizar valores
de expressatildeo jaacute normalizados por FPKM uma vez que o pipeline do pacote realiza uma
normalizaccedilatildeo interna A obtenccedilatildeo das listas de genes com contagem bruta tambeacutem foi
realizada pelo mapeamento das sequecircncias no software CLC Genomics Workbench
As anaacutelises comparativas foram realizadas em trecircs niacuteveis 1) comparaccedilotildees entre
transcritomas da mesma cepa e mesmo meio em fases de crescimento diferentes como
por exemplo entre os transcritomas da cepa 9a5c crescida em PIM6 no iniacutecio e no final
da fase exponencial 2) comparaccedilotildees entre transcritomas da mesma cepa em meios
diferentes mas em fases de crescimento equivalentes como por exemplo entre o
transcritoma de 9a5c no iniacutecio da fase exponencial em PIM6 com o transcritoma de
9a5c no iniacutecio da fase exponencial em PWG 3) comparaccedilotildees entre transcritomas de
cepas diferentes poreacutem em mesmo meio e fase de crescimento como por exemplo
entre o transcritoma de 9a5c e o transcritoma de Temecula1 ambas no iniacutecio da fase
exponencial em PIM6 Os paracircmetros utilizados para considerar um gene como
significativamente diferencialmente expresso foram um valor de p ajustado pela
correccedilatildeo FDR (False Discovery Rate) (Benjamini e Hochberg 1995) menor do que
005 e um valor de razatildeo de expressatildeo (fold change) maior que 2 A Tabela 12 apresenta
um resumo de quantos genes foram encontrados dentro desses paracircmetros em cada
comparaccedilatildeo
Como uma forma graacutefica de mostrar uma visatildeo geral da dispersatildeo de todos os
genes em cada transcritoma o pacote DESeq2 (Love et al 2014) tambeacutem realiza
plotagens tendo os valores de expressatildeo meacutedia entre todas as condiccedilotildees analisadas no
eixo das abscissas e os seus respectivos valores de razatildeo de expressatildeo no eixo das
ordenadas (Figura 8) Estes graacuteficos apresentam em pontos vermelhos os genes
considerados diferencialmente expressos de acordo com os paracircmetros acima citados e
em cinza os genes cuja expressatildeo natildeo variou
Resultados e Discussatildeo
117
Tabela 12 Resumo do nuacutemero de genes diferencialmente expressos (plt005 fold changegt2) em todas as comparaccedilotildees
Niacuteveis de comparaccedilatildeo
Total de genes
Condiccedilatildeo 1 (c1)
Condiccedilatildeo 2 (c2)
Genes DE (plt005 FCgt20)
Genes up-regulated (c1c2)
1
2639 9a5c_PIM6_1d 9a5c_PIM6_3d 83 (31) 794
2639 9a5c_PWG_3d 9a5c_PWG_10d 0 0
2476 Tem_PIM6_1d Tem_PIM6_3d 61 (25) 5011
2476 Tem_PWG_3d Tem_PWG_7d 1 (004) 01
2
2639 9a5c_PIM6_1d 9a5c_PWG_3d 4 (015) 04
2639 9a5c_PIM6_3d 9a5c_PWG_10d 20 (08) 317
2476 Tem_PIM6_1d Tem_PWG_3d 1 (004) 10
2476 Tem_PIM6_3d Tem_PWG_7d 6 (024) 24
3
1882 9a5c_PIM6_1d Tem_PIM6_1d 102 (54) 5448
1882 9a5c_PIM6_3d Tem_PIM6_3d 238 (126) 115123
1882 9a5c_PWG_3d Tem_PWG_3d 58 (31) 4216
1882 9a5c_PWG_10d Tem_PWG_7d 95 (50) 4649
DE diferencialmente expressos Tem Temecula1
No primeiro niacutevel de comparaccedilatildeo foi possiacutevel observar um maior nuacutemero de
genes diferencialmente expressos nas comparaccedilotildees entre transcritomas de ceacutelulas em
meio PIM6 do que entre os transcritomas de ceacutelulas em PWG para ambas as cepas
Dentre estes genes a maioria estaacute mais expressa no iniacutecio da fase exponencial Dos
genes considerados diferencialmente expressos nas comparaccedilotildees das duas cepas 31 satildeo
comuns entre elas correspondendo a 373 e 508 nas cepas 9a5c e Temecula1
respectivamente Todos estes genes estatildeo mais expressos na mesma fase de crescimento
nas duas cepas sendo 28 genes no iniacutecio do crescimento e 3 no final Foram
encontrados genes relacionados a proteiacutenas ribossomais chaperonas biogecircnese dos pili
longo e curto e genes com funccedilatildeo hipoteacutetica sendo positivamente regulados no iniacutecio da
fase exponencial Dentre os genes positivamente regulados no final da fase exponencial
estatildeo um gene de uma colicina V de uma fumarase e um gene com funccedilatildeo hipoteacutetica
Estes resultados podem sugerir que as ceacutelulas cultivadas em meio miacutenimo
enfrentam em menor intervalo de tempo mudanccedilas no ambiente por exemplo um
esgotamento dos nutrientes e que resulta na alteraccedilatildeo do transcritoma As observaccedilotildees
de uma maior atividade de siacutentese proteica associada agrave atividade de chaperonas
corrobora uma resposta de adaptaccedilatildeo a um ambiente estressante Esta anaacutelise pode ser
extrapolada ao ambiente natural da bacteacuteria a qual vive constantemente em um
Resultados e Discussatildeo
118
ambiente de escassez nutricional seja no xilema da planta ou no cibaacuterio do inseto tendo
que rapidamente regular a expressatildeo de seus genes para sobreviver
Nas comparaccedilotildees entre transcritomas em meio PWG somente um gene de uma
colicina V foi encontrado diferencialmente expresso na comparaccedilatildeo de transcritomas
da cepa Temecula1 com maior expressatildeo no final da fase exponencial Este gene eacute o
mesmo encontrado como positivamente regulado no final do crescimento em PIM6 em
ambas as cepas O fato de somente um gene ser encontrado diferencialmente expresso
nas comparaccedilotildees em PWG pode ser justificado devido agraves ceacutelulas em meio rico
encontrarem um ambiente favoraacutevel desde o iniacutecio do crescimento ateacute o final da fase
exponencial natildeo necessitando de alteraccedilotildees significativas na expressatildeo de seus genes
Nas comparaccedilotildees entre meios de cultivo no segundo niacutevel de anaacutelises foi
observado um maior nuacutemero de genes diferencialmente expressos entre os transcritomas
do final da fase exponencial para ambas as cepas Dentre estes genes considerados
diferencialmente expressos a maioria deles foi positivamente regulada nos
transcritomas em meio PWG Entretanto nenhum gene foi encontrado em comum entre
as duas cepas Na cepa 9a5c vaacuterios genes relacionados a proteiacutenas ribossomais um
gene responsaacutevel pela formaccedilatildeo do poro para a externalizaccedilatildeo do pilus longo um gene
para uma proteiacutena de transporte pela membrana um gene para colicina V e trecircs genes
para bacteriocinas aleacutem de genes com funccedilatildeo hipoteacutetica foram positivamente regulados
no final do crescimento em PWG Dentre os genes positivamente regulados no final da
fase exponencial em PIM6 estatildeo um gene para uma proteiacutena translocase e dois genes
com funccedilatildeo hipoteacutetica Para a cepa Temecula1 dois genes foram positivamente
regulados no final do crescimento em PIM6 codificadores de uma proteiacutena ribossomal
e uma proteiacutena de um sistema de estabilizaccedilatildeo de plasmiacutedeo Por sua vez no meio PWG
quatro genes para proteiacutenas hipoteacuteticas foram identificados
Dentre os poucos genes encontrados diferencialmente expressos nas
comparaccedilotildees entre os transcritomas de fase inicial nos dois meios trecircs bacteriocinas e
uma bacterioferritina foram positivamente reguladas em PWG na cepa 9a5c O uacutenico
gene diferencialmente expresso na cepa Temecula1 foi positivamente regulado no iniacutecio
do crescimento em PIM6 e codifica para uma proteiacutena hipoteacutetica
Em dois estudos utilizando a tecnologia de microarranjos para anaacutelise de
expressatildeo gecircnica foram realizadas comparaccedilotildees dos transcritomas da cepa 9a5c
cultivada em dois meios diferentes (Travensolo et al 2009 Ciraulo et al 2010) Assim
como no presente estudo um dos meios apresentava composiccedilatildeo especificamente
Resultados e Discussatildeo
119
desenvolvida para o melhor crescimento de Xylella em comparaccedilatildeo com outros meios
complexos (Lemos et al 2003 Leite et al 2004) Vaacuterios genes foram encontrados
diferencialmente expressos entre as duas condiccedilotildees nos dois estudos poreacutem somente
quatro genes em comum com as comparaccedilotildees aqui apresentadas Travensolo e
colaboradores compararam os transcritomas de 9a5c nos meios XDM2 (meio definido) e
BCYE (meio complexo) apoacutes cultivo de 4 dias a 30degC e agitaccedilatildeo de 140 rpm Somente
o gene pilQ (XF0373) o qual codifica para a proteiacutena formadora de poro na membrana
para externalizaccedilatildeo do pilus longo foi encontrado em comum com a comparaccedilatildeo entre
os transcritomas de 9a5c de final da fase exponencial em ambos os meios Nos dois
trabalhos este gene apresentou-se mais expressos nos meios complexos BCYE e PWG
embora com diferentes razotildees de expressatildeo (183 e 373 respectivamente) (Travensolo
et al 2009) No segundo estudo novamente a cepa 9a5c teve seus transcritomas
analisados agora nos meios 3G10-R (meio definido) e PW (meio complexo) apoacutes
cultivo a 28degC e 100 rpm por 13 e 3 dias respectivamente Comparando os resultados
deste trabalho com os genes diferencialmente expressos obtidos na comparaccedilatildeo entre os
transcritomas de iniacutecio da fase exponencial do presente estudo um gene codificando
para uma bacterioferritina (XF0395) foi encontrado positivamente regulado nos meios
complexos PW e PWG com razotildees de expressatildeo 233 e 615 respectivamente Ao
comparar com os genes diferencialmente expressos no final da fase exponencial dois
genes foram encontrados em comum Um deles codificando para uma proteiacutena
ribossomal (XF1164) mostrou concordacircncia com o presente estudo sendo mais
expresso nos meios complexos com diferentes razotildees de expressatildeo (188 para o PW e
566 para o PWG) Entretanto outro gene codificando para um colicina V foi visto
mais expresso no meio definido 3G10-R (razatildeo de expressatildeo igual a 1715) e mais
expresso no meio complexo PWG no presente estudo (razatildeo de expressatildeo igual a 492)
(Ciraulo et al 2010) Desta forma sugere-se que embora as composiccedilotildees dos meios
sejam semelhantes quaisquer diferenccedilas de nutrientes podem influenciar nas
comparaccedilotildees entre eles aleacutem de variaccedilotildees nas condiccedilotildees de cultivo densidade celular
passagem da cepa utilizada entre outros fatores dificultando as comparaccedilotildees entre
estudos
A observaccedilatildeo de uma maior quantidade de genes positivamente regulados em
PWG poderia ser explicada pelo fato de que as ceacutelulas estariam metabolicamente mais
ativas neste meio devido agrave abundacircncia de nutrientes Entretanto o objetivo do presente
trabalho era identificar possiacuteveis genes com expressatildeo aumentada no meio miacutenimo
Resultados e Discussatildeo
120
PIM6 o qual simula a condiccedilatildeo nutricional do fluido xilemaacutetico do hospedeiro vegetal
Poreacutem somente foram encontrados trecircs genes positivamente regulados neste meio em
cada cepa quando comparados com o meio PWG o que nos leva a concluir que natildeo haacute
diferenccedilas significativas na expressatildeo dos genes nos dois meios de cultivo quando
comparamos pontualmente fases de crescimento semelhantes Por outro lado haacute
diferenccedilas na expressatildeo gecircnica ao longo do crescimento em cada meio conforme
descrito nos paraacutegrafos acima
No terceiro e uacuteltimo niacutevel de comparaccedilatildeo foram analisados os valores de
expressatildeo somente de genes compartilhados entre as cepas 9a5c e Temecula1 natildeo
levando em consideraccedilatildeo genes exclusivos de cada uma delas Nestas comparaccedilotildees
podemos observar um maior nuacutemero de genes diferencialmente expressos nas
comparaccedilotildees entre transcritomas de ceacutelulas cultivadas em PIM6 embora tambeacutem tenha
sido encontrado um nuacutemero razoaacutevel de genes diferencialmente expressos nas
comparaccedilotildees entre transcritomas de PWG Dentre estes genes nas comparaccedilotildees de
iniacutecio do crescimento em ambos os meios foi observado um maior nuacutemero de genes
positivamente regulados na cepa 9a5c Ao contraacuterio a cepa Temecula1 apresentou um
maior nuacutemero de genes positivamente regulados nas duas comparaccedilotildees de final de
crescimento nos dois meios (Tabela 12)
Quando satildeo comparados os genes diferencialmente expressos entre os
transcritomas das duas cepas cultivadas em PIM6 observamos que 84 genes satildeo
comuns agraves comparaccedilotildees de iniacutecio e final do crescimento Tal quantidade de genes
corresponde a 824 de todos os genes considerados diferencialmente expressos no
iniacutecio do crescimento e 353 no final Destes genes em comum 46 foram
positivamente regulados na cepa 9a5c e 38 na cepa Temecula1 Todos os genes foram
positivamente regulados para a mesma cepa nas duas fases de crescimento ou seja tais
genes manteacutem sua expressatildeo desde o iniacutecio ateacute o final do crescimento Dentre os genes
mais expressos em 9a5c vaacuterios codificam proteiacutenas com funccedilatildeo hipoteacutetica um gene
para uma adesina da extremidade do pilus longo genes relacionados a bacterioacutefagos
genes para proteiacutenas de sistema de toxinaantitoxina e estabilizaccedilatildeo de plasmiacutedeos
DNA polimerase I componentes do sistema de transporte ABC entre outros Os genes
regulados positivamente na cepa Temecula1 codificam para proteiacutenas relacionadas
principalmente a bacterioacutefagos e com funccedilatildeo hipoteacutetica embora tambeacutem tenham sido
encontrados genes relacionados agrave siacutentese do pilus curto proteiacutenas de membrana
Resultados e Discussatildeo
121
desidrogenases uma proteiacutena ribossomal proteiacutenas de transporte pela membrana entre
outros
Nas comparaccedilotildees entre os transcritomas das fases de crescimento em PWG
foram observados 41 genes regulados durante todo o crescimento correspondendo a
707 e 432 de todos os genes considerados diferencialmente expressos no iniacutecio e
no final do crescimento respectivamente Trinta genes foram encontrados mais
expressos na cepa 9a5c e 11 na cepa Temecula1 Todos eles foram positivamente
regulados para a mesma cepa nas duas fases de crescimento mantendo sua expressatildeo
desde o iniacutecio ateacute o final Dentre os genes positivamente regulados para a cepa 9a5c haacute
predominacircncia de genes de proteiacutenas relacionadas a bacterioacutefagos ou com funccedilatildeo
hipoteacutetica embora deva ser destacada a maior expressatildeo do gene da DNA polimerase I
de uma adesina da extremidade do pilus longo uma proteiacutena quinase relacionada agrave
sinalizaccedilatildeo entre outros Enquanto isso os genes positivamente regulados para a cepa
Temecula1 foram quase todos de proteiacutenas de fagos e com funccedilatildeo hipoteacutetica com
exceccedilatildeo de uma aminotransferase e uma desidrogenase
Este alto nuacutemero de genes diferencialmente expressos que foi observado
justifica outras comparaccedilotildees entre transcritomas de cepas diferentes uma vez que
mesmo os genes ortoacutelogos desses genomas parecem apresentar regulaccedilatildeo distinta na
mesma condiccedilatildeo de cultivo Aleacutem disso em todas as comparaccedilotildees entre cepas foi
possiacutevel observar altos valores de razatildeo de expressatildeo (fold change) entre genes dos
transcritomas comparados Tal resultado demonstra que aleacutem de apresentar um maior
nuacutemero de genes diferencialmente expressos as comparaccedilotildees entre cepas tambeacutem
apresentam maiores diferenccedilas na expressatildeo sugerindo que cada cepa possui um
panorama uacutenico de expressatildeo gecircnica em resposta a determinada condiccedilatildeo de cultivo
Resultados e Discussatildeo
122
Figura 8 Graacuteficos de dispersatildeo dos genes analisados em cada comparaccedilatildeo No eixo das abscissas estatildeo os valores de expressatildeo meacutedia no eixo das ordenadas estatildeo os valores de razatildeo de expressatildeo em log2 Os pontos em vermelho representam genes com valores de p ajustado menores do que 005 os pontos em cinza representam genes com valores de p ajustado maiores que 005 Cada graacutefico representa uma comparaccedilatildeo (A) 9a5c-PIM6-1d e 9a5c-PIM6-3d (B) 9a5c-PWG-3d e 9a5c-PWG-10d (C) 9a5c-PIM6-1d e 9a5c-PWG-3d (D) 9a5c-PIM6-3d e 9a5c-PWG-10d (E) Tem-PIM6-1d e Tem-PIM6-3d (F) Tem-PWG-3d e Tem-PWG-7d (G) Tem-PIM6-1d e Tem-PWG-3d (H) Tem-PIM6-3d e Tem-PWG-7d (I) 9a5c-PIM6-1d e Tem-PIM6-1d (J) 9a5c-PIM6-3d e Tem-PIM6-3d (K) 9a5c-PWG-3d e Tem-PWG-3d (L) 9a5c-PWG-10d e Tem-PWG-7d Tem Temecula1
Resultados e Discussatildeo
123
482 Categorizaccedilatildeo funcional dos genes diferencialmente expressos
4821 Anaacutelise por ontologia gecircnica
Foram realizadas anaacutelises globais funcionais dos genes considerados
diferencialmente expressos (plt005 e fold changegt2) utilizando o software online
BayGO (Vencio et al 2006) Primeiramente tais genes foram categorizados baseando-
se nas suas ontologias gecircnicas (Gene Ontology ou GO) (Ashburner et al 2000 Gene
Ontology Consortium 2004)
Iniciamos as anaacutelises com os transcritomas do niacutevel 1 de comparaccedilatildeo Nas fases
iniciais do crescimento exponencial de ambas as cepas em meio PIM6 quando
comparado com sua fase final foi possiacutevel observar um enriquecimento de categorias
GO relacionadas agrave transcriccedilatildeo e traduccedilatildeo (Tabela 13) Dentre as categorias em comum
estatildeo biossiacutentese de proteiacutenas biogecircnese e montagem do ribossomo e transcriccedilatildeo pela
atividade de RNA polimerase A cepa 9a5c apresentou como categorias exclusivas
algumas relacionadas ao enovelamento proteico atividade de fatores de elongaccedilatildeo da
traduccedilatildeo ligaccedilatildeo a tRNA atividade de nucleotidiltransferase transporte proteico
intracelular e secreccedilatildeo de proteiacutenas Por sua vez a cepa Temecula1 apresentou duas
categorias exclusivas enriquecidas relacionadas agrave atividade de metalopeptidades e
metaloendopeptidases Entretanto na fase final do crescimento exponencial natildeo foi
encontrada nenhuma categoria enriquecida nas comparaccedilotildees das duas cepas
Na comparaccedilatildeo entre as diferentes fases de crescimento no meio PWG na cepa
9a5c jaacute haviacuteamos mencionado que natildeo foi encontrado nenhum gene diferencialmente
expresso Na cepa Temecula1 foi encontrado apenas um gene
Tabela 13 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em categorias GO dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas de diferentes fases de crescimento nas cepas 9a5c e Temecula1 Categorias GO up-regulated no iniacutecio da fase exponencial em meio PIM6 na cepa 9a5c Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0006457 protein folding 001 061 [061061] GO0051082 unfolded protein binding 001 074 [074074] GO0003723 RNA binding 0 082 [082082] GO0006412 protein biosynthesis 0 089 [088090] GO0003746 translation elongation factor activity 003 081 [081081] GO0006414 translational elongation 0 086 [086086] GO0003735 structural constituent of ribosome 0 095 [095096] GO0005622 Intracelular 0 087 [086088] GO0005840 Ribosome 0 095 [095096] GO0030529 ribonucleoprotein complex 0 095 [095095] GO0000049 tRNA binding 0 088 [088088]
Resultados e Discussatildeo
124
GO0015935 small ribosomal subunit 0 099 [099099] GO0019843 rRNA binding 0 096 [096096] GO0003899 DNA-directed RNA polymerase activity 0 091 [091091] GO0006350 Transcription 0 083 [083083] GO0006351 transcription DNA-dependent 0 097 [097097] GO0016779 nucleotidyltransferase activity 002 068 [068068] GO0006986 response to unfolded protein 002 082 [082082] GO0045449 regulation of transcription 004 074 [070080] GO0006886 intracellular protein transport 0 090 [090090] GO0009306 protein secretion 004 064 [064064] GO0015450 protein translocase activity 0 090 [090090] GO0015934 large ribosomal subunit 0 093 [093093] GO0042254 ribosome biogenesis and assembly 0 100 [100100] Categorias GO up-regulated no iniacutecio da fase exponencial em meio PIM6 na cepa Temecula1 Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0003723 RNA binding 0 078 [075081] GO0006412 protein biosynthesis 0 089 [087090] GO0003735 structural constituent of ribosome 0 094 [093094] GO0005622 Intracelular 0 085 [083087] GO0005840 Ribosome 0 094 [092094] GO0030529 ribonucleoprotein complex 0 092 [092093] GO0015935 small ribosomal subunit 001 082 [082082] GO0019843 rRNA binding 0 090 [090090] GO0003899 DNA-directed RNA polimerase activity 0 082 [082082] GO0006350 Transcription 004 073 [067083] GO0006351 transcription DNA-dependent 0 094 [094094] GO0004222 metalloendopeptidase activity 004 070 [070070] GO0042254 ribosome biogenesis and assembly 001 100 [100100] GO0008237 metallopeptidase activity 003 080 [080080] GO0006364 rRNA processing 003 072 [072072] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
A categorizaccedilatildeo funcional dos genes diferencialmente expressos tambeacutem foi
realizada nas comparaccedilotildees de niacutevel 2 entre os meios de cultivo e em uma mesma fase
do crescimento bacteriano Dentre todas as comparaccedilotildees somente foram observadas
categorias enriquecidas no final do crescimento em PWG na cepa 9a5c quando
comparado com o final do crescimento em PIM6 (Tabela 14) Tais categorias estatildeo
relacionadas exclusivamente a atividade de siacutentese e transporte de proteiacutenas incluindo
categorias de formaccedilatildeo de ribossomos
Tabela 14 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em categorias GO dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas de diferentes meios de cultivo na cepa 9a5c Categorias GO up-regulated no meio PWG no final da fase exponencial na cepa 9a5c Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0003723 RNA binding 0 090 [090090] GO0006412 protein biosynthesis 0 097 [096097] GO0003735 structural constituent of ribosome 0 098 [098099] GO0005622 Intracelular 0 097 [096097] GO0005840 Ribosome 0 098 [097099] GO0030529 ribonucleoprotein complex 0 098 [098099] GO0019843 rRNA binding 001 096 [096096] GO0008565 protein transporter activity 0 085 [083090] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
Resultados e Discussatildeo
125
Como descrito anteriormente no uacuteltimo niacutevel de comparaccedilatildeo envolvendo as
duas cepas nas mesmas condiccedilotildees foi encontrado um maior nuacutemero de genes
diferencialmente expressos os quais tambeacutem foram categorizados funcionalmente
(Tabela 15) Na comparaccedilatildeo entre transcritomas do iniacutecio do crescimento em PIM6 a
cepa 9a5c apresentou um enriquecimento de categorias relacionadas agrave ligaccedilatildeo
integraccedilatildeo e recombinaccedilatildeo de DNA aleacutem de atividades de helicase e ligase e uma
categoria de fosforilaccedilatildeo de aminoaacutecidos Por sua vez a cepa Temecula1 na mesma fase
de crescimento em PIM6 mostrou enriquecimento de categorias relacionadas agrave siacutentese e
transporte de proteiacutenas Ainda no meio PIM6 mas na comparaccedilatildeo de transcritomas no
final da fase exponencial foram encontradas enriquecidas categorias relacionadas agrave
atividade de metiltransferases e metilaccedilatildeo de DNA na cepa 9a5c aleacutem novamente das
categorias de fosforilaccedilatildeo de aminoaacutecidos e integraccedilatildeo de DNA tambeacutem enriquecidas
no iniacutecio do seu crescimento Enquanto isso a cepa Temecula1 apresentou o maior
nuacutemero de categorias enriquecidas com 28 no total Elas se dividem em quatro
importantes processos celulares transcriccedilatildeo (atividade de RNA polimerase regulaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo atividade de fator sigma) metabolismo de ATP (transporte de
proacutetonshidrogecircnio atividade de ATP sintase e ATPase) defesa (atividade de lisozima
citoacutelise catabolismo de peptidioglicano e parede celular resposta de defesa contra
bacteacuterias) e siacutentese proteica (biogecircnese de ribossomo enovelamente e transporte) O
maior nuacutemero de categorias enriquecidas na cepa Temecula1 significa uma atividade
metaboacutelica mais intensa no meio PIM6 possivelmente para lidar com o estresse
nutricional encontrado neste meio De fato o meio PIM6 foi desenvolvido baseado na
composiccedilatildeo nutricional do fluido xilemaacutetico de videiras na Ameacuterica do Norte (Michelle
Igo comunicaccedilatildeo pessoal) o que pode justificar uma melhor adaptaccedilatildeo desta cepa neste
meio De qualquer forma o uso do PIM6 para o crescimento de outras cepas que natildeo
tenham videiras como hospedeiros natildeo eacute inviabilizada devido ao fato de ainda
constituir um meio pobre em nutrientes e que se assemelha com composiccedilotildees de fluidos
xilemaacuteticos de outras plantas
Tabela 15 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em categorias GO dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas em meio PIM6 de ambas as cepas Categorias GO up-regulated na cepa 9a5c no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0005524 ATP binding 001 049 [041060] GO0003677 DNA binding 001 072 [060081] GO0006310 DNA recombination 002 085 [078092]
Resultados e Discussatildeo
126
GO0003676 nucleic acid binding 004 062 [051077] GO0004386 helicase activity 0 079 [074086] GO0006468 protein amino acid phosphorylation 0 086 [086086] GO0016874 ligase activity 004 048 [040052] GO0015074 DNA integration 0 098 [094099] Categorias GO up-regulated na cepa Temecula1 no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0006412 protein biosynthesis 003 045 [039060] GO0003677 DNA binding 0 062 [049077] GO0003735 structural constituent of ribosome 001 066 [060073] GO0005622 Intracelular 001 060 [054070] GO0005840 Ribosome 001 066 [060069] GO0030529 ribonucleoprotein complex 0 067 [060073] GO0008565 Protein transport activity 001 072 [066082] Categorias GO up-regulated na cepa 9a5c no final da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0000287 magnesium ion binding 0 052 [052052] GO0006306 DNA-methylation 002 095 [076099] GO0008170 N-methyltransferase activity 004 095 [078099] GO0009007 Site-specific DNA-methyltransferase (adenine-specific)
activity 0 100 [100100]
GO0006468 Protein amino acid phosphorylation 004 053 [053053] GO0015074 DNA integration 003 091 [077097] Categorias GO up-regulated na cepa Temecula1 no final da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0003677 DNA binding 004 041 [029052] GO0003735 structural constituent of ribosome 0 058 [053063] GO0005622 Intracelular 0 047 [039055] GO0005840 Ribosome 0 058 [053064] GO0030529 ribonucleoprotein complex 0 060 [056067] GO0015935 small ribosomal subunit 0 073 [073073] GO0019843 rRNA binding 0 068 [064073] GO0003899 DNA-directed RNA polymerase activity 0 084 [084084] GO0006350 Transcription 004 059 [051072] GO0006355 regulation of transcription DNA-dependent 0 050 [040059] GO0003796 lysozyme activity 0 100 [092100] GO0009253 peptidoglycan catabolism 004 090 [076096] GO0016998 cell wall catabolism 002 090 [076096] GO0019835 Cytolysis 002 086 [076093] GO0042742 defense response to bacteria 002 100 [090100] GO0006986 response to unfolded protein 0 069 [069069] GO0015986 ATP synthesis coupled proton transport 0 073 [073073] GO0016469 proton-transporting two-sector ATPase complex 002 069 [069069] GO0046933 hydrogen-transporting ATP synthase activity rotational
mechanism 002 073 [073073]
GO0046961 hydrogen-transporting ATPase activity rotational mechanism
002 073 [073073]
GO0006352 transcription initiation 0 090 [090090] GO0016987 sigma fator activity 002 090 [090090] GO0015031 protein transport 0 061 [061061] GO0015934 large ribosomal subunit 0 077 [077077] GO0008462 endopeptidase Clp activity 0 100 [095100] GO0015992 proton transport 002 073 [073073] GO0016820 hydrolase activity acting on acid anhydrides catalyzing
transmembrane movement of substances 0 090 [090090]
GO0015078 hydrogen ion transporter activity 001 077 [077077] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
Resultados e Discussatildeo
127
Os transcritomas das duas cepas crescidas em meio PWG tambeacutem apresentaram
diferenccedilas No iniacutecio da fase exponencial somente a cepa 9a5c apresentou categorias
enriquecidas mostrando maior atividade de ligaccedilatildeo a DNA e aacutecidos nucleicos ligaccedilatildeo
de ATP atividade de helicase e fosforilaccedilatildeo de aminoaacutecidos Ao final do crescimento
exponencial no meio PWG pudemos encontrar quase as mesmas categorias
enriquecidas no iniacutecio em 9a5c apenas substituindo fosforilaccedilatildeo de aminoaacutecidos por
atividade de ligase Enquanto isso a cepa Temecula1 novamente mostrou alta atividade
metaboacutelica no final do crescimento desta vez em PWG Dentre as categorias super-
representadas estatildeo o metabolismo de carbohidratos transcriccedilatildeo e novamente defesa
(atividade de lisozima citoacutelise catabolismo de peptidioglicano e parede celular
resposta de defesa contra bacteacuterias) as mesmas encontradas no final do crescimento em
PIM6 (Tabela 16)
Tabela 16 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em categorias GO dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas em meio PWG de ambas as cepas Categorias GO up-regulated na cepa 9a5c no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0005524 ATP binding 0 074 [067080] GO0003677 DNA binding 003 062 [046080] GO0003676 Nucleic acid binding 0 077 [069084] GO0004386 Helicase activity 0 087 [083092] GO0006468 Protein amino acid phosphorylation 0 092 [092092] Categorias GO up-regulated na cepa 9a5c no final da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0005524 ATP binding 0 069 [060077] GO0003677 DNA binding 001 070 [061084] GO0003676 Nucleic acid binding 0 074 [066085] GO0004386 Helicase activity 0 086 [082091] GO0016874 Ligase activity 0 063 [055067] Categorias GO up-regulated na cepa Temecula1 no final da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0003677 DNA binding 003 064 [050077] GO0003824 Catalytic activity 0 051 [044066] GO0005975 Carbohydrate metabolismo 003 070 [057084] GO0016798 Hydrolase activity acting on glycosyl bonds 0 090 [083095] GO0008152 Metabolismo 003 052 [044064] GO0003899 DNA-directed RNA polymerase activity 0 093 [093093] GO0016779 Nucleotidyltransferase activity 0 078 [072085] GO0003796 Lysozyme activity 0 100 [098100] GO0009253 Peptidoglycan catabolism 0 098 [094099] GO0016998 Cell wall catabolism 0 098 [094099] GO0019835 Cytolysis 0 097 [094098] GO0042742 Defense response to bacteacuteria 0 100 [098100] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
Resultados e Discussatildeo
128
4822 Anaacutelise por vias KEGG
Os genes considerados diferencialmente expressos tambeacutem foram categorizados
em relaccedilatildeo as suas vias metaboacutelicas que estariam mais representadas e enriquecidas
(vias KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (Kanehisa e Goto 2000
Kanehisa et al 2016)
No primeiro niacutevel de comparaccedilatildeo entre fases de crescimento no mesmo meio
somente foram encontradas vias enriquecidas no iniacutecio de crescimento em PIM6 Dentre
elas estatildeo vias relacionadas ao processamento da informaccedilatildeo geneacutetica traduccedilatildeo
ribossomo e RNA polimerase em ambas as cepas Uma via relacionada ao exporte e
enovelamento de proteiacutenas foi encontrada enriquecida na cepa 9a5c enquanto uma via
relacionada a fatores de traduccedilatildeo na cepa Temecula1 (Tabela 17)
Tabela 17 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em vias KEGG dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas de diferentes fases de crescimento nas cepas 9a5c e Temecula1 Vias KEGG up-regulated no iniacutecio da fase exponencial em meio PIM6 na cepa 9a5c Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1200 genetic information processing 0 085 [084086] 1220 Translation 0 082 [081083] 3100 protein folding and associated processing 002 071 [071071] 3010 Ribosome 0 093 [093094] 3020 RNA polymerase 001 085 [085085] Vias KEGG up-regulated no iniacutecio da fase exponencial em meio PIM6 na cepa Temecula1 Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1200 genetic information processing 0 090 [087091] 1220 Translation 0 090 [088091] 3014 other translation factors 002 074 [074074] 3010 Ribosome 0 093 [092094] 3020 RNA polymerase 002 078 [078078] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
As vias KEGG tambeacutem foram classificadas nas comparaccedilotildees entre meios de
cultivo sendo encontradas vias enriquecidas somente no final do crescimento em PWG
na cepa 9a5c Trecircs vias foram encontradas relacionadas a processamento da informaccedilatildeo
geneacutetica traduccedilatildeo e ribossomo (Tabela 18)
Tabela 18 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em vias KEGG dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas de diferentes meios de cultivo na cepa 9a5c Vias KEGG up-regulated no meio PWG no final da fase exponencial na cepa 9a5c Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1200 genetic information processing 001 100 [100100] 1220 Translation 001 093 [090093] 3010 ribosome 0 097 [097097] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
Resultados e Discussatildeo
129
Nas comparaccedilotildees entres cepas algumas vias foram encontradas enriquecidas O
iniacutecio do crescimento em meio PIM6 estimulou na cepa 9a5c o enriquecimento da via
de metabolismo de carboidratos enquanto que na cepa Temecula1 foi observado um
enriquecimento das vias de metabolismo de lipiacutedeos traduccedilatildeo e ribossomo Jaacute no final
do crescimento em PIM6 a cepa 9a5c mostrou uma maior expressatildeo de genes de vias
relacionadas ao metabolismo de aminoaacutecidos (fenilalanina tirosina triptofano e
histidina) transportadores ABC e a via das pentoses-fosfato Por sua vez a cepa
Temecula1 manteve um enriquecimento de vias de traduccedilatildeo e ribossomo aleacutem de vias
relacionadas com transcriccedilatildeo siacutentese de ATP enovelamento proteico metabolismo de
tirosina e transportadores acoplados a iacuteons (Tabela 19)
Tabela 19 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em vias KEGG dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas em meio PIM6 em ambas as cepas Vias KEGG up-regulated na cepa 9a5c no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1110 Carbohydrate metabolism 0 070 [058077] Vias KEGG up-regulated na cepa Temecula1 no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1130 lipid metabolism 002 074 [067082] 1220 Translation 001 060 [055070] 3010 Ribosome 0 079 [077085] Vias KEGG up-regulated na cepa 9a5c no final da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1160 metabolism of other amino acids 001 043 [043043] 400 phenylalanine tyrosine and tryptophan biosynthesis 004 055 [046066] 30 pentose phosphate pathway 0 074 [074074] 2010 ABC transporters prokaryotic 003 056 [056056] 340 histidine metabolismo 0 080 [080080] Vias KEGG up-regulated na cepa Temecula1 no final da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1200 genetic information processing 0 053 [046059] 1220 Translation 002 046 [041051] 1210 Transcription 001 061 [056069] 350 tyrosine metabolism 001 093 [086097] 3100 protein folding and associated processing 0 070 [067075] 3010 Ribosome 0 073 [070077] 2052 other ion-coupled transportes 003 057 [057057] 193 ATP synthesis 002 081 [081081] 3020 RNA polymerase 0 089 [089089] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
Nas comparaccedilotildees do crescimento em PWG foram observadas somente duas vias
enriquecidas a de processamento da informaccedilatildeo geneacutetica no iniacutecio do crescimento na
cepa 9a5c e a de metabolismo de lipiacutedeos no final do crescimento na cepa Temecula1
(Tabela 20)
Resultados e Discussatildeo
130
Tabela 20 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em vias KEGG dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas em meio PWG em ambas as cepas Vias KEGG up-regulated na cepa 9a5c no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1200 genetic information processing 0 100 [100100] Vias KEGG up-regulated na cepa Temecula1 no final da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1130 lipid metabolism 0 078 [074085] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
4823 Anaacutelise de genes relacionados agrave virulecircncia e patogenicidade
Foi realizada uma anaacutelise dos niacuteveis de expressatildeo de genes relacionados agrave
virulecircncia em X fastidiosa (Simpson et al 2000 Van Sluys et al 2003 Chatterjee et
al 2008) eventualmente incluiacutedos entre os genes diferencialmente expressos
identificados nas comparaccedilotildees anteriormente descritas (Tabela 21)
No primeiro niacutevel de comparaccedilatildeo somente foi possiacutevel observar genes
diferencialmente expressos no iniacutecio do crescimento em meio PIM6 Dentre eles
destacam-se genes relacionados com a biogecircnese do pilus longo responsaacutevel pela
motilidade twitching da bacteacuteria (Meng et al 2005) como o gene pilV em ambas as
cepas Jaacute os genes pilO e pilQ foram mais expressos somente na cepa 9a5c Tal
resultado sugere que um contato inicial com o xilema promoveria a expressatildeo de genes
relacionados agrave motilidade O gene fimA relacionado com a formaccedilatildeo de pilus curto (tipo
chaperone-usher) (Li et al 2007) responsaacutevel pela adesatildeo ao substrato (parede dos
vasos do xilema ou exoesqueleto do tubo digestoacuterio do inseto vetor) tambeacutem foi
diferencialmente expresso nas duas cepas analisadas Outro gene observado em comum
entre as comparaccedilotildees de 9a5c e Temecula1 codifica para uma protease dependente de
zinco com funccedilatildeo de chaperona Dentre os genes diferencialmente expressos em
somente uma das cepas estatildeo os que codificam para a proteiacutena regulatoacuteria LexA fator
sigma 70 duas proteases e uma proteiacutena de membrana externa na cepa 9a5c na cepa
Temecula1 foi encontrada uma oligopeptidase dependente de zinco e uma flavodoxina
multimeacuterica (WrbA)
Nas comparaccedilotildees entre as fases de crescimento em meio PWG natildeo foi
encontrado nenhum gene diferencialmente expresso relacionado com a virulecircncia da
bacteacuteria Tal observaccedilatildeo pode refletir o menor nuacutemero de genes diferencialmente
expressos no meio PWG em comparaccedilatildeo com o meio PIM6 Obviamente natildeo eacute
possiacutevel afirmar que tais genes de virulecircncia natildeo estatildeo ativos no meio rico em
Resultados e Discussatildeo
131
nutrientes somente eacute possiacutevel inferir que eles natildeo apresentam mudanccedila de expressatildeo
entre as duas fases de crescimento testadas ao contraacuterio do que acontece no meio PIM6
No segundo niacutevel de comparaccedilatildeo entre os transcritomas dos dois meios de
cultivo somente foi possiacutevel observar dois genes diferencialmente expressos
relacionados agrave virulecircncia ambos nas comparaccedilotildees de final do crescimento Na cepa
9a5c o gene pilQ responsaacutevel pela externalizaccedilatildeo do pilus longo foi encontrado mais
expresso no meio PWG Na cepa Temecula1 transcritos de uma proteiacutena regulatoacuteria
relacionada com estabilizaccedilatildeo de ribossomos modulaccedilatildeo do σ54 estariam mais
abundantes no meio PIM6 Esta proteiacutena tem sido relacionada a resposta a estresse
ambientais e a virulecircncia (Oosthuizen et al 2002 Ancona et al 2014) Nas
comparaccedilotildees de iniacutecio da fase exponencial natildeo foram observadas diferenccedilas de
expressatildeo destes genes entre os meios de cultivo nas duas cepas analisadas
No terceiro niacutevel de comparaccedilatildeo entre os transcritomas das duas cepas nas
mesmas condiccedilotildees somente foram analisados os genes presentes em ambas No iniacutecio
do crescimento em meio PIM6 foram encontrados cinco genes diferencialmente
expressos Dentre eles genes de uma adesina da extremidade do pilus longo (PilY1)
uma histidina quinase e uma proteiacutena com funccedilatildeo regulatoacuteria (AraC-type) foram mais
expressos na cepa 9a5c Enquanto isso a cepa Temecula1 mostrou maior expressatildeo de
um gene de uma proteiacutena com domiacutenio de clivagem do tipo preacute-pilina (relacionada ao
pilus longo) e de uma lipase Todos estes genes mantiveram suas expressotildees
diferenciais no final do crescimento em PIM6 inclusive no que diz respeito em qual
cepa estariam mais expressos Outros genes foram encontrados diferencialmente
expressos nesta comparaccedilatildeo de final do crescimento em PIM6 Na cepa 9a5c foram
observados os genes de uma glicosidade (enzima degradadora de parede vegetal) um
regulador transcricional (famiacutelia LuxRUhpA) uma flavodoxina multimeacuterica (WrbA)
outro regulador transcricional e um gene para hemolisinas Na cepa Temecula1 os
genes rpfG e rpfF foram mais expressos no final do crescimento em PIM6 O primeiro
codifica para uma proteiacutena reguladora de resposta sensiacutevel agraves concentraccedilotildees de DSF e
atuando como uma fosfodiesterase degradando o segundo mensageiro intracelular c-di-
GMP Jaacute RpfF seria responsaacutevel pela proacutepria siacutentese de DSF (Chatterjee et al 2008)
Juntamente com os genes do cluster rpf foi observado um gene para uma diguanilato
ciclase regulado positivamente em Temecula 1 quando comparado com a cepa 9a5c Em
X fastidiosa o acuacutemulo de DSF (moleacutecula sinalizadora produzida por genes deste
cluster) modula negativamente os niacuteveis de c-di-GMP resultando em maior formaccedilatildeo
Resultados e Discussatildeo
132
de biofilme (Chatterjee et al 2010) Outros genes encontrados positivamente regulados
em Temecula1 foram dois genes de fatores sigma (σ70 e RpoH) de regulaccedilatildeo de
nitrogecircnio subunidade ClpP da protease Clp uma protease dependente de zinco com
funccedilatildeo de chaperona e uma proteiacutena associada com gracircnulos de poli-hidroxialcanoatos
As diferenccedilas de expressatildeo gecircnica nos transcritomas de ceacutelulas cultivadas em
PWG foram poucas Tanto no iniacutecio da fase exponencial como no seu final foi possiacutevel
observar na cepa 9a5c uma maior expressatildeo de um gene codificando uma adesina da
extremidade do pilus longo (PilY1) e outro para uma histidina quinase relacionada a
transduccedilatildeo de sinal A cepa 9a5c tambeacutem teve um gene para hemolisina mais expresso
no iniacutecio do crescimento Para a cepa Temecula1 apenas foi observada uma maior
expressatildeo de um gene de uma lipase no final do crescimento em PWG
Estas observaccedilotildees sugerem diferenccedilas relevantes na virulecircncia de cada cepa e
possivelmente na resposta da bacteacuteria ao ambiente do xilema e poderatildeo nortear futuros
estudos sobre sistemas ou genes que foram destacados nas anaacutelises comparativa dos
transcritomas que foram detalhadas aqui
Tabela 21 Lista com genes diferencialmente expressos em todas as comparaccedilotildees e que estatildeo relacionados com sistemas de virulecircncia de X fastidiosa
Anotaccedilatildeo
XFPD Anotaccedilatildeo IMG Descriccedilatildeo
Fold change
(log2)
9a5c_PIM6_1d x 9a5c_PIM6_3d
Biogecircnese do pilus longo
XF0029 XF9a_00026 type IV pilus modification protein PilV 213
XF0371 XF9a_00335 type IV pilus assembly protein PilO 179
XF0373 XF9a_00337 type IV pilus secretin (or competence protein)
PilQ 173
Biogecircnese do pilus curto
XF0083 XF9a_00074 P pilus assembly protein pilin FimA 204
Funccedilotildees regulatoacuterias
XF0122 XF9a_00107 SOS regulatory protein LexA (EC342188) 164
XF1350 XF9a_01234 RNA polymerase sigma factor sigma-70 family 151
Proteases
XF0453 XF9a_00409 Membrane protease subunits stomatinprohibitin
homologs (EC34-) 158
XF1484 XF9a_01357 ATP-dependent protease HslVU peptidase
subunit (EC34252) 214
XF2625 XF9a_02481 Zn-dependent protease with chaperone function 284
Resultados e Discussatildeo
133
(EC3424-)
Outras funccedilotildees
XF0343 XF9a_00315 Outer membrane protein and related
peptidoglycan-associated (lipo)proteins 191
Temecula1_PIM6_1d x Temecula1_PIM6_3d
Biogecircnese do pilus longo
PD0020 XFTem_00023 type IV pilus modification protein PilV 230
Biogecircnese do pilus curto
PD0062 XFTem_00068 P pilus assembly protein pilin FimA 228
Funccedilotildees regulatoacuterias
PD0422 XFTem_00475 Multimeric flavodoxin WrbA 199
Proteases
PD0856 XFTem_00970 Zn-dependent oligopeptidases (EC34155) 208
PD1995 XFTem_02316 Zn-dependent protease with chaperone function
(EC3424-) 257
9a5c_PIM6_3d x 9a5c_PWG_10d
Biogecircnese do pilus longo
XF0373 XF9a_00337 type IV pilus secretin (or competence protein)
PilQ -186
Temecula1_PIM6_3d x Temecula1_PWG_7d
Funccedilotildees regulatoacuterias
PD0636 XFTem_00723 ribosomal subunit interface protein
(sigma fator 54) 224
9a5c_PIM6_1d x Temecula1_PIM6_1d
Biogecircnese do pilus longo
XF1224
PD0502
XF9a_01129
XFTem_00565
type IV pilus assembly protein tip-associated
adhesin PilY1 196
XF2539
PD1924
XF9a_02403
XFTem_02236
prepilin-type N-terminal cleavagemethylation
domain (PilA) -235
Funccedilotildees regulatoacuterias
XF1254
PD0520
XF9a_01154
XFTem_00591
AraC-type DNA-binding domain-containing
proteins 199
XF2535
PD1920
XF9a_02399
XFTem_02232 Signal transduction histidine kinase 244
Lipases
XF2151
PD1211
XF9a_02036
XFTem_01402 hypothetical protein (lipase) -262
9a5c_PIM6_3d x Temecula1_PIM6_3d
Enzimas degradadoras de parede vegetal (CWDEs)
XF0845 XF9a_00767 Beta-glucosidase-related glycosidases 163
Resultados e Discussatildeo
134
PD1829 XFTem_02128 (EC32121)
Biogecircnese do pilus longo
XF1224
PD0502
XF9a_01129
XFTem_00565
type IV pilus assembly protein tip-associated
adhesin PilY1 250
XF2539
PD1924
XF9a_02403
XFTem_02236
prepilin-type N-terminal cleavagemethylation
domain (PilA) -294
Cluster rpf
XF1113
PD0405
XF9a_01026
XFTem_00457
Response regulator containing a CheY-like
receiver domain and an HD-GYP domain (RpfG) -157
XF1115
PD0407
XF9a_01028
XFTem_00459
Enoyl-CoA hydratasecarnithine racemase
(RpfF) -148
Fosfodiesterase e diguanilato ciclase
XF2624
PD1994
XF9a_02479
XFTem_02315
PAS domain S-boxdiguanylate cyclase (GGDEF)
domain -219
Funccedilotildees regulatoacuterias
XF0972
PD0268
XF9a_00898
XFTem_00303
Response regulator containing a CheY-like
receiver domain and an HTH DNA-binding
domain
153
XF1133
PD0422
XF9a_01043
XFTem_00475 Multimeric flavodoxin WrbA 144
XF1254
PD0520
XF9a_01154
XFTem_00591
AraC-type DNA-binding domain-containing
proteins 262
XF1275
PD0534
XF9a_01172
XFTem_00606
poly(hydroxyalkanoate) granule-associated
protein -164
XF1350
PD0593
XF9a_01234
XFTem_00672 RNA polymerase sigma factor sigma-70 family -146
XF1463
PD0682
XF9a_01338
XFTem_00771 Transcriptional regulators 168
XF1843
PD1025
XF9a_01728
XFTem_01193 Nitrogen regulatory protein PII -175
XF2535
PD1920
XF9a_02399
XFTem_02232 Signal transduction histidine kinase 206
XF2691
PD2048
XF9a_02538
XFTem_02377 alternative sigma factor RpoH -166
Hemolisinas
XF1280
PD0536
XF9a_01174
XFTem_00610
Hemolysins and related proteins containing CBS
domains 244
Lipases
XF2151
PD1211
XF9a_02036
XFTem_01402 hypothetical protein (lipase) -281
Resultados e Discussatildeo
135
Proteases
XF1187
PD0472
XF9a_01095
XFTem_00531
ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit
ClpP (EC342192) -154
XF2625
PD1995
XF9a_02481
XFTem_02316
Zn-dependent protease with chaperone function
(EC3424-) -160
9a5c_PWG_3d x Temecula1_PWG_3d
Biogecircnese do pilus longo
XF1224
PD0502
XF9a_01129
XFTem_00565
type IV pilus assembly protein tip-associated
adhesin PilY1 251
Funccedilotildees regulatoacuterias
XF2535
PD1920
XF9a_02399
XFTem_02232 Signal transduction histidine kinase 255
Hemolisinas
XF1280
PD0536
XF9a_01174
XFTem_00610
Hemolysins and related proteins containing CBS
domains 182
9a5c_PWG_10d x Temecula1_PWG_7d
Biogecircnese do pilus longo
XF1224
PD0502
XF9a_01129
XFTem_00565
type IV pilus assembly protein tip-associated
adhesin PilY1 200
Funccedilotildees regulatoacuterias
XF2535
PD1920
XF9a_02399
XFTem_02232 Signal transduction histidine kinase 298
Lipases
XF2151
PD1211
XF9a_02036
XFTem_01402 hypothetical protein (lipase) -274
49 Identificaccedilatildeo de pequenos RNAs (sRNAs) expressos pela cepa 9a5c
Eacute crescente o interesse na identificaccedilatildeo de pequenos RNAs regulatoacuterios em
bacteacuterias (sRNA) e no estudo de sua biogecircnese e dos mecanismos de atuaccedilatildeo (Morris e
Mattick 2014 Nitzan et al 2017) Na tentativa de descrever o conteuacutedo de sRNAs em
X fastidiosa e concomitantemente estimar seus niacuteveis de expressatildeo foi realizado o
sequenciamento de bibliotecas enriquecidas em sRNAs preparadas da cepa 9a5c
cultivada no meio rico PWG (iniacutecio do crescimento exponencial) Segundo o protocolo
de preparaccedilatildeo de bibliotecas de sRNA a etapa de ligaccedilatildeo dos adaptadores eacute passiacutevel de
modificaccedilatildeo Deve-se escolher entre incubar a amostra por um menor periacuteodo de tempo
agrave temperatura ambiente (1 hora a 25degC biblioteca A) ou aumentar o tempo de
Resultados e Discussatildeo
136
incubaccedilatildeo em uma temperatura inferior (18 horas a 16degC biblioteca B) A diferenccedila
estaria no fato de que diferentes tipos de sRNAs poderiam ter diferentes eficiecircncias na
ligaccedilatildeo dos adaptadores Uma vez que se trata da primeira tentativa em analisar sRNAs
de X fastidiosa foi decidido realizar o sequenciamento de bibliotecas preparadas com
os dois protocolos de incubaccedilatildeo
Apoacutes o sequenciamento foi realizada a etapa de filtragem dos diacutemeros de
adaptadores que possam ter sido formados e do corte (trimming) de sequecircncias de
adaptadores das sequecircncias dos cDNA obtidos Em seguida as sequecircncias obtidas
foram usadas para montagem de transcritos gerando sRNAs candidatos (Tabelas S7 e
S8) Foram encontrados 1154 e 1167 sRNAs candidatos para as bibliotecas A e B
respectivamente Conforme sugerido no protocolo a biblioteca B incubada por um
periacuteodo de tempo maior teve um maior nuacutemero de sRNAs obtidos apesar da diferenccedila
ser de somente 13 sRNAs Entretanto podemos observar a presenccedila de transcritos
montados com tamanhos fora dos limites descritos na literatura para sRNAs
bacterianos que teriam comprimentos entre 50 e 500 nucleotiacutedeos Apoacutes a retirada
dessas sequecircncias que estatildeo fora dos limites foram definidos 1126 e 1143 sRNAs para
as bibliotecas A e B respectivamente com tamanhos meacutedios de cerca de 80
nucleotiacutedeos (Tabela 22)
Os valores de cobertura dos transcritos isto eacute a razatildeo entre ldquonuacutemero total de
bases das sequecircncias (reads)rdquo pelo ldquonuacutemero de bases do sRNA montadordquo variou de
pouco mais de 3x ateacute cerca de 6500x contando ambas as bibliotecas O nuacutemero de
reads usados para a montagem de cada sRNA candidato variou entre 10 e 11700
valores que podem indicar uma medida superficial de expressatildeo daquele candidato
Tabela 22 Resultados da montagem dos sRNAs candidatos Os valores de tamanho cobertura e nuacutemero de reads correspondem ao total de sRNAs com tamanho entre 50 e 500 nucleotiacutedeos
Biblioteca Total de sRNAs
Total (50 a 500
nts)
Tamanho (meacutedia) (nts)
Cobertura (meacutedia)
Ndeg de reads (meacutedia)
A (1h 25degC) 1154 1126 50 - 486 (81)
34 - 44419 (284)
10 ndash 11202 (839)
B (16h 18degC) 1167 1143 50 - 476 (825)
33 - 65815 (339)
10 ndash 11773 (1138)
Em seguida foram realizados alinhamentos das sequecircncias das duas bibliotecas
entre si e contra o genoma da cepa 9a5c utilizando a ferramenta BLAST (Altschul et al
1990) No primeiro caso foi possiacutevel observar 321 alinhamentos com alta porcentagem
de identidade (gt96) entre as sequecircncias dos sRNAs candidatos das duas bibliotecas
Resultados e Discussatildeo
137
correlacionando os sRNAs em comum (Tabela S9) Apesar da grande quantidade de
sRNAs candidatos observados nas duas bibliotecas apenas cerca de 28 foram
encontrados em ambas de acordo com este alto valor de identidade considerado Pode-
se sugerir que a diferenccedila no tempo de incubaccedilatildeo das preparaccedilotildees refletiu nos diferentes
perfis de sRNAs candidatos observados
Ao realizar o alinhamento dos sRNAs candidatos com o genoma de 9a5c foram
obtidas as coordenadas genocircmicas exatas que definem a regiatildeo de onde eles foram
transcritos (Tabelas S10 e S11) Em ambas as bibliotecas foram encontrados sRNAs
que mapearam em mais de um local no genoma podendo estar proacuteximos ou mesmo
distantes Trata-se de uma informaccedilatildeo interessante uma vez que o genoma de Xylella
apresenta diversas regiotildees repetidas o que pode ter aumentado o nuacutemero de coacutepias
destes sRNAs Segundo o protocolo de preparaccedilatildeo de bibliotecas utilizado eacute preservada
a informaccedilatildeo da direccedilatildeo da transcriccedilatildeo ou seja de qual fita do DNA o transcrito
originou-se Dessa forma seraacute possiacutevel definir sRNAs candidatos que estejam antisenso
a regiotildees contendo ORFs jaacute conhecidas Tal correlaccedilatildeo entre ORFs e sRNAs deveraacute ser
feita futuramente juntamente com a busca por possiacuteveis moleacuteculas de mRNAs que
possam ser alvo de regulaccedilatildeo por estes sRNAs
Resultados e Discussatildeo
138
Parte B) Descriccedilatildeo e comparaccedilatildeo dos transcritomas de oito cepas de Xylella
fastidiosa
Nesta segunda parte do trabalho seratildeo apresentados os estudos dos transcritomas
de oito cepas de X fastidiosa em duas fases do crescimento em meio PWG Como
detalhado na seccedilatildeo anterior (parte A) foi observado maior quantidade de genes
diferencialmente expressos na comparaccedilatildeo entre transcritomas de duas cepas (9a5c e
Temecula1) cultivadas nas mesmas condiccedilotildees do que na comparaccedilatildeo entre meios ou
fases de crescimento de uma mesma cepa Estas observaccedilotildees sugerem uma regulaccedilatildeo
gecircnica diferente entre genes ortoacutelogos destas duas cepas o que motivou a ampliaccedilatildeo do
trabalho para descrever e comparar transcritomas de seis outras cepas de X fastidiosa
Dessa forma foram realizadas anaacutelises dos transcritomas de outras seis cepas
isoladas de hospedeiros vegetais ou locais distintos (Tabela 2) J1a12 (natildeo virulenta)
U24d e Fb7 isoladas de citros 3124 isolada de cafeeiro Hib4 isolada de hibisco e
Pr8x isolada de ameixeira Ao contraacuterio das cepas Temecula1 e 9a5c estas seis cepas
satildeo ainda pouco estudadas mas tambeacutem apresentam diferenccedilas genocircmicas e fenotiacutepicas
in vitro (Pierry 2012 Santana 2012) Por exemplo algumas mutaccedilotildees em genes de
virulecircncia importantes foram encontradas no gene pilQ relacionado a externalizaccedilatildeo
do pilus longo na cepa U24d (Santana 2012) no gene rpfC proteiacutena sensora de DSF
na sinalizaccedilatildeo por percepccedilatildeo de quorum na cepa Fb7 (Santana 2012) no gene rpfB
responsaacutevel pela diversidade de moleacuteculas de DSF na cepa J1a12 (Pierry 2012) aleacutem
da confirmaccedilatildeo das diferenccedilas encontradas em um trabalho anterior com esta cepa
utilizando microarranjos (Koide et al 2004) a observaccedilatildeo de que o gene para a
poligalacturonase (pglA) se encontra intacto nas cepas Hib4 e Pr8x (Pierry 2012) assim
como nas cepas norte-americanas e diferente do gene truncado encontrado nas cepas
sul-americanas (Simpson et al 2000) Somadas agraves anaacutelises dos seus genomas as
anaacutelises dos transcritomas seratildeo importantes para explicar os fenoacutetipos observados
Aleacutem disso as comparaccedilotildees entre os transcritomas tem o potencial de apontar para
determinantes relevantes para a especificidade de hospedeiro bem como de revelar
novos genes associados agrave colonizaccedilatildeo e virulecircncia
Assim como no caso das cepas 9a5c e Temecula1 foram sequenciados os
transcritomas de ceacutelulas no iniacutecio e no final do crescimento exponencial no meio rico
PWG Este meio foi escolhido porque resulta em melhor rendimento do crescimento
populacional e maior facilidade na obtenccedilatildeo de amostras iacutentegras de RNA total Foram
Resultados e Discussatildeo
139
realizadas as curvas de crescimento para orientar a escolha do tempo de coleta das
ceacutelulas para extraccedilatildeo da amostra de RNA total Os procedimentos de extraccedilatildeo de RNA
total depleccedilatildeo do rRNA preparo das bibliotecas de cDNA sequenciamento do
transcritoma e anaacutelises de dados foram realizados como descrito na parte A deste
trabalho seguindo o fluxograma mostrado na Figura 1
410 Curva de crescimento populacional de seis cepas de X fastidiosa
O crescimento populacional das seis cepas no meio PWG foi analisado por 21
dias (Figura 9) assim como realizado para as cepas 9a5c e Temecula1 (Figura 2) As
cepas isoladas de citros J1a12 e U24d apresentaram certo atraso no crescimento nos
primeiros dias de cultivo quando comparado com as outras cepas analisadas
Consequentemente ambas atingiram o final da fase exponencial tardiamente poreacutem
com valores semelhantes de densidade celular A cepa Pr8x isolada de ameixeira
apresentou valores altos de densidade celular ao final do ensaio assim como observado
para a cepa 9a5c A cepa 3124 apresentou um perfil mais caracteriacutestico de crescimento
bacteriano com suas fases bem definidas e atingindo a fase estacionaacuteria com tempo
semelhante ao observado para a cepa J1a12
A cepa Fb7 isolada de citros na Argentina atingiu a fase estacionaacuteria mais cedo
(~8 dias) aleacutem de apresentar um crescimento populacional menor (DO600nm lt 10) Tal
fato tambeacutem foi observado para a cepa Temecula1 a qual parece ter atingido a fase
estacionaacuteria com 7 dias Jaacute o perfil de crescimento populacional da cepa Hib4 isolada
de hibisco parece apresentar um decreacutescimo moderado com 15 dias poreacutem retoma apoacutes
21 dias e ultrapassa ligeiramente a DO600nm gt10
As curvas de crescimento foram utilizadas para guiar a escolha do dia de coleta
para cada uma das seis cepas As amostras do iniacutecio do crescimento exponencial foram
obtidas no 3deg dia para as cepas Fb7 3124 Hib4 e Pr8x no 5deg dia para a cepa J1a12 e 7deg
dia para a cepa U24d As amostras do final do crescimento exponencial foram obtidas
no 7deg dia para as cepas Fb7 3124 e Hib4 no 10deg dia para J1a12 e Pr8x e no 15deg dia
para U24d (Figura 9) Todos os cultivos foram iniciados com DO600nm = 005
Assim como observado para as cepas 9a5c e Temecula1 os fenoacutetipos in vitro de
cultivo das seis cepas analisadas nesta etapa tambeacutem mostraram grande variaccedilatildeo (Figura
10) As cepas J1a12 Fb7 e Hib4 mostraram fenoacutetipos de menor agregaccedilatildeo de ceacutelulas
Resultados e Discussatildeo
140
planctocircnicas quando comparados com as outras cepas Apesar disso em fases tardias de
crescimento apresentaram formaccedilatildeo de biofilme aderido ao frasco A cepa U24d
apresentou a maior deposiccedilatildeo de ceacutelulas aderidas em biofilme
Figura 9 Curva de crescimento de seis cepas de X fastidiosa (A) cepa J1a12 (B) cepa U24d (C) cepa Fb7 (D) cepa 3124 (E) cepa Hib4 e (F) cepa Pr8x foram cultivadas em tubos cocircnicos de 50 mL com DO600nm inicial de 005 no meio PWG a 28oC e 170 rpm Mediccedilotildees da DO600nm foram realizadas nos 1deg 3deg 7deg 10deg 15deg e 21deg dias de cultivo Barras verticais representam o desvio padratildeo da meacutedia de trecircs reacuteplicas teacutecnicas
Resultados e Discussatildeo
141
Figura 10 Fenoacutetipo de crescimento in vitro no meio PWG dos dias escolhidos para a extraccedilatildeo de RNA total (A) cepa J1a12 com 5 dias (B) cepa J1a12 com 10 dias (C) cepa U24d com 7 dias (D) cepa U24d com 15 dias (E) cepa Fb7 com 3 dias (F) cepa Fb7 com 7 dias (G) cepa 3124 com 3 dias (H) cepa 3124 com 7 dias (I) cepa Hib4 com 3 dias (J) cepa Hib4 com 7 dias (K) cepa Pr8x com 3 dias (L) cepa Pr8x com 10 dias O cultivo foi iniciado com DO600nm de 005 As imagens mostram uma de duas reacuteplicas bioloacutegicas para cada condiccedilatildeo Frascos incubados a 28degC e 170 rpm
411 Obtenccedilatildeo dos transcritomas por RNA-Seq
As extraccedilotildees das amostras de RNA total das seis cepas quantificaccedilotildees e anaacutelises
de qualidade e integridade foram realizadas exatamente como descrito na parte A (item
43) A Tabela 23 lista os paracircmetros de qualidade para todas as amostras de RNA
extraiacutedas das seis cepas os quais de modo geral estatildeo plenamente adequados para
realizaccedilatildeo do RNA-Seq Tambeacutem para estas amostras a completa remoccedilatildeo do DNA
destas preparaccedilotildees de RNA total foi confirmada por PCR com um par de primers
especiacutefico para detecccedilatildeo de DNA de X fastidiosa (dados natildeo mostrados)
As preparaccedilotildees de RNA total foram submetidas agrave depleccedilatildeo de rRNAs para
enriquecimento em moleacuteculas de mRNAs seguindo-se anaacutelise por eletroforese capilar
Para quase todas as amostras indicadas na Tabela 23 a eficiecircncia na remoccedilatildeo de rRNAs
Resultados e Discussatildeo
142
foi muito bem-sucedida (dados natildeo mostrados) Entretanto em algumas reacuteplicas das
cepas Hib4 e U24d a depleccedilatildeo do rRNA foi incompleta o que soacute foi verificado apoacutes o
sequenciamento do transcritoma Assim novas reacuteplicas foram obtidas sendo que
apenas os paracircmetros destas reacuteplicas constam da Tabela 23
As amostras purificadas e depletadas de rRNAs foram entatildeo utilizadas para a
preparaccedilatildeo das bibliotecas de cDNA Assim como observado para as bibliotecas das
cepas 9a5c e Temecula1 para todas elas foi obtido um excelente rendimento tanto
quanto agrave concentraccedilatildeo como na qualidade pureza e tamanho meacutedio do inserto (Tabela
23) As 31 bibliotecas de cDNA foram sequenciadas em nove corridas no equipamento
MiSeq (Illumina) utilizando a estrateacutegia de Paired-End com um kit para 500 ciclos Este
total de bibliotecas inclui 7 bibliotecas das cepas Hib4 e U24d que foram refeitas devido
a falhas na etapa depleccedilatildeo de rRNAs como mencionado acima Assim como nas
corridas anteriores (Tabela 3) o rendimento da maioria dessas corridas foi excelente
com quantidades de sequecircncias muito proacuteximas ou ateacute maiores do que o previsto pelo
fabricante que eacute de 25 milhotildees de sequecircncias (Tabela 24) Dados das corridas 1 e 3
(Tabela 3) foram novamente citados na Tabela 24 uma vez que incluiacuteram bibliotecas da
cepa Fb7
Cabe destacar que a corrida 11 gerou cerca de 20 milhotildees de sequecircncias devido
a uma densidade de clusters mais baixa que as demais Por outro lado densidades muito
altas tambeacutem podem prejudicar como aconteceu na corrida 8 quando a porcentagem de
sequecircncias de alta qualidade apresentou uma queda em relaccedilatildeo as outras corridas Essas
variaccedilotildees na densidade de clusters provavelmente refletem pequenos erros na
quantificaccedilatildeo das bibliotecas sendo que a concentraccedilatildeo que foi utilizada nestes
sequenciamentos variou de 6 a 8 pM
Resultados e Discussatildeo
143
Tabela 23 Dados das amostras de RNA de cada uma das seis cepas cultivadas em PWG (painel esquerdo) e de suas respectivas bibliotecas de cDNA (painel direito)
Cepa Tempo (dias)
NanoDrop (ngmicroL)
A260 280
A260 230
RIN RiboGreen
(ngmicroL) NanoDrop
(ngmicroL) A260 280
A260 230
Tamanho meacutedio (pb)
qPCR (nM)
Reacuteplica
J1a12
5 2298 215 089 82 1423 847 185 219 412 1384 1
2671 214 226 85 1577 896 187 221 417 1101 2
10 2519 215 218 87 1612 872 186 211 388 1418 1
2387 215 159 82 1459 929 184 215 404 1598 2
U24d
7 2557 214 226 88 1494 893 186 217 401 1365 1
2807 213 181 94 1662 856 187 229 422 1444 2
15 1773 210 177 92 1005 451 184 220 368 1064 5
1853 210 144 91 1179 414 180 196 352 907 6
Fb7
3 2554 213 213 93 1411 744 185 222 369 2029 1
2469 214 107 94 1313 780 187 234 370 1484 2
7 3682 216 187 80 3353 607 184 191 381 940 1
2011 210 213 84 2246 506 182 229 342 1915 2
3124
3 2665 215 142 85 1559 932 184 221 383 1289 1
2629 215 204 88 1523 983 184 216 402 1327 2
7 2551 214 220 91 1515 857 185 220 401 1342 1
2606 215 222 95 1548 879 185 220 438 1171 2
Hib4
3 2687 215 193 81 1558 887 186 214 407 1528 2
2818 212 231 86 1753 939 182 193 415 2229 3
7 1931 207 203 89 1267 762 186 214 382 1774 3
1766 208 142 86 1112 731 186 227 352 2111 4
Pr8x
3 2525 214 222 92 1529 851 187 209 416 1388 1
2525 215 218 97 1462 731 190 205 389 1226 2
10 2621 216 115 90 1528 851 190 215 397 1492 1
2675 215 223 91 1572 733 190 208 383 1336 2
Resultados e Discussatildeo
144
Tabela 24 Resumo do rendimento de nove corridas contendo as bibliotecas das cepas J1a12 U24d Fb7 3124 Hib4 e Pr8x
Corrida Total de
sequecircncias Sequecircncias filtradas
Nuacutemero de bibliotecas
Densidade de clusters
gtQ30
1+ 25687600 16908052 4 1439 777
3+ 27988934 23358634 4 1547 777
6 22602532 20644205 6 1196 801
7 29875986 23164145 5 1654 746
8 30020946 24186651 5 1630 623
9 29033867 23293348 5 1591 751
10 27364241 23518326 5 1471 773
11 20793330 19006836 5 1099 797
12 22873995 19779191 2 1245 741
Paired-end reads Filtragem que remove sequecircncias com baixa qualidade gtQ30 indica sequecircncias de alta qualidade + Corridas citadas na Tabela 3 mas que conteacutem bibliotecas da cepa Fb7
412 Anaacutelises da qualidade das sequecircncias dos transcritomas
As sequecircncias obtidas nos sequenciamentos de todos os transcritomas das seis
cepas foram analisadas quanto agrave qualidade de suas bases seguindo a mesma estrateacutegia
descrita no item 43 De modo geral quase todos os transcritomas sequenciados nesta
parte apresentaram padrotildees de qualidade semelhantes ao exemplo mostrado
anteriormente (Figura 4) como exemplificado pela anaacutelise das sequecircncias da biblioteca
da primeira reacuteplica da cepa 3124 crescida por 3 dias em meio PWG (Figura 11A-C)
No entanto foi verificado que as bibliotecas sequenciadas na corrida 8
(3124_7d1 Pr8x_3d1 e Pr8x_10d1) apresentaram uma maior quantidade de sequecircncias
com escores de qualidade acima de Q15 (Figura 11D) o que reflete o fato dessa corrida
ter apresentado uma menor porcentagem de sequecircncias com alta qualidade
Resultados e Discussatildeo
145
Figura 11 Anaacutelise da qualidade por base das sequecircncias do transcritomas 3124_3d1 e Pr8x_3d1 Anaacutelise das sequecircncias da primeira extremidade (read1) (A) da segunda extremidade (read2) (B) e as sequecircncias pareadas (read1+read2) (C) do transcritoma da primeira reacuteplica da cepa 3124 cultivada por 3 dias em PWG (D) anaacutelise das sequecircncias pareadas (read1+read2) da primeira reacuteplica da cepa Pr8x cultivada por 3 dias em PWG As anaacutelises foram realizadas usando o software FASTQC O eixo das abcissas conteacutem os tamanhos das sequecircncias (1 ateacute 250) enquanto que o eixo das ordenadas conteacutem os valores de Q escore (de 0 a 40)
413 Mapeamento das sequecircncias dos transcritomas nos genomas de referecircncia
O software CLC Genomics Workbench foi utilizado para o mapeamento das
sequecircncias nos genomas de referecircncia exatamente como descrito no item 44 Todas as
cepas utilizadas neste estudo jaacute tiveram seus genomas sequenciados e montados em
trabalhos anteriores (Pierry 2012 Santana 2012) Portanto cada transcritoma foi
adequadamente mapeado na sua respectiva sequecircncia genocircmica e anotaccedilatildeo gecircnica para
obtenccedilatildeo de valores de expressatildeo baseados na normalizaccedilatildeo por FPKM
O nuacutemero de sequecircncias por biblioteca variou refletindo o nuacutemero de bibliotecas
sequenciadas por corrida (Tabela 25) e assim como observado para os transcritomas de
9a5c e Temecula1 (item 44) estaacute dentro do recomendado para anaacutelise de expressatildeo
Resultados e Discussatildeo
146
diferencial (Haas et al 2012) As porcentagens de sequecircncias mapeadas (664 a 889)
foram consideradas satisfatoacuterias para as anaacutelises subsequentes
Tabela 25 Resumo do rendimento de cada biblioteca sequenciada
Cepa Tempo (dias)
Total de sequecircncias
Tamanho meacutedio (bases)
Distacircncia entre paired reads
(bases)
Sequecircncias mapeadas
Reacuteplica
J1a12
5 8094534 156 63 a 240 6752880 (834) 1
9982832 157 65 a 249 8064520 (808) 2
10 9683066 150 62 a 240 7195622 (743) 1
7957756 150 63 a 249 5792488 (728) 2
U24d
7 10279226 151 60 a 240 8997494 (875) 1
9332698 150 59 a 240 7635964 (818) 2
15 19078998 152 64 a 250 15067468 (790) 5
19890124 146 63 a 249 17282894 (869) 6
Fb7
3 5783996 159 71 a 240 4809678 (832) 1
9142576 157 70 a 240 6984550 (764) 2
7 7743594 163 66 a 241 6458294 (834) 1
10071298 147 67 a 241 8943750 (888) 2
3124
3 9733762 158 67 a 249 8445092 (868) 1
9546034 153 63 a 240 8236080 (863) 2
7 8542486 160 63 a 235 6554300 (767) 1
11366984 149 63 a 240 10105710 (889) 2
Hib4
3 8676050 155 62 a 249 6783638 (782) 2
7658814 160 68 a 248 6161342 (805) 3
7 8571260 155 64 a 248 7132760 (832) 3
6979646 155 67 a 249 5719766 (820) 4
Pr8x
3 10111206 159 62 a 238 7770606 (769) 1
7377760 154 65 a 249 5832910 (791) 2
10 8900358 163 63 a 232 5913106 (664) 1
8509818 149 64 a 249 6681236 (785) 2
414 Anaacutelise de correlaccedilatildeo das reacuteplicas bioloacutegicas e entre diferentes transcritomas
As anaacutelises de transcritomas relatadas na parte A mostraram altos valores de
correlaccedilatildeo entre as trecircs reacuteplicas bioloacutegicas para cada amostra quando comparadas aos
pares Este resultado justificou a decisatildeo de sequenciar somente duas reacuteplicas de cada
condiccedilatildeo no caso dos transcritomas das seis cepas descritas nesta parte da tese
Sabe-se que um maior nuacutemero de reacuteplicas eleva o poder estatiacutestico nas anaacutelises
de expressatildeo diferencial principalmente na detecccedilatildeo de genes com baixa expressatildeo
Para contornar eventuais imprecisotildees de anaacutelises de expressatildeo baseadas em duas
Resultados e Discussatildeo
147
reacuteplicas Schurch e colaboradores (Schurch et al 2016) recomendam que seja
estabelecido um limite ao fold change diferente da hipoacutetese nula default que seria 0 o
que eacute possiacutevel quando eacute utilizada a ferramenta DESeq2 Estes autores realizaram um
estudo com 48 reacuteplicas bioloacutegicas de duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae e
utilizaram 11 ferramentas de anaacutelise de expressatildeo diferencial Dentre elas DESeq2 foi
considerada uma das 5 melhores ferramentas uma vez que eacute capaz de controlar o iacutendice
de falsos positivos mantendo-o perto ou abaixo de 5 (conforme utilizado neste
trabalho padjlt005) independentemente do nuacutemero de reacuteplicas ou do valor limite de
fold change Outra vantagem desta ferramenta eacute a sua opccedilatildeo exclusiva de especificar o
valor limite de fold change para a hipoacutetese nula sendo testada Neste modo a ferramenta
testa se o valor medido para o fold change de um determinado gene eacute consistente em
estar abaixo do valor limite escolhido do que ser consistente com zero fornecendo um
mecanismo natural de incorporar um limite ao fold change de uma forma
estatisticamente significante
Assim como para os transcritomas de 9a5c e Temecula1 tambeacutem foram
realizadas anaacutelises de correlaccedilatildeo de Pearson entre as duas reacuteplicas de uma mesma
condiccedilatildeo utilizando valores de expressatildeo por FPKM Os valores de correlaccedilatildeo das
reacuteplicas foram sempre acima de 09 (Tabela 26) indicando que podem ser tratadas
como tal As plotagens de valores de FPKM entre duas reacuteplicas em uma mesma
condiccedilatildeo demonstram a alta correlaccedilatildeo entre as reacuteplicas bioloacutegicas (Figura 12)
Tabela 26 Valores de correlaccedilatildeo de Pearson entre as reacuteplicas de uma mesma condiccedilatildeo Anaacutelise foi realizada com os valores de FPKM de cada transcritoma
Cepa Meio Tempo (dias)
Valor de correlaccedilatildeo de Pearson
J1a12 PWG 5 0984
PWG 10 0995
U24d PWG 7 0991
PWG 15 0995
Fb7 PWG 3 0999
PWG 7 0999
3124 PWG 3 0992
PWG 7 0990
Hib4 PWG 3 0926
PWG 7 0955
Pr8x PWG 3 0997
PWG 10 0994
Resultados e Discussatildeo
148
Figura 12 Graacuteficos de correlaccedilatildeo entre reacuteplicas da mesma condiccedilatildeo baseado nos valores de FPKM transformados em logaritmo na base 10 Os graacuteficos correspondem agrave correlaccedilatildeo entre reacuteplicas de transcritomas em PWG das cepas J1a12 iniacutecio (A) e final (B) da fase exponencial U24d iniacutecio (C) e final (D) da fase exponencial Fb7 iniacutecio (E) e final (F) da fase exponencial 3124 iniacutecio (G) e final (H) da fase exponencial Hib4 iniacutecio (I) e final (J) da fase exponencial Pr8x iniacutecio (K) e final (L) da fase exponencial
Com os valores de FPKM transformados em log10 de todos os transcritomas
analisados foram gerados dois heatmaps um separado por reacuteplicas (Figura 13) e outro
com valores meacutedios de cada condiccedilatildeo (Figura 14) Estas anaacutelises incluiacuteram os
transcritomas de 9a5c e Temecula1 obtidos do crescimento em meio PWG para
comparaccedilatildeo com os transcritomas das outras seis cepas
O heatmap baseado nos valores de cada reacuteplica separadamente mostrou que as
cepas Fb7 J1a12 Pr8x e Hib4 tiveram todos os seus transcritomas agrupados lado a
Resultados e Discussatildeo
149
lado inclusive separados de acordo com a mesma fase de crescimento (Figura 13)
Entretanto as cepas 9a5c U24d 3124 e Temecula1 natildeo seguiram o mesmo padratildeo Em
alguns casos as reacuteplicas de mesma fase do crescimento se mantiveram agrupadas como
para as cepas 9a5c e 3124 Jaacute na cepa U24d uma das reacuteplicas de iniacutecio do crescimento
agrupou-se distante do grupo de outras reacuteplicas da mesma cepa Os transcritomas de
Temecula1 a uacutenica cepa norte-americana e da subespeacutecie fastidiosa apresentaram
localizaccedilotildees isoladas dos grupos maiores comportando-se com ldquogrupo externordquo Os
dois transcritomas de iniacutecio de crescimento de Temecula1 localizaram-se externamente
ao grupo de todos os transcritomas de Hib4 e os de fase inicial das cepas 9a5c e 3124 A
primeira reacuteplica do transcritoma de Temecula1 na fase final comportou-se com ldquogrupo
externordquo ao grupo contendo todos os transcritomas de Pr8x trecircs reacuteplicas de U24d e os
transcritomas de fase final de 9a5c Jaacute a segunda reacuteplica do transcritoma de Temecula1
na fase final posicionou-se externamente ao grupo contendo todos os transcritomas de
Fb7 os transcritomas de 3124 na fase final e uma reacuteplica do transcritoma de iniacutecio do
crescimento de U24d Os transcritomas da cepa J1a12 foram os que mostraram maior
diferenccedila em relaccedilatildeo aos outros uma vez que se localizaram isoladamente em um uacutenico
grupo (Figura 13)
O heatmap baseado nos valores meacutedios (log10) de FPKM de cada condiccedilatildeo
mostrou um agrupamento das condiccedilotildees similar ao observado no heatmap anterior As
cepas Fb7 J1a12 Hib4 e Pr8x apresentaram seus transcritomas de iniacutecio e final do
crescimento agrupados lado a lado As cepas 9a5c e 3124 tiveram os transcritomas de
iniacutecio do crescimento posicionados em um mesmo grupo Por outro lado o transcritoma
da cepa 9a5c no final do crescimento agrupou com o da cepa U24d tambeacutem da fase
final do crescimento Jaacute a condiccedilatildeo de fase inicial de U24d agrupou-se com a de fase
final de 3124 tendo a condiccedilatildeo de Temecula1 em fase final localizada proacutexima Ainda
Temecula1 teve sua condiccedilatildeo de iniacutecio do crescimento localizada externamente ao
grupo que inclui Hib4 (Figura 14)
Novamente justificamos que estas discrepacircncias podem ser um reflexo da
dificuldade em se obter inoacuteculos da mesma condiccedilatildeo nos quais as populaccedilotildees
bacterianas estejam em sincronismo entre si assim como dito em relaccedilatildeo aos heatmaps
da parte A (item 45) Entretanto de um modo geral foi possiacutevel observar uma
coerecircncia nos agrupamentos baseados nos valores de FPKM das oito cepas analisadas
Resultados e Discussatildeo
150
Figura 13 Heatmap com valores de FPKM em log10 de todas as reacuteplicas das condiccedilotildees analisadas em todas as cepas As colunas representam os transcritomas devidamente nomeadas As linhas representam cada gene analisado (1341 genes) O dendrograma no topo da figura mostra o agrupamento dos transcritomas em questatildeo O graacutefico na parte superior direita da figura representa uma gradaccedilatildeo de cores baseando-se nos valores de FPKM sendo que na escala quanto mais proacuteximo do vermelho menor a expressatildeo e quanto mais proacuteximo do branco maior a expressatildeo Para a geraccedilatildeo da imagem foi usada a funccedilatildeo heatmap2 do pacote gplots utilizando a plataforma R
Resultados e Discussatildeo
151
Figura 14 Heatmap com as meacutedias dos valores de FPKM em log10 de todas as reacuteplicas para cada condiccedilatildeo analisada em todas as cepas As colunas representam as condiccedilotildees devidamente nomeadas As linhas representam cada gene analisado (1341 genes) O dendrograma no topo da figura mostra o agrupamento das condiccedilotildees em questatildeo O graacutefico na parte superior direita da figura representa uma gradaccedilatildeo de cores baseando-se nos valores meacutedios de FPKM sendo que na escala quanto mais proacuteximo do vermelho menor a expressatildeo e quanto mais proacuteximo do branco maior a expressatildeo Para a geraccedilatildeo da imagem foi usada a funccedilatildeo heatmap2 do pacote gplots utilizando a plataforma R
Resultados e Discussatildeo
152
415 Anaacutelise dos transcritomas baseada nos valores de FPKM
4151 Panorama da expressatildeo gecircnica das seis cepas
As listas de genes e seus respectivos valores de expressatildeo em FPKM (dados natildeo
apresentados) para cada transcritoma foram devidamente ordenadas e os genes divididos
em quatro categorias (Tabela 27) de acordo com intervalos de valores de FPKM Assim
como observado nos transcritomas de 9a5c e Temecula1 a categoria mais representada
foi a de genes com FPKM entre 100 e 0 evidenciando que a maioria dos genes
apresenta baixa expressatildeo (456 ndash 766)
Genes com valores de expressatildeo iguais a zero tambeacutem foram observados nestes
transcritomas (59 ndash 133) Dentre esses genes estatildeo a grande maioria dos genes de
tRNAs pois como mencionado anteriormente tais transcritos satildeo perdidos durante o
procedimento de preparaccedilatildeo das bibliotecas Estas observaccedilotildees confirmam a completa
ausecircncia de contaminaccedilatildeo com DNA nas preparaccedilotildees de RNA total que foram utilizadas
no RNA-Seq
Tambeacutem como observado anteriormente (parte A item 471) sequecircncias de
rRNAs foram detectadas com baixiacutessima expressatildeo em poucos transcritomas Conforme
jaacute mencionado o paracircmetro utilizado no mapeamento permite a contagem do fragmento
apenas caso ele mapeie exclusivamente em um uacutenico local do genoma Uma vez que
tambeacutem observamos altos valores de porcentagens de mapeamento das sequecircncias em
um uacutenico local no genoma em todos os transcritomas (862 - 939) pode-se considerar
a depleccedilatildeo de rRNAs satisfatoacuteria (Tabela 27)
A maioria dos genes encontrada com expressatildeo igual a zero satildeo aqueles com
funccedilatildeo hipoteacutetica ou provenientes de regiotildees de proacutefagos assim como verificado para
os transcritomas analisados na parte A (item 471) Vale lembrar que o conteuacutedo de
fagos nos diferentes genomas varia em nuacutemero e composiccedilatildeo de genes (Santana 2012)
Novamente podemos sugerir que tais genes possivelmente fazem parte de regiotildees
remanescentes de fagos incompletos e inativos embora pudessem eventualmente ser
expressos em outras condiccedilotildees de cultivo Entretanto alguns genes relacionados a fagos
apresentaram valores positivos de expressatildeo por FPKM em todos os transcritomas
Resultados e Discussatildeo
153
Destacamos a observaccedilatildeo de que genes codificadores da toxina Zonula
occludens (Zot) tambeacutem natildeo estatildeo expressos nas cepas 3124 e Hib4 assim como visto
em Temecula1 Nas outras cepas todos os genes para Zot estariam expressos
Nas cepas de citros U24d e J1a12 os genes para uma DNA primase e para a
proteiacutena VirD4 tambeacutem foram encontrados silenciados assim como em 9a5c Um gene
codificador de uma flavodoxina multimeacuterica (WrbA) foi encontrado com expressatildeo zero
em U24d Jaacute na cepa J1a12 dois genes para subunidades da protease Clp e dois genes
para proteiacutenas de montagem do pilus longo (PilA) natildeo estatildeo expressos Entretanto
outras duas coacutepias de pilA mostraram-se fracamente expressas Na outra cepa de citros
Fb7 genes de proteiacutenas de exportaccedilatildeo de grupo heme e uma acetiltransferase foram
encontrados silenciados
Assim como visto para a cepa U24d as cepas 3124 e Pr8x mostraram expressatildeo
zero para o gene da flavodoxina multimeacuterica (WrbA) Na cepa 3124 genes de uma
possiacutevel hemaglutinina e de uma metilase de DNA natildeo estatildeo expressos Jaacute em Pr8x um
gene de uma permease para arabinose e outro de GTPase relacionada a fatores de
elongaccedilatildeo da traduccedilatildeo estariam silenciados
Na cepa Hib4 foi observado que genes codificadores de acetiltransferases
proteiacutenas de biossiacutentese de grupo heme glicosil transferases uma esterase predita uma
metilase envolvida na biossiacutentese de ubiquinona e metaloproteases dependentes de
zinco (elastase) tambeacutem natildeo estatildeo expressos Poreacutem outras duas coacutepias de elastases
estariam expressas Por fim genes da proteiacutena de retraccedilatildeo do pilus longo (PilT) e uma
hemaglutinina tambeacutem apresentaram valores de expressatildeo iguais a zero
As cepas que tiveram seus transcritomas sequenciados exceto a cepa 3124
possuem plasmiacutedeos (Pierry 2012 Santana 2012) As sequecircncias obtidas nos
transcritomas tambeacutem foram mapeadas contra as sequecircncias destes plasmiacutedeos e o niacutevel
de expressatildeo desses genes foi classificado baseado nos valores de FPKM A grande
maioria dos genes mostrou altos valores de expressatildeo em todas as condiccedilotildees e cepas
concentrando-se nas categorias ldquoacima de 10000rdquo e ldquoentre 10000 e 1000rdquo (Tabela 28)
A alta expressatildeo destes genes pode estar relacionada ao nuacutemero de coacutepias destes
plasmiacutedeos
Nos plasmiacutedeos pXF27 (J1a12) pXF39 (Pr8x) e nos transcritomas da fase
inicial em pXF64 (Hib4) a categoria mais representada foi a de genes com FPKM
maiores que 10000 Enquanto isso os outros plasmiacutedeos e os transcritomas de fase
Resultados e Discussatildeo
154
final em pXF64 a categoria com maior nuacutemero de genes foi a de genes com FPKM
entre 10000 e 1000 (Tabela 28)
Quase todos os genes dos plasmiacutedeos foram encontrados com valores de FPKM
diferentes de zero com algumas exceccedilotildees (Tabela 28) No pXF39 da cepa Fb7 foi
anotado o ncRNA traJ-II poreacutem tais transcritos natildeo foram detectados em nenhum dos
transcritomas analisados Trata-se de um motivo cis-regulatoacuterio encontrado in silico em
proteobacteacuterias poreacutem ainda sem funccedilatildeo definida (Weinberg et al 2010) Os outros
poucos genes com expressatildeo igual a zero satildeo classificados com funccedilotildees hipoteacuteticas
Alguns deles se repetem nos transcritomas da mesma cepa como por exemplo o
primeiro gene do pXF51 de U24d os genes 50 e 52 no pXF64 e o genes 1 21 e 57 do
pXF39 de Pr8x
Resultados e Discussatildeo
155
Tabela 27 Nuacutemero de genes contabilizados por faixa de valores de FPKM e porcentagem de genes expressos em cada transcritoma Cepa Tempo (dias) Total de genes gt10000 Entre 10000 e 1000 Entre 1000 e 100 Entre 100 e 0 Zero+ Genes expressos () Reacuteplica
J1a12
5 2784 9 89 929 1422 335 880 1
2784 11 104 901 1434 334 880 2
10 2784 2 64 767 1621 330 881 1
2784 4 30 709 1697 344 876 2
U24d
7 2623 5 32 691 1711 184 930 1
2623 4 16 388 1996 219 917 2
15 2623 9 63 987 1410 154 941 5
2623 6 45 759 1651 162 938 6
Fb7
3 2659 4 87 611 1706 251 906 1
2659 4 74 552 1819 209 921 2
7 2659 3 35 340 2037 243 909 1
2659 4 38 474 1979 162 939 2
3124
3 2674 6 95 735 1578 260 903 1
2674 8 98 772 1540 256 904 2
7 2674 3 40 510 1836 285 893 1
2674 3 35 530 1840 266 901 2
Hib4
3 2765 8 89 808 1504 356 871 2
2765 10 117 949 1321 368 862 3
7 2765 10 126 929 1356 344 871 3
2765 6 130 1003 1262 364 864 4
Pr8x
3 2603 12 72 811 1506 202 922 1
2603 11 70 738 1563 221 915 2
10 2603 8 70 784 1531 210 919 1
2603 6 36 686 1672 203 922 2
total de genes analisado subtraindo-se os genes de rRNAs e tRNAs +genes com valor zero de FPKM subtraindo-se os genes de rRNAs e tRNAs
Resultados e Discussatildeo
156
Tabela 28 Nuacutemero de genes dos plasmiacutedeos indicados contabilizados por faixa de valores de FPKM e porcentagem de genes expressos
Plasmiacutedeo Tempo (dias)
Total de
genes gt10000
Entre 10000 e 1000
Entre 1000 e 100
Entre 100 e 0
Zero Genes
expressos ()
Reacuteplica
pXF27
(J1a12)
5 38 31 6 1 0 0 100 1
38 26 11 1 0 0 100 2
10 38 30 7 1 0 0 100 1
38 28 9 0 0 1 974 2
pXF51
(J1a12)
5 73 25 42 5 0 1 986 1
73 27 38 7 0 1 986 2
10 73 29 38 6 0 0 100 1
73 26 40 7 0 0 100 2
pXF51
(U24d)
7 70 27 40 1 1 1 986 1
70 32 35 1 0 2 971 2
15 70 29 38 2 0 1 986 5
70 26 41 2 0 1 986 6
pXF39
(Fb7)
3 51 21 26 3 0 1 980 1
51 21 26 3 0 1 980 2
7 51 23 25 2 0 1 980 1
51 23 27 0 0 1 980 2
pXF64
(Hib4)
3 67 33 29 3 0 2 970 2
67 32 30 3 0 2 970 3
7 67 28 34 3 0 2 970 3
67 30 33 2 0 2 970 4
pXF39
(Pr8x)
3 57 32 20 3 0 2 965 1
57 33 20 2 0 2 965 2
10 57 32 22 0 0 3 947 1
57 35 19 1 0 2 965 2
4152 Descriccedilatildeo dos genes mais expressos
A partir das listas de genes e seus respectivos valores de expressatildeo gecircnica
normalizados por FPKM foram destacados os dez genes mais expressos em todas as
condiccedilotildees e reacuteplicas das seis cepas em questatildeo (Tabelas 29 e 30)
Em quase todos os transcritomas o gene que apresentou maior expressatildeo
codifica para o ncRNA da endoribonuclease RNase P (Altman 2011) assim como
observado para os transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1 (item 472) As exceccedilotildees
foram as duas reacuteplicas dos transcritomas de fase final do crescimento em Hib4 nos
quais o gene mais expresso codifica uma colicina V (XF0263) O ncRNA da RNase P
Resultados e Discussatildeo
157
foi encontrado respectivamente nas 6ordf e 2ordf posiccedilotildees dos ordenamentos das reacuteplicas 1 e
2 de Hib4
O ncRNA 6S tambeacutem foi encontrado nas dez primeiras posiccedilotildees em 18 dos 24
transcritomas analisados As exceccedilotildees foram dois transcritomas de fase inicial (um em
J1a12 e um em 3124) e todos os transcritomas de Hib4 Nestes sua posiccedilatildeo no
ranqueamento variou da 11ordf ateacute a 47ordf Por se tratar de um RNA relacionado agrave mudanccedila
da fase exponencial para a fase estacionaacuteria em geral ele ocupa posiccedilotildees mais altas nos
rankings de FPKM dos transcritomas do final do crescimento assim como visto para as
cepas 9a5c e Temecula1
De modo similar ao observado com os transcritomas de 9a5c e Temecula1 (Parte
472) em todos os 24 transcritomas analisados estatildeo vaacuterios genes codificadores de
bacteriocinas Entre eles estatildeo os ortoacutelogos de trecircs colicinas V descritas no genoma de
X fastidiosa (XF0262 XF0263 e XF0264) (Simpson et al 2000) sendo que a XF0263
figura na primeira posiccedilatildeo dos rankings dos transcritomas do final do crescimento em
Hib4 Tambeacutem procuramos a identidade dos genes anotados como hipoteacuteticos e estes
codificam vaacuterias novas microcinas preditas em genomas de X fastidiosa (Rodrigo R
Duarte e Aline M da Silva dados natildeo publicados) Aleacutem daquelas indicadas nos
transcritomas de Temecula1 e 9a5c foram detectados transcritos de
bacteriocinasmicrocinas exclusivas das cepas J1a12 3124 e Fb7 Desta forma
modificamos a anotaccedilatildeo destes genes para ldquobacteriocinardquo A observaccedilatildeo de que o
arsenal de toxinas expressos nas cepas 9a5c e Temecula1 tambeacutem eacute abundantemente
encontrado em outras seis cepas de X fastidiosa eacute um forte indiacutecio de que esta pode ser
uma caracteriacutestica importante e comum neste fitopatoacutegeno Isto sugere um
comportamento agressivo desta bacteacuteria em seus nichos naturais para disputar recursos
(espaccedilo e nutrientes) com outros microrganismos presentes nos seus hospedeiros eou
vetores
Outra caracteriacutestica comum entre todas as cepas eacute detecccedilatildeo do gene de
Ax21Omp1X nas primeiras posiccedilotildees dos rankings de FPKM dos transcritomas das seis
cepas principalmente com maior expressatildeo no iniacutecio do crescimento
Outros genes tambeacutem encontrados entre os dez mais expressos em todos os
transcritomas codificam proteiacutenas relacionadas a estresses sejam as cold shock proteins
ou a heat shock protein Hsp20 Genes de proteiacutenas de membrana externa como a
OmpW tambeacutem estatildeo entre os mais expressos em todas as cepas e condiccedilotildees
Bacterioferritinas foram encontradas altamente expressas nos transcritomas das cepas
Resultados e Discussatildeo
158
J1a12 U24d Fb7 e 3124 assim como haviam sido vistas em 9a5c e Temecula1 Aleacutem
disso as cepas J1a12 e Fb7 apresentaram em comum a alta expressatildeo de genes de uma
cisteiacutena protease e de duas subunidades da protease Clp (ClpP e ClpX) O gene de uma
peroxiredoxina estaacute entre os dez mais expressos em J1a12 Jaacute em Fb7 trecircs genes de
proteiacutenas ribossomais um de uma lisozima um de uma peptidase e dois genes de
lipases (especificamente no final do crescimento) estatildeo abundantemente expressos
Mais uma vez genes com funccedilatildeo hipoteacutetica tambeacutem aparecem altamente expressos em
vaacuterios dos transcritomas os quais poderatildeo ser analisados em futuros estudos (Tabelas
29 e 30)
Os genes dos plasmiacutedeos de todas as cepas tambeacutem foram ranqueados baseados
em seus valores de FPKM (Tabela S12) O plasmiacutedeo pXF51 de U24d apresentou o
gene 37 o qual codifica uma proteiacutena relacionada a fagos sempre na primeira
colocaccedilatildeo em todos os transcritomas desta cepa Os outros genes observados entre os
dez primeiros do ranking codificam hidrolases putativas proteiacutena VirB5
transglicosilases uma proteiacutena de regulaccedilatildeo transcricional e a proteiacutena TrbJ
(relacionada agrave transferecircncia conjugativa) (Tabela S12)
A cepa J1a12 apresenta dois plasmiacutedeos o pXF27 e o pXF51 O primeiro
mostrou alta expressatildeo dos genes 13 (proteiacutena do sistema de secreccedilatildeo do tipo IV) e 23
(funccedilatildeo hipoteacutetica) nos transcritomas de iniacutecio do crescimento Jaacute nos transcritomas do
seu final o gene 8 (funccedilatildeo hipoteacutetica) foi o primeiro colocado nos rankings seguido
tambeacutem pelo gene 23 Outros genes altamente expressos codificam uma proteiacutena
inibidora de crescimento (provavelmente uma toxina para manutenccedilatildeo do plasmiacutedeo na
ceacutelula) proteiacutenas do sistema de secreccedilatildeo do tipo IV e transposases No pXF51 o gene
37 (proteiacutena com funccedilatildeo hipoteacutetica) foi o primeiro colocado em todos os transcritomas
desta cepa Os outros genes observados entre os dez mais expressos no pXF51 da cepa
J1a12 codificam para a proteiacutena VirB5 uma proteiacutena relacionada a fagos e uma proteiacutena
de regulaccedilatildeo transcricional (Tabela S12)
No plasmiacutedeo encontrado cepa Fb7 o gene 37 (proteiacutena relacionada a fagos) foi
encontrado como mais expresso em todos os transcritomas desta cepa O segundo
colocado codifica uma metil-ester carboxilesterase seguido de diversos genes com
funccedilatildeo hipoteacutetica reguladores transcricionais proteiacutena da famiacutelia ParB a interferase
MazF e a proteiacutena TrbJ (Tabela S12) No plasmiacutedeo pXF39 da cepa Pr8x o gene 19
(funccedilatildeo hipoteacutetica) foi encontrado como mais expresso em todos as condiccedilotildees
analisadas nesta cepa Outros genes observados nas dez primeiras posiccedilotildees codificam
Resultados e Discussatildeo
159
para proteiacutenas do sistema de secreccedilatildeo do tipo IV como a VirB2 VirB3 VirB5 e VirD2
aleacutem de reguladores transcricionais proteiacutenas relacionadas a fagos e diversas proteiacutenas
hipoteacuteticas (Tabela S12) Finalmente o pXF64 da cepa Hib4 apresentou o gene 4
(funccedilatildeo hipoteacutetica) como mais expresso nos transcritomas da fase inicial de
crescimento Jaacute nos transcritomas de final do crescimento o gene 35 (aciltransferase) e
o 42 (funccedilatildeo hipoteacutetica) foram encontrados na primeira posiccedilatildeo nas reacuteplicas analisadas
Genes codificando para proteiacutenas hipoteacuteticas proteiacutenas relacionadas a fagos
recombinases e aciltransferases tambeacutem figuram entre os dez genes mais expressos
(Tabela S12)
Resultados e Discussatildeo
160
Tabela 29 Lista dos dez genes mais expressos nos transcritomas das cepas J1a12 U24d e Fb7 baseando-se em valores de FPKM Genes anotados utilizando a plataforma IMGER (httpsimgjgidoegov)
Cepa Tempo (dias)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
J1a12
5
RNase P (13800)
Omp W (24200)
Bacteriocina (12310)
Cold shock proteins (26860)
Bacteriocina (12300)
6S RNA (21550)
Bacteriocina (11430)
Hipoteacutetica (11640)
Ax21 (18890)
Bacterio-ferritina (03640)
RNase P (13800)
Bacteriocina (11430)
Bacteriocina (11470)
Cold shock proteins (26860)
Ax21 (18890)
Bacteriocina (12310)
Omp W (24200)
Colicina V (02430)
Bacteriocina (12300)
Hipoteacutetica (11850)
10
RNase P (13800)
6S RNA (21550)
Cold shock proteins (26860)
Hipoteacutetica (11850)
Hipoteacutetica (11640)
Bacterio-ferritina (03640)
Omp W (24200)
Bacteriocina (12310)
Cysteine protease (01370)
Clp protease subunit ClpP
(12570)
RNase P (13800)
Colicina V (02420)
6S RNA (21550)
Hipoteacutetica (11850)
Heat shock protein Hsp20
(15830)
Cold shock proteins (26860)
Clp regulatory
subunit ClpX (12560)
Bacterio-ferritina (03640)
Peroxiredo-xina
(16820)
Bacteriocina (12310)
U24d
7
RNase P (0983)
Colicina V (0244)
Colicina V (0245)
6S RNA (1924)
Hipoteacutetica (1759)
Bacteriocina (1209)
Hipoteacutetica (1480)
Bacteriocina (1132)
Bacteriocina (1210)
Bacteriocina (1211)
RNase P (0983)
6S RNA (1924)
Colicina V (0244)
Colicina V (0245)
Bacteriocina (1209)
Hipoteacutetica (1759)
Ax21 (1709)
Bacteriocina (1210)
Bacteriocina (1132)
Hipoteacutetica (1480)
15
RNase P (0983)
6S RNA (1924)
Colicina V (0245)
Colicina V (0244)
Hipoteacutetica (1759)
Bacteriocina (1132)
Bacterio-ferritina (0360)
Omp W (0798)
Bacteriocina (1210)
Bacteriocina (1209)
RNase P (0983)
6S RNA (1924)
Colicina V (0244)
Colicina V (0245)
Hipoteacutetica (1759)
Hipoteacutetica (1480)
Bacterio-ferritina (0360)
Bacteriocina (1132)
Heat shock protein Hsp20 (2153)
Bacteriocina (1210)
Fb7 3 RNase P (112021)
Cold shock protein
(112563)
Ax21 (111062)
Bacterio-ferritina (11369)
Omp (112285)
Proteiacutena ribossomal
S13P (111907)
Cysteine protease (11142)
6S RNA (111355)
Hipoteacutetica (111798)
Proteiacutena ribossomal
S3P (111922)
RNase P Cold shock Ax21 6S RNA Omp Cysteine Hipoteacutetica Bacterio- Proteiacutena Proteiacutena
Resultados e Discussatildeo
161
(112021) protein (112563)
(111062) (111355) (112285) protease (11142)
(111798) ferritina (11369)
ribossomal S3P
(111922)
ribossomal S13P
(111907)
7
RNase P (112021)
6S RNA (111355)
Colicina V (11247)
Secretory lipase
(11333)
Lysozyme (11711)
Hipoteacutetica (111798)
Hipoteacutetica (111660)
Cold shock protein
(112563)
Secretory lipase
(11332)
Cysteine protease (11142)
RNase P (112021)
6S RNA (111355)
Cold shock protein
(112563)
Colicina V (11247)
Hipoteacutetica (111798)
Lysozyme (11711)
Clp protease subunit ClpX
(111892)
Clp protease subunit ClpP
(111893)
Proteiacutena ribossomal
L29 (111920)
Cysteine protease (11142)
Tabela 30 Lista dos dez genes mais expressos nos transcritomas das cepas 3124 Hib4 e Pr8x baseando-se em valores de FPKM Genes anotados utilizando a plataforma IMGER (httpsimgjgidoegov)
Cepa Tempo (dias)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3124
3
RNase P (2024)
Colicina V (0235)
Hipoteacutetica (1481)
Ax21 (1330)
Bacteriocina (1877)
Cold shock proteins (2569)
Hipoteacutetica (1207)
Omp W (2308)
Bacteriocina (1876)
Bacterio-ferritina (0353)
RNase P (2024)
Colicina V (0235)
Cold shock proteins (2569)
Ax21 (1330)
Bacteriocina (1877)
Hipoteacutetica (1481)
Hipoteacutetica (1207)
Bacteriocina (1876)
6S RNA (1036)
Bacteriocina (1802)
7
RNase P (2024)
Colicina V (0235)
6S RNA (1036)
Hipoteacutetica (1207)
Bacteriocina (1877)
Bacteriocina (1802)
Hipoteacutetica (0236)
Cold shock proteins (2569)
Bacterio-ferritina (0353)
Bacteriocina (1806)
RNase P (2024)
Colicina V (0235)
Hipoteacutetica (1207)
6S RNA (1036)
Hipoteacutetica (0236)
Bacteriocina (1802)
Bacteriocina (1877)
Omp W (2308)
Colicina V (0234)
Bacteriocina (1806)
Hib4 3
RNase P (2229)
Colicina V (0235)
Ax21 (1380)
Bacteriocina (2083)
Bacteriocina (2082)
Omp W (2410)
Cold shock proteins (2676)
Bacteriocina (1999)
Bacteriocina (1998)
Bacteriocina (2081)
RNase P (2229)
Colicina V (0235)
Ax21 (1380)
Bacteriocina (2083)
Bacteriocina (2082)
Omp W (2410)
Cold shock proteins (2676)
Bacteriocina (1999)
Colicina V (0236)
Hipoteacutetica (0989)
Resultados e Discussatildeo
162
7
Colicina V (0235)
Colicina V (0236)
Cold shock proteins (2676)
Bacteriocina (2083)
Bacteriocina (2082)
RNase P (2229)
Acyl carrier protein (0600)
Bacteriocina (2081)
Bacteriocina (1998)
Bacteriocina (1999)
Colicina V (0235)
RNase P (2229)
Colicina V (0236)
Bacteriocina (2083)
Bacteriocina (2082)
Cold shock proteins (2676)
Bacteriocina (1997)
Ax21 (1380)
Bacteriocina (2081)
Bacteriocina (1998)
Pr8x
3
RNase P (2017)
Colicina V (0243)
Hipoteacutetica (1189)
Bacteriocina (1865)
Omp W (2272)
Ax21 (1240)
Colicina V (0244)
Bacteriocina (1773)
Bacteriocina (1864)
6S RNA (1024)
RNase P (2017)
Colicina V (0243)
Hipoteacutetica (1189)
Colicina V (0244)
Bacteriocina (1865)
6S RNA (1024)
Omp W (2272)
Ax21 (1240)
Bacteriocina (1773)
Cold shock proteins (2479)
10
RNase P (2017)
Colicina V (0243)
6S RNA (1024)
Hipoteacutetica (1189)
Bacteriocina (1773)
Bacteriocina (1865)
Omp W (2272)
Cold shock proteins (2479)
Bacteriocina (1771)
Colicina V (0244)
RNase P (2017)
Colicina V (0243)
Colicina V (0244)
6S RNA (1024)
Hipoteacutetica (1189)
Bacteriocina (1773)
Bacteriocina (1865)
Bacteriocina (1771)
Bacteriocina (1772)
Cold shock proteins (2479)
Resultados e Discussatildeo
163
4153 Anaacutelise de rotas metaboacutelicas expressas
Assim como realizado para os transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1 (item
473) os valores de expressatildeo gecircnica normalizados para FPKM de todos os
transcritomas das seis cepas descritos nesta parte da tese tambeacutem foram submetidos a
anaacutelises de rotas metaboacutelicas ativas utilizando o software MinPath Os genes utilizados
nesta anaacutelise apresentaram valores de expressatildeo de FPKM maiores que 10 sendo que a
notaccedilatildeo ldquo1rdquo significa presenccedila da rota naquele transcritoma e ldquo0rdquo significa a sua
ausecircncia (Tabela S13)
A maioria das observaccedilotildees encontradas na anaacutelise das cepas da parte A tambeacutem
foi vista na anaacutelise das outras seis cepas da parte B mostrando que as principais rotas
metaboacutelicas de sobrevivecircncia e manutenccedilatildeo da vida estatildeo presentes em todas elas
(Tabela S13) Isto significa que nenhuma cepa analisada teria alguma deficiecircncia
importante no metabolismo celular que possa prejudicar o seu adequado crescimento
As rotas relacionadas agrave obtenccedilatildeo de energia metabolismo de carboidratos
manutenccedilatildeo e transmissatildeo da informaccedilatildeo geneacutetica metabolismo de purinas e
pirimidinas exportaccedilatildeo de proteiacutenas e outras rotas de transporte de moleacuteculas formaccedilatildeo
de membranas e parede celular metabolismo de vitaminas coenzimas nitrogecircnio e
enxofre biossiacutentese e metabolismo de alguns aminoaacutecidos estatildeo presentes e ativas nas
cepas analisadas
Da mesma forma rotas metaboacutelicas que foram consideradas inativas nas cepas
9a5c e Temecula1 tambeacutem natildeo foram detectadas nos transcritomas das outras seis
cepas Dentre elas o metabolismo de inositol galactose accediluacutecares presentes em
nucleotiacutedeos aleacutem das rotas de metabolismo e degradaccedilatildeo dos aminoaacutecidos glutamato
cisteiacutena tirosina valina leucina isoleucina e lisina
Entretanto algumas particularidades puderam ser observadas A rota para o
metabolismo de triptofano foi vista inativa em quase todos os transcritomas com
exceccedilatildeo de uma reacuteplica de U24d_15d e uma reacuteplica de 3124_7d Nestes mesmos
transcritomas a rota para o metabolismo de metano foi observada inativa enquanto que
foi vista ativa nos outros transcritomas Esta mesma relaccedilatildeo tambeacutem pode ser observada
em alguns transcritomas da cepa 9a5c descrita na parte A No transcritoma de uma das
reacuteplicas de U24d_7d a rota de metabolismo de enxofre mostrou-se inativa
As rotas metaboacutelicas observadas nos transcritomas da cepa Fb7 foram as que
Resultados e Discussatildeo
164
apresentaram um maior nuacutemero de diferenccedilas em relaccedilatildeo aos outros transcritomas A
rota de degradaccedilatildeo de N-glicano mostrou-se inativa em Fb7 e ativa nas outras cepas
Entretanto a rota de degradaccedilatildeo de estruturas de glicanos mostrou-se ativa em Fb7 e
inativa nos outros transcritomas Apesar de serem capazes de degradar estruturas de
glicanos os genes para a rota de sua biossiacutentese aparentemente estatildeo ausentes nesta
cepa Aleacutem disso as rotas para biossiacutentese de zeatina e de alcaloacuteides tambeacutem estariam
ausentes nesta cepa A rota relacionada ao sistema de secreccedilatildeo do tipo IV natildeo foi
encontrada em Fb7 e Pr8x Estas mesmas duas cepas tambeacutem diferiram das outras ao
apresentarem a rota de resistecircncia a beta-lactacircmicos ativa
Em resumo a anaacutelise de rotas metaboacutelicas das oito cepas de X fastidiosa
mostrou um perfil metaboacutelico geral para este fitopatoacutegeno no qual as rotas essenciais
para a sua sobrevivecircncia nos seus nichos bioloacutegicos estatildeo ldquoativasrdquo Foi observada alta
concordacircncia entre as cepas e algumas poucas diferenccedilas observadas que natildeo gerariam
vantagens ou desvantagens significativas agrave determinada cepa Vale lembrar que este tipo
de anaacutelise leva em consideraccedilatildeo somente se a rota estaacute ativa e natildeo diz respeito agrave
intensidade da expressatildeo gecircnica a qual seraacute analisada e comparada a seguir
416 Anaacutelises de expressatildeo gecircnica diferencial
A intensidade da expressatildeo gecircnica foi comparada entre os transcritomas
analisados utilizando o mesmo pacote DESeq2 (Love et al 2014) sendo que os dados
de entrada foram os valores de contagem brutos de quantas sequecircncias mapearam em
cada gene
Uma vez que para as seis cepas foram sequenciados transcritomas em um uacutenico
meio de cultivo (PWG) foram realizados apenas dois niacuteveis de comparaccedilatildeo A
nomenclatura dos niacuteveis definida na parte A (item 481) foi mantida 1) comparaccedilotildees
entre transcritomas da mesma cepa mas em fases de crescimento diferentes como por
exemplo entre os transcritomas da cepa J1a12 no iniacutecio e no final da fase exponencial
3) comparaccedilotildees entre transcritomas de cepas diferentes poreacutem na mesma fase de
crescimento como por exemplo entre o transcritoma de J1a12 e o transcritoma de Fb7
ambos do iniacutecio da fase exponencial No niacutevel 3 foram incluiacutedas as comparaccedilotildees entre
os transcritomas da cepa 9a5c e Temecula1 com os das outras seis cepas
Resultados e Discussatildeo
165
Assim como nas anaacutelises discutidas na parte A os paracircmetros utilizados para
considerar um gene como significativamente diferencialmente expresso foram um valor
de p ajustado pela correccedilatildeo FDR (False Discovery Rate) (Benjamini e Hochberg
1995) menor do que 005 e um valor de razatildeo de expressatildeo (fold change) maior que 2
A Tabela 31 apresenta o nuacutemero de genes diferencialmente expressos dentro desses
paracircmetros em cada comparaccedilatildeo Os graacuteficos de dispersatildeo baseados nos valores de
expressatildeo meacutedia dos genes entre as condiccedilotildees analisadas foram gerados mas devido ao
alto nuacutemero de comparaccedilotildees realizadas seraacute mostrado um exemplo deste graacutefico para
cada niacutevel (Figura 15)
Tabela 31 Resumo do nuacutemero de genes diferencialmente expressos (plt005 fold changegt2) em todas as comparaccedilotildees
Niacuteveis Total de
genes Condiccedilatildeo 1
(c1) Condiccedilatildeo 2
(c2)
Genes DE (plt005 FCgt20)
Genes up-regulated (c1c2)
Genes DE em
comum
1
2841 J1a12_PWG_5d J1a12_PWG_10d 2 (007) 20 -
2679 U24d_PWG_7d U24d_PWG_15d 1 (004) 10 -
2714 Fb7_PWG_3d Fb7_PWG_7d 14 (05) 104 -
2729 3124_PWG_3d 3124_PWG_7d 11 (04) 101 -
2822 Hib4_PWG_3d Hib4_PWG_7d 3 (011) 30 -
2660 Pr8x_PWG_3d Pr8x_PWG_10d 0 0 -
3
2316 9a5c_PWG_3d J1a12_PWG_5d 63 (27) 4419 55
2316 9a5c_PWG_10d J1a12_PWG_10d 85 (37) 5530
2536 9a5c_PWG_3d U24d_PWG_7d 4 (02) 13 0
2536 9a5c_PWG_10d U24d_PWG_15d 5 (02) 05
2192 9a5c_PWG_3d Fb7_PWG_3d 108 (49) 6345 69
2192 9a5c_PWG_10d Fb7_PWG_7d 100 (46) 4654
2284 9a5c_PWG_3d 3124_PWG_3d 42 (18) 3210 37
2284 9a5c_PWG_10d 3124_PWG_7d 53 (23) 3518
2206 9a5c_PWG_3d Hib4_PWG_3d 120 (54) 8337 105
2206 9a5c_PWG_10d Hib4_PWG_7d 145 (66) 9352
2268 9a5c_PWG_3d Pr8x_PWG_3d 50 (22) 2822 39
2268 9a5c_PWG_10d Pr8x_PWG_10d 63 (28) 2934
2265 U24d_PWG_7d 3124_PWG_3d 76 (34) 4828 44
2265 U24d_PWG_15d 3124_PWG_7d 69 (30) 3732
2198 U24d_PWG_7d Fb7_PWG_3d 183 (83) 79104 117
2198 U24d_PWG_15d Fb7_PWG_7d 167 (76) 66101
2321 U24d_PWG_7d J1a12_PWG_5d 94 (40) 5539 83
2321 U24d_PWG_15d J1a12_PWG_10d 147 (63) 7572
2206 U24d_PWG_7d Hib4_PWG_3d 126 (57) 9234 118
2206 U24d_PWG_15d Hib4_PWG_7d 263 (119) 137126
Resultados e Discussatildeo
166
2262 U24d_PWG_7d Pr8x_PWG_3d 42 (19) 2517 38
2262 U24d_PWG_15d Pr8x_PWG_10d 98 (43) 4058
1874 U24d_PWG_7d Tem_PWG_3d 129 (69) 7950 54
1874 U24d_PWG_15d Tem_PWG_7d 87 (46) 3552
2274 J1a12_PWG_5d 3124_PWG_3d 119 (52) 7544 86
2274 J1a12_PWG_10d 3124_PWG_7d 104 (46) 6539
2186 J1a12_PWG_5d Fb7_PWG_3d 139 (64) 7366 69
2186 J1a12_PWG_10d Fb7_PWG_7d 84 (38) 2757
2199 J1a12_PWG_5d Hib4_PWG_3d 179 (81) 10475 153
2199 J1a12_PWG_10d Hib4_PWG_7d 209 (95) 11891
2249 J1a12_PWG_5d Pr8x_PWG_3d 95 (42) 4847 80
2249 J1a12_PWG_10d Pr8x_PWG_10d 106 (47) 5551
1856 J1a12_PWG_5d Tem_PWG_3d 120 (65) 7050 53
1856 J1a12_PWG_10d Tem_PWG_7d 60 (32) 2535
2163 Fb7_PWG_3d 3124_PWG_3d 163 (75) 9172 95
2163 Fb7_PWG_7d 3124_PWG_7d 114 (53) 7143
2117 Fb7_PWG_3d Hib4_PWG_3d 225 (106) 15372 162
2117 Fb7_PWG_7d Hib4_PWG_7d 216 (102) 15462
2178 Fb7_PWG_3d Pr8x_PWG_3d 160 (73) 9466 108
2178 Fb7_PWG_7d Pr8x_PWG_10d 142 (65) 7963
2192 3124_PWG_3d Hib4_PWG_3d 148 (68) 8662 129
2192 3124_PWG_7d Hib4_PWG_7d 185 (84) 10778
2244 3124_PWG_3d Pr8x_PWG_3d 63 (28) 2241 42
2244 3124_PWG_7d Pr8x_PWG_10d 48 (21) 1830
1879 3124_PWG_3d Tem_PWG_3d 118 (63) 5662 50
1879 3124_PWG_7d Tem_PWG_7d 58 (31) 1642
2229 Hib4_PWG_3d Pr8x_PWG_3d 134 (60) 4490 131
2229 Hib4_PWG_7d Pr8x_PWG_10d 221 (99) 68153
1887 Hib4_PWG_3d Tem_PWG_3d 145 (77) 5689 102
1887 Hib4_PWG_7d Tem_PWG_7d 132 (70) 3597
1872 Pr8x_PWG_3d Tem_PWG_3d 95 (51) 6233 47
1872 Pr8x_PWG_10d Tem_PWG_7d 60 (32) 2832
1799 Tem_PWG_3d Fb7_PWG_3d 206 (115) 91115 53
1799 Tem_PWG_7d Fb7_PWG_7d 58 (32) 1840
DE diferencialmente expressos Tem Temecula1
Resultados e Discussatildeo
167
Figura 15 Graacuteficos de dispersatildeo dos genes analisados em uma comparaccedilatildeo de cada niacutevel No eixo das abscissas estatildeo os valores de expressatildeo meacutedia no eixo das ordenadas estatildeo os valores de razatildeo de expressatildeo em log2 Os pontos em vermelho representam genes com valores de p ajustado menores do que 005 os pontos em cinza representam genes com valores de p ajustado maiores que 005 Cada graacutefico representa uma comparaccedilatildeo (A) Fb7-PWG-3d e Fb7-PWG-7d (B) 9a5c-PWG-3d e J1a12-PWG-5d
No primeiro niacutevel de comparaccedilatildeo entre transcritomas da mesma cepa e em
tempos de crescimento diferentes foi possiacutevel observar poucos genes considerados
diferencialmente expressos com os paracircmetros utilizados A maior quantidade de genes
observada foi na comparaccedilatildeo entre os transcritomas da cepa Fb7 com 14 genes sendo
10 positivamente regulados no iniacutecio do crescimento exponencial O mesmo padratildeo se
manteve nas comparaccedilotildees das outras cepas com a maioria dos genes modulados
positivamente na fase inicial Tais resultados satildeo corroborados com as comparaccedilotildees
entre os transcritomas de 9a5c e Temecula1 em meio PWG evidenciando que neste
meio rico em nutrientes o ambiente de cultivo estaacute favoraacutevel agrave manutenccedilatildeo do
crescimento por um periacuteodo prolongado e que no intervalo de tempo das amostras
analisadas poucas mudanccedilas na expressatildeo gecircnica foram necessaacuterias
Dentre os genes positivamente regulados no iniacutecio do crescimento em Fb7
podemos encontrar genes codificando proteiacutenas ribossomais proteiacutenas relacionadas a
transporte uma proteiacutena para a biossiacutentese do pilus longo (relacionado agrave motilidade da
bacteacuteria) e o gene codificando para Ax21 Interessantemente dois ncRNAs foram
encontrados mais expressos no final do crescimento a RNaseP e o 6S Dos 11 genes
diferencialmente expressos na cepa 3124 10 mostraram-se mais expressos no iniacutecio do
crescimento genes da DNA polimerase III da RNA polimerase proteiacutenas ribossomais
e de um transportador Jaacute na cepa J1a12 genes de uma GTPase putativa e de uma
Resultados e Discussatildeo
168
proteiacutena com funccedilatildeo hipoteacutetica foram mais expressos no iniacutecio do crescimento A cepa
U24d apresentou apenas um gene codificando para uma proteiacutena hipoteacutetica sendo mais
expresso no iniacutecio do crescimento Um gene de uma proteiacutena de membrana OmpW um
gene relacionado agrave biossiacutentese do pilus longo e um com funccedilatildeo hipoteacutetica foram
encontrados positivamente regulados na cepa Hib4 A cepa Pr8x natildeo mostrou nenhum
gene diferencialmente expresso dentro dos paracircmetros utilizados
No terceiro niacutevel de comparaccedilatildeo entre transcritomas de cepas diferentes foi
observado um alto nuacutemero de genes diferencialmente expressos em todas as 54
comparaccedilotildees Assim como nas comparaccedilotildees entre as cepas da parte A foram
considerados somente genes ortoacutelogos entre o par de cepas analisado Examinando um
mesmo par de cepas comparadas observa-se um maior nuacutemero de genes
diferencialmente expressos nas comparaccedilotildees entre transcritomas de iniacutecio do
crescimento mais especificamente em 15 pares (total de 27) No que diz respeito agraves
comparaccedilotildees com a cepa 9a5c quase em todos os casos foi observada uma maior
quantidade de genes diferencialmente expressos no final do crescimento (incluindo a
comparaccedilatildeo com a cepa Temecula1) com exceccedilatildeo da comparaccedilatildeo com a cepa Fb7 No
caso de Fb7 em todas as comparaccedilotildees maior nuacutemero de genes diferencialmente
expressos foi sempre observado nas comparaccedilotildees entre transcritomas no iniacutecio do
crescimento Nas outras cepas natildeo foram observados padrotildees variando entre as
comparaccedilotildees com cada cepa Aleacutem disso um grande nuacutemero de genes foi
diferencialmente expresso desde o iniacutecio ateacute o final da fase exponencial em todas as
comparaccedilotildees entre pares de cepas (Tabela 31) Assim como jaacute mencionado o meio rico
PWG parece ser um ambiente relativamente estaacutevel e que exige poucas mudanccedilas na
expressatildeo gecircnica durante o crescimento populacional bacteriano Devido ao alto nuacutemero
de comparaccedilotildees e de genes diferencialmente expressos somente os genes relacionados agrave
virulecircncia seratildeo discutidos mais detalhadamente na seccedilatildeo seguinte
Em resumo foi observado um alto nuacutemero de genes diferencialmente expressos
nas comparaccedilotildees entre transcritomas de cepas distintas aleacutem de altos valores de razatildeo
de expressatildeo (fold change) assim como observado na parte A Isto sugere que as
maiores diferenccedilas entre as cepas natildeo estatildeo necessariamente no seu genoma mas na
regulaccedilatildeo da expressatildeo do conteuacutedo gecircnico em resposta a determinado ambiente ou
estiacutemulo
Resultados e Discussatildeo
169
4161 Anaacutelise de genes relacionados agrave virulecircncia e patogenicidade
A Tabela S14 conteacutem todos os genes diferencialmente expressos nas
comparaccedilotildees entre os transcritomas de todas as cepas analisadas que jaacute foram
relacionados aos sistemas de virulecircncia descritos em X fastidiosa (Simpson et al 2000
Van Sluys et al 2003 Chatterjee et al 2008)
Dentre as comparaccedilotildees do niacutevel 1 somente as cepas Fb7 e Hib4 apresentaram
genes relacionados agrave virulecircncia dentre os que foram definidos como diferencialmente
expressos Em ambos os casos um gene relacionado agrave biogecircnese do pilus longo
(XF2539 e XF2542 para Fb7 e Hib4 respectivamente) foi mais expresso no iniacutecio do
crescimento (Tabela S14)
Nas anaacutelises de niacutevel 3 diversos genes de virulecircncia foram encontrados entre
todos os pares de cepas com exceccedilatildeo da comparaccedilatildeo entre os transcritomas de iniacutecio do
crescimento das cepas 9a5c e U24d (Tabela S14)
Para melhor visualizaccedilatildeo dos resultados graacuteficos do tipo Radar Chart ou Spider
Chart foram confeccionados de duas formas diferentes A primeira tem como veacutertices
as oito cepas que tiveram seus transcritomas analisados (Figura 16) Cada um dos charts
representa um sistema de virulecircncia sendo que as linhas verdes e vermelhas dizem
respeito agraves comparaccedilotildees de transcritomas no iniacutecio e final do crescimento
respectivamente Como todas as cepas foram comparadas entre si um niacutevel aumentado
no graacutefico significa que determinada cepa apresentou maior expressatildeo daquele sistema
do que outra com a qual foi comparada Por exemplo se encontramos um niacutevel 4 no
chart aquela cepa teve um maior nuacutemero de genes positivamente regulados a seu favor
do que outras 4 cepas com as quais foi comparada (miacutenimo 0 e maacuteximo 7) Este tipo de
anaacutelise fornece um panorama de expressatildeo destes sistemas e que natildeo leva em
consideraccedilatildeo os genes individualmente e nem seus valores de razatildeo de expressatildeo Tais
informaccedilotildees estatildeo detalhadas na Tabela S14
Resultados e Discussatildeo
170
Figura 16 Graacuteficos do tipo radar chart com os resultados das comparaccedilotildees entre as cepas em relaccedilatildeo aos sistemas de virulecircncia analisados As linhas verdes representam as comparaccedilotildees entre transcritomas no iniacutecio do crescimento exponencial enquanto que as linhas vermelhas representam as comparaccedilotildees entre transcritomas no final do crescimento exponencial Cada graacutefico representa um sistema de virulecircncia como segue (A) Enzimas degradadoras de parede (CWDE) (B) Biogecircnese do pilus longo (C) Biogecircnese do pilus curto (D) Goma fastidiana (E) Lipopolissacariacutedeos (F) Funccedilotildees regulatoacuterias (G) Adesinas autotransportadoras (H) Hemolisinas (I) Lipases (J) Proteases A cada niacutevel aumentado no graacutefico significa que aquela cepa apresentou maior expressatildeo daquele sistema do que em comparaccedilatildeo com outra cepa
Resultados e Discussatildeo
171
Neste primeiro grupo de Radar charts foi observada uma maior expressatildeo de
enzimas degradadoras de parede (CWDE) nas cepas U24d e Pr8x nas comparaccedilotildees do
iniacutecio do crescimento enquanto isso J1a12 e Fb7 apresentam maior expressatildeo nas
comparaccedilotildees da fase final (Figura 16A) As cepas restantes natildeo apresentaram diferenccedilas
significativas quando comparadas com as outras
No que diz respeito aos genes relacionados com a biogecircnese do pilus longo as
cepas 3124 e Temecula1 apresentaram maior expressatildeo desse sistema do que outras
quatro cepas nas comparaccedilotildees no iniacutecio da fase exponencial (Figura 16B) Foram
seguidas pelas cepas 9a5c e Pr8x com 3 niacuteveis neste chart de genes para o pilus longo
Entretanto nas comparaccedilotildees de final do crescimento a cepa Pr8x apresentou maiores
niacuteveis mostrando maior expressatildeo destes genes do que outras quatro cepas A cepa
U24d se juntou com a 9a5c na segunda colocaccedilatildeo de expressatildeo destes genes atingindo
o niacutevel 3 Tais cepas com maior expressatildeo de genes do pilus longo seriam
hipoteacuteticamente mais moacuteveis do que as outras dentro das condiccedilotildees de crescimento
analisadas Entretanto sabe-se que a cepa U24d apresenta uma mutaccedilatildeo no gene pilQ
(proteiacutena formadora de poro pra externalizar o pilus) a qual impede a correta traduccedilatildeo
desta proteiacutena (Santana 2012) Dessa forma mesmo que haja a produccedilatildeo de transcritos
de genes relacionados com a biogecircnese do pilus longo este natildeo poderia ser
externalizado e portanto natildeo exerceria sua funccedilatildeo
Enquanto isso os genes para a biogecircnese do pilus curto mostraram maior
expressatildeo nas cepas Hib4 e Temecula1 nas comparaccedilotildees entre transcritomas do iniacutecio
do crescimento com 4 niacuteveis cada no chart (Figura 16C) Poreacutem no final da fase
exponencial a cepa U24d apresentou maior expressatildeo destes genes do que outras quatro
cepas sendo que a cepa Hib4 caiu para 3 niacuteveis Nota-se que a cepa Fb7 natildeo apresentou
nenhum niacutevel para este sistema de pilus curto o qual estaacute relacionado agrave adesatildeo ceacutelula-
ceacutelula e ceacutelula-substrato o que corrobora com seu fenoacutetipo sem formaccedilatildeo de agregados
de ceacutelulas planctocircnicas e a ausecircncia de ceacutelulas aderidas no frasco de cultivo
A seguir foram analisados os genes relacionados com a formaccedilatildeo de goma
fastidiana um produto celular essencial para a formaccedilatildeo do biofilme bacteriano A cepa
que apresentou maior atividade destes genes foi a Fb7 com 5 e 6 niacuteveis nas
comparaccedilotildees de iniacutecio e final da fase exponencial respectivamente (Figura 16D) Estes
dados estatildeo de acordo com a alta viscosidade de suas colocircnias em placas de cultivo
contrastando com o aspecto seco e aacutespero de outras cepas de X fastidiosa Aleacutem disso
nota-se claramente a turbidez no meio liacutequido ao cultivar Fb7 A segunda colocaccedilatildeo
Resultados e Discussatildeo
172
ficou com a cepa J1a12 a qual tambeacutem apresenta certa viscosidade em suas colocircnias
embora natildeo seja como a cepa Fb7 (Figura 16D)
Outro fator de virulecircncia analisado foi a produccedilatildeo de lipopolissacariacutedeos (LPS)
LPSs satildeo componentes da membrana externa atuando como proteccedilatildeo da ceacutelula contra
substacircncias toacutexicas e como modulador da resposta de defesa do hospedeiro (Newman et
al 2001) Genes para a produccedilatildeo de LPS foram vistos mais expressos nas cepas 9a5c e
Fb7 com 4 niacuteveis cada nas comparaccedilotildees entre transcritomas da fase inicial do
crescimento exponencial (Figura 16E) Interessantemente as outras duas cepas que
tambeacutem mostraram uma expressatildeo aumentada destes genes foram U24d e J1a12
tambeacutem cepas isoladas de citros Jaacute nas comparaccedilotildees de transcritomas de final do
crescimento exponencial Pr8x e Temecula1 apresentaram niacuteveis no chart embora
U24d se mantenha como a cepa com niacutevel mais alto (Figura 16E)
Uma extensa e diversa categoria de genes importantes para a virulecircncia eacute a
daqueles relacionados a funccedilotildees regulatoacuterias como reguladores transcricionais e fatores
sigma Nesta categoria a cepa J1a12 se destacou nas comparaccedilotildees com as outras cepas
atingindo os niacuteveis 7 e 6 nas comparaccedilotildees de iniacutecio e final da fase exponencial
respectivamente As outras cepas tambeacutem mostraram expressotildees aumentadas em
algumas comparaccedilotildees atingindo ateacute o niacutevel 4 (Fb7 nas comparaccedilotildees de iniacutecio do
crescimento exponencial) (Figura 16F)
Aleacutem das adesinas localizadas nas extremidades dos pili longo e curto X
fastidiosa ainda apresenta outros genes codificando para proteiacutenas adesinas afimbriais
como hemaglutininas e adesinas da famiacutelia dos autotransportadores trimeacutericos (Xad)
(Simpson et al 2000 Caserta et al 2010) Satildeo trecircs genes codificando para Xads
presentes no genoma de Xylella e eles mostraram-se mais expressos na cepa Fb7
atingindo trecircs niacuteveis tanto nas comparaccedilotildees de fase inicial como nas de fase final
(Figura 16G) A uacutenica outra cepa que mostrou expressatildeo aumentada de genes para Xads
foi a cepa U24d nas comparaccedilotildees de iniacutecio do crescimento
Assim como pudemos observar altos valores de expressatildeo de bacteriocinas e
colicinas em todos os transcritomas analisados as hemolisinas tambeacutem constituem um
importante grupo de toxinas atuando como fatores de virulecircncia amplamente
distribuiacutedos entre bacteacuterias patogecircnicas Gram-negativas (Simpson et al 2000
Linhartova et al 2010) Genes de hemolisinas mostraram-se mais expressos na cepa
Fb7 alcanccedilando o niacutevel 4 tanto nas comparaccedilotildees de fase inicial como final (Figura
Resultados e Discussatildeo
173
16H) A cepa 3124 tambeacutem apresentou expressatildeo aumentada nas comparaccedilotildees entre
transcritomas de fase inicial e final
Outros dois grupos de enzimas que satildeo considerados importantes fatores de
virulecircncias em X fastidiosa satildeo as lipases e proteases Uma das lipases de X fastidiosa
jaacute foi descrita como importante fator de virulecircncia para este fitopatoacutegeno (Nascimento
et al 2016) Neste estudo foi gerado um mutante para a lipase LesA (PD1703 e
XF0357) o qual apresentou virulecircncia reduzida ao ser inoculado em videiras quando
comparado com a cepa selvagem Aleacutem disso foi descrito que esta proteiacutena seria
secretada associada a vesiacuteculas de membrana externa e consequentemente poderia
causar seu efeito toacutexico em partes da planta distantes de sua ceacutelula de origem Dessa
forma lipases estariam associadas diretamente com a patogenicidade de X fastidiosa
(Nascimento et al 2016) Nas anaacutelises dos transcritomas foram detectados genes de
lipases abundantemente expressos na cepa Fb7 atingindo os niacuteveis maacuteximos nos charts
das duas comparaccedilotildees (Figura 16I) Aleacutem de vaacuterios genes para lipases estarem
positivamente regulados nesta cepa ainda foram observados altos valores de razatildeo de
expressatildeo (Tabela S14) Outra cepa com alta expressatildeo de lipases foi a J1a12 atingindo
os niacuteveis 5 e 6 nas comparaccedilotildees de fase inicial e final respectivamente Em relaccedilatildeo agraves
cepas restantes Temecula1 tambeacutem se destacou atingindo niacutevel 3 nas duas comparaccedilotildees
(Figura 16I)
As proteases tambeacutem constituem um importante grupo de enzimas relacionadas
agrave virulecircncia bacteriana Elas podem agir diretamente na integridade do tecido do
hospedeiro atuando na inativaccedilatildeo de proteiacutenas de defesa aleacutem de lidar com o turnover
de proteiacutenas bacterianas que tenham sido geradas em resposta agraves condiccedilotildees adversas
encontradas no hospedeiro (Lantz 1997 Ingmer e Brondsted 2009) Em relaccedilatildeo aos
genes codificando proteases em X fastidiosa (Chen et al 2008 Leite et al 2013
Zhang et al 2015 Gouran et al 2016) foi observada sua alta expressatildeo na cepa J1a12
nas comparaccedilotildees de iniacutecio da fase exponencial seguido por Fb7 e U24d (Figura 16J)
Entretanto nas comparaccedilotildees de fase final do crescimento a cepa Fb7 se destaca
atingindo o niacutevel 6 seguido de J1a12 e 9a5c (Figura 16J)
O segundo grupo de Radar Charts apresentou como veacutertices dez categorias de
genes de virulecircncia (Figura 17) Neste caso cada um dos charts representa uma cepa
que teve seus transcritomas analisados Novamente as linhas verdes dizem respeito agraves
comparaccedilotildees de transcritomas no iniacutecio do crescimento e as vermelhas no seu final
Dessa forma seraacute possiacutevel analisar qualquer mudanccedila significativa de expressatildeo de
Resultados e Discussatildeo
174
algum sistema entre as fases do crescimento O esquema de niacuteveis no chart eacute o mesmo
utilizado no primeiro grupo
A cepa 9a5c apresentou um aumento na expressatildeo de genes relacionados a
proteases na fase final do crescimento enquanto que pode ser observada uma
diminuiccedilatildeo nas categorias de LPS e genes regulatoacuterios (Figura 17A) Jaacute na cepa U24d
niacuteveis para biogecircnese dos pili longo e curto e para a produccedilatildeo de LPS foram
aumentados no final do crescimento com diminuiccedilatildeo dos niacuteveis das categorias de
CWDEs Xads hemolisinas lipases e proteases (Figura 17B) A cepa J1a12 apresentou
mudanccedilas de niacuteveis com o aumento de CWDEs goma fastidiana LPS e lipases aleacutem de
diminuiccedilotildees de niacuteveis nas categorias de biogecircnese do pilus longo e proteases (Figura
17C) A cepa Fb7 mostrou um aumento de genes relacionados agraves CWDEs goma
fastidiana e proteases na fase final do crescimento Entretanto foram observadas quedas
em niacuteveis das categorias relacionadas agrave produccedilatildeo de LPS e funccedilotildees regulatoacuterias (Figura
17D) Na cepa 3124 mudanccedilas foram vistas no aumento dos niacuteveis de expressatildeo de
hemolisinas e lipases embora tenham sido observadas diminuiccedilotildees nas categorias de
biogecircnese do pilus longo goma fastidiana funccedilotildees regulatoacuterias e proteases (Figuras
17E) A cepa Hib4 foi a que apresentou menos alteraccedilotildees entre as duas fases do
crescimento exponencial mostrando somente a queda de um niacutevel na categoria de
biogecircnese do pilus curto (Figura 17F) Jaacute a cepa Pr8x mostrou um aumento da
expressatildeo de CWDEs biogecircnese do pilus longo e LPS com queda nos niacuteveis de
hemolisinas (Figura 17G) Temecula1 mostrou um aumento de genes relacionados a
funccedilotildees regulatoacuterias e proteases na fase final do crescimento embora tenha sido vista
uma diminuiccedilatildeo nos niacuteveis de genes para biogecircnese dos pili longo e curto (Figura 17H)
Resultados e Discussatildeo
175
Figura 17 Graacuteficos do tipo radar chart com os resultados das comparaccedilotildees entre as cepas em relaccedilatildeo aos sistemas de virulecircncia analisados As linhas verdes representam as comparaccedilotildees entre transcritomas no iniacutecio do crescimento enquanto que as linhas vermelhas representam as comparaccedilotildees entre transcritomas no final do crescimento Cada graacutefico representa uma cepa como segue (A) 9a5c (B) U24d (C) J1a12 (D) Fb7 (E) 3124 (F) Hib4 (G) Pr8x (H) Temecula1 A cada niacutevel aumentado no graacutefico significa que aquela cepa apresentou maior expressatildeo daquele sistema do que em comparaccedilatildeo com outra cepa
Consideraccedilotildees finais
176
5 Consideraccedilotildees finais
O sequenciamento de transcritomas de diferentes cepas de Xylella fastidiosa no iniacutecio
e no final da fase exponencial de crescimento no meio rico PWG e no meio miacutenimo PIM6
possibilitou uma descriccedilatildeo abrangente do repertoacuterio de genes que eacute expresso nas diferentes
cepas e condiccedilotildees de cultivo A tecnologia de RNA-Seq mostrou-se altamente reprodutiacutevel e
robusta fornecendo enorme quantidade de dados de oacutetima qualidade e sem precedentes para
X fastidiosa Aleacutem da definiccedilatildeo de perfis transcricionais e anaacutelises de expressatildeo diferencial
entre transcritomas foi possiacutevel utilizar os dados gerados para definir as coordenadas
genocircmicas exatas para os transcritos descrevendo suas regiotildees 5rsquo e 3rsquo natildeo-traduzidas Aleacutem
disso as estruturas de operons expressos nas condiccedilotildees investigadas tambeacutem foram definidas
para as cepas 9a5c e Temecula1 Pela primeira vez foi descrito o perfil de sRNAs expressos
por X fastidiosa (cepa 9a5c)
Os transcritomas mostraram que a maior parte dos genes eacute transcrita em todas as
cepas mesmo que seus transcritos sejam pouco abundantes Em todos os transcritomas foram
observados ncRNAs muito abundantes como os da RNase P e do 6S Outra observaccedilatildeo
interessante foi a elevada expressatildeo de genes de bacteriocinas (colicinas microcinas
hemolisinas) sugerindo que mesmo em um cultivo in vitro sem a presenccedila de espeacutecies
competidoras a X fastidiosa expressa seu arsenal de toxinas As principais vias metaboacutelicas
de manutenccedilatildeo da sobrevivecircncia da ceacutelula foram encontradas ativas em todas as cepas e
transcritomas
Os transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1 na condiccedilatildeo de crescimento em PIM6
um meio que mimetiza a composiccedilatildeo da seiva do xilema revelou um conjunto de genes que
tem relaccedilatildeo com a carecircncia de nutrientes que a bacteacuteria enfrenta no xilema O crescimento da
populaccedilatildeo microbiana em PIM6 foi gravemente afetado pela escassez nutricional antecipando
a fase estacionaacuteria e com menor concentraccedilatildeo celular Ainda assim nesta condiccedilatildeo foi
observada a expressatildeo de genes que parecem relevantes para manutenccedilatildeo da sobrevivecircncia no
inoacutespito ambiente do hospedeiro vegetal eou do inseto vetor
As anaacutelises de expressatildeo diferencial entre os transcritomas das duas fases de
crescimento em um mesmo meio evidenciaram que o estresse gerado pela limitaccedilatildeo
nutricional do meio PIM6 exigiu mudanccedilas mais draacutesticas na expressatildeo gecircnica devido ao
maior nuacutemero de genes diferencialmente expressos observados Aleacutem disso o contato inicial
com este meio estimulou uma maior ativaccedilatildeo da transcriccedilatildeo As comparaccedilotildees entre os
transcritomas em meio PWG natildeo mostraram muitas mudanccedilas na expressatildeo de seus genes
Consideraccedilotildees finais
177
sugerindo que o meio rico em nutrientes apresentou condiccedilotildees adequadas para o crescimento
desde o iniacutecio do cultivo as quais natildeo sofreram muitas alteraccedilotildees ateacute o final da fase
exponencial Quando comparamos transcritomas de diferentes meios foram observadas
maiores diferenccedilas na fase final exponencial mostrando que o contato inicial com ambos os
meios ativa basicamente os mesmos genes e na mesma intensidade com divergecircncias sendo
observadas apoacutes o cultivo prolongado
As comparaccedilotildees entre os transcritomas de diferentes cepas mostraram que genes
ortoacutelogos respondem de maneiras distintas a uma mesma condiccedilatildeo evidenciando que
aparentemente satildeo regulados de formas diferentes
A comparaccedilatildeo da expressatildeo de genes de fatores de virulecircncia das cepas de X
fastidiosa revelou diferenccedilas significativas interessantes Natildeo foi observada uma
homogeneidade na resposta para estes sistemas sendo que cada sistema de virulecircncia
analisado se mostrou mais ativo em determinadas cepas Em alguns casos foi possiacutevel
correlacionar estas particularidades aos fenoacutetipos in vitro e virulecircncia in planta
As anaacutelises dos transcritomas evidenciaram vaacuterios genes candidatos que poderatildeo ser
futuramente investigados em maior detalhe quanto ao seu papel na biologia e na virulecircncia de
X fastidiosa Aleacutem disso a transcritocircmica comparativa expocircs diferenccedilas relevantes na
regulaccedilatildeo gecircnica de cepas de hospedeiros vegetais distintos que podem estar relacionadas agrave
especificidade ao hospedeiro
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200
Apecircndices
Tabela S1 Lista de regiotildees natildeo-traduzidas (UTRs) obtidas a partir do mapeamento de sequecircncias dos transcritomas da cepa 9a5c e suas respectivas coordenadas O mapeamento foi realizado com o software Rockhopper2
Coacutedigo Fita 5 UTR Iniacutecio de transcriccedilatildeo Iniacutecio de traduccedilatildeo Final de traduccedilatildeo Final de transcriccedilatildeo 3 UTR
XF0001 + 88 55 143 1462 1592 130
XF0002 + - 1759 1759 2859 2888 29
XF0003 + 34 3127 3161 4255 4255 -
XF0004 + 30 4470 4500 4766 - -
XF0006 + 834 7208 8042 8962 8969 7
XF0008 + 39 10260 10299 10394 10394 -
XF0009 + 308 10395 10703 11368 11405 37
XF0010 + - 11464 11464 12228 12256 28
XF0011 + 6 12279 12285 12707 12707 -
XF0012 + 3 12708 12711 13121 13122 1
XF0016 + - 16281 16281 16823 16897 74
XF0021 + 24 19371 19395 19691 19691 -
XF0024 + 100 20554 20654 20815 20981 166
XF0025 + - 20982 20982 21236 21947 711
XF0026 - 20 22846 22826 21732 21295 437
XF0028 + 7 23992 23999 24562 24562 -
XF0029 + 9 24563 24572 25048 - -
XF0032 + 5 26598 26603 30295 30297 2
XF0033 + - 30298 30298 30717 31018 301
XF0034 - 314 32207 31893 31159 30126 1033
XF0035 + 1 32676 32677 32811 32828 17
XF0036 + 6 33012 33018 34220 34220 -
201
XF0037 + 28 34221 34249 34434 34511 77
XF0038 - 38 34948 34910 34755 34753 2
XF0039 - 111 35610 35499 35095 35041 54
XF0040 - 501 36677 36176 35823 35753 70
XF0041 + 68 36131 36199 36459 36470 11
XF0042 + - 36474 36474 37736 37835 99
XF0044 + 506 38892 39398 39937 39996 59
XF0046 + 1 43590 43591 43686 43702 16
XF0047 + 338 43871 44209 44655 44655 -
XF0048 + 24 44694 44718 45203 45203 -
XF0049 + 57 45204 45261 46628 46889 261
XF0050 - 286 49277 48991 46805 46311 494
XF0052 - 112 50523 50411 50226 50186 40
XF0053 + 187 50364 50551 51744 52189 445
XF0054 - 69 52195 52126 51758 51693 65
XF0055 + 12 52200 52212 52319 52429 110
XF0056 + 23 52430 52453 52626 52626 -
XF0057 + 6 52704 52710 52820 52834 14
XF0061 - - - 56257 55178 54869 309
XF0064 + 320 57783 58103 59128 59128 -
XF0065 + 52 59130 59182 59283 59317 34
XF0066 + 54 59333 59387 60574 60710 136
XF0067 + 88 60951 61039 61278 61545 267
XF0068 - - 62396 62396 61395 58524 2871
XF0071 + 14 71794 71808 72623 72960 337
XF0072 - 843 74446 73603 72755 72537 218
XF0073 + 73 73682 73755 75059 75333 274
202
XF0074 + - 75334 75334 75627 75698 71
XF0076 - - - 76905 76738 76702 36
XF0078 - - 79077 79077 78097 77864 233
XF0079 + 441 78788 79229 79465 79480 15
XF0080 - - 80706 80706 79744 79429 315
XF0081 - 26 83512 83486 80781 80707 74
XF0082 - 60 84373 84313 83513 83513 -
XF0083 - 175 85114 84939 84385 84383 2
XF0084 + 126 85227 85353 85448 85476 28
XF0085 + 134 85477 85611 85775 86086 311
XF0086 - 2 86911 86909 86421 86373 48
XF0087 - 48 88344 88296 86989 86912 77
XF0088 - 8 89705 89697 88345 88345 -
XF0089 - 17 90007 89990 89712 89706 6
XF0090 - - - 91047 90094 90008 86
XF0091 - 308 92251 91943 91047 - -
XF0092 + 1031 91013 92044 92250 94476 2226
XF0094 - 8 94886 94878 94237 94190 47
XF0095 + 13 94935 94948 95253 95271 18
XF0097 + 1 95804 95805 95969 96150 181
XF0098 - - - 96234 96040 95838 202
XF0099 - 33 98096 98063 96231 - -
XF0104 - 15 102758 102743 101904 101902 2
XF0105 + - 102867 102867 104213 104465 252
XF0106 + 10 104587 104597 105979 106091 112
XF0107 + - 106195 106195 106455 106498 43
XF0109 + 109 107012 107121 107906 107979 73
203
XF0110 + 63 108008 108071 108481 108481 -
XF0111 + 71 108835 108906 109685 109710 25
XF0112 + - 109735 109735 109929 109979 50
XF0113 + 15 110028 110043 110210 110258 48
XF0115 + - - 111267 111641 111648 7
XF0116 + 9 111704 111713 112846 112931 85
XF0117 + - 112932 112932 113093 113132 39
XF0118 + 113 113133 113246 114937 115212 275
XF0119 - 223 116246 116023 114995 114805 190
XF0120 + 123 116652 116775 116930 116930 -
XF0121 + - 117045 117045 118076 118114 38
XF0124 + 47 120765 120812 123562 123562 -
XF0125 + 6 123695 123701 123916 123995 79
XF0126 + 332 124089 124421 124600 124647 47
XF0127 - 14 127065 127051 125027 124988 39
XF0133 + - - 131034 132008 132326 318
XF0134 - - 135249 135249 132265 131970 295
XF0142 + 3 143184 143187 144386 144582 196
XF0145 - - 148457 148457 147702 147666 36
XF0147 - - 151138 151138 149378 149339 39
XF0148 - - 151893 151893 151195 151175 20
XF0149 + 8 151960 151968 153197 - -
XF0151 + 490 154154 154644 156038 156415 377
XF0152 - 130 156754 156624 156052 154132 1920
XF0156 - 10 160152 160142 159327 159317 10
XF0159 + - - 161369 161719 161773 54
XF0161 + - 162520 162520 164328 164479 151
204
XF0162 - 64 164624 164560 164426 164297 129
XF0163 + 129 164752 164881 164976 165006 30
XF0166 - - 168767 168767 167622 167598 24
XF0167 - 47 170290 170243 168828 168786 42
XF0168 + 84 170094 170178 170294 170443 149
XF0169 + - 170444 170444 171700 172273 573
XF0170 + 11 177513 177524 178339 178830 491
XF0171 - 100 179419 179319 178471 178116 355
XF0172 + - 179767 179767 181674 181725 51
XF0173 - - 182830 182830 182075 181846 229
XF0174 + 176 183153 183329 184975 184975 -
XF0175 + 82 184976 185058 185702 185707 5
XF0176 - - 187063 187063 185927 185821 106
XF0177 - 10 188003 187993 187211 187068 143
XF0178 + 68 188273 188341 189114 189114 -
XF0179 + 9 189115 189124 189216 189535 319
XF0180 + - 189953 189953 190414 190737 323
XF0181 - 57 192231 192174 191779 191349 430
XF0182 - 279 192695 192416 192282 192232 50
XF0183 - 22 193824 193802 192696 192696 -
XF0185 - 274 195667 195393 194380 - -
XF0187 - - - 197338 196538 196534 4
XF0188 - 294 198186 197892 197335 - -
XF0189 + 536 197386 197922 199382 - -
XF0192 + 166 201507 201673 203013 203013 -
XF0193 + 65 203014 203079 203450 203450 -
XF0194 + 160 203451 203611 203769 203803 34
205
XF0195 + 133 203804 203937 204140 204194 54
XF0196 - - 205047 205047 204523 203769 754
XF0197 + 1285 204255 205540 206202 206202 -
XF0198 + 267 206203 206470 206634 207156 522
XF0199 - - 207521 207521 206814 206023 791
XF0200 - 95 207910 207815 207720 207677 43
XF0201 - 14 208570 208556 207957 207947 10
XF0202 + 251 208370 208621 209073 209075 2
XF0203 - - 210198 210198 209239 209108 131
XF0205 - 29 215118 215089 214163 214096 67
XF0207 + - 215580 215580 215957 215976 19
XF0209 - 282 217721 217439 217032 217032 -
XF0210 + 451 217133 217584 219047 219067 20
XF0211 + 8 219194 219202 219786 219824 38
XF0212 + - 219855 219855 220889 220892 3
XF0213 + 2 220966 220968 221762 - -
XF0214 + - - 221759 222481 222896 415
XF0215 - 132 223452 223320 223150 222970 180
XF0216 + - 223451 223451 223957 224083 126
XF0217 - 81 224385 224304 224149 223459 690
XF0218 + 138 225112 225250 225348 225491 143
XF0219 - 60 225783 225723 225511 225279 232
XF0220 + - 225879 225879 227081 227242 161
XF0221 + 11 227243 227254 229095 229100 5
XF0223 + 5 231337 231342 232496 232513 17
XF0224 + 56 232551 232607 232969 233035 66
XF0226 + 19 234881 234900 235865 236138 273
206
XF0229 + 6 238005 238011 238829 - -
XF0230 + - - 238826 239671 239696 25
XF0232 + 3 240135 240138 241646 241801 155
XF0233 + 799 242919 243718 244365 - -
XF0235 + 95 245874 245969 248647 248647 -
XF0236 + 107 248648 248755 249132 249132 -
XF0237 + 90 249133 249223 250131 250191 60
XF0238 + 41 250261 250302 250562 250563 1
XF0239 + 53 250607 250660 252819 252929 110
XF0240 - 157 253554 253397 252969 249634 3335
XF0241 + 518 252994 253512 254393 254831 438
XF0242 - 259 254950 254691 254467 254405 62
XF0243 - - - 258792 255709 255427 282
XF0244 - 52 259950 259898 258789 - -
XF0245 - 12 260121 260109 259951 259951 -
XF0247 - 134 260795 260661 260326 260287 39
XF0248 + 187 260497 260684 261076 261094 18
XF0251 + 83 262578 262661 262831 263200 369
XF0252 - - 264692 264692 262848 262752 96
XF0253 - - - 265942 264992 264766 226
XF0254 - 36 266724 266688 265939 - -
XF0255 + - 266904 266904 267965 268025 60
XF0259 - - 271988 271988 270540 270536 4
XF0260 - 428 273931 273503 272001 272001 -
XF0261 + 31 273516 273547 273747 273869 122
XF0262 - 91 274331 274240 273932 273932 -
XF0263 + 141 274417 274558 274866 274866 -
207
XF0264 + 562 274867 275429 275737 275737 -
XF0265 + 39 275810 275849 276070 276171 101
XF0268 - 198 282567 282369 281182 280953 229
XF0269 + 122 282294 282416 282526 282551 25
XF0270 - 228 283045 282817 282659 282643 16
XF0272 - 46 283896 283850 283275 283275 -
XF0273 - 75 284082 284007 283897 283897 -
XF0274 - - 285543 285543 284260 284203 57
XF0275 + 44 285612 285656 286219 286241 22
XF0276 + 263 286250 286513 287928 287928 -
XF0277 - 482 290807 290325 288196 288196 -
XF0278 + 48 290292 290340 290999 290999 -
XF0279 + 9 291094 291103 291321 291425 104
XF0281 - 19 293991 293972 292803 292801 2
XF0283 - 30 294833 294803 294369 - -
XF0284 - 28 295244 295216 294851 294844 7
XF0285 - 117 297033 296916 295471 295395 76
XF0286 - - 298080 298080 297184 297082 102
XF0287 - 1 300496 300495 298786 298639 147
XF0289 + 30 301149 301179 301478 301609 131
XF0290 - 61 304789 304728 302002 301974 28
XF0291 + 116 305049 305165 305599 - -
XF0292 + - - 305596 308256 308312 56
XF0293 + - 308408 308408 308575 308583 8
XF0296 - 39 313758 313719 312391 312318 73
XF0302 + - - 317243 317530 317578 48
XF0303 + 74 317747 317821 318570 318570 -
208
XF0304 + 41 318571 318612 319010 319057 47
XF0305 + 72 319143 319215 319622 - -
XF0306 + - - 319592 320167 320205 38
XF0309 + - - 322272 322799 322803 4
XF0312 + 29 326370 326399 327457 - -
XF0313 + - - 327458 327949 327953 4
XF0316 + 7 328925 328932 331073 331073 -
XF0317 + 21 331074 331095 332600 332625 25
XF0318 + - 332635 332635 334092 334169 77
XF0319 - 58 335567 335509 334769 334625 144
XF0320 - 132 337031 336899 335568 335568 -
XF0321 - 221 338449 338228 337032 337032 -
XF0322 + 241 338187 338428 339123 - -
XF0325 + 5 341641 341646 341960 342003 43
XF0327 - 119 343379 343260 343099 343074 25
XF0329 - 2 343991 343989 343885 343858 27
XF0330 + 129 344002 344131 344715 344715 -
XF0336 + - - 346223 346399 346448 49
XF0337 - - 346497 346497 346387 346305 82
XF0338 - - 347248 347248 346772 346722 50
XF0339 + - 347467 347467 350250 350266 16
XF0340 - 144 351283 351139 350618 350355 263
XF0341 + 24 351314 351338 351433 351446 13
XF0342 + 48 351524 351572 351760 351949 189
XF0343 - - 353268 353268 352099 352064 35
XF0344 - 76 353540 353464 353360 353315 45
XF0345 + 1419 352124 353543 353776 353776 -
209
XF0346 + 281 354014 354295 354399 354410 11
XF0347 - - 356526 356526 355141 355027 114
XF0348 - - 356994 356994 356842 356756 86
XF0349 + 364 356673 357037 357210 357210 -
XF0350 + 6 357211 357217 357312 357332 20
XF0351 - 443 358027 357584 357360 357236 124
XF0352 + 38 357786 357824 360031 360031 -
XF0355 + 74 362793 362867 363013 363040 27
XF0357 + 53 365111 365164 366327 366577 250
XF0358 + - 367442 367442 368599 368717 118
XF0359 + 78 368942 369020 369202 - -
XF0360 + - - 369172 369285 369296 11
XF0361 + - 369297 369297 370712 370847 135
XF0362 - 29 371266 371237 370914 370904 10
XF0363 + 21 371354 371375 372103 372368 265
XF0364 - - 372383 372383 372111 371351 760
XF0365 - 245 373261 373016 372813 372786 27
XF0366 - 2 374222 374220 373267 373262 5
XF0368 - - 378493 378493 375998 375697 301
XF0369 + 12 378536 378548 379726 - -
XF0373 + - - 381583 383496 383920 424
XF0375 + - - 385628 387286 387528 242
XF0376 - 140 387899 387759 387598 387571 27
XF0379 + 12 390684 390696 390869 391355 486
XF0380 - 131 391301 391170 391003 390841 162
XF0381 + - 391356 391356 393941 394022 81
XF0382 - - 394665 394665 394483 393394 1089
210
XF0383 - 114 395383 395269 394790 394666 124
XF0384 + 1314 394042 395356 397401 397454 53
XF0387 + - 399121 399121 400143 400152 9
XF0388 + 79 400282 400361 400732 400797 65
XF0389 + - 400823 400823 401506 401513 7
XF0392 + 107 404363 404470 405681 405932 251
XF0393 + 52 406028 406080 406652 406652 -
XF0394 + 26 406729 406755 406979 407060 81
XF0395 + - 407061 407061 407525 407538 13
XF0396 + - 407540 407540 407821 407892 71
XF0397 - 44 408614 408570 408157 408105 52
XF0399 - 53 409539 409486 409292 409223 69
XF0400 - 4 409977 409973 409578 409576 2
XF0401 - 257 411935 411678 409978 409978 -
XF0402 + 1064 411456 412520 412759 - -
XF0405 + 34 413779 413813 414199 415272 1073
XF0406 - 22 415272 415250 414291 413859 432
XF0407 + - 415519 415519 416688 417478 790
XF0408 - - 418505 418505 417063 417010 53
XF0409 - 307 419154 418847 418692 418506 186
XF0410 + 60 418762 418822 418986 419151 165
XF0411 + 7 419252 419259 421013 421033 20
XF0412 + 2 421057 421059 422360 422368 8
XF0413 + - 422702 422702 424072 424240 168
XF0414 + 70 424241 424311 424505 424507 2
XF0415 + - 424508 424508 424708 425631 923
XF0416 - 14 425829 425815 424760 424276 484
211
XF0419 - 101 427415 427314 426778 - -
XF0420 - - - 428205 427456 427439 17
XF0421 - 132 429131 428999 428205 - -
XF0432 - 29 443670 443641 442832 442823 9
XF0433 - 142 444542 444400 443954 443954 -
XF0434 - 76 444878 444802 444587 444587 -
XF0435 + 5 444970 444975 446021 446021 -
XF0436 + 33 446071 446104 446466 446466 -
XF0437 + 113 446467 446580 447998 447998 -
XF0438 + 139 447999 448138 448254 448455 201
XF0439 + 15 448456 448471 450693 450772 79
XF0440 + - 450905 450905 451153 451394 241
XF0441 - 267 452158 451891 451421 450961 460
XF0442 - - 453084 453084 452314 452303 11
XF0443 - 190 453480 453290 453138 453097 41
XF0444 + 160 453117 453277 453627 453686 59
XF0445 + 25 453687 453712 455406 455495 89
XF0446 + - 455556 455556 455930 456555 625
XF0447 - 82 456551 456469 456269 454258 2011
XF0448 + 55 456580 456635 456742 456908 166
XF0449 + - 457038 457038 457388 457479 91
XF0450 - 60 458430 458370 457972 457947 25
XF0451 - 4152 463694 459542 458451 458451 -
XF0452 + 516 459086 459602 460741 - -
XF0454 + 78 461602 461680 461946 461949 3
XF0455 + 121 461988 462109 463431 464104 673
XF0456 - 34 463947 463913 463737 463736 1
212
XF0457 - 22 464974 464952 463948 463948 -
XF0458 + 18 466464 466482 466907 466917 10
XF0460 + 55 468139 468194 468934 468940 6
XF0462 + 10 469577 469587 469808 469817 9
XF0463 + 51 469818 469869 470525 470525 -
XF0464 + 12 470526 470538 471761 471786 25
XF0465 + - 471787 471787 473184 473231 47
XF0466 - - - 474556 473417 473063 354
XF0467 - 29 474710 474681 474553 - -
XF0468 - - 475120 475120 474935 474864 71
XF0469 - 166 475622 475456 475196 475196 -
XF0471 + 6 477152 477158 477286 477294 8
XF0472 + 25 477541 477566 478915 479060 145
XF0478 + - - 481950 486368 486382 14
XF0479 + - 486443 486443 486820 486924 104
XF0480 - - - 488229 487057 486935 122
XF0486 - 17 490789 490772 490161 - -
XF0487 - 102 491506 491404 490847 490810 37
XF0488 - - 491782 491782 491516 491509 7
XF0494 + - 494079 494079 494432 494439 7
XF0495 + - 494469 494469 494771 494854 83
XF0496 + 6 495051 495057 496232 - -
XF0497 + - - 496232 496699 496858 159
XF0499 - 36 497605 497569 497039 496941 98
XF0530 + - 525069 525069 525194 525227 33
XF0531 + 16 525323 525339 526343 527329 986
XF0532 - - - 527065 526772 526306 466
213
XF0533 - 71 527407 527336 527049 - -
XF0534 - 145 528108 527963 527619 527613 6
XF0535 + 22 528629 528651 528965 529094 129
XF0539 - 594 532354 531760 531197 - -
XF0543 + - 533197 533197 533865 533910 45
XF0544 - - 534044 534044 533877 533785 92
XF0545 + 43 533977 534020 534202 534312 110
XF0546 + 20 534337 534357 534557 534571 14
XF0550 - 335 541106 540771 537646 537628 18
XF0551 + 420 540413 540833 541027 541105 78
XF0552 - - 542110 542110 541289 541154 135
XF0553 + 6 542186 542192 543922 543922 -
XF0555 + 133 544292 544425 544607 - -
XF0556 + - - 544600 545625 546316 691
XF0557 - - 546302 546302 545847 545604 243
XF0561 + 21 548195 548216 549112 549311 199
XF0562 - - - 549920 549180 548500 680
XF0563 - 11 550350 550339 549917 - -
XF0564 - 74 550646 550572 550357 550351 6
XF0565 - 46 551598 551552 550647 550647 -
XF0566 + 1402 550272 551674 552687 552777 90
XF0567 - - 553787 553787 553023 553015 8
XF0568 - 38 554801 554763 553855 553788 67
XF0570 + 102 555996 556098 556328 556451 123
XF0571 - 24 556563 556539 556369 555996 373
XF0575 + - - 558092 558442 560251 1809
XF0577 + 24 560692 560716 560865 560885 20
214
XF0578 + 14 560886 560900 561037 561037 -
XF0579 + 16 561093 561109 561330 561339 9
XF0580 + - 561340 561340 561993 561999 6
XF0581 + 65 562024 562089 562298 562323 25
XF0582 + 12 562324 562336 562527 562650 123
XF0583 - - 563249 563249 562566 562244 322
XF0584 - 9 564119 564110 563253 563251 2
XF0587 - - 566212 566212 565157 565156 1
XF0593 + 240 571496 571736 572065 572746 681
XF0594 - 4 573749 573745 572810 572724 86
XF0596 - - 575208 575208 574684 574660 24
XF0597 - - 575890 575890 575234 575209 25
XF0598 - 43 576635 576592 575900 575891 9
XF0600 + 4 579285 579289 579699 - -
XF0601 + - - 579699 580592 580706 114
XF0602 + 164 580758 580922 581143 581143 -
XF0603 + 133 581144 581277 582647 582736 89
XF0604 - 1843 584704 582861 582700 581760 940
XF0605 + - 582883 582883 583023 583159 136
XF0608 + - - 584709 587258 587268 10
XF0609 + 46 587304 587350 588390 588419 29
XF0610 + - 588420 588420 589307 589315 8
XF0611 + 22 589316 589338 590327 590329 2
XF0612 + - 590330 590330 591283 591301 18
XF0613 + 35 591648 591683 592276 - -
XF0614 + - - 592267 594354 594541 187
XF0615 - - 596278 596278 594635 594616 19
215
XF0616 - 247 596923 596676 596389 596279 110
XF0617 + 2114 594692 596806 597006 597006 -
XF0618 + 81 597010 597091 597183 597188 5
XF0620 + - - 597627 599903 600334 431
XF0621 - - - 600892 600068 599175 893
XF0623 + 149 601690 601839 602171 602384 213
XF0624 + 64 602495 602559 603407 603508 101
XF0625 - - 603668 603668 603402 603344 58
XF0627 - 202 604918 604716 604465 604465 -
XF0629 - - 606406 606406 605696 605691 5
XF0630 - 50 606947 606897 606421 606407 14
XF0632 + 24 608573 608597 608941 608941 -
XF0641 - 65 615885 615820 614678 - -
XF0642 + 658 615626 616284 616469 616469 -
XF0643 - - 616708 616708 616520 616487 33
XF0644 - 2 617612 617610 616918 616714 204
XF0645 + 630 617183 617813 617935 618016 81
XF0646 + 30 618141 618171 618602 618628 26
XF0648 + 119 619286 619405 619626 619627 1
XF0649 - - 620279 620279 619605 619001 604
XF0650 + 32 620281 620313 620429 620681 252
XF0651 - - 622017 622017 620725 620696 29
XF0653 + - 622544 622544 623182 623227 45
XF0654 + - 623228 623228 624094 624326 232
XF0655 - 50 624738 624688 624428 624401 27
XF0656 - 15 626161 626146 624833 624804 29
XF0667 + 157 633578 633735 634160 - -
216
XF0668 + - - 634160 637783 637810 27
XF0669 - 31 640911 640880 638190 637894 296
XF0671 + 6 642415 642421 643164 643310 146
XF0673 + 157 643569 643726 644961 644975 14
XF0674 + 76 645102 645178 646536 646536 -
XF0675 + 96 646554 646650 647702 647708 6
XF0677 + - - 648688 649044 649103 59
XF0678 - - 650278 650278 649115 647860 1255
XF0683 - 1 655042 655041 652861 - -
XF0687 - 110 658801 658691 658467 - -
XF0695 + 113 661168 661281 661541 661541 -
XF0696 - 66 662447 662381 661716 661692 24
XF0697 + 3 662443 662446 662670 662751 81
XF0698 - - - 663065 662844 662834 10
XF0700 - - 663829 663829 663335 663285 50
XF0701 + 141 663704 663845 663997 - -
XF0702 + - - 663994 664242 664319 77
XF0703 - 65 664739 664674 664312 663830 482
XF0704 + 205 664653 664858 665490 665601 111
XF0705 + 12 665612 665624 668161 668560 399
XF0706 + - 668704 668704 668901 668937 36
XF0707 + 3 669675 669678 670172 670174 2
XF0709 + - - 670466 670945 671065 120
XF0719 + - - 679473 680060 680576 516
XF0720 - - 680340 680340 680065 679934 131
XF0721 - - 680668 680668 680351 680341 10
XF0729 + 2 685973 685975 686262 686284 22
217
XF0735 - 355 691648 691293 690919 690538 381
XF0736 + 167 691300 691467 693374 693374 -
XF0737 + 115 693375 693490 693969 694153 184
XF0739 + - - 694230 694427 694428 1
XF0740 + 9 694429 694438 694797 694882 85
XF0741 + 146 694923 695069 696070 696153 83
XF0742 + - 696154 696154 698532 698551 19
XF0743 + 4 698552 698556 698855 - -
XF0744 + - - 698830 699192 699234 42
XF0745 + 45 699399 699444 699563 699605 42
XF0746 + - 699868 699868 700143 700365 222
XF0749 - 8 703140 703132 702728 702716 12
XF0750 - 53 703410 703357 703259 703243 16
XF0751 - 10 704509 704499 703411 703411 -
XF0753 - 22 706690 706668 706483 706472 11
XF0754 + 98 706452 706550 707407 707618 211
XF0755 - 5 708812 708807 707473 706894 579
XF0757 + 206 709051 709257 710747 - -
XF0758 + - - 710744 711232 711290 58
XF0759 + - 711291 711291 712910 712986 76
XF0760 + 3 713043 713046 714905 714905 -
XF0761 + 39 714911 714950 715867 716710 843
XF0762 - 17 716728 716711 716136 715941 195
XF0763 - 31 717112 717081 716788 716788 -
XF0769 - - 721856 721856 720966 720541 425
XF0770 - - 722283 722283 721873 721857 16
XF0773 - 126 723647 723521 723417 723417 -
218
XF0774 + 241 723295 723536 723823 - -
XF0775 + - - 723820 724800 724917 117
XF0778 - 666 731492 730826 728706 728614 92
XF0779 + 11 730795 730806 731462 731462 -
XF0780 + 150 731463 731613 731855 731855 -
XF0781 - - 734041 734041 732248 732237 11
XF0782 + 11 734145 734156 734383 734383 -
XF0783 + 3 734396 734399 735226 - -
XF0784 + - - 735223 735957 735970 13
XF0789 + - 739092 739092 739604 739610 6
XF0798 + 55 749033 749088 750521 750521 -
XF0799 + 2 750522 750524 751486 751486 -
XF0801 + - - 752426 753661 753830 169
XF0802 + - 753831 753831 755066 755438 372
XF0803 + - 755439 755439 756353 756729 376
XF0804 - 88 756873 756785 756513 754914 1599
XF0805 + 138 756828 756966 757925 757968 43
XF0806 + 12 758061 758073 760817 - -
XF0807 + - - 760796 760963 760977 14
XF0808 + 235 761179 761414 761548 761557 9
XF0809 - 328 762042 761714 761538 758032 3506
XF0810 + 40 761673 761713 763410 763505 95
XF0811 - 181 764731 764550 763690 763690 -
XF0812 + 84 764533 764617 764757 764863 106
XF0814 + 176 765595 765771 765923 765964 41
XF0815 + - 765965 765965 766126 769071 2945
XF0816 - - 769224 769224 766252 766219 33
219
XF0817 + 17 769255 769272 769448 769578 130
XF0818 - - 771418 771418 769640 769225 415
XF0819 - 164 771970 771806 771651 771623 28
XF0820 + - 771718 771718 773376 773385 9
XF0821 - - 774064 774064 773555 773534 21
XF0822 - - 775484 775484 774081 774065 16
XF0823 + 3 776089 776092 777267 777273 6
XF0824 + 8 777677 777685 779151 779151 -
XF0826 + 8 779860 779868 780872 781002 130
XF0827 - 176 782025 781849 781043 781022 21
XF0828 + 446 781602 782048 782629 782629 -
XF0829 + 44 782630 782674 782901 783011 110
XF0830 - 10 783384 783374 782958 782602 356
XF0834 - - - 788361 787165 786875 290
XF0835 - 45 789596 789551 788343 - -
XF0836 - - 790009 790009 789746 789614 132
XF0838 + - - 792417 793811 793814 3
XF0851 + 7 811602 811609 812916 - -
XF0853 + 373 814087 814460 815959 816234 275
XF0854 + - 816235 816235 816444 817337 893
XF0855 - - - 817850 817122 816601 521
XF0857 - - - 819164 818487 818483 4
XF0858 - 101 820050 819949 819161 - -
XF0859 + 78 819890 819968 820216 820244 28
XF0860 - 643 821560 820917 820210 820109 101
XF0861 + 242 820970 821212 821478 821667 189
XF0867 + 15 826338 826353 826691 826858 167
220
XF0868 - 45 828948 828903 827092 826606 486
XF0869 - 31 830635 830604 828949 828949 -
XF0871 + 165 831074 831239 831463 831468 5
XF0872 + 105 831489 831594 832139 832167 28
XF0873 - 37 833067 833030 832245 832220 25
XF0874 - - - 833831 833124 833068 56
XF0876 - - 835558 835558 835250 835246 4
XF0877 + 231 835588 835819 836133 - -
XF0880 + - 838143 838143 838805 838833 28
XF0881 + - 838834 838834 839442 839492 50
XF0882 - - 841802 841802 839676 839324 352
XF0883 - - - 842380 841823 841813 10
XF0884 - 3 844806 844803 842377 - -
XF0885 + - 845057 845057 846181 846202 21
XF0890 + - 859344 859344 860192 860259 67
XF0894 + 3 862798 862801 863649 863649 -
XF0895 + 4 863866 863870 864721 864803 82
XF0898 - 3 867220 867217 866864 866858 6
XF0899 - 126 867535 867409 867221 867221 -
XF0904 - 54 873127 873073 872090 872090 -
XF0905 - 10 873403 873393 873199 873152 47
XF0907 + - 875047 875047 875940 875986 46
XF0910 + - - 877970 878731 878872 141
XF0911 + - 878873 878873 879508 879538 30
XF0913 + 10 879980 879990 880775 880823 48
XF0914 + - 880998 880998 881423 881484 61
XF0915 + 3 881583 881586 881918 881925 7
221
XF0916 + 33 881926 881959 882204 - -
XF0919 - 113 884245 884132 883569 883311 258
XF0921 + 79 886820 886899 887117 887138 21
XF0922 + 151 887328 887479 887652 888278 626
XF0923 - 27 888201 888174 887701 887021 680
XF0924 - 6 889389 889383 888220 888220 -
XF0926 + 19 890730 890749 891261 891261 -
XF0927 + 105 891262 891367 892290 892291 1
XF0928 + 19 892292 892311 893576 893614 38
XF0930 + 219 895331 895550 895846 895859 13
XF0931 - 183 896240 896057 895887 895886 1
XF0933 + - - 896526 898379 898382 3
XF0935 + 15 898684 898699 899634 - -
XF0937 - - - 901121 900732 900485 247
XF0938 - 1117 903132 902015 901122 - -
XF0939 + 8 902095 902103 903098 903099 1
XF0944 - - 908895 908895 907231 907229 2
XF0945 - 176 909449 909273 909058 909052 6
XF0947 + 128 910831 910959 911456 911483 27
XF0949 + 3 912133 912136 912393 912454 61
XF0950 + - 912455 912455 913549 913593 44
XF0951 - 1091 915112 914021 913782 913782 -
XF0952 + 165 913971 914136 914738 - -
XF0953 + - - 914735 915868 915888 20
XF0954 + 9 915889 915898 916362 - -
XF0955 + - - 916359 916832 916917 85
XF0956 + 5 916918 916923 917897 918163 266
222
XF0957 + 251 918356 918607 918831 918836 5
XF0958 + 54 918887 918941 919222 919268 46
XF0959 - 35 919832 919797 919201 918340 861
XF0960 - - 920601 920601 919858 919833 25
XF0961 - 34 921179 921145 920666 920666 -
XF0962 - - 921818 921818 921192 921182 10
XF0963 + 19 921901 921920 922828 - -
XF0964 + - - 922818 923354 923376 22
XF0965 + 80 923420 923500 923631 924122 491
XF0966 - 30 924407 924377 923820 921878 1942
XF0967 + - 924533 924533 926542 926572 30
XF0968 - - 927659 927659 926826 926625 201
XF0972 + - 928656 928656 929288 929420 132
XF0973 - - 930962 930962 929325 928584 741
XF0975 - 79 932982 932903 931734 931669 65
XF0976 + 4 933074 933078 934550 934685 135
XF0977 + - 934718 934718 937012 937015 3
XF0978 - - 939156 939156 937243 937236 7
XF0979 + 43 939288 939331 939957 - -
XF0980 + - - 939954 940442 940448 6
XF0981 + 1 940500 940501 940983 - -
XF0982 + - - 940961 941155 941175 20
XF0984 + - - 941436 943247 943519 272
XF0985 - 325 944219 943894 943733 943718 15
XF0986 + 243 943752 943995 945779 945936 157
XF0987 - - - 946736 945879 944632 1247
XF0989 - 83 948428 948345 948082 - -
223
XF0990 - 611 949605 948994 948809 948463 346
XF0991 + 47 948406 948453 949397 949397 -
XF0992 + 23 949602 949625 950608 950608 -
XF0993 - - - 952048 950792 949856 936
XF0994 - 15 952500 952485 952045 - -
XF0995 - 420 954414 953994 952570 952501 69
XF0996 + 66 954075 954141 954668 954668 -
XF0997 + - 954674 954674 954958 955006 48
XF0998 + 14 955043 955057 956067 956072 5
XF1001 + 10 958523 958533 959849 959849 -
XF1010 + 10 967322 967332 967841 967841 -
XF1014 + 225 973718 973943 974125 974125 -
XF1015 + 1 974126 974127 975545 975558 13
XF1016 + 2 975559 975561 975725 975758 33
XF1017 - - 975876 975876 975703 975536 167
XF1018 - - 976807 976807 976043 975961 82
XF1020 - 3 977723 977720 977229 977229 -
XF1022 - 128 978923 978795 978685 978676 9
XF1024 - 14 979821 979807 979490 979468 22
XF1025 - 2833 983998 981165 980782 980161 621
XF1026 + 5 980862 980867 983875 983881 6
XF1027 - 18 984384 984366 984121 984022 99
XF1028 - 39 984926 984887 984687 984492 195
XF1029 - 26 987136 987110 985119 985119 -
XF1030 + - 987384 987384 987557 987559 2
XF1031 - 21 990380 990359 987747 987714 33
XF1032 - 57 991239 991182 990976 990951 25
224
XF1033 + 108 991256 991364 991549 - -
XF1034 + - - 991519 991734 991853 119
XF1035 + - 991854 991854 992156 992167 11
XF1036 + 11 992240 992251 995277 995656 379
XF1037 - - 996825 996825 995383 992812 2571
XF1038 + 348 997421 997769 999280 999290 10
XF1041 - - 1000783 1000783 1000079 1000029 50
XF1042 - 43 1002040 1001997 1000840 1000840 -
XF1043 - 20 1002885 1002865 1002074 1002074 -
XF1045 - 21 1004451 1004430 1003366 - -
XF1046 - - 1006931 1006931 1004577 1004548 29
XF1047 - 56 1008390 1008334 1007030 1006932 98
XF1049 - - - 1010438 1009584 1009582 2
XF1051 - - 1011762 1011762 1011205 1011203 2
XF1052 - 36 1012202 1012166 1011927 1011763 164
XF1053 - - 1013856 1013856 1012513 1012267 246
XF1054 + 184 1013885 1014069 1014767 1014819 52
XF1055 + 48 1014831 1014879 1015199 1015359 160
XF1056 - 221 1015999 1015778 1015455 1015410 45
XF1057 + 29 1016049 1016078 1016380 1017133 753
XF1058 - 207 1017359 1017152 1016409 1016017 392
XF1059 + - 1017134 1017134 1017292 1017308 16
XF1060 - 31 1017782 1017751 1017524 1017360 164
XF1061 - - 1019186 1019186 1018527 1018339 188
XF1063 - - - 1022035 1021316 1021310 6
XF1067 + 36 1024769 1024805 1025899 1025922 23
XF1068 - 3450 1030411 1026961 1026044 1025411 633
225
XF1069 + 207 1026950 1027157 1027375 1027375 -
XF1070 + 24 1027376 1027400 1027828 - -
XF1072 + 7 1028209 1028216 1030006 1030006 -
XF1073 + 20 1030007 1030027 1030812 1030812 -
XF1074 + 75 1030813 1030888 1031181 1031181 -
XF1075 + 19 1031182 1031201 1031584 1031599 15
XF1076 + - 1031610 1031610 1032851 1032866 15
XF1077 + - 1032883 1032883 1033566 1033642 76
XF1080 + 4 1037040 1037044 1037481 - -
XF1082 + - - 1039244 1040263 1040663 400
XF1083 - 5 1040668 1040663 1040487 1040011 476
XF1084 + 130 1040779 1040909 1041550 1041550 -
XF1085 + 16 1041551 1041567 1042046 1042046 -
XF1086 + 19 1042047 1042066 1042638 - -
XF1087 + - - 1042635 1044593 1044604 11
XF1090 - - 1046010 1046010 1045600 1045588 12
XF1093 - 14 1047804 1047790 1047305 1047125 180
XF1094 - - 1048632 1048632 1048033 1047902 131
XF1098 + 32 1050411 1050443 1050562 1050608 46
XF1099 - - 1051154 1051154 1050579 1050327 252
XF1100 + 256 1051294 1051550 1051771 1051859 88
XF1101 + 3 1052094 1052097 1052255 1052552 297
XF1102 - - 1052826 1052826 1052533 1052079 454
XF1103 + - 1052911 1052911 1055682 1055740 58
XF1106 + 97 1057139 1057236 1058360 1058360 -
XF1107 + 77 1058484 1058561 1061803 1061811 8
XF1109 + 46 1062277 1062323 1063204 1063240 36
226
XF1110 + 29 1063241 1063270 1065015 1065167 152
XF1111 + 101 1065680 1065781 1066797 1066803 6
XF1112 + - 1066981 1066981 1068501 1068546 45
XF1113 + 37 1068596 1068633 1069793 1069798 5
XF1114 + 7 1069935 1069942 1071930 1071954 24
XF1115 - 1072 1073897 1072825 1071953 1071244 709
XF1116 + 111 1072995 1073106 1075712 - -
XF1118 + - - 1077145 1078551 1078797 246
XF1119 - 96 1079611 1079515 1079129 1079124 5
XF1121 - 17 1081426 1081409 1080582 1080582 -
XF1122 + 1 1081690 1081691 1081831 1082640 809
XF1123 - 25 1082653 1082628 1081900 1081763 137
XF1125 + - - 1083317 1084810 1084957 147
XF1128 + 18 1090367 1090385 1090504 1090504 -
XF1129 + 46 1090505 1090551 1090715 1090715 -
XF1130 - 53 1091425 1091372 1090815 1090784 31
XF1131 + 259 1091254 1091513 1092799 1092803 4
XF1132 - 70 1093861 1093791 1092886 1092488 398
XF1133 + 74 1093932 1094006 1094575 1094575 -
XF1134 + 26 1094576 1094602 1094778 - -
XF1136 + 85 1094909 1094994 1096052 1096056 4
XF1137 + - 1096057 1096057 1096746 1096806 60
XF1138 + 16 1097194 1097210 1097428 1097492 64
XF1139 - 26 1097843 1097817 1097518 1093869 3649
XF1140 - - 1099595 1099595 1098222 1098046 176
XF1141 - 19 1100569 1100550 1099975 1099949 26
XF1142 - - 1101228 1101228 1100797 1100570 227
227
XF1143 - 82 1102780 1102698 1101298 1101229 69
XF1145 - 49 1105334 1105285 1103738 1103645 93
XF1147 - 1 1106337 1106336 1105866 1105863 3
XF1148 - 1 1106763 1106762 1106457 1106342 115
XF1149 - - 1107623 1107623 1106826 1106764 62
XF1150 - 462 1108486 1108024 1107653 1107629 24
XF1151 + 854 1108507 1109361 1109672 1109672 -
XF1152 + 27 1109675 1109702 1110334 1110348 14
XF1154 + - - 1110945 1111256 1111257 1
XF1155 + 7 1111261 1111268 1112095 1112095 -
XF1156 + 7 1112096 1112103 1112372 1112384 12
XF1157 + - 1112385 1112385 1112720 1112737 17
XF1158 + 1 1112738 1112739 1113458 1113458 -
XF1159 + 5 1113459 1113464 1113877 - -
XF1162 + 23 1114341 1114364 1114732 1114732 -
XF1163 + 15 1114733 1114748 1115065 1115065 -
XF1164 + 11 1115066 1115077 1115616 1115616 -
XF1165 + 16 1115617 1115633 1115938 1115938 -
XF1166 + 19 1116078 1116097 1116495 1116503 8
XF1167 + 6 1116504 1116510 1117037 1117037 -
XF1168 + 87 1117038 1117125 1117484 1117491 7
XF1169 + 5 1117655 1117660 1118199 1118199 -
XF1170 + 19 1118200 1118219 1118380 - -
XF1171 + - - 1118381 1118830 1118839 9
XF1172 + - 1118840 1118840 1120213 1120275 62
XF1173 + 51 1120292 1120343 1120699 1120701 2
XF1174 + 13 1120702 1120715 1121107 1121110 3
228
XF1175 + 11 1121111 1121122 1121748 1121802 54
XF1177 + 10 1122921 1122931 1123311 1123459 148
XF1178 + - 1124306 1124306 1124626 1124636 10
XF1179 + - 1124637 1124637 1126157 1126252 95
XF1182 + - - 1129813 1130865 1131311 446
XF1183 + - 1131441 1131441 1132742 1133137 395
XF1184 - 113 1133727 1133614 1133510 1133236 274
XF1185 - 122 1134461 1134339 1133878 1133762 116
XF1186 + 127 1136120 1136247 1137542 1137676 134
XF1187 + - 1137677 1137677 1138303 1138398 95
XF1188 + 32 1138399 1138431 1139711 1139711 -
XF1189 + 77 1139712 1139789 1142335 1142335 -
XF1190 + 220 1142336 1142556 1142840 1142841 1
XF1191 + 61 1143374 1143435 1145402 1145438 36
XF1192 + 601 1146051 1146652 1147677 1147677 -
XF1193 - 400 1148262 1147862 1147719 1147462 257
XF1194 + 256 1147725 1147981 1148190 1148266 76
XF1196 + 66 1148810 1148876 1151368 1151368 -
XF1197 + 77 1151369 1151446 1152486 1152497 11
XF1199 + - - 1152952 1153278 1153367 89
XF1201 + - - 1154406 1155086 1155169 83
XF1202 + - 1155269 1155269 1155481 1156828 1347
XF1203 - - 1155857 1155857 1155591 1155075 516
XF1204 - 55 1156549 1156494 1155937 1155895 42
XF1205 - 1131 1158046 1156915 1156550 1156550 -
XF1206 + 153 1156933 1157086 1157322 1157322 -
XF1207 + 13 1157323 1157336 1157500 - -
229
XF1208 + - - 1157501 1157650 1157662 12
XF1210 + 7 1159452 1159459 1160076 1160853 777
XF1211 - - 1161254 1161254 1160247 1159038 1209
XF1212 - 27 1161889 1161862 1161368 1161353 15
XF1213 + 140 1161962 1162102 1163931 1163946 15
XF1214 + 214 1163947 1164161 1164436 1164455 19
XF1215 + 195 1164506 1164701 1164877 1164983 106
XF1216 + - 1165068 1165068 1166330 1166555 225
XF1217 + - 1166556 1166556 1166810 1166850 40
XF1218 + 107 1166859 1166966 1167265 1167265 -
XF1219 + 122 1167378 1167500 1167739 1168133 394
XF1220 + 184 1168218 1168402 1170525 1170558 33
XF1221 + 9 1170662 1170671 1170970 1171171 201
XF1222 - - 1171819 1171819 1171040 1170473 567
XF1223 - 12 1172843 1172831 1171899 1171893 6
XF1224 + 20 1173700 1173720 1177373 1177396 23
XF1226 - - 1178263 1178263 1177772 1177525 247
XF1227 + 109 1178469 1178578 1178739 1178966 227
XF1228 - 259 1179821 1179562 1179173 1178977 196
XF1230 - 75 1183373 1183298 1182810 1182331 479
XF1231 + 5 1183586 1183591 1185444 - -
XF1232 + - - 1185441 1189262 1189369 107
XF1233 - 19 1189503 1189484 1189365 1189113 252
XF1234 + - 1190039 1190039 1190935 1191329 394
XF1236 + 123 1191986 1192109 1192426 1192446 20
XF1240 - - 1194136 1194136 1193891 1193854 37
XF1242 + - 1197439 1197439 1197609 1197639 30
230
XF1250 + 2 1203096 1203098 1203979 1204128 149
XF1251 - 32 1204351 1204319 1204131 1203129 1002
XF1252 + 13 1204461 1204474 1209399 1209457 58
XF1253 - - 1210482 1210482 1209505 1209467 38
XF1254 + - 1210746 1210746 1211600 1211616 16
XF1255 - 434 1212484 1212050 1211775 1211743 32
XF1257 + 57 1212432 1212489 1213070 1213080 10
XF1258 - - - 1214205 1213288 1213196 92
XF1259 - 11 1216592 1216581 1214206 - -
XF1261 + 81 1217568 1217649 1218134 1218148 14
XF1262 + - 1218184 1218184 1218690 1218822 132
XF1264 - - - 1220796 1219168 1219167 1
XF1265 - 19 1221659 1221640 1220711 - -
XF1266 + 8 1222043 1222051 1222161 1222230 69
XF1269 - 36 1226851 1226815 1225694 1225683 11
XF1271 - 32 1227839 1227807 1227529 - -
XF1272 - 10 1228783 1228773 1227973 1227944 29
XF1273 - 11 1229073 1229062 1228784 1228784 -
XF1274 - 508 1229824 1229316 1229074 1229074 -
XF1275 + 19 1229269 1229288 1229809 1229816 7
XF1276 - 584 1230561 1229977 1229825 1229825 -
XF1277 + - 1229990 1229990 1230190 1230299 109
XF1281 + 78 1234372 1234450 1234653 1234818 165
XF1282 - - 1236284 1236284 1234773 1234245 528
XF1284 + - - 1236503 1236661 1237530 869
XF1285 - 101 1237014 1236913 1236743 1236735 8
XF1287 + - 1238943 1238943 1239383 1239393 10
231
XF1289 + 65 1241303 1241368 1242198 1242325 127
XF1290 + 5 1242361 1242366 1242530 1242532 2
XF1291 + - 1242553 1242553 1243938 1243941 3
XF1294 + - 1245011 1245011 1245517 1246577 1060
XF1295 - 32 1246334 1246302 1245760 1245704 56
XF1298 - 99 1249704 1249605 1247959 1247800 159
XF1299 + 30 1249665 1249695 1250297 1250781 484
XF1300 - - - 1251133 1250492 1250375 117
XF1301 - 1 1252057 1252056 1251130 - -
XF1303 - 487 1254573 1254086 1252896 - -
XF1304 + 39 1254085 1254124 1255386 1255565 179
XF1306 + 18 1255822 1255840 1256040 1256729 689
XF1307 - 442 1256737 1256295 1256059 1255626 433
XF1308 + - 1258417 1258417 1258704 1258826 122
XF1309 + - 1258846 1258846 1259955 1260096 141
XF1310 + 56 1260097 1260153 1261103 - -
XF1314 + 89 1264778 1264867 1265910 1265922 12
XF1315 + 447 1265923 1266370 1266546 1266614 68
XF1316 + - 1266639 1266639 1268795 1268806 11
XF1318 + - - 1268973 1270376 1270569 193
XF1319 - 2 1271406 1271404 1270898 1270602 296
XF1321 - - 1272533 1272533 1271724 1271722 2
XF1322 - 15 1273301 1273286 1272570 1272545 25
XF1323 - 1745 1275625 1273880 1273302 1273302 -
XF1324 + 932 1273351 1274283 1275470 1275478 8
XF1325 + 116 1275482 1275598 1275816 1275819 3
XF1326 + 48 1275820 1275868 1276518 1276604 86
232
XF1327 - - 1277430 1277430 1276861 1276630 231
XF1328 - - 1278014 1278014 1277448 1277433 15
XF1329 - - 1278731 1278731 1278027 1278015 12
XF1331 - 45 1283185 1283140 1283039 1282502 537
XF1332 - 18 1284268 1284250 1283186 1283186 -
XF1337 + - 1286542 1286542 1287168 1287411 243
XF1338 - - 1289156 1289156 1287414 1287134 280
XF1344 + 1 1291348 1291349 1292368 1292371 3
XF1347 + 13 1294189 1294202 1295248 1295716 468
XF1348 - 27 1296447 1296420 1295470 1295386 84
XF1349 - 18 1296591 1296573 1296448 1296448 -
XF1350 + 5 1296784 1296789 1298645 1298645 -
XF1351 - 62 1298847 1298785 1298657 1296827 1830
XF1352 + 29 1298959 1298988 1299161 1299650 489
XF1354 + 3 1301817 1301820 1302257 1302377 120
XF1356 - 14 1303826 1303812 1303045 1303045 -
XF1359 + 30 1305695 1305725 1306888 - -
XF1360 + - - 1306885 1307796 1307890 94
XF1361 + 216 1308249 1308465 1309304 1309713 409
XF1362 - 12 1310923 1310911 1309661 1308433 1228
XF1364 - 47 1313328 1313281 1313126 - -
XF1365 - - - 1314563 1313682 1313562 120
XF1367 - 46 1315116 1315070 1314918 - -
XF1368 + 1 1315139 1315140 1316066 1316071 5
XF1370 + 18 1317263 1317281 1317439 1317472 33
XF1371 + - 1317583 1317583 1318617 1318637 20
XF1372 + 17 1318638 1318655 1320571 1320571 -
233
XF1373 + 41 1320572 1320613 1321386 - -
XF1374 + - - 1321356 1322045 1322140 95
XF1376 + 125 1323764 1323889 1324695 1324699 4
XF1377 + - 1324700 1324700 1324933 1325208 275
XF1378 - 6 1326324 1326318 1324927 1322628 2299
XF1379 + 26 1326490 1326516 1327481 1328166 685
XF1380 - - 1328158 1328158 1327682 1327377 305
XF1382 - 70 1330923 1330853 1330263 1330219 44
XF1383 + 661 1330237 1330898 1335298 1335816 518
XF1384 - 1201 1338053 1336852 1335311 1335228 83
XF1385 + 408 1336818 1337226 1340207 1340273 66
XF1386 + - 1340274 1340274 1340420 1340494 74
XF1387 - - - 1340914 1340573 1340571 2
XF1389 - - - 1343546 1341528 1341523 5
XF1390 - 91 1344569 1344478 1343519 - -
XF1391 - 3 1345943 1345940 1344942 1344604 338
XF1392 + 34 1346155 1346189 1346683 1346786 103
XF1397 + - 1348297 1348297 1349208 1349219 11
XF1398 + 31 1349464 1349495 1350715 1350715 -
XF1400 - 91 1351848 1351757 1351542 1351540 2
XF1401 - 139 1352928 1352789 1351956 1351925 31
XF1405 - - - 1356657 1355785 1355713 72
XF1406 - 109 1357713 1357604 1356654 - -
XF1407 - 20 1358240 1358220 1357870 1357715 155
XF1408 - - 1359666 1359666 1358278 1358271 7
XF1409 - - - 1360430 1359708 1359667 41
XF1413 - 20 1363091 1363071 1362070 1362070 -
234
XF1414 + 8 1363125 1363133 1363360 1363429 69
XF1416 + - - 1364704 1365006 1365113 107
XF1417 - 36 1365350 1365314 1365072 1365027 45
XF1418 - - 1365780 1365780 1365385 1365351 34
XF1420 + - - 1366827 1367027 1367033 6
XF1421 + - 1367034 1367034 1367222 1367759 537
XF1422 - - - 1367562 1367323 1367266 57
XF1423 - 5 1371536 1371531 1367563 - -
XF1429 + 327 1377353 1377680 1377838 1378529 691
XF1430 - - - 1378619 1377930 1377801 129
XF1433 + 37 1378963 1379000 1379095 1379206 111
XF1435 + 133 1380704 1380837 1380989 1381049 60
XF1436 + - 1381050 1381050 1381697 1381804 107
XF1437 + - 1381805 1381805 1382587 1382632 45
XF1438 + - 1382633 1382633 1383370 1383437 67
XF1439 - - - 1384093 1383479 1383351 128
XF1442 + 344 1385514 1385858 1386178 1386178 -
XF1443 + 130 1386181 1386311 1388587 1389170 583
XF1444 - 13 1388860 1388847 1388638 1388370 268
XF1445 - 32 1389170 1389138 1388920 1388919 1
XF1447 - 1 1391126 1391125 1389998 1389998 -
XF1448 - 681 1393208 1392527 1391562 1391357 205
XF1449 + 105 1392571 1392676 1392780 1392793 13
XF1450 + - 1392794 1392794 1395148 1395168 20
XF1451 + 2 1395331 1395333 1397243 1397286 43
XF1452 + 28 1397777 1397805 1398431 1398438 7
XF1453 + 28 1398528 1398556 1399923 1399939 16
235
XF1454 + 6 1399944 1399950 1400495 1400858 363
XF1456 + 15 1402645 1402660 1403289 1403300 11
XF1457 - 3 1404040 1404037 1403300 1402356 944
XF1458 + 21 1404103 1404124 1405308 - -
XF1459 + - - 1405296 1405712 1405721 9
XF1460 - - 1406751 1406751 1405732 1404856 876
XF1461 + 57 1407043 1407100 1407363 1407363 -
XF1466 - 816 1413117 1412301 1412152 1412136 16
XF1467 + 359 1412136 1412495 1413391 - -
XF1468 + - - 1413388 1414734 1414787 53
XF1469 - - - 1415672 1414818 1414797 21
XF1470 - 415 1417214 1416799 1415669 - -
XF1471 + 322 1416745 1417067 1417222 1417222 -
XF1478 + 57 1423322 1423379 1423798 1423798 -
XF1480 + - - 1426722 1427030 1427039 9
XF1483 + 23 1428563 1428586 1429470 1429740 270
XF1484 + 204 1429856 1430060 1430611 1430659 48
XF1485 + - 1430680 1430680 1432059 1432727 668
XF1486 - 582 1434212 1433630 1432275 1432242 33
XF1487 + 431 1433507 1433938 1434699 1434858 159
XF1488 + 37 1434869 1434906 1436921 1436921 -
XF1489 + 523 1436922 1437445 1438086 1438147 61
XF1490 - 35 1438876 1438841 1438362 1438316 46
XF1492 - 46 1440010 1439964 1439752 1439752 -
XF1493 + 75 1440371 1440446 1440862 1441385 523
XF1494 - 51 1443090 1443039 1442152 1441650 502
XF1495 - 7 1443544 1443537 1443091 1443091 -
236
XF1496 + 136 1443914 1444050 1446101 1446341 240
XF1500 + 15 1450864 1450879 1451832 - -
XF1501 + - - 1451832 1453814 1454246 432
XF1502 - 35 1454258 1454223 1453924 1453482 442
XF1504 - 25 1456040 1456015 1455152 1455123 29
XF1505 + 12 1456101 1456113 1456838 1456838 -
XF1506 + 54 1456865 1456919 1457533 1457533 -
XF1507 + - 1457756 1457756 1458907 1458969 62
XF1508 + 15 1458970 1458985 1461480 - -
XF1509 + - - 1461477 1461815 1461844 29
XF1510 - - 1462839 1462839 1461898 1461632 266
XF1517 + 192 1469345 1469537 1471288 1471323 35
XF1518 + - 1471324 1471324 1472541 1472669 128
XF1519 + 25 1472670 1472695 1473192 1473192 -
XF1520 + 5 1473193 1473198 1473704 - -
XF1526 + - - 1477297 1478064 1478068 4
XF1530 + 298 1487450 1487748 1488368 1488368 -
XF1531 + 71 1488375 1488446 1490161 1490223 62
XF1532 + - 1490224 1490224 1491201 1491326 125
XF1533 + - 1491327 1491327 1492016 1492332 316
XF1534 + - 1492333 1492333 1492575 1492642 67
XF1535 + 154 1492649 1492803 1494092 1495230 1138
XF1536 - 4 1494707 1494703 1494311 1491788 2523
XF1537 - 94 1495230 1495136 1494708 1494708 -
XF1538 + 1 1495356 1495357 1496010 1497114 1104
XF1539 - 1145 1498117 1496972 1496178 1495373 805
XF1541 + 94 1497805 1497899 1498072 1498079 7
237
XF1542 + 73 1498107 1498180 1498383 1498383 -
XF1544 + - - 1498643 1498813 1498891 78
XF1545 - 3 1499954 1499951 1499121 1498487 634
XF1546 + 26 1500315 1500341 1500508 1500514 6
XF1547 + 89 1500599 1500688 1501149 1501219 70
XF1548 - 400 1504173 1503773 1502301 1502279 22
XF1549 - 42 1505391 1505349 1504174 1504174 -
XF1550 - 15 1508235 1508220 1505392 1505392 -
XF1551 + 166 1508913 1509079 1509342 1509425 83
XF1552 - - 1510682 1510682 1509414 1508236 1178
XF1553 - - 1512220 1512220 1510853 1510824 29
XF1554 + 39 1512794 1512833 1514242 1514362 120
XF1555 - - 1515201 1515201 1514347 1512767 1580
XF1556 - - - 1515386 1515231 1515202 29
XF1562 + 29 1519107 1519136 1519402 - -
XF1563 + - - 1519389 1519727 1519779 52
XF1568 + 5 1521501 1521506 1521904 - -
XF1571 + - - 1523387 1524790 1525442 652
XF1572 - - - 1525120 1524839 1524651 188
XF1579 + 2 1529430 1529432 1529806 - -
XF1583 + - - 1531095 1532591 1532600 9
XF1588 - - 1536306 1536306 1535977 1535644 333
XF1589 - - - 1536873 1536445 1536307 138
XF1590 - 1 1537135 1537134 1536874 - -
XF1595 + - - 1539789 1540142 1540156 14
XF1596 - - - 1540497 1540198 1540157 41
XF1598 + 63 1540830 1540893 1541075 - -
238
XF1599 + - - 1541057 1541287 1543016 1729
XF1600 - 130 1542078 1541948 1541391 1541385 6
XF1602 - 8548 1552452 1543904 1543053 - -
XF1604 + 365 1544309 1544674 1545258 1545260 2
XF1606 + 2 1546886 1546888 1548240 - -
XF1608 + 38 1548477 1548515 1549150 1549234 84
XF1609 + 165 1549839 1550004 1551284 - -
XF1611 + - - 1552294 1553499 1553503 4
XF1612 - 3 1553723 1553720 1553568 1552953 615
XF1613 + 154 1553538 1553692 1553871 1554154 283
XF1616 - 177 1556497 1556320 1556201 - -
XF1619 + 44 1557900 1557944 1558099 1558099 -
XF1620 + 254 1558325 1558579 1559469 1559655 186
XF1621 - 5 1560968 1560963 1559596 1559391 205
XF1622 - 61 1561893 1561832 1561665 1561433 232
XF1623 + 430 1562025 1562455 1564359 1564359 -
XF1624 + 28 1564360 1564388 1565062 1565075 13
XF1625 + - 1565076 1565076 1566116 1566141 25
XF1627 + 16 1566901 1566917 1567834 1567869 35
XF1628 - 115 1568854 1568739 1567888 1567842 46
XF1629 - 1327 1570683 1569356 1568994 1568994 -
XF1630 + 224 1569281 1569505 1570554 1570554 -
XF1631 + 278 1570555 1570833 1570985 1572263 1278
XF1632 - - 1572201 1572201 1571071 1571009 62
XF1633 - 8 1573409 1573401 1572367 1572202 165
XF1634 - - 1573667 1573667 1573470 1573410 60
XF1635 - 70 1573965 1573895 1573767 1573668 99
239
XF1636 - 1888 1576154 1574266 1573991 1573966 25
XF1637 + 516 1574091 1574607 1575491 1575606 115
XF1638 - 6 1576985 1576979 1576155 1576155 -
XF1640 + - 1579527 1579527 1582703 1583800 1097
XF1641 - 148 1585767 1585619 1583028 1582267 761
XF1642 - - - 1586999 1585980 1585808 172
XF1643 - 18 1587264 1587246 1586989 - -
XF1644 - 18 1587738 1587720 1587265 1587265 -
XF1646 - - - 1589534 1588734 1588728 6
XF1650 - 6 1593335 1593329 1592955 1592945 10
XF1656 + 9 1595537 1595546 1595734 - -
XF1657 + - - 1595731 1596342 1596783 441
XF1658 - - 1597088 1597088 1596393 1596271 122
XF1659 - 151 1598250 1598099 1597134 1597134 -
XF1660 + 947 1597168 1598115 1598267 - -
XF1661 + - - 1598264 1598512 1598568 56
XF1662 + - 1598569 1598569 1598892 1598893 1
XF1665 + - - 1600510 1601598 1601807 209
XF1668 + 144 1603529 1603673 1604035 1604137 102
XF1676 + - - 1607753 1609156 1609893 737
XF1677 - - - 1609486 1609205 1608974 231
XF1678 - 61 1609882 1609821 1609483 - -
XF1684 + 2 1613796 1613798 1614172 - -
XF1688 + - - 1615461 1616957 1616966 9
XF1692 + - - 1617971 1619860 1620094 234
XF1693 + 13 1620114 1620127 1620366 1620366 -
XF1694 + 33 1620367 1620400 1620588 1621295 707
240
XF1695 - - 1620763 1620763 1620593 1620082 511
XF1696 - - 1621371 1621371 1621075 1620769 306
XF1701 + - - 1623962 1624315 1624859 544
XF1702 - - - 1624631 1624326 1624325 1
XF1706 + 3 1626732 1626735 1627898 1629986 2088
XF1707 - 32 1628442 1628410 1627931 1627547 384
XF1709 - 9 1629874 1629865 1629575 1629560 15
XF1710 + 93 1630083 1630176 1630508 1630701 193
XF1711 + - 1630703 1630703 1631056 1631332 276
XF1712 - 72 1632833 1632761 1631811 1631418 393
XF1714 - 384 1634079 1633695 1633153 - -
XF1715 + 809 1632875 1633684 1634505 1634638 133
XF1716 + 91 1634758 1634849 1637560 1638152 592
XF1717 - 318 1638715 1638397 1637597 1637491 106
XF1719 - - 1641621 1641621 1640956 1640902 54
XF1725 - 8 1645618 1645610 1645362 1645295 67
XF1755 + 11 1674470 1674481 1675110 1675110 -
XF1756 + 12 1675183 1675195 1675413 1675439 26
XF1757 - 16 1676094 1676078 1675818 1675816 2
XF1774 - 6 1694035 1694029 1690011 1690011 -
XF1777 + 236 1696375 1696611 1696781 1696781 -
XF1788 - - 1705285 1705285 1704782 1704770 12
XF1789 - 29 1705642 1705613 1705455 1705307 148
XF1790 + 383 1705285 1705668 1705781 1705836 55
XF1791 + 37 1705965 1706002 1706265 - -
XF1792 + - - 1706262 1706546 1706633 87
XF1793 - 450 1707511 1707061 1706753 1706710 43
241
XF1794 - - 1708375 1708375 1707749 1707588 161
XF1795 - - - 1709114 1708386 1708376 10
XF1796 - 275 1710339 1710064 1709111 - -
XF1797 - - - 1711638 1710469 1710340 129
XF1799 - 1922 1715502 1713580 1712663 - -
XF1800 + 459 1713511 1713970 1714455 1714456 1
XF1801 + 12 1714561 1714573 1715091 1715111 20
XF1802 + - 1715112 1715112 1716152 1716945 793
XF1803 - 84 1716946 1716862 1716290 1716290 -
XF1804 + - 1717816 1717816 1718697 1718884 187
XF1805 + - 1719045 1719045 1719215 1719552 337
XF1808 + 3 1722294 1722297 1722620 1722664 44
XF1809 + 1 1722674 1722675 1723409 1723470 61
XF1810 + - 1723471 1723471 1723815 1724599 784
XF1811 - 229 1724594 1724365 1723883 1723465 418
XF1813 - 552 1728809 1728257 1727304 1727289 15
XF1814 + 35 1728232 1728267 1730114 1730156 42
XF1816 + 50 1730779 1730829 1731023 1731023 -
XF1817 + 94 1731024 1731118 1732092 1733505 1413
XF1818 - - 1734144 1734144 1732585 1730086 2499
XF1819 - 27 1735368 1735341 1734199 1734186 13
XF1822 - 21 1738433 1738412 1737396 1737396 -
XF1823 - 135 1741373 1741238 1739055 1738794 261
XF1824 - - 1741564 1741564 1741403 1741379 24
XF1825 - 8 1742626 1742618 1741620 1741576 44
XF1826 + 298 1742370 1742668 1742871 1743809 938
XF1827 - - 1743299 1743299 1742868 1742866 2
242
XF1828 - - - 1744704 1743487 1743397 90
XF1830 - - 1746856 1746856 1745528 1745377 151
XF1831 - 35 1748061 1748026 1747175 1747077 98
XF1832 + 674 1747501 1748175 1748822 - -
XF1833 + - - 1748819 1750477 1751254 777
XF1834 - - 1751131 1751131 1750667 1750665 2
XF1835 - 15 1752550 1752535 1751330 1751275 55
XF1836 - - - 1753511 1752957 1752946 11
XF1838 - 10 1755336 1755326 1754397 1754360 37
XF1839 - 33 1755788 1755755 1755510 1755489 21
XF1840 + 435 1755388 1755823 1756536 1757536 1000
XF1841 - 5 1757477 1757472 1756687 1756687 -
XF1843 + 53 1759305 1759358 1759696 - -
XF1844 + - - 1759686 1761164 1761524 360
XF1845 - - 1761667 1761667 1761182 1761042 140
XF1846 - 10 1761883 1761873 1761703 1761668 35
XF1847 + 1 1761949 1761950 1762048 1762114 66
XF1848 - - - 1763617 1762190 1761935 255
XF1849 - 5 1764670 1764665 1763610 - -
XF1850 - 78 1765608 1765530 1765042 1764828 214
XF1851 + 65 1765667 1765732 1768734 1769220 486
XF1852 - 6 1769253 1769247 1768999 1768000 999
XF1853 + 329 1769322 1769651 1769839 - -
XF1854 + - - 1769836 1771446 1771452 6
XF1855 + 121 1771454 1771575 1773230 1773314 84
XF1856 - 13 1775207 1775194 1773425 1773424 1
XF1857 - 359 1775969 1775610 1775434 1775433 1
243
XF1858 + 169 1775460 1775629 1776393 1776434 41
XF1859 + 29 1776974 1777003 1778181 - -
XF1860 + - - 1778168 1778500 1778506 6
XF1861 + - 1778507 1778507 1778668 1778709 41
XF1862 - - - 1779086 1778757 1778742 15
XF1863 - 283 1779581 1779298 1779077 - -
XF1864 - 14 1780030 1780016 1779582 1779582 -
XF1870 + - - 1782890 1783960 1784441 481
XF1871 - 13 1784398 1784385 1784137 1783188 949
XF1872 - 1220 1785856 1784636 1784448 1784448 -
XF1873 + 6 1784953 1784959 1785306 1785323 17
XF1874 + 40 1785329 1785369 1785680 1786598 918
XF1878 - 21 1788741 1788720 1788499 1788499 -
XF1880 - 2 1789256 1789254 1788949 1788943 6
XF1885 - - 1791564 1791564 1791298 1791252 46
XF1886 - - 1792302 1792302 1791658 1791565 93
XF1887 - 158 1794675 1794517 1792367 1792303 64
XF1889 + 45 1796815 1796860 1797639 1797639 -
XF1890 - 68 1798273 1798205 1797633 1797633 -
XF1891 + 726 1797805 1798531 1800063 1800218 155
XF1892 - 62 1801006 1800944 1800225 1800225 -
XF1893 + - 1801044 1801044 1801793 1801795 2
XF1894 - - 1802575 1802575 1801892 1801840 52
XF1895 - - 1803408 1803408 1802593 1802576 17
XF1896 - - 1803972 1803972 1803412 1803409 3
XF1897 - 251 1805557 1805306 1804014 1803973 41
XF1900 - 9 1807875 1807866 1807093 1807060 33
244
XF1901 - - - 1808336 1807890 1807876 14
XF1903 - - 1811330 1811330 1809426 1809365 61
XF1904 - - 1811969 1811969 1811385 1811383 2
XF1905 - 94 1812670 1812576 1812055 1811970 85
XF1906 - 624 1814054 1813430 1812696 1812696 -
XF1907 + 2485 1811257 1813742 1813879 1814054 175
XF1909 - 65 1815595 1815530 1814457 - -
XF1910 - - 1816799 1816799 1815606 1815603 3
XF1911 + 6 1817361 1817367 1817840 1817840 -
XF1912 + 7 1818104 1818111 1818716 1818861 145
XF1913 - - 1819654 1819654 1818848 1816800 2048
XF1918 + 124 1823938 1824062 1824634 1824699 65
XF1919 + - 1824700 1824700 1825290 1825372 82
XF1920 - 7 1825767 1825760 1825482 1825482 -
XF1921 + 35 1825987 1826022 1826750 1826765 15
XF1922 - 78 1826995 1826917 1826795 1825870 925
XF1923 + 1 1827247 1827248 1828219 1828219 -
XF1924 + 4 1828228 1828232 1829770 1829771 1
XF1925 + - 1829772 1829772 1830641 1830701 60
XF1926 - - 1830771 1830771 1830613 1830236 377
XF1933 + 74 1836064 1836138 1836932 1836978 46
XF1935 + 138 1837857 1837995 1838633 1839162 529
XF1936 - - 1840683 1840683 1838683 1838623 60
XF1937 - 161 1842294 1842133 1840790 1840771 19
XF1938 + 12 1842281 1842293 1842412 1842427 15
XF1939 + - 1842428 1842428 1842559 1842819 260
XF1940 - 60 1843497 1843437 1842787 1842787 -
245
XF1941 - - 1844039 1844039 1843545 1843500 45
XF1942 - 27 1844315 1844288 1844193 1844186 7
XF1943 + - 1844716 1844716 1845108 1845296 188
XF1944 + 233 1845552 1845785 1847935 1848001 66
XF1945 - - 1848455 1848455 1848018 1845357 2661
XF1947 + 31 1850488 1850519 1851487 1851487 -
XF1948 + 77 1851488 1851565 1852266 1852337 71
XF1949 + - 1852338 1852338 1853795 1853830 35
XF1950 - - 1854655 1854655 1854185 1854081 104
XF1951 - 16 1855862 1855846 1854677 1854656 21
XF1955 - 378 1864550 1864172 1863756 1863740 16
XF1956 + 59 1864369 1864428 1865372 - -
XF1957 + - - 1865350 1866249 1866322 73
XF1958 + - 1866558 1866558 1867367 1869248 1881
XF1959 - 92 1869814 1869722 1867554 1867527 27
XF1960 - 23 1870761 1870738 1869815 1869815 -
XF1961 - 52 1872738 1872686 1871049 1871049 -
XF1963 - 204 1873571 1873367 1873134 1873088 46
XF1964 + 139 1873419 1873558 1873941 1873941 -
XF1968 - 30 1879582 1879552 1877948 - -
XF1970 - 28 1881133 1881105 1880089 1879917 172
XF1971 - 7 1881575 1881568 1881257 1881219 38
XF1972 + 11 1881791 1881802 1882248 1882262 14
XF1973 + 7 1882638 1882645 1883037 1883060 23
XF1974 - 2 1883296 1883294 1883067 1882665 402
XF1975 + 352 1883131 1883483 1885207 1885287 80
XF1976 + - 1885366 1885366 1886679 1886691 12
246
XF1978 + - - 1887189 1889411 1889637 226
XF1979 - 510 1891037 1890527 1889583 1888903 680
XF1980 + 44 1890585 1890629 1891003 1891015 12
XF1981 - 246 1894833 1894587 1891180 1891178 2
XF1983 + - 1895679 1895679 1896299 1896319 20
XF1985 - - 1898930 1898930 1898181 1898145 36
XF1986 - - 1899336 1899336 1899019 1898931 88
XF1987 - - 1901898 1901898 1899481 1899403 78
XF1988 - - 1902029 1902029 1901910 1901899 11
XF1989 - 74 1903390 1903316 1902087 1902030 57
XF1990 - 62 1904317 1904255 1903620 1903494 126
XF1991 - 380 1905051 1904671 1904318 1904318 -
XF1992 + 2145 1903139 1905284 1906480 1906500 20
XF1993 - - - 1907863 1906829 1906818 11
XF1994 - 15 1908750 1908735 1907860 - -
XF1995 - 18 1910063 1910045 1908774 1908751 23
XF1999 - - 1913242 1913242 1912154 1912114 40
XF2000 - 21 1913888 1913867 1913316 1913292 24
XF2001 + - 1913995 1913995 1914420 1914508 88
XF2002 - - 1914828 1914828 1914667 1914621 46
XF2003 - 14 1915191 1915177 1914944 1914944 -
XF2004 + 18 1915378 1915396 1916049 1916086 37
XF2005 - 172 1917604 1917432 1916095 1915870 225
XF2006 + 10 1917402 1917412 1917573 1917581 8
XF2007 + - 1917643 1917643 1918218 1918228 10
XF2008 + - 1918400 1918400 1919053 1921084 2031
XF2009 - - - 1920517 1919177 1918477 700
247
XF2010 - 135 1921206 1921071 1920514 - -
XF2011 + 5 1921259 1921264 1921485 - -
XF2012 + - - 1921482 1921781 1922201 420
XF2013 + 48 1922235 1922283 1922894 1922894 -
XF2014 + 5 1922910 1922915 1923358 1923387 29
XF2015 + 22 1923399 1923421 1924068 1924068 -
XF2016 + 196 1924090 1924286 1924501 1924850 349
XF2017 - 331 1925424 1925093 1924521 1924453 68
XF2018 + 101 1925221 1925322 1925447 1925576 129
XF2019 - 387 1927468 1927081 1925444 1925444 -
XF2020 + 775 1926666 1927441 1927737 1927876 139
XF2021 - 11 1929357 1929346 1928048 1927996 52
XF2025 + 67 1932813 1932880 1933971 1933971 -
XF2026 + 3 1933972 1933975 1934082 1934105 23
XF2027 - - 1934821 1934821 1934189 1933973 216
XF2028 - 1 1935500 1935499 1934942 1934934 8
XF2033 + - - 1937083 1937304 1938116 812
XF2034 - - 1938778 1938778 1937477 1936853 624
XF2035 - - - 1939139 1938855 1938847 8
XF2038 - 7 1941920 1941913 1941263 - -
XF2040 - - 1943881 1943881 1942781 1942779 2
XF2041 - - 1944647 1944647 1943886 1943882 4
XF2042 - 363 1945749 1945386 1944658 1944648 10
XF2043 - 18 1946312 1946294 1945929 1945929 -
XF2045 - - 1948432 1948432 1947827 1947814 13
XF2046 - - 1949832 1949832 1948438 1948433 5
XF2047 - 31 1950103 1950072 1949836 1949833 3
248
XF2049 - 5 1952286 1952281 1950881 1950881 -
XF2050 - 2 1952765 1952763 1952287 1952287 -
XF2052 - 123 1954512 1954389 1953673 1953657 16
XF2064 - - 1966249 1966249 1966034 1965605 429
XF2065 - 35 1966593 1966558 1966289 1966289 -
XF2066 - 3 1966978 1966975 1966667 1966667 -
XF2069 - 149 1968716 1968567 1968283 1967704 579
XF2070 - - - 1969296 1969111 1969003 108
XF2071 - 158 1969689 1969531 1969289 - -
XF2072 + 443 1969126 1969569 1969751 1969751 -
XF2073 - 6 1970009 1970003 1969791 1969791 -
XF2074 - - - 1970484 1970188 1970102 86
XF2075 - 3 1970753 1970750 1970472 - -
XF2078 + - - 1972173 1972574 1972611 37
XF2080 - - - 1973273 1972992 1972970 22
XF2081 - 86 1973606 1973520 1973260 - -
XF2082 - - 1974656 1974656 1973850 1973626 224
XF2083 - - - 1977764 1974702 1974657 45
XF2085 - 59 1979626 1979567 1978950 1978950 -
XF2087 - 104 1982042 1981938 1981669 1981544 125
XF2089 - 40 1983815 1983775 1982816 1982493 323
XF2090 - 22 1984650 1984628 1983861 1983861 -
XF2091 - 13 1989717 1989704 1984713 1984713 -
XF2092 + 28 1989784 1989812 1990006 1990006 -
XF2093 + 17 1990469 1990486 1991712 1991726 14
XF2096 - 65 1996571 1996506 1995607 - -
XF2097 + 13 1996739 1996752 1997009 1997215 206
249
XF2098 - - 1997458 1997458 1997252 1996700 552
XF2100 + 74 1998727 1998801 1999706 2000292 586
XF2101 - - - 2000643 2000035 1999644 391
XF2104 + 95 2001659 2001754 2001864 2001880 16
XF2106 + 25 2002086 2002111 2004000 2004071 71
XF2108 + 205 2004842 2005047 2005232 2005232 -
XF2111 + 677 2006748 2007425 2007703 2007713 10
XF2112 + 3 2007751 2007754 2008146 2008248 102
XF2127 + - 2019346 2019346 2020365 2020453 88
XF2128 + 7 2020564 2020571 2020735 2020747 12
XF2133 - 2 2024356 2024354 2022417 2022417 -
XF2134 + 55 2024461 2024516 2026897 2027674 777
XF2135 - 370 2028127 2027757 2026987 2026672 315
XF2136 + 15 2027901 2027916 2028086 2028103 17
XF2137 + - 2028310 2028310 2030676 2030702 26
XF2138 - 1 2030866 2030865 2030698 2030337 361
XF2139 + 17 2030989 2031006 2031149 2031280 131
XF2140 + 102 2031653 2031755 2033473 2033597 124
XF2141 + 253 2033598 2033851 2034945 2035029 84
XF2143 + - - 2036031 2036894 2036896 2
XF2145 + 19 2037746 2037765 2038475 2038495 20
XF2146 + 205 2038496 2038701 2039336 2039336 -
XF2148 + - 2039854 2039854 2040726 2040751 25
XF2150 + 14 2041147 2041161 2042039 2042068 29
XF2151 + - 2042614 2042614 2043888 2044689 801
XF2153 - 148 2045046 2044898 2044119 2044113 6
XF2154 + 61 2044829 2044890 2045942 2046363 421