Trabajo Práctico Observación de vectores. Estudios Parasitológicos Floridia Ricardo Ariel 2012
Trabajo Práctico
Observación de vectores.
Estudios Parasitológicos
Floridia Ricardo Ariel
2012
Estudios Parasitológicos
Sensibilidad de métodos
El laboratorio en el diagnóstico de la infección chagásicaDra. Beatriz Basso
Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector
Identificar si se trata de un insecto de la subfamilia Triatominae (posible transmisor de la enfermedad de Chagas – Mazza
Tomar el insecto con la pinza
Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector
Liberar el contenido intestinal.Con dos pinzas
Precauciones. Guardapolvo, guantes, gafas y vidrio protector.
Observar al microscopio a 40x
Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector
Xenodiagnóstico
Considerado el método de referencia Sensibilidad: En formas agudas entre 85 al 100%, en las congénitas
80% y en las crónicas entre el 20 al 50%. Las cajas están compuestas por ninfas de 3o a 4o estadio, con algunas
semanas de ayuno (2 a 3) y ávidas de alimentarse. Se colocan alrededor de 10 a 12 ninfas dentro de una caja, con una boca libre, cubierta con gasa; se utilizan 4 de estas cajas sobre la piel de los antebrazos.
Xenodiagnóstico
Observar contenido intestinal a los 30, 60 y 90 días de la succión de sangre.
Se busca tripomastigotes o epimastigotes en el contenido intestinal.
Método Strout
Es el método de preferencia en la etapa aguda (hasta los 40 – 60 días post infección).
Reconocer la movilidad de los parásitos entre los hematíes
Se debe repetir en forma seriada (3 veces)
También se utiliza para control de tratamiento. Para informar un Strout como positivo debemos observar
la movilidad del parásito. IMPORTANTE: observar recorriendo todos los campos
(no menos de 45 minutos) y varios preparados
Sensibilidad 95%
5-10 mL
Tº amb
Coag.
600 rpm 2 min.
2500 rpm 10 min.
Suero
Sedimento
Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)
Micrométodo de Strout
Se utiliza un tubo Eppendorf de 1,5 ml de capacidad al que se le agrega una gota de heparina más 0,5 ml de sangre venosa, se mezcla por inversión
Centrifugar durante dos minutos a 3000 rpm. Tomar una gota de la interfase, rica en glóbulos blancos,
y se observa entre porta y cubreobjeto al microscopio con 400 aumentos. Deben observarse como mínimo 4 preparados.
Sensibilidad similar al Strout Reducción de cantidad de sangre a extraer.
Medicina Vol 59 Supl III – 1999De Rissio, AM; Maidana,CG; Martín García, MC y Ruiz, AMINP”Dr. Mario Fatala Chabén”
Microhematocrito
Para diagnóstico durante la etapa aguda o en los casos congénitos.
Es importante extraer 6 o mas tubos capilares (50 ul c/u)
Sensibilidad semejante a strout Observar varios preparados con las consideraciones
del strout Inconvenientes técnicos.
Bioseguridad
J Clin Microbiol. 1983 August; 18(2): 327-330
H Feilij, L Muller and S M Gonzalez Cappa
Sensibilidad 90 a 95%
45 segundos a 5000 rpm
6 a 9 microhematocrito heparinizado
Cerrar extremo con plastilina
Cortar
BIOSEGURIDAD
Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)
Gota fresca
Método que se puede efectuar en la etapa aguda
De fácil realización De baja sensibilidad Observar movilidad de los parásitos.
Aumentar irrigación
Sensibilidad 50%
100x / 400x
gota de citrato al 2%)
Tripanosoma cruzi
45 minutos
Gota gruesa
Método sencillo Baja sensibilidad Observar morfología del parásito
Sensibilidad 50%
Colocar 1 a 3 gotas
Desfibrinar
1-2min
Dejar secar
Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos.Lavar y secar
objetivo de 100x aceite
Tripanosoma cruzi
Hemocultivo
Consiste en sembrar una muestra de sangre en un medio de cultivo artificial y amplificar el número de parásitos. Como producto del cultivo se obtienen epimatigotes de T. cruzi.
Es aplicable a la etapa aguda pero también en la crónica, en la cual disminuye en gran medida la sensibilidad.
Requiere de un tiempo prolongado para obtener resultados.
Se puede realizar una coloración (Giemsa) para visualizar el tripanosoma con mayor definición.
Sensibilidad: Agudo: 80 – 100%Crónico:40 – 60%
Se incuba sangre heparinizada a 28ºC hasta 60 días
PCR para Chagas
No está validad (solo para seguimiento de tratamiento)
Tiene elevada sensibilidad (aún en etapa crónica) Falsos positivos y algunos falsos negativos. Selectivo para T. cruzi y T. rangeli Amplifica un fragmento de 330 pb del ADN k
Mix p/1x30: 30ul
H2O: 12,7 ul Buffer (10x) Taq: 3 ul MgCl2 (25mM): 3,6 ul dNTPs (5mM): 1,5 ul Primer 121 (50pmol/ml): 1,5 ul Primer 122 (50pmol/ml): 1,5 ul Taq (0,8ul/20ul): 1,2 ul TOTAL: 25 ul
(1x25ul) 25ul mix + 5 ul
(muestra)
PCR para Chagas
Temperature Time
4ºC 3 minutos
94 ºC 3 minutes
94 ºC 1 minute
68 ºC 1 minute
72 ºC 1 minute
94 ºC 45 second
64 ºC 45 second
72 ºC 45 second
72 ºC 10 minutes
4 ºC Hold
35 cycles
5 cycles
Bibliografía
Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de la Trypanosomiosis americana (enfermedad de Chagas). Serie de Normas Técnicas Nº 00. Lima, 2005
Fortalecimiento en la Enseñanza de la Enfermedad de Chagas Diagnóstico de Laboratorio Dra. Beatriz Basso* * Profesora, Servicio de Neonatologia, Cátedra de Pediatría y Neonatología. Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba Universidad Nacional de Córdoba
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Diciembre, 2009 Aspectos exocoriales de huevos de Triatoma patagonica Del Ponte, 1929 por microscopía electrónica de barrido Elena VisciarelliI; Adriana FerreroII; Sixto
Raúl CostamagnaI. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur, San Juan 670, 8000 Bahía Blanca, Prov. de Buenos Aires, Argentina. E-mail: [email protected] ICátedra de Parasitología Clínica. IICátedra de Zoología de Invertebrados II
Las especies de Triatominae de mayor adaptación al hombre, tratadas en este trabajo. Hipotesis sobre el desarrollo de la Trypanosomiasis Americana - Carpintero, D. J. y Viana, E.J. Buenos Aires, Argentina
Alimentación y defecación en triatominos del género Rhodnius (Hemiptera: Reduviidae) alimentados con sangre humana. E. Aldana E.Lizano M.Rodríguez A. Valderrama. Recibido 28-IV-2000. Corregido 20-XI-2000. Aceptado 20-XI-2000
Ecología de la enfermedad de Chagas, y su prevención y control en la Amazonia. Un enfoque de ecosalud. Roberto Bazzani, IDRC/CRDI; Roberto Salvatella, OPS/OMS
La aerotermia como alternativa para el control de Triatoma infestans (Hemiptera, Reduviidae) resistentes a deltametrina. Alberto G. GentileI; José L. SartiniII; María C. CamposIII; Juan F. SánchezIV. ICoordinación de Gestión Epidemiológica, Ministerio de Salud Pública, Salta, Argentina
Diagnóstico Molecular de la enfermedad de Chagas. Constança Britto. Laboratorio de Biología Molecular y Enfermedades Endémicas, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, 21040-900, Río de Janeiro, RJ, Brasil. Correo electrónico: [email protected]
Utilidad de la técnica de PCR. en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Brusés, Bettina L. - Lucero, Horacio - Gorodner, Jorge O. Departamento de Biología Molecular - Instituto de Medicina Regional - UNNE.