TOXOPLASMOSE EM BOVINOS E SUÍNOS, E A VIABILIDADE DE CISTOS DE Toxoplasma gondii EM ENCÉFALOS SUÍNOS NO MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ EDWARDS FRAZÃO-TEIXEIRA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ MARÇO - 2006
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TOXOPLASMOSE EM BOVINOS E SUÍNOS, E A VIABILIDADE DE CISTOS DE Toxoplasma gondii EM ENCÉFALOS SUÍNOS NO
MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
EDWARDS FRAZÃO-TEIXEIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
MARÇO - 2006
TOXOPLASMOSE EM BOVINOS E SUÍNOS, E A VIABILIDADE DE CISTOS DE Toxoplasma gondii EM ENCÉFALOS SUÍNOS NO
MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
EDWARDS FRAZÃO-TEIXEIRA Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Orientador: Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira
Co-Orientadora: Profª. Lílian Maria Garcia Bahia-Oliveira
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ MARÇO - 2006
TOXOPLASMOSE EM BOVINOS E SUÍNOS, E A VIABILIDADE DE CISTOS DE Toxoplasma gondii EM ENCÉFALOS SUÍNOS NO
MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
EDWARDS FRAZÃO-TEIXEIRA
Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Aprovada em 03 de março de 2006 Comissão Examinadora: ___________________________________________________________________
Prof. Walter Flausino (Doutor, Parasitologia) - UFRRJ
___________________________________________________________________ Profª. Maria Angélica V. da C. Pereira (Doutora, Parasitologia) - UENF
___________________________________________________________________ Profª. Sílvia Regina Ferreira G. Pereira (Doutora, Microbiologia) - UENF
___________________________________________________________________ Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira (Doutor, Parasitologia) - UENF
(Orientador)
ii
“Maybe I will never be
All the things that I want to be
But now is not the time to cry
Now's the time to find out why
I think you're the same as me
We see things they'll never see
You and I are gonna live forever”
Noel Gallagher
iii
A
Todos aqueles que me conhecem na íntegra e,
por isso, sei que sempre serão os meus
verdadeiros amigos.
DEDICO
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por continuar oferecendo sua proteção e me guiar por
caminhos inimagináveis em busca de uma luz.
Ao meu pai, pelo constante zelo e por ser meu modelo de honestidade e
caráter.
A minha mãe, pelo carinho e cuidados dispensados numa vida inteira de
realizações. Ainda não sei como consegue fazer tantas coisas ao mesmo tempo.
Ao meu irmão Diego. Ver você crescer é como reviver grandes momentos da
minha vida. O futuro exige apenas que nós tenhamos o trabalho de estender a mão
para alcançá-lo.
Ao meu irmão Dariozinho. Crescemos juntos e aprendemos juntos. Sempre
admirei sua inteligência, que me custou algumas partidas de xadrez perdidas. O
sucesso é pouco para mentes brilhantes.
A Lu, suporte constante quando tudo parece perdido. Você é minha luz,
minha maior incentivadora. Ainda espero, algum dia, ter 7% da sua praticidade.
Aos meus avós Frazão, Jutirene, Heloíza e Edwards, admiro vocês pela vida
que viveram e pelo muito que ainda têm a viver. São os pilares da nossa família e
onde minha vida começa. Obrigado por terem se amado, do contrário não estaria
aqui.
A Tia Inês e Tia Lolô. O orgulho de vocês é alimento à minha caminhada,
que está apenas começando. Torcemos juntos, comemoraremos juntos.
A Vulks e Zari. Muitos seres humanos tendem a adquirir características
animais. Muitos animais demonstram as qualidades mais humanas.
v
Aos amigos, colegas e muitas outras pessoas que tive o prazer de conhecer
nestes dois anos de trabalho. De várias maneiras diferentes, vocês contribuíram
para a execução deste Projeto.
Ao meu amigo Lério, pela grande ajuda durante a coleta das amostras e cujo
carinho e brincadeiras dão toque especial à Pesquisa Científica. Valeu “coisinha” !
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, pela
oportunidade de fazer Ciência.
À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela bolsa de estudos.
Àqueles professores que sabem os mestres que são, mas nunca esquecem
os alunos que foram.
Em especial, às Professoras Maria Angélica e Sílvia Regina, pelas
constantes palavras de elogio e incentivo.
À Profª. Lílian, pela co-orientação, confiança, incentivo e conhecimentos
passados durante estes anos de pesquisa.
Finalmente, ao “meu jovem” amigo Francisco. Obrigado pela constante
confiança em meu potencial. Muitos têm a sorte de ter um Orientador amigável.
Poucos têm o prazer de ter um grande amigo como Orientador.
vi
BIOGRAFIA
EDWARDS FRAZÃO TEIXEIRA, filho de Manoel Dario Marinho Teixeira e
Lídia Pessanha dos Santos Teixeira, nasceu em Campos dos Goytacazes, Estado
do Rio de Janeiro, em 3 de setembro de 1979.
Concluiu o Ensino Fundamental em 1994 nas escolas Externato Nacional e
Instituto Dom Bosco - Salesiano, em Campos dos Goytacazes. Em 1997, concluiu o
Ensino Médio no Colégio Escola Santo Antônio – CESA.
Ingressou no Curso de Medicina Veterinária em 1999, na Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF). No mesmo ano, iniciou suas
atividades como bolsista de trabalho junto ao Laboratório de Biologia do Reconhecer
do Centro de Biociências e Biotecnologia (CBB) da UENF, sendo selecionado em
2001 pela Comissão de Bolsas de Iniciação Científica para atuar no Laboratório de
Sanidade Animal do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA).
Em fevereiro de 2004, foi selecionado para ingresso no Curso de Pós-
Graduação em Produção Animal, área de concentração Sanidade Animal, nível de
Mestrado, da UENF. Em março de 2005, iniciou suas atividades como bolsista no
Pré-Vestibular Teorema, que envolve aulas ministradas por pós-graduandos da
UENF. No referido curso, tem ministrado aulas na disciplina Inglês.
Em janeiro de 2006, foi selecionado para o Doutorado no Curso de Pós-
Graduação em Produção Animal, Sanidade Animal, da UENF.
Defende, agora, sua Dissertação de Mestrado.
vii
CONTEÚDO
RESUMO................................................................................................................ xiv
ABSTRACT............................................................................................................ xvi
Figura 9. Espécimes de Toxoplasma gondii observados em cérebros de
camundongos. Em A e B, cistos em observação a fresco.
Destaque para a parede cística de espessura delgada (→). Em
C e D, cistos corados por GIEMSA. Destaque para os núcleos
dos bradizoítas (→). Barra com 20 µm...........................................
56
xiv
RESUMO
FRAZÃO-TEIXEIRA, Edwards, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; março de 2006; Toxoplasmose em bovinos e suínos, e a viabilidade de cistos em encéfalos suínos no município de Campos dos Goytacazes-RJ; Orientador: Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira. Co-Orientadora: Profª. Lílian Maria Garcia Bahia-Oliveira.
Soros de 73 bovinos e 62 suínos criados em Campos dos Goytacazes e
arredores foram analisados para a presença de anticorpos do tipo IgG contra
Toxoplasma gondii. Ainda, 12 cabeças de suínos foram adquiridas em
estabelecimentos populares do município, os quais comercializam carne suína in
natura diretamente para a população. Seus encéfalos foram removidos e
processados para bioprova em camundongos, com o intuito de isolar formas
infectivas viáveis do parasita. As prevalências de anticorpos anti-T. gondii foram
52,06% para bovinos em geral e 20,59% para suínos domiciliares. O nível de
isolamento de encéfalos suínos foi 50%. A atenção dispensada pelos criadores aos
suínos dos sistemas de criação intensiva devem ter contribuído para a baixa
soroprevalência nestes animais. As prevalências verificadas para bovinos e suínos
representam potenciais de infecção através do consumo de suas carnes, de acordo
com informações relatadas por outros estudos. Para os suínos, a suspeita levantada
pela soropositividade pôde ser confirmada pelo alto percentual de isolamento do
parasita nos encéfalos analisados. Outros autores já relataram correlação entre a
presença de T. gondii em cérebros de suínos e outros tecidos, incluindo músculos. A
padronização da técnica de ELISA indireto para detecção de anticorpos em soros de
xv
suínos e bovinos foi bem sucedida, o que confirma os relatos de outros
pesquisadores acerca de seu uso para investigação de infecções em populações.
Conclui-se, ainda, que existe alto percentual de infecção dentre os bovinos e suínos
analisados, e que estes animais são fontes de infecção humana. Adicionalmente, a
presença do parasita em suínos comercializados em estabelecimentos populares
deste município confirma que a toxoplasmose tem uma importante fonte de infecção
FRAZÃO-TEIXEIRA, Edwards, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; February 2004; Toxoplasmosis in cattle and pigs, and the viability of Toxoplasma gondii cysts in encephalons of pigs in the municipality of Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro state; Adviser: Professor Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira. Co-Adviser: Professor Lílian Maria Garcia Bahia de Oliveira.
Sera from 73 bovines and 62 pigs bred in Campos dos Goytacazes and
surroundings were analysed for the presence of IgG antibodies against Toxoplasma
gondii. Though, 12 pigs’ heads were acquired in popular establishments of the
municipality, which commercialize in natura pig’s meat directly to the population.
Their encephalons were removed and processed for bioassay in mice, in order to
isolate viable infective forms of the parasite. The prevalences of anti-T. gondii
antibodies were 52.06% for cattle in general and 20,59% for domicile pigs. The
isolation level from pigs’ encephalons was 50%. The attention given by the breeders
to the intensive breeding system pigs must have contributed for the low
seroprevalence in these animals. The prevalence verified for cattle and pigs
represent potential of infection through the consumption of their meat raw or
undercooked meat, according to information reported by other studies. For pigs, the
suspicion raised by the seropositivity could be confirmed by the high percentage of
isolation of the parasite in the analyzed encephalons. Other authors have already
reported correlation between the presence of T. gondii in pigs brains and other
tissues, including muscles. The standardization of the indirect ELISA technique for
detection of antibodies in pig’s and bovine’s sera was successful, what confirms the
xvii
reports by other researchers on its use for infection investigations in populations. It is
concluded, though, that there is high percentage of T. gondii infection among the
analysed bovines and pigs, and that these animals are sources for human infection.
Additionally, the presence of the parasite in pigs commercialized in popular
establishments of this municipality confirms that toxoplasmosis have an important
source of infection in this animal species.
Key words: anti-T. gondii, cattle, pigs, ELISA.
1
1. INTRODUÇÃO
Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, parasitose que
acomete animais de sangue quente e tem como hospedeiros definitivos os felídeos.
A doença afeta seriamente indivíduos imunocomprometidos, com sérios danos ao
sistema nervoso central. Vários pesquisadores relatam que indivíduos
imunocompetentes são menos vulneráveis à infecção e aos danos causados pelo T.
gondii ao tecido nervoso. Entretanto, com o advento de novas tecnologias
moleculares e pesquisas comportamentais, diversos autores têm proposto que a
situação pode ser mais grave do que se imagina. Vários sinais têm sido detectados
em indivíduos imunocompetentes e a associação com a presença do parasita
exaustivamente investigada.
Paralelamente a isso, cresce cada vez mais o interesse dos pesquisadores
em estudar a cadeia epidemiológica de várias doenças e as principais fontes de
infecção humana. Várias infecções estão re-emergindo, antigos patógenos se
modificando. Estudos sobre zoonoses tornam-se ainda mais importantes e a
toxoplasmose, a mais cosmopolita delas, vem atraindo cada vez mais atenção da
comunidade científica.
A cidade de Campos dos Goytacazes, localizada no Norte do Estado do Rio
de Janeiro, tem sido internacionalmente citada pela endemia de toxoplasmose
humana, com relatos de alto percentual em indivíduos de baixa renda e doença
congênita. Vários estudos têm sido realizados a fim de detectar a principal fonte de
infecção humana neste município. Estas pesquisas comprovaram a ampla
2
contaminação ambiental e ponderam acerca do papel de fontes de água na
epidemiologia da doença.
Por outro lado, este município possui papel histórico no ciclo da pecuária e
até hoje destaca-se pela produção extensiva de gado bovino. Estes hospedeiros
intermediários, após adquirirem a infecção a partir de ambientes contaminados,
podem exercer papel fundamental não só para disseminação da toxoplasmose como
para a intensidade da infecção. Isto porque um cisto tecidual de T. gondii pode
albergar até centenas de formas infectivas do parasita. A carne de um animal
infectado pode conter muitos cistos e é, definitivamente, uma fonte a ser
considerada em regiões endêmicas para essa parasitose.
Bovinos e suínos são importantes fontes de proteína animal para populações
humanas. Várias são as pesquisas que visam determinar os índices de infecção por
T. gondii em rebanhos de inúmeras regiões do planeta. Os índices variam e o
assunto é cada vez mais estudado à medida que a correlação com a possibilidade
de infecção humana é confirmada. Os investimentos em métodos preventivos têm
crescido, o que pode ser confirmado pela corrida em busca de uma vacina para a
toxoplasmose animal e pela melhoria das condições sanitárias em criadouros.
Nesse contexto, cresce ainda mais a importância da Vigilância Sanitária na
fiscalização e garantia de produtos de origem animal livres de patógenos. Vários são
os relatos de isolamento de T. gondii viável em tecidos animais comestíveis, assim
como os surtos da doença humana, tendo como causa a ingestão de alimentos de
origem animal.
Com base nestes relatos, justifica-se um trabalho de pesquisa que avalie a
prevalência da toxoplasmose em animais de produção em Campos dos Goytacazes,
assim como a presença do parasita em tecidos de animais comercializados in natura
nos limites deste município.
3
2. OBJETIVOS
2.1. Gerais a) Examinar bovinos e suínos criados em áreas urbanas periféricas e
arredores do município de Campos dos Goytacazes-RJ quanto à presença de
anticorpos anti-T. gondii em amostras séricas;
b) Demonstrar a presença de formas infectivas viáveis de T. gondii em
encéfalos de suínos comercializados in natura em estabelecimentos populares que
comercializam carne suína neste município.
2.2. Específicos
a) Padronizar o teste de ELISA indireto (“indirect Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay”) para detecção de anticorpos anti-T. gondii em soros de
bovinos e suínos;
b) Verificar a importância de bovinos e suínos na cadeia epidemiológica da
toxoplasmose em Campos dos Goytacazes;
c) Verificar a importância das carnes suína e bovina como potenciais
transmissoras da toxoplasmose neste município e arredores;
d) Avaliar o risco de ocorrência de toxoplasmose através da ingestão de
tecidos e derivados da carne de suínos naturalmente infectados;
e) Alertar quanto à necessidade de maior controle na Inspeção Sanitária dos
animais que servem ao consumo humano e são criados em regiões urbanas e
arredores do município sem controle sanitário.
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3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Toxoplasma gondii 3.1.1. Taxionomia A classificação taxionômica do agente etiológico da toxoplasmose, de
acordo com Current et al. (1990) e Cavalier-Smith (1993), é:
Império: Eucariota (CAVALIER-SMITH, 1993)
Reino: Protozoa (OWEN, 1858)
Filo: Apicomplexa (LEVINE, 1970)
Classe: Sporozoazida (LEUKART, 1879)
Ordem: Eucoccidiorida (LEUKART, 1879)
Subordem: Eimeriorina (LÉGER, 1911)
Família: Sarcocystidae (POCHE, 1913)
Sub-família: Toxoplasmatinae (BIOCA, 1956)
Gênero: Toxoplasma (NICOLLE e MANCEAUX, 1909)
Espécie: Toxoplasma gondii (NICOLLE e MANCEAUX, 1909)
3.1.2. Histórico Alfonso Splendore foi o primeiro a detectar T. gondii. Em um estudo com
coelhos em São Paulo, o pesquisador de origem italiana observou uma patologia
5
com quadro semelhante ao kalazar humano. Ele descreveu as lesões e os
corpúsculos parasitários presentes, tanto as formas livres como intracelulares
(SPLENDORE, 1908). A descoberta de Splendore ocorreu em julho de 1908,
porém em outubro do mesmo ano, Nicolle e Manceaux relataram uma
descoberta semelhante em células de baço e do fígado de Ctenodactylus gundi,
um roedor africano (NICOLLE e MANCEAUX, 1908).
Segundo OLIVEIRA (2002), um oftalmologista chamado Jankü fez a
primeira descrição de toxoplasmose congênita humana, em 1923. O paciente era
uma criança de 11 anos de idade com hidrocefalia e cegueira, que veio a falecer.
Ao corte histológico do globo ocular durante a necropsia, pôde-se observar a
presença de parasitas na retina. TORRES (1927) relatou toxoplasmose humana
pela primeira vez no Rio de Janeiro e descreveu microorganismos em cortes
histológicos do cérebro, miocárdio e músculos esqueléticos de um bebê que
faleceu aos 29 dias de vida. Ele reconheceu os organismos como sendo
semelhantes a Toxoplasma gondii e espécies do gênero Encephalitozoon.
A primeira caracterização de toxoplasmose fatal em recém-nascidos foi
realizada por WOLF e COWEN (1937). Dois anos mais tarde WOLF et al. (1939
e 1940) conseguiram, pela primeira vez, infectar animais com cepas isoladas de
uma lesão do sistema nervoso central de um bebê falecido com um mês de vida.
A caracterização da doença em indivíduos adultos foi documentada por
PINKERTON e WEINMAN (1940) nos Estados Unidos (EUA).
Após a padronização de testes sorológicos, em especial o teste de Sabin-
Feldman (SABIN e FELDMAN, 1948), pôde-se quantificar a prevalência da
infecção por T. gondii em seres humanos e animais, confirmando sua ampla
distribuição na natureza (FELDMAN, 1982).
Todavia, o ciclo completo do parasita só foi desvendado em estudos
realizados por HUTCHISON (1965) e DUBEY et al. (1970), que descreveram a
transmissão do parasita pelas fezes de gatos e sua fase sexual no intestino
destes felídeos, culminando com a produção de oocistos.
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3.1.3. Ciclo biológico
Dentre todas as espécies de parasitas, T. gondii destaca-se pela
complexidade do seu ciclo biológico (DUBEY, 1994). As formas infectivas se
diferenciam de acordo com cada uma das três fases de seu ciclo.
No intestino de seu hospedeiro definitivo, o felídeo, a forma infectiva
resultante é o oocisto. Este é liberado em sua forma não esporulada juntamente com
as fezes do felídeo infectado. No ambiente, este oocisto sofre uma alteração em sua
estrutura para tornar-se potencialmente infectivo. Esta transformação é catalisada
pela ação da temperatura, umidade e concentração de oxigênio ambientes ideais e é
chamada esporulação (DUBEY, 1994).
O oocisto é uma importante ferramenta de disseminação do parasita no meio
ambiente (da SILVA et al., 2003). Nesse local ele pode alcançar uma grande
variedade de hospedeiros intermediários, onde realiza mais uma etapa de seu
desenvolvimento biológico. Ao ser ingerido por qualquer animal de sangue quente,
seja através de alimentos ou água contaminados, o oocisto esporulado rompe-se no
intestino, liberando oito esporozoítas. Estes se dividem rapidamente nas células
intestinais e linfonodos associados e dão origem aos taquizoítas (DUBEY, 1994). Os
taquizoítas aproveitam-se da circulação sanguínea e linfática para atingirem os mais
variados tecidos do hospedeiro (DUBEY e BEATTIE, 1988). Entretanto, dependendo
da competência imunológica do indivíduo, o parasita migra para tecidos nervosos,
musculares e hepáticos, onde se encistam. É importante ressaltar que essa fase
extra-intestinal ocorre também nos felídeos (FREYRE et al., 1989), tornando-os,
Alemanha Hesse 19,0 2041 - Ensaio Imunoenzimático Damriyasa et al. (2004) Alemanha Munsterland 9,3 1500 - Ensaio Imunoenzimático Damriyasa e Bauer (2005) Suíça - 0,0 - - Ensaio Imunoenzimático Wyss et al. (2000) Argentina - 37,8 230 - / abate Aglutinação Modificada Argentina - 4,5 88 tecnificado / - Aglutinação Modificada Argentina - 40,2 112 a pasto Aglutinação Modificada
Venturini et al. (2004)
Áustria (1982) - 13,7 - - Áustria (1992) - 0,9 -
Imunofluorescência Indireta Edelhofer (1994)
Brasil São Paulo 9,6 300 abate Ensaio Imunoenzimático / Western Blot Suarez-Aranda et al. (2000)
Peru Lima 32,3 96 abate Ensaio Imunoenzimático / Western Blot Suarez-Aranda et al. (2000)
Canadá - 9,4 1443 abate Aglutinação Modificado Smith (1991) China Guangdong 10,4 816 - Hemaglutinação Indireta Lin et al. (1990)
Costa Rica - 43,8 496 - Imunofluorescência Indireta Arias et al. (1994b)
Espanha - 38,4 507 animais selvagens Aglutinação Modificada Gauss et al. (2005) Peru Lima 27,7 137 EUA Geórgia 16,4 152 - / abate Western Blot Saavedra e Ortega (2004)
[2,2-azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-G-sulfonic acid)]1mg/ml, e H2O2 a 0,003%}, que
reagiu com a peroxidase e resultou numa coloração verde, onde a reação foi
positiva.
1 IMMUNLON 2-DYNATECH 2 SIGMA
26
Foram deixados poços para os controles branco e conjugado. Nos poços
reservados para o controle branco adicionou-se tampão carbonato-bicarbonato (pH
9,6), em substituição ao antígeno, na fase de sensibilização, e PBS-T 0,05% nas
fases de bloqueio e de adição dos soros controle, seguindo-se normalmente as
outras fases do processo. Nos poços reservados para o controle do conjugado
apenas não foram adicionados os soros controle, substituindo-os por PBS-T 0,05%
no mesmo volume.
A reação foi interrompida com a adição de 30µl da solução de ácido cítrico
(42g de ácido cítrico em um litro de água destilada) após o surgimento da cor. A
leitura da placa foi feita no leitor de ELISA3, utilizando-se filtro de 405nm.
4.4.2. Para análise de soro suíno
Uma placa de ELISA foi sensibilizada com antígenos de T. gondii da cepa
RH em duas concentrações diferentes, 5 e 10µg/ml, diluídas em tampão carbonato-
bicarbonato (pH 9,6), durante 18 a 20 horas a 4ºC.
Após o período de sensibilização, a placa foi lavada três vezes com solução
PBS-T 0,05%, seca por inversão em papel toalha, bloqueada com solução PBS-T
0,05% + BSA 1% e incubada a 37ºC por duas horas. A solução bloqueio foi
descartada e a placa foi lavada conforme acima descrito.
Foram adicionados os soros controle positivos e negativos previamente
diluídos em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%, 100µl/poço, em três diluições: 1:200, 1:400 e
1:800. As três diluições foram associadas a ambas as concentrações do antígeno. A
placa foi incubada a 37ºC por uma hora, lavada três vezes com solução PBS-T
0,05% e seca como acima descrito. Acrescentaram-se então os anticorpos anti-IgG
suína conjugados a peroxidase4, previamente diluídos nas concentrações 1:10.000 e
1:20.000 em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%, incubando-se a 37ºC por uma hora. Ambas
as diluições foram também associadas às duas concentrações do antígeno e às três
diluições dos soros controle.
Ao término deste período, a placa foi lavada, seca e revelada pela adição da
solução substrato (item 4.4.1.), que reagiu com a peroxidase resultando numa
coloração verde, onde a reação foi positiva.
3 DYNATECH MR500 4 SIGMA
27
Foram deixados poços, em duplicata, para os controles branco e conjugado,
conforme descrito no item 4.4.1.
A reação foi interrompida com a adição de 30µl da solução de ácido cítrico
(item 4.4.1.) após o surgimento da cor. A leitura da placa foi feita no leitor de ELISA,
utilizando-se filtro de 405nm.
4.5. Avaliação sorológica 4.5.1. Nos bovinos
Duas placas de ELISA foram sensibilizadas com antígeno de T. gondii da
cepa RH previamente diluído com tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,6) na
concentração 10µg/ml, incubando-se por 18 a 20 horas a 4ºC.
Após o período, as placas foram lavadas três vezes com solução PBS-T
0,05%, secas por inversão em papel toalha, bloqueadas com solução PBS-T 0,1% e
incubadas a 37ºC por duas horas. A solução bloqueio foi então descartada e as
placas foram lavadas como descrito acima.
Foram adicionados os soros controle (positivo e negativos) e os soros dos
bovinos a serem analisados, previamente diluídos em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%,
100µl/poço, em 1:500. As placas foram incubadas a 37ºC por uma hora, lavadas três
vezes com solução PBS-T 0,05% e secas como acima descrito. Acrescentou-se,
então, a solução com os anticorpos anti-IgG bovino conjugados a peroxidase
previamente diluídos na concentração 1:4000 em PBS-T 0,05% + BSA 0,5% a 37ºC
por uma hora.
Ao término deste período, as placas foram lavadas, secas e reveladas pela
adição da solução substrato mencionada no item 4.4.1., que reagiu com a
peroxidase resultando numa coloração verde, onde a reação foi positiva.
Foram deixados poços para os controles branco e conjugado, como descrito
no item 4.4.1.
A reação foi interrompida com a adição de 30µl da solução de ácido cítrico
(item 4.4.1.) após o surgimento da cor. A leitura da placa foi feita no leitor de ELISA,
utilizando-se filtro de 405nm.
28
4.5.2. Nos suínos
Duas placas de ELISA foram sensibilizadas com antígeno de T. gondii da
cepa RH previamente diluído com tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,6) na
concentração 5µg/ml, incubando-se durante 18-20 horas a 4ºC.
Após este período, as placas foram lavadas por três vezes com solução
PBS-T 0,05%, secas por inversão em papel toalha e bloqueadas com solução PBS-T
0,05% + BSA 1%, incubando-se a 37ºC por duas horas. A solução bloqueio foi então
descartada e as placas foram lavadas como descrito acima.
Foram adicionados os soros controle (positivos e negativos) e os soros dos
suínos a serem avaliados previamente diluídos em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%,
100µl/poço, em 1:400. As placas foram incubadas a 37ºC por uma hora, lavadas três
vezes com solução PBS-T 0,05% e secas como acima descrito. Acrescentou-se,
então, a solução com os anticorpos anti-suíno conjugados a peroxidase previamente
diluídos na concentração 1:20.000 em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%, incubando-se a
37ºC por uma hora.
Ao término deste período, as placas foram lavadas, secas e reveladas pela
adição da solução substrato mencionada no item 4.4.1., que reagiu com a
peroxidase e resultou numa coloração verde, onde a reação foi positiva.
Foram deixados poços para os controles branco e substrato, conforme
descrito no item 4.4.1.
A reação foi interrompida com a adição de 30µl da solução de ácido cítrico
(item 4.4.1.) após o surgimento da cor. A leitura da placa foi feita no leitor de ELISA,
utilizando-se filtro de 405nm.
4.6. Visualização dos resultados sorológicos
Após a leitura das placas, foram obtidos valores numéricos que representam
as variações de cor formadas após a adição da solução substrato. Esta variação de
cor é denominada densidade óptica (DO).
Através das DOs dos soros controle negativos calculou-se um valor
referencial a partir do qual a soropositividade ou não, de cada amostra, foi
discriminada. Este valor referencial é chamado “cut-off”. Valores de DO superiores
29
ou iguais ao “cut-off” foram considerados positivos, enquanto valores inferiores foram
considerados negativos.
Para o cálculo do “cut-off”, utilizou-se a seguinte fórmula:
cut-off = + 3s
= média dos controles negativos s = desvio padrão da média
4.7. Seleção dos estabelecimentos comerciais
Foram selecionados para o estudo estabelecimentos populares que
comercializam carne suína in natura para consumo humano no município de
Campos dos Goytacazes. O critério de seleção dos estabelecimentos para coleta
das amostras foi por conveniência (PEREIRA, 1995) e naqueles de maior procura
pelo consumidor.
4.8. Aquisição dos encéfalos suínos
Foram adquiridas 12 cabeças de suínos diretamente nos estabelecimentos
comerciais. Estas foram abertas com o uso de serras, que foram eficientemente
lavadas e autoclavadas após cada utilização, evitando contaminação entre os
tecidos. Os encéfalos foram retirados, armazenados em recipientes individuais
identificados e mantidos sob refrigeração até seu processamento.
4.9. Digestão péptica das amostras encefálicas
A aplicação da técnica de digestão péptica baseou-se em protocolo
previamente estabelecido por DUBEY (1998b), assim como o preparo do inóculo,
com algumas modificações.
30
Cada encéfalo foi triturado por inteiro e separadamente, utilizando-se para
isso um liquidificador de uso doméstico. Durante a trituração adicionou-se um
volume mínimo de PBS para facilitar o procedimento. O copo do aparelho foi
devidamente lavado entre as etapas para evitar contaminação entre as amostras.
Foram então retirados 40 gramas de cada homogeneizado, que foram armazenados
individualmente em Erlenmeyers de 200ml devidamente identificados. Completou-se
o conteúdo com solução de pepsina ácida até o volume de 200ml. A pepsina ácida
foi preparada com a adição de 2,6 g de pepsina, 5 g de cloreto de sódio e 7 ml de
ácido clorídrico, completando-se com água destilada até atingir um volume total de
500 ml. Com o auxílio de um peagâmetro, estabilizou-se o pH entre 1,1 e 1,2.
O processo de digestão foi simulado com o uso de um agitador orbital
termostatizado (incubadora tipo “shaker”), programado para uma temperatura de
37°C durante uma hora. Após este período, o material digerido foi passado em tamis
com gaze dupla, o filtrado distribuído em quatro tubos de 50ml e então centrifugado
a 1800g por 10 minutos.
Após a centrifugação, descartou-se o sobrenadante, restando apenas um
“pellet” de aproximadamente 5 ml no interior de cada tudo. Completou-se o conteúdo
com solução neutralizadora até atingir um volume final de 10 ml. Para o preparo da
solução neutralizadora (bicarbonato de sódio 1,2%) adicionaram-se 12 g de
bicarbonato de sódio e água destilada até atingir um litro. O pH da solução final foi
estabilizado em 8,3.
O conteúdo total de cada um dos quatro tubos foi reunido em um único tubo
de 50ml. Este foi centrifugado e processado a 1800g durante 20 minutos. Após a
centrifugação, o sobrenadante foi descartado e adicionaram-se cinco a 10 ml de
solução antibiótica. A solução antibiótica foi preparada com a adição de 100 µg/ml
de estreptomicina e 1000 UI de penicilina. 4.10. Bioprova
4.10.1. Inoculação Foram utilizados 48 camundongos albinos, pesando entre 20 e 25 g,
oriundos do Biotério da UENF. Duas doses de 1 ml da suspensão contendo o
produto da digestão péptica foram inoculadas via intraperitoneal (i.p.) nos
camundongos, com um intervalo de 24 horas entre as inoculações. Foram utilizados
31
três camundongos para cada amostra, totalizando 36 camundongos inoculados.
Outros 12 receberam inóculo contendo apenas o veículo (Tampão Salina Fosfato –
PBS) e serviram como controle para cada três amostras de encéfalo analisadas.
4.10.2. Isolamento do parasita
Cada grupo de camundongos inoculados, referente a um encéfalo
examinado, foi mantido em uma caixa devidamente identificada e recebeu ração
própria para a espécie e água ad libitum. Os animais foram observados durante seis
semanas. Aqueles que morreram, apresentaram aumento de volume abdominal ou
qualquer sinal que sugeriu infecção por T. gondii, foram examinados para eventual
presença do parasita em líquido peritoneal e impressão de órgãos em lâminas,
através da observação em microscópio óptico5 após coloração com GIEMSA. Os
encéfalos dos camundongos que não apresentaram quaisquer sinais de
toxoplasmose ao fim do período de observação foram examinados através de
observação direta de esfregaços de encéfalos ao microscópico óptico e da técnica
de arrasto.
a) Observação de taquizoítas em líquido peritoneal
Nos animais que morreram ou apresentaram aumento de volume abdominal
e/ou outros sinais que demonstraram suspeita da doença foi realizada lavagem
peritoneal com solução salina 0,9%. Uma gota do conteúdo foi então colocada entre
lâmina e lamínula para observação de formas de proliferação rápida de T. gondii
(taquizoítas).
b) Impressão de órgãos em lâminas Daqueles animais que vieram a óbito ou que foram eutanasiados, por
apresentarem aumento de volume abdominal, foram colhidas amostras de fígado,
baço e pulmão. Estas amostras passaram por um procedimento que consiste em
opor fragmentos de tecidos em lâminas, fixar com metanol, corar com GIEMSA e
5 OPTON
32
observar ao microscópio óptico em busca de taquizoítas. Para a coloração com
GIEMSA, cada lâmina foi completamente coberta com o corante (Azur II 80mg/dl +
Eosinato de Azur II 100mg/dl), através do auxílio de uma pipeta Pasteur. Decorridos
30 minutos, as lâminas foram lavadas em água corrente para remoção do excesso
do corante e secas à temperatura ambiente.
c) Observação direta de esfregaços de encéfalos
Os animais que não vieram a óbito 42 dias após a inoculação foram
eutanasiados, seus encéfalos retirados e individualmente macerados com PBS em
quantidade suficiente apenas para homogeneização da mistura. Em seguida, com o
auxílio de seringas e tubos de 15 ml, foram feitos esfregaços em lâminas para
observação direta ao microscópio óptico em busca de cistos encefálicos.
d) Técnica de arrasto Ainda acerca dos animais que não vieram a óbito após o fim do período de
observação, fragmentos dos tecidos encefálicos foram utilizados para a observação
de cistos cerebrais sob a técnica de arrasto.
Esta técnica consiste em colocar-se um fragmento de tecido entre duas
lâminas e arrastar uma sobre a outra, formando uma camada delgada de tecido para
observação ao microscópio óptico após fixação e coloração com GIEMSA.
4.10.3. Eutanásia
A eutanásia dos camundongos utilizados neste experimento foi realizada em
câmara de CO2, conforme resolução nº 714 de 20 de junho de 2002 do Conselho
Federal de Medicina Veterinária (CFMV, 2002) e com a Lei Estadual nº 3900/02
(ALERJ, 2002).
33
4.11. Análise estatística das medidas dos taquizoítas
As medidas médias e os índices morfométricos dos taquizoítas foram
submetidos à análise descritiva e suas médias comparadas através do teste de
Tukey (PIMENTEL GOMES, 2000).
34
5. RESULTADOS
5.1. Padronização do teste sorológico 5.1.1. Para amostras bovinas
As amostras de soros de bovinos foram testadas nas diluições 1:500 e
1:1.000, nos três sistemas, a primeira permitiu melhor distinção entre os controles.
As três concentrações de solução bloqueio apresentaram resultados
satisfatórios e podem ser utilizadas em ensaios imunoenzimáticos para análise da
presença de anticorpos anti-T. gondii em soros de bovinos (figura 2). Entretanto, o
sistema que utilizou PBS-T 0,1% como bloqueio foi o escolhido para esta análise.
5.1.2. Para amostras suínas
Dentre as diluições de soro 1:200, 1:400 e 1:800, a que melhor permitiu
observar as diferenças existentes entre os soros positivos e negativos nos quatro
sistemas apresentados foi a diluição 1:400, como pode ser observado nas figuras 3
e 4.
A diluição do conjugado escolhida foi 1:20.000 (Figura 4) e a concentração
de antígeno escolhida para sensibilização da placa foi 5µg/ml (Figuras 3 e 4).
35
0,6135
0,3495
0,46
0,251
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
1 500 + 1 500 - 1 1000 + 1 1000 -
0,6795
0,327
0,457
0,236
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
1 500 + 1 500 - 1 1000 + 1 1000 -
0,6385
0,326
0,4925
0,2515
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
1 500 + 1 500 - 1 1000 + 1 1000 -
B C
A
Figura 2. Valores em densidade óptica (DO) em ensaio para padronização deELISA indireto em soros de bovinos. Diluição do conjugado 1:4.000;diluição dos soros controle positivo e negativo a 1:500 e 1:1000 esensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml. (A) Solução bloqueiocom PBS-T 0,05% + BSA 1%. (B) PBS-T 0,05% + ovalbubina 1%. (C)PBS-T 0,1%.
36
1,3485
0,5885
1,3153
0,392
0,9783
0,3115
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1 200 + 1 200 - 1 400 + 1 400 - 1 800 + 1 800 -
1,54
0,6635
1,4605
0,4635
1,2803
0,3255
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1 200 + 1 200 - 1 400 + 1 400 - 1 800 + 1 800 -
A B
Figura 3. Valores em densidade óptica para padronização do ELISA indireto emsoros de suínos. Diluição do conjugado 1:10.000; diluição dos soroscontrole positivos e negativos a 1:200, 1:400 e 1:800. (A)sensibilização da placa com antígeno a 5 µg/ml. (B) sensibilização daplaca com antígeno a 10 µg/ml.
0,8515
0,3805
0,6978
0,265
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1 200 + 1 200 - 1 400 + 1 400 -
1,0163
0,3885
0,792
0,2845
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1 200 + 1 200 - 1 400 + 1 400 -
A B
Figura 4. Valores em densidade óptica em ensaio para padronização do ELISAindireto em soros de suínos. Diluição do conjugado 1:20.000 ediluição dos soros controle positivos e negativos a 1:200 e 1:400. (A)sensibilização da placa com antígeno a 5 µg/ml. (B) sensibilização daplaca com antígeno a 10 µg/ml.
37
5.2. Cálculo do “cut-off” e discriminação da soropositividade 5.2.1. Em bovinos O ELISA indireto para detecção de anticorpos do tipo IgG em soros de
bovinos foi realizado em duas placas. Para a primeira placa, os valores em DO
obtidos para os controles sabidamente positivos e os três controles negativos foram,
respectivamente, 0,2760; 0,1840; 0,1910 e 0,1895. A partir destes valores, aplicou-
se a fórmula (ver material e métodos) e calculou-se o “cut-off” em 0,1992. Os valores
em DO para os soros positivos são apresentados na figura 5.
Para a segunda placa, observaram-se valores em DO para o controle
positivo e os três controles negativos de 0,2190; 0,1555; 0,1560 e 0,1555. Com base
nestes valores, calculou-se o “cut-off” correspondente a este sistema em 0,1565. Os
valores em DO para os soros considerados positivos são apresentados na figura 6. 5.2.2. Em suínos O teste de ELISA indireto para detecção de anticorpos do tipo IgG anti-T.
gondii em soros de suínos também foi realizado em duas placas. Na primeira placa,
os valores em DO para os dois controles positivos e os quatro negativos foram,
respectivamente, 0,7195; 0,5595; 0,1555; 0,2860; 0,2705 e 0,2370. A partir destes
valores, calculou-se o “cut-off” em 0,4120. Os valores em DO para os soros positivos
são apresentados na figura 7.
Para a segunda placa os valores em DO obtidos para os dois controles
positivos e os três controles negativos foram, respectivamente, 0,4430; 0,7125;
0,1580; 0,2145 e 0,2245. O valor do “cut-off” para este sistema foi 0,2810. Nesta
placa, todos os soros analisados foram considerados negativos.
38
0,
0,276
0,184 0,1992 0,2195 0,20250,2305 0,2125 0,2
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 1 2 3 4 5
276
0,184 0,1992 0,209 0,22950,278
0,214 0,2055
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 6 7 8 9 10
0,276
0,184 0,1992
0,260,202 0,204 0,2135 0,2075 0,2175
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 11 12 13 14 15 16
Figura 5. Valores em densidade óptica (DO) em ensaio imunoenzimático (ELISA indireto)dos soros dos bovinos positivos (placa 1). Diluição do conjugado 1:4.000;diluição dos soros a 1:500; sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml ebloqueio com PBS-T 0,1%.
39
-0
0,219
0,1555 0,1565 0,178 0,161 0,1570,1965
0,1615
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 1 2 3 4 5
0,219
0,1555 0,1565 0,158 0,1570,184
0,1575 0,165
,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 6 7 8 9 10
0,2190,1555 0,1565
0,1965 0,171 0,158 0,1605 0,1575
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 11 12 13 14 15
0,219
0,1555 0,1565
0,3025
0,1775 0,1585 0,159 0,1655
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 16 17 18 19 20
0,2190,1555 0,1565 0,158 0,1615
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Controle + Controle - cut-off 21 22
Figura 6. Valores em densidade óptica em ensaio imunoenzimático (ELISA indireto)
dos soros dos bovinos positivos (placa 2). Diluição do conjugado 1:4.000;diluição dos soros a 1:500; sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/mle bloqueio com PBS-T 0,05% e BSA 1%.
40
0,7195
0,1555
0,412 0,429
0,585
0,4590,535
0,469
0,5950,539
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 1 2 3 4 5 6 7
Figura 7. Valores em densidade óptica em ensaio imunoenzimático (ELISAindireto) dos soros dos suínos positivos. Diluição do conjugado1:20.000; diluição dos soros a 1:400 e sensibilização da placa comantígeno a 5 µg/ml.
41
5.3. Prevalência de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii
5.3.1. Nos soros bovinos A análise laboratorial das amostras de soro dos bovinos criados em
propriedades dos arredores e limites deste município resultou num percentual de
positividade total de 49,35% (Tabela 1).
Dos 77 animais analisados, 39 eram utilizados para produção tanto de leite
como de carne (produção mista), 33 para produção apenas de leite e cinco para
produção de carne (Tabela 1).
Dentre os cinco animais utilizados para produção de carne, nenhum
apresentou soropositividade. Em compensação, dos animais utilizados para
produção mista, em 53,85% foi observada positividade. Para os animais utilizados
para produção leiteira, 51,51% apresentaram anticorpos anti-T. gondii em suas
amostras séricas (Tabela 1).
Um outro ponto que se pôde avaliar nesta pesquisa foi o comportamento das
prevalências de anticorpos nos soros dos bovinos provenientes de diferentes
sistemas de criação. Foi possível distinguir dois tipos principais de sistemas, sendo
eles o extensivo e o semi-extensivo. Analisando-se os dados da tabela, pôde-se
detectar um maior percentual de anticorpos dentre aqueles animais mantidos sob
sistema extensivo (70%). Uma prevalência igualmente elevada foi encontrada para o
sistema semi-extensivo (44,64%). Todavia, o sistema semi-extensivo foi
predominante dentre as propriedades pesquisadas (Tabela 1). É importante salientar
que 11 animais não foram possíveis de serem identificados quanto ao tipo de
criação. Neste grupo também foi possível detectar um alto percentual de positividade
para a presença de anticorpos anti-T. gondii em seus soros (54,55%)
42
Tabela 1. Presença de anticorpos anti-Toxoplasma gondii, pelo teste de ELISA indireto, em bovinos criados nos arredores e limites do município de Campos dos Goytacazes/RJ.
ESPECIALIDADE Mista Leite Carne Total
SISTEMA DE CRIAÇÃO
NAa MIb DPc NA MI DP NA MI DP NA MI DP Extensivo
Animais Totais Nd - - 10 6,9 1,91 N - - 10 6,9 1,91Animais Positivos N - - 7
a Número de animais b Média das idades dos animais c Desvio padrão da média das idades d Não foram avaliados soros de animais com essas características
5.3.2. Nos soros suínos Após discriminação dos resultados das DOs dos soros dos suínos em
relação aos valores de “cut-off” obtidos para os ensaios realizados, observou-se uma
prevalência de 20,59% de soropositividade para anticorpos anti-T. gondii para
suínos mantidos sob sistema de criação domiciliar.
Os suínos mantidos sob sistema de confinamento obtiveram uma
prevalência baixa, pois nenhum dos animais estava soropositivo para anticorpos
anti-T. gondii.
Os índices de infecção obtidos em relação ao sexo foram, para machos e
fêmeas, respectivamente, 33,33% e 13,64% (Tabela 2). No entanto, os fatores
determinantes desta diferença não puderam ser detectados, havendo necessidade
da realização de outros trabalhos para uma investigação mais acurada desta
relação.
43
No que diz respeito à idade dos animais, os percentuais de soropositividade
foram, para os animais de criações domiciliares, 35,29% para animais com idade
igual ou superior a um ano de vida e 5,88% para animais que apresentaram idade
inferior a um ano (tabela suínos).
Tabela 2. Anticorpos anti-Toxoplasma gondii observados em soros de suínos criados em regiões urbanas e arredores do Município de Campos dos Goytacazes/RJ.
SISTEMA DE CRIAÇÃO MACHOS FÊMEAS TOTAL P/Na PPb P/N PP P/N PP
TOTAL 4/36 11,11% 3/25 12% 7/61 11,48%< 1 ANO 1/31 3,23% 0/13 0 1/44 2,27% ≥ 1 ANO 3/5 60% 3/12 25%
6/17 35,29%a Número de animais positivos / número total de animais. b Percentual de positividade.
5.4. Isolamento de Toxoplasma gondii em encéfalos de suínos
Dos 12 encéfalos de suínos analisados neste experimento foi possível
detectar a presença de T. gondii em seis. Isto significa que 50% dos animais
estavam infectados por parasitas viáveis, os quais promoveram infecções agudas e
latentes em camundongos.
Foram observados parasitas no exsudato peritoneal, fígado, baço, pulmão e
encéfalo dos camundongos infectados, variando de animal e estado infectivo. Houve
ampla distribuição do parasita nos órgãos dos camundongos, com 25% de
isolamento para cada órgão (Tabela 3).
O resultado da inoculação de homogeneizados de encéfalos de três suínos
(animais de números quatro, seis e sete) provocou morte nos camundongos nos dias
15, nove e seis após a infecção, respectivamente. Estes animais foram vítimas de
44
toxoplasmose aguda, comprovada pelo isolamento do parasita em líquido peritoneal.
Não foram observados sinais clínicos da doença nestes animais.
Os camundongos inoculados com homogeneizados de encéfalos de outros
dois suínos (animais números dois e nove) não apresentaram sinais clínicos até o
término do período de observação. Nestes, verificou-se a presença de cistos de T.
gondii em seus encéfalos.
Um camundongo inoculado com homogeneizado de amostra encefálica do
suíno número cinco apresentou sinais nervosos 38 dias após a inoculação e foram
detectados cistos de T. gondii em seu encéfalo.
Os taquizoítas observados no líquido peritoneal dos camundongos (Tabela
4) apresentaram medidas médias de 5,86 x 2,06 µm em seus diâmetros maior e
menor, respectivamente, para o suíno quatro; 5,25 x 2,08 µm para o suíno seis; e
6,22 x 2,31 µm para o suíno sete. Não foram observadas diferenças significativas
entre as medidas referentes a cada animal.
Tabela 3. Isolamento de Toxoplasma gondii de suínos (Sus scrofa) comercializados em estabelecimentos populares do Município de Campos dos Goytacazes/RJ.
Percentual 25 25 25 25 25 50 a Procedimento verificado em animais com ascite ou sinais de toxoplasmose. b Procedimento verificado em animais seis semanas após inoculação. c Animal eutanasiado com sintomatologia nervosa cinco semanas após inoculação.
45
Tabela 4. Dimensões de taquizoítas de Toxoplasma gondii isolados de suínos (Sus scrofa) em lavado peritoneal de camundongos (Mus musculus).
ISOLAMENTOS VALOR DE pDADOS
Suíno 4 Suíno 6 Suíno 7
Amostrasa 10 10 10 -
Diâmetro maior 5,86±0,50 5,25±1,30 6,22±0,86 0,0880
Diâmetro menor 2,06±0,48 2,08±0,33 2,31±0,40 0,3347
Índice Morfométrico 3,02±0,91 2,54±0,59 2,74±0,44 0,3046 aNúmero de taquizoítas medidos.
46
6. DISCUSSÃO
6.1. Padronização do teste sorológico
6.1.1. Para amostras bovinas A escolha da solução PBS-T 0,1% como bloqueio para a análise sorológica
em bovinos deveu-se ao fato desta demandar um reagente a menos em comparação
às demais, que continham, além do PBS-T, ovalbumina ou BSA. Isto é um fator
simplificador e econômico para o procedimento. O ELISA é um método diagnóstico
considerado viável para a avaliação em massa (GUHL et al., 1981). Desta forma,
toda oportunidade para simplificá-lo e reduzir custos deve ser considerada.
6.1.2. Para amostras suínas Durante o processo de escolha da diluição do conjugado adequada para o
ensaio, optou-se por aquela que apresentou boas diferenças entre os controles, com
menores valores de DO. Valores de DO muito altos em ELISA podem aumentar as
chances de interferências nos resultados, como as oriundas de alta concentração do
conjugado. Por isso a escolha da diluição do conjugado 1:20.000 em detrimento a
1:10.000. (Figura 7). Seguindo o mesmo raciocínio, a concentração de antígenos
escolhida para sensibilização da placa foi 5µg/ml (Figuras 6 e 7).
47
6.2. Cálculo do “cut-off” e discriminação da prevalência 6.2.1. Em bovinos De todas as amostras de soros bovinos analisadas, a de número 16 da placa
dois merece destaque pela expressiva absorção no comprimento de onda de 405
nm (Figura 6). Esta amostra foi coletada de uma vaca de cinco anos de idade.
Outras quatro amostras destacam-se pelos maiores valores em relação às demais.
São as de números quatro e 11 do ensaio realizado com a placa dois, e oito e 11 da
placa um (Figuras 5 e 6).
Algumas amostras consideradas negativas apresentaram valores em DO
muito próximos ao “cut-off”. Nove amostras (12,33%) obtiveram valores para DO
que ficaram a menos de 0,0100 do valor do “cut-off” de sua respectiva placa. É um
expressivo percentual e merece ser comentado.
6.2.2. Em suínos De todas as amostras de soro positivas, merecem destaque as de números
dois e seis (Figura 7), pela expressiva absorção no comprimento de onda de 405
nm. Ambas são provenientes de animais machos, com cinco meses e dois anos de
idade, respectivamente.
6.3. Prevalência de anticorpos IgG anti-T. gondii
6.3.1. Nos soros bovinos TIÚBA (1998) revisou dados sobre os índices nacionais de infecção por T.
gondii nos principais animais passíveis de transmitir o parasita ao homem pela
ingestão de sua carne. O percentual encontrado para bovinos (32,30%) ficou abaixo
do detectado neste trabalho de pesquisa (49,35%). Desta forma, com um índice que
ultrapassa os níveis de infecção bovina por T. gondii do país, pode-se considerá-lo
expressivo. É interessante comentar que os níveis de anticorpos anti-T. gondii em
outros estados do Brasil, como a Bahia (PITA-GONDIM et al., 1999), distanciam-se
em larga escala dos da região pesquisada neste trabalho (1,03%).
O alto percentual de infecção bovina aqui apresentado, somado aos dados
encontrados por outros pesquisadores (OLIVEIRA et al., 2001), permite que se
48
pondere sobre o risco de infecção com T. gondii através do consumo da carne
destes animais. Em outras áreas do mundo, pesquisadores ponderam que o bovino
não representa uma fonte potencial de infecção humana por T. gondii ao afirmar que
não encontraram cistos do parasita em tecidos deste animal de produção após
infecção oral com oocistos esporulados (ESTEBAN-REDONDO et al., 1999).
Entretanto, OLIVEIRA et al. (2001) confrontam estes dados, já que infectaram
bovinos experimentalmente, via oral, com oocistos de T. gondii e isolaram o parasita
70 dias depois, em diferentes órgãos. Estes autores isolaram, inclusive das
musculaturas dos animais, incluindo partes nobres muito apreciadas e, em muitos
casos, ingeridas mal-cozidas pelo consumidor, como o filé mignon (psoas maior) e a
picanha (glúteo superficial).
O percentual de soropositividade para a presença de anticorpos anti-T.
gondii encontrado dentre os animais utilizados para produção leiteira (51,51%) foi
alto quando comparado ao obtido com o mesmo tipo de animal em outras regiões do
Brasil e do mundo. ALBUQUERQUE et al. (2005) analisaram soros de vacas leiteiras
dos municípios de Resende e Rio Claro no Estado do Rio de Janeiro. Os resultados
foram 15,3% e 14,2% respectivamente. O teste sorológico utilizado foi o de
Imunofluorescência (IFAT). Utilizando-se o LAT (Teste de Aglutinação em Látex) e o
IHAT (Teste de Hemaglutinação Indireta), HASHEMI-FESHARKI (1996) não
encontrou anticorpos anti-T. gondii numa amostragem total de 2000 vacas leiteiras
no Iran. Já em pesquisa realizada por HUONG et al. (1998) no sul do Vietnã foi
relatado um nível de anticorpos em bovinos de 10,5%, numa amostragem de 200
animais. Isso mostra o quanto, apesar de ser a mais cosmopolita das zoonoses, os
níveis de infecção por T. gondii podem variar muito entre as diferentes regiões do
planeta. Ao mesmo tempo, infere-se que a infecção por T. gondii seja altamente
disseminada, também, em outros países, como citado por SAMAD et al. (1993) a
respeito do nível de infecção em bovinos utilizados para consumo humano em
Bangladesh (Quadro 1).
Analisando-se os dados referentes às idades dos animais (Tabela 1), é
importante destacar o alto percentual de animais soropositivos em idade avançada.
Segundo DUBEY (1983), T. gondii pode permanecer viável em tecidos bovinos até a
idade de abate destes animais.
Em busca de fatores que explicassem a prevalência da toxoplasmose em
bovinos, HEJLICEK et al. (1995) realizaram estudos com esses animais em diversas
49
propriedades. Segundo estes autores, animais de propriedades pequenas possuem
mais chances de aquisição de infecções por T. gondii, pois estão mais sujeitos ao
contato com gatos. Estes dados estão de acordo com observações feitas em
propriedades de bovinos nos arredores do município, válidos também para as
propriedades de suínos. Em adição, os principais reservatórios de T. gondii nas
propriedades são os pequenos mamíferos terrestres, em virtude da importância que
possui a transmissão intra-uterina na disseminação da toxoplasmose nestes animais
(HEJLICEK et al., 1995). Não raro observa-se roedores e outros pequenos
mamíferos ao redor das propriedades. Estes animais são, geralmente, caças
perfeitas para os felídeos que vivem nas proximidades da criação e, indiretamente,
mantém o ciclo da parasitose ativo.
DUBEY relatou o primeiro isolamento de T. gondii viável em uma vaca adulta
naturalmente infectada. O estudo aconteceu numa propriedade americana e o
animal seria utilizado para consumo humano (DUBEY, 1992). O parasita foi isolado
da parede intestinal e o hospedeiro apresentou alta titulação para anticorpos contra
T. gondii em seu soro. Um ano depois, DUBEY e THULLIEZ (1993) isolaram T.
gondii da língua, coração, fígado, cérebro e musculatura esquelética de três bovinos
experimentalmente infectados com 10.000 oocistos da cepa GT-1. No ano seguinte,
ARIAS et al. (1994a) isolaram T. gondii em vários outros tecidos bovinos
naturalmente infectados através de bioprova e ponderaram a respeito da importância
destes animais na epidemiologia da toxoplasmose na Costa Rica.
Estes isolamentos vêm respaldar a importância da carne bovina como
reservatório do parasita. HEJLICEK et al. (1995) ponderam que a transmissão de
formas infectantes de T. gondii ao homem a partir de fontes conhecidas merece total
atenção dos especialistas e é um ponto-chave para a prevenção da toxoplasmose.
6.3.2. Nos soros suínos A análise dos resultados encontrados para a soroprevalência de anticorpos
anti-T. gondii nos suínos mantidos sob sistema de criação domiciliar (20,59%)
permite inferir que o nível de infecção por T. gondii dos suínos criados em sistema
de confinamento é expressivamente menor, pois todos foram soronegativos. Estes
resultados foram também verificados por outros pesquisadores (TENTER et al.,
2000), os quais afirmaram que a prevalência de T. gondii em animais utilizados para
50
consumo humano criados em propriedades que utilizam sistema intensivo de criação
decresceu consideravelmente nos últimos 20 anos. Afirmam ainda que a utilização
do sistema tecnificado para criação de suínos reduziu a importância da carne suína
como transmissora da toxoplasmose para o homem em países da União Européia.
Mas, segundo WANG et al. (2002), mesmo havendo indícios de que o sistema
intensivo de criação diminua significativamente a probabilidade dos suínos serem
infectados, o baixo retorno financeiro não compensaria a mudança de manejo,
desestimulando os criadores em tal investimento.
As práticas de manejo estão associadas diretamente à prevalência de
anticorpos anti-T. gondii em suínos (AGANGA et al., 1981; ARKO-MENSAH et al.,
2000). Os cuidados dispensados pelos criadores (WENTZ et al., 1986) aos animais
sob regime tecnificado como, por exemplo, maior rigor no controle de outros animais
na área, inclusive roedores, e melhor sistema de limpeza e desinfecção ambiental
devem ter seguramente contribuído para minimizar os riscos de infecção pelo
protozoário. Pondera-se que estes fatores justificariam as baixas prevalências em
suínos registradas em outras pesquisas no Brasil (AMARAL et al., 1975; SILVA et
al., 1981; SOUZA, 1995).
DAVIES et al. (1998) classificaram suínos em terminação na Carolina do
Norte, EUA, de acordo com os sistemas de manejo, em animais mantidos a pasto e
animais mantidos em confinamento. Após pesquisa de anticorpos, descobriu-se que
a soroprevalência de anticorpos anti-T. gondii dentre os animais mantidos a pasto foi
de 19,47% e apenas 0,057% para os animais mantidos em confinamento. SOUZA
(1995) coopta com estes dados, pois encontrou baixo índice de positividade (1,11%)
em animais tecnificados em trabalho realizado em abatedouros de suínos da
Mesorregião do Grande Rio de Janeiro.
Estes dados vêm reafirmar os resultados aqui apresentados e reforçam,
ainda, os de GARCIA et al. (1999), que encontraram resultados similares em suínos
criados em áreas rurais, com prevalência de 24% através da Reação de
Imunofluorescência Indireta (RIFI) no Município de Jaguapitã, Paraná. Outros
pesquisadores ponderam, inclusive, que suínos criados em regime semi-intensivo
estão mais sujeitos e expostos ao risco de infecção, através da ingestão de oocistos
liberados pelas fezes de felídeos (DUBEY, 1990; DUBEY et al., 1990; ZIMMERMAN
et al., 1990; DUBEY et al., 1991).
51
Um surto de toxoplasmose clínica foi registrado em 13 de 80 suínos numa
propriedade alemã (WEISSENBOCK e DUBEY, 1993). A causa presumida foi
ingestão de fezes de gatos através da comida dos animais. Sete animais morreram e
um foi eutanasiado. Os principais sinais clínicos foram anorexia, apatia, febre,
cianose, dispnéia e fraqueza parcial de membros posteriores. Dois animais
sobreviveram e foram eutanasiados nos dias 40 e 140 após o aparecimento dos
sinais. Nestes foram detectados altos títulos de anticorpos, meningoencefalite severa
e cistos de T. gondii no cérebro, além de hiperplasia dos órgãos linfóides.
Providências deveriam ser tomadas para que haja uma redução da exposição dos
animais ao T. gondii (GAMBLE et al., 1999), o que inclui melhores condições de
higiene nos criadouros.
OMATA et al. (1994) sugerem que a produção de anticorpos anti-T. gondii
em suínos é dependente da patogenicidade da cepa infectante. As principais
evidências para esta afirmação encontram-se no fato de isolados que provocaram
morte mais rápida em camundongos (< 15 dias apos a infecção) foram os que
suscitaram titulações mais altas em suínos. Após as análises dos soros dos suínos
do presente estudo, foram observados valores de DO que se destacaram das
demais (Figura 7). Esta última observação suporta a necessidade da realização de
pesquisas futuras que caracterizem geneticamente os isolados de T. gondii oriundos
de carnes suínas comercializadas neste município.
Em resposta ao uso cada vez maior de sistemas tecnificados de produção
animal, muito mais eficientes contra a propagação de doenças, e à demanda
crescente de consumidores cada vez mais exigentes, alguns produtores holandeses
têm investido em sistemas de manejo mais sensíveis ao conforto animal (KIJLSTRA
et al., 2004). Um novo sistema que tem adquirido fama na Holanda é o chamado
“Animal-Friendly Pig Production Systems”, que possui algumas características
singulares em comparação ao tradicional sistema tecnificado. As principais
diferenças são: acesso dos animais ao pasto, cama de palha, uso restrito de drogas
e antibióticos e alimentos orgânicos (vegetais cultivados em fazendas que não
utilizam fertilizantes químicos artificiais ou pesticidas). A análise final permite aos
autores inferirem que o novo sistema de criação pode levar à reemergência da
toxoplasmose no país.
52
6.4. Isolamento de Toxoplasma gondii em encéfalos de suínos
A detecção de cistos em cérebros de suínos pode ser indício da presença de
cistos em outras vísceras e musculaturas (DUBEY et al., 1986). Levando-se em
consideração os resultados encontrados neste trabalho de pesquisa para a presença
de T. gondii viável em encéfalos de suínos e que, muitas vezes, cérebro e músculos
são utilizados na confecção de embutidos, como a lingüiça, existe risco real de
infecção através do consumo de carne e vísceras cruas ou mal cozidas de suínos do
Município de Campos dos Goytacazes (SUAREZ-ARANDA et al., 2000). Ainda,
estes animais podem ser fonte de infecção para felídeos e, conseqüentemente, fonte
indireta de infecção ao homem através dos oocistos liberados quando felídeos são
alimentados com músculos ou vísceras infectadas de suínos (RUIZ e FRENKEL,
1980; DUBEY, 1986; MAYER et al., 1987).
Em um estudo feito por DUBEY (1988), foi possível isolar T. gondii em 14 de
16 suínos soropositivos para anticorpos anti-T. gondii. Após eutanásia nos dias 103
e 875 após inoculação com oocistos do parasita, T. gondii foi isolado do cérebro,
coração, língua e diafragma dos animais. Este mesmo autor infere ainda a respeito
da possibilidade de outros órgãos estarem infectados. Tendo em vista as
ponderações deste autor, pode-se afirmar que houve correlação positiva entre os
resultados sorológicos de suínos criados neste município e o isolamento de T. gondii
em amostras encefálicas desta espécie comercializada na mesma área geográfica.
A busca por anticorpos em animais de produção pode ser um avaliador concreto da
presença de T. gondii em tecidos suínos e, conseqüentemente, do risco a que se
submete a população ao ingerir carne crua ou mal-cozida destes animais
(D`ÁNGELINO e ISHIZUKA, 1986).
Em pesquisa a respeito da distribuição de cistos teciduais deste parasita em
suínos, DUBEY et al. (1984) isolaram T. gondii em vários órgãos dos animais,
incluindo cérebro (8/8), língua (7/8), musculatura esquelética (5/8), diafragma (4/8),
rins, fígado e intestino delgado (2/8), e glândulas salivares e olhos (1/8). Segundo os
autores, coração e cérebro são os tecidos mais indicados para pesquisa de T.
gondii. Afirmam também que espécimes viáveis de T. gondii podem persistir em
tecidos comestíveis de suínos vivos por no mínimo 171 dias. Há, desta forma, uma
relação positiva entre a presença de T. gondii em encéfalos de suínos e outros
tecidos comestíveis do animal, representando risco de infecção pela ingestão de
carne ou vísceras de porco cruas ou mal cozidas. No presente trabalho os suínos
53
utilizados estavam naturalmente infectados, diferentemente dos suínos analisados
pelos autores acima citados. Isto é mais uma evidência do risco de infecção ao qual
a população está exposta, ressaltando-se que animais deste tipo são
comercializados livremente em Campos dos Goytacazes.
Pesquisas foram realizadas com o intuito de se estudar a prevalência da
toxoplasmose suína em várias regiões do Brasil e no mundo. NAVARRO et al.
(1992) encontraram cistos teciduais em 19,66% das carnes suínas comercializadas
em açougues da cidade de Londrina/PR. Mais recentemente, GARCIA et al. (1999)
revelaram uma soroprevalência de 24% em suínos criados de forma rústica em
propriedades rurais do Estado do Paraná. T. gondii viável foi isolado de uma de 67
amostras de carne suína curada pronta para consumo (WARNEKULASURIYA et al.,
1998). Em São Paulo, isolou-se T. gondii viável em 7 de 28 suínos soropositivos. Em
Massachussetts, EUA, isolou-se T. gondii em 51 de 55 suínos destinados ao
consumo humano.
Dois surtos de toxoplasmose aguda em seres humanos foram notificados
por CHOI et al. (1997). No primeiro caso, três pacientes apresentaram sinais de
coriorretinite unilateral como conseqüência da ingestão de baço e fígado crus de um
suíno selvagem. Os primeiros sinais clínicos surgiram três meses após a ingestão
dos tecidos infectados. No segundo surto, um de cinco soldados que comeram
fígado cru de um suíno doméstico desenvolveram linfadenopatia. Ambos os casos
ocorreram na Coréia.
Na presente pesquisa, encontrou-se um alto percentual de suínos
soropositivos para anticorpos anti-T. gondii, em sua grande maioria com idade
superior a um ano. Tomando como base a relação soropositividade e isolamento, já
discutida nos parágrafos acima, isto explicaria o alto percentual de isolamento da
pesquisa (50%), pois verificou-se grande maioria de animais abatidos com idade
superior a um ano nos estabelecimentos comerciais pesquisados.
Pesquisas têm confirmado a contaminação ambiental com oocistos de T.
gondii em áreas endêmicas para toxoplasmose humana em Campos dos
Goytacazes (DUBEY et al., 2003). A confirmação ocorreu através de bioprova em
camundongos de cérebros e corações de galinhas criadas no município. A
prevalência de T. gondii em galinhas é um bom indicador da contaminação
ambiental (DUBEY et al., 2003), devido ao seu hábito de ingerir porções de terra
durante a alimentação. Assim, é certo que outros animais domésticos que convivem
54
no mesmo espaço também estejam expostos à infecção, principalmente porcos, pelo
seu hábito de fuçar o solo. Adicionalmente, observou-se uma predominância de
isolados da linhagem tipo I nas galinhas da região. Esta cepa é altamente virulenta e
encontrada em infecções clínicas em humanos (DUBEY et al., 2002). Outros
trabalhos são, portanto, necessários para uma análise genética da linhagem de T.
gondii isolada dos suínos comercializados em estabelecimentos que fornecem carne
in natura para a população humana. Todavia, há grande possibilidade de estes
animais serem portadores das linhagens tipos I e III, comprovadamente presentes no
solo de áreas endêmicas para toxoplasmose deste município (DUBEY et al., 2003).
De acordo com BAHIA-OLIVEIRA et al. (2003), a incidência de anticorpos
anti-T. gondii na população humana do Município de Campos dos Goytacazes/RJ é
próxima a 80%. Estes resultados, juntamente com os obtidos neste trabalho,
permitem considerar a hipótese de que a alta soroprevalência humana em Campos
dos Goytacazes tenha expressiva influência da ingestão de carne infectada com
cistos do parasita. Um ponto fundamental para a redução da prevalência da
toxoplasmose em seres humanos é o investimento em programas educacionais. Em
estudo realizado por BOYER et al. (2005), a preconização deste tipo de programa
pode ter prevenido a aquisição de T. gondii por mães que tinham riscos claros de
exposição direta ou indireta à carne crua ou mal cozida ou a excrementos de gatos.
No entanto, os autores afirmam que apenas uma busca sistemática por anticorpos
anti-T. gondii de todas as crianças ao parto poderia prevenir ou detectar uma maior
proporção de infecções.
De acordo com DUBEY (1980), em infecções experimentais as cepas
patogênicas matam camundongos dentro de 15 dias e as cepas pouco patogênicas
dentro de um a dois meses. Ainda, segundo BEVERLEY (1976), algumas cepas são
fatais para camundongos, mesmo em baixas doses, enquanto outras não causam
doença aparente. Estes achados nos permitem inferir que algumas das cepas
encontradas neste experimento são virulentas, devido aos óbitos dos camundongos
a partir da primeira semana do experimento.
As medidas médias obtidas de taquizoítas isolados neste experimento estão
de acordo com FRENKEL (1973), que confirmam a forma em meia-lua ou arco dos
taquizoítas, medindo de 4 a 7 µm de comprimento e 2 a 4 µm de largura, e sua
extremidade anterior mais afilada que a posterior (Figura 8).
55
Considerando os taquizoítas e suas respectivas medidas observadas nos
líquidos peritoneais, a morfologia dos cistos observados nos encéfalos dos
camundongos (Figura 9), além da patogenicidade verificada em camundongos,
podemos inferir que o parasita isolado é T. gondii.
Figura 8. Espécimes de Toxoplasma gondii isolados em lavado peritoneal de
camundongo corados por GIEMSA. Em A (— com 10 µm) e em B (—com 5 µm), são observados taquizoítas livres no exsudato peritoneal.Destaque para os núcleos dos parasitas (→). Em C (— com 5 µm),observa-se em detalhes o núcleo de um taquizoíta e grânulos deamilopectina em seu citoplasma (→). Em D (— com 5 µm), destaca-seo parasita em processo de divisão dentro de macrófagos (→ abaixo) e aformação do vacúolo parasitóforo (→ acima).
56
Figura 9. Espécimes de Toxoplasma gondii observados em cérebros decamundongos. Em A e B, cistos em observação a fresco. Destaquepara a parede cística de espessura delgada (→). Em C e D, cistoscorados por GIEMSA. Destaque para os núcleos dos bradizoítas (→).Barra com 20 µm.
57
7. CONCLUSÕES
A partir dos resultados apresentados nesta pesquisa, pode-se concluir que:
O teste de ELISA indireto pode ser utilizado para análises de prevalências
de infecções por T. gondii em rebanhos de suínos e bovinos;
A prevalência de infecção por T. gondii em bovinos e suínos criados no
município de Campos dos Goytacazes e arredores foi considerada alta;
O percentual de infecção por T. gondii dos suínos criados sob sistema de
confinamento foi menor em comparação aos sistemas domiciliares;
Pode haver risco de infecção por T. gondii para a população humana através
do consumo de carne crua ou mal cozida de bovinos de Campos dos Goytacazes e
arredores;
O parasita isolado em encéfalos de suínos comercializados in natura em
estabelecimentos populares do município de Campos dos Goytacazes é T. gondii;
A carne suína in natura vendida em estabelecimentos comerciais populares
deste município pode estar altamente infectada por T. gondii e, desta forma, seu
consumo, crua ou mal cozida, pode representar risco de infecção para a população.
58
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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