Toxicidade de extratos de Piper nigrum, piperina e piperamidas para o diplópodo Orthoporus fuscipes em condições de laboratório

REVISTA BRASILEIRA DE TOXICOLOGIA

BRAZILIAN JOURNAL OF TOXICOLOGY

Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008) 33 - 38

© 2008 Sociedade Brasileira de Toxicologiadireitos reservados

Toxicidade de extratos de Piper nigrum, piperina e piperamidas para o diplópodo Orthoporus fuscipes em

condições de laboratórioJúlia Andrade Romão1, Lilian Boccardo1*, Vanderlúcia Fonseca de Paula2,

Ricardo Jucá Chagas1, Bruno Oliveira Moreira2

1Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Departamento de Ciências Biológicas, Jequié, BA, Brasil; 2Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia Departamento de Química e Exatas, Jequié, BA, Brasil.

Abstract

Toxicity of extracts from Piper nigrum, piperine and piperamides to the millipede Orthoporus fuscipes under labora-tory conditions

The toxicity of an ethanolic extract of black pepper (Piper nigrum), of piperine and of the synthetic amides adamantylpiperamide, isopentylpiperamide and diisopropylpiperamide was evaluated using the millipede Orthoporus fuscipes. For the experiments, the test organism was exposed to a diet of wheat bran and sugar (9:1) supplemented with the test substance in solution and mortality was monitored over a period of 17 days. Mortality was 100% for 0.3 g of the ethanolic extract of black pepper fruits and for diisopropylpiperamide after 4 and 14 days of exposure, respectively. Piperine at a concentration of 0.3 g resulted in 70% mortality after 4 days and remained at this rate until the end of the exposure period. Thus, among the compounds tested the ethanolic extract of black pepper fruit was the most effective and most promising for the control of Orthoporus fuscipes populations since it promoted a higher rate of mortality of the test organism within a shorter period of exposure.

Keywords: millipede, population control, black pepper

*Autor correspondente. Endereço para correspondência: Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Departamento de Ciências Biológicas, Av. José Moreira Sobrinho, s/n°, 45206-190, Jequié, BA, Brasil. Fone: +55 (73) 3528-9656. Fax: +55 (73) 3525-6683. E-mail: [email protected]

INTRODUÇÃO

Os Diplópoda compreendem cerca de 11000 espécies descritas. Seus representantes são distribuídos em todo o mundo e habitam preferencialmente os trópicos (1). São conhecidos, popularmente, como piolhos-de-cobra, caramujis, bichos-do-ouvido, gongos, gongôlos, emboás, milipés e várias outras denominações atribuídas em outras regiões do mundo (2). São encontrados em áreas naturais, jardins, hortas e quintais onde o acúmulo de folhas, detritos, cascas e troncos de árvores conservam umidade e temperatura criando microambientes ideais para sua sobrevivência (3).

Desempenham importante papel na dinâmica dos ecossistemas terrestres, principalmente no que se refere à

decomposição, provocando impactos tanto sob o ponto de vista químico quanto mecânico (4-6).

Entretanto, em condições de secas prolongadas, escassez de alimento e ocupação de nichos vagos, esses animais podem causar transtornos às populações humanas, tanto rurais quanto urbanas, ao invadirem residências e ao acumularem-se em jardins, hortas, lavouras e quintais (7).

Fenômenos desta natureza, no Brasil, foram relatados por Boccardo et al. (8) e Boccardo et al. (9) que registraram a ocorrência e a expansão populacional do diplópodo Plusioporus setiger (Broelemann, 1901) (Diplopoda: Spirostreptidae) em lavouras cafeeiras na região do Alto Paranaíba, MG. Com o intuito de controlar o surto os agricultores utilizaram agrotóxicos organofosforados, carbamatos e piretróides, mas não obtiveram sucesso.

Experimentos de laboratório realizados por Boccardo e Fernandes (6) demonstraram, para Gymnostreptus olivaceus Schubart 1944 (Diplopoda: Spirostreptidae) e Plusioporus setiger uma baixa toxicidade do carbamato methiocarb, por aplicação tópica. Boccardo et al. (7), utilizando o piretróide Deltamethrin, com os mesmos diplópodos verificaram, também, uma baixa toxicidade deste para as duas espécies quando aplicados topicamente. Os autores atribuíram a baixa atividade do produto à aplicação tópica, pois diplópodos, principalmente

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)34

na fase adulta, tem um exoesqueleto calcificado rígido que interfere na penetração do produto.

Assim, no caso deste grupo de animais, faz-se necessária à adoção de outras formas de aplicação e utilização de defensivos eficientes, menos impactantes, e principalmente em dosagens que acarretem um menor risco ambiental e à saúde humana.

Esta é uma preocupação que atinge, de maneira geral, o controle químico de “pragas” de plantas cultivadas, pois é praticamente impossível prever com precisão, o real impacto que os produtos químicos poderão causar, a longo prazo, no meio ambiente (10). Em conseqüência, nos últimos anos, têm aumentado as pesquisas em busca de alternativas para o controle de “pragas” com produtos que possam substituir os agrotóxicos tradicionais, por outros naturais, biodegradáveis e de menor impacto ambiental.

Neste contexto, os efeitos biológicos de plantas da família Piperaceae, têm sido estudados (11-15) e as propriedades inseticidas de plantas dessa família, entre elas Piper nigrum L. (Piperaceae), conhecida como pimenta-do-reino, são bem conhecidas para muitos organismos exceto para diplópodos.

Para outros artrópodos a toxicidade de extratos de frutos da pimenta-do-reino é conhecida desde 1924 (16). Estes extratos são considerados tóxicos para a mosca doméstica Musca domestica Linnaeus, 1758 (Diptera, Muscidae), mosquito Culex pipiens pallens Coquillett, 1898 (Diptera, Culicidae), gorgulho do feijão de corda Callosobruchus chinensis Linnaeus, 1758 (Coleoptera, Bruchidae) (17), bicudo do algodoeiro Anthonomus grandis Boheman, 1843 (Coleoptera, Curculionidae), caruncho do arroz Sitophilus oryzae (Linnaeus, 1763) (Coleoptera, Curculionidae), caruncho do feijão Acanthoscelides obtectus Say, 1831 (Coleoptera, Bruchidae) (16,18); gorgulho do caupi Callosobruchus maculatus Fabricius, 1775 (Coleoptera, Bruchidae) (19), ao caruncho do feijão Zabrotes subfasciatus Boheman, 1833 (Coleoptera, Bruchidae) (20), e à traça dos cereais Sitotroga cerealella (Oliver, 1819) (Lepidoptera, Gelechiidae) (21); são, ainda, repelentes para adultos da lagarta da espiga do milho Helicoverpa zea (Boddie, 1850) (Lepidoptera, Noctuidae) (16,18).

A toxicidade do extrato de frutos da pimenta-do-reino para organismos tem sido atribuída à presença de amidas, entre elas a piperina, seu principal constitutinte (22).

Em relação à toxicidade da piperina, esta foi reportada para Ascia monuste orseis (Godart, 1818) (Lepidoptera: Peiridae) (23), Ostrinia nubilalis Hubner (24) e larvas de Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) resistentes a piretróides (25).

Além da piperina, várias outras amidas naturais, com propriedades inseticidas, têm sido isoladas de frutos de Piper nigrum (26), entre elas, várias isobutilamidas. Entretanto, devido à alta concentração da piperina (3-7%) no fruto (27) e, conseqüentemente, maior facilidade de isolamento, neste trabalho optou-se por utilizá-la como

padrão para comparação das atividades apresentadas pelo extrato e pelas piperamidas sintéticas.

Apesar do desenvolvimento de várias amidas sintéticas, algumas delas, derivadas das próprias amidas naturais (23), pouco se conhece sobre a atividade biológica destas substâncias, e apenas ensaios para avaliação de suas atividades inseticidas têm sido realizados.

Nesta perspectiva este estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade do extrato bruto da pimenta-do-reino, da piperina e das piperamidas, por ingestão, no controle do diplópodo sinantrópico Orthoporus fuscipes (PORAT, 1888) (Diplopoda: Spirostreptidae), encontrado na região de Jequié, BA. O estudo visa gerar alternativa de controle viável economicamente que possa ser aplicada em áreas rurais e urbanas infestadas com diplópodos com baixos riscos ambientais e para a saúde humana.

MATERIAL E MÉTODOS

Organismos-testeOs exemplares adultos de Orthoporus fuscipes

(massa corpórea: 4,0±1,5 g) utilizados neste estudo, foram coletados no Campus Universitário da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB em Jequié, BA. No Laboratório de Zoologia de Invertebrados, os diplópodos foram mantidos em terrários, contendo solo umedecido e material orgânico proveniente dos locais de coleta e alimentados regularmente com folhas de alface e cenoura.

Substâncias-testeA obtenção dos extratos brutos de frutos da

pimenta-do-reino, bem como o isolamento da piperina, foram realizados no Laboratório de Produtos Naturais da UESB, Campus de Jequié e a síntese das piperamidas foi realizada no Laboratório de Análise e Síntese de Agroquímicos da Universidade Federal de Viçosa. Foram utilizados solventes e reagentes da marca Vetec (grau P.A.), exceto o cloreto de oxalila que foi obtido da Aldrich, com grau de pureza de 98%.

Os extratos de frutos da pimenta-do-reino foram obtidos por extração com hexano e com etanol 95%, em aparelho tipo Soxhlet (27). O extrato etanólico foi submetido a fracionamento em coluna de sílica gel, utilizando-se como eluente uma mistura de hexano/acetato de etila (2:1), para isolamento da piperina.

Três amidas, isopentilpiperamida, adamantilpiperamida e diisopropilpiperamida foram obtidas a partir do ácido pipérico proveniente da hidrólise da piperina, de acordo com os procedimentos descritos nas seguintes etapas.

As fórmulas estruturais da piperina e das piperamidas são apresentadas na Figura 1.

Etapa 1. Conversão do ácido pipérico em seu respectivo cloreto de ácido: em um balão de fundo redondo (50 mL) dissolveu-se o ácido pipérico (500 mg, 2,29 mmol) em tetraidrofurano (THF) seco (10 mL) e, em seguida, foi adicionado o cloreto de oxalila (C2Cl2O2) (1 mL, 11,5 mmol). Ao balão foi adaptado um tubo contendo cloreto de

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008) 35

cálcio (CaCl2) e a solução foi mantida sob agitação durante 6 h, à temperatura ambiente. Após este tempo, o solvente e o excesso de cloreto de oxalila foram completamente removidos sob pressão reduzida em evaporador rotatório, levando à obtenção de um resíduo.

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)41

O

O N

O

(1) (2) R = isopentil; R' = H(3) R = adamantil; R' = H(4) R = R'= isopropil

O

O N

O

R

R'

Figura 1: Fórmulas estruturais da piperina (1) e das amidas sintéticas: isopentilpiperamida (2), adamantilpiperamida (3) e isopropilpiperamida (4)

Etapa 2 - Obtenção das piperamidas: o resíduo obtido na etapa 1 foi dissolvido em THF seco (4 mL) e, a esta solução, foram adicionados cerca de 5 mmol (aproximadamente dois equivalentes) de cada amina (isopentilamina, adamantilamina, diisopropilamina). A mistura reacional foi mantida sob agitação, a 60ºC, durante 1,5 a 2,0 h. Em seguida, o solvente e o excesso da amina foram eliminados em evaporador rotatório. O resíduo obtido foi fracionado em coluna de sílica gel para obtenção das piperamidas 2, 3 e 4 puras. Em cada 1 g de dieta, foi adicionado, em etapas distintas, 1 mL de solução, do extrato da pimenta-do-reino e da piperina em diferentes concentrações 0,1; 0,2 e 0,3 g.mL-1. Para as piperamidas 2, 3 e 4 foi utilizado o mesmo procedimento, no entanto, utilizou-se apenas soluções na concentração 0,3 g.mL-1. O extrato bruto foi diluído em etanol (95%) e a piperina e as piperamidas foram diluídas em clorofórmio.

Testes de toxicidadeOs testes de toxicidade consistiram na exposição

de O. fuscipes a tratamentos com dieta contendo: extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino, piperina, diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e adamantilpiperamida, na temperutura de 25º ± 1ºC, por um período de 17 dias. Como recipientes-teste foram utilizados potes descartáveis de 250 mL. No início dos experimentos, em cada recipiente teste (n=10), forrado com papel filtro umedecido com água destilada, foi adicionado 1 diplópodo e 1 g de alimento acrescido de 1 mL da substância teste. O alimento consistiu numa mistura de farelo de trigo e açúcar na proporção de 9:1. Para evitar o ressecamento da dieta, a cada 24 h eram adicionadas 03 gotas de água destilada. Os recipientes permaneceram tampados durante o período de exposição, já que as tampas eram perfuradas para propiciar a ventilação interna. Ao longo do teste foi observada a mortalidade dos organismos. Para cada tratamento foi realizado um controle experimental.

No ensaio realizado, o extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino e a piperina foram testadas nas doses 0,1; 0,2 e 0,3 g; enquanto que as piperamidas (diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e adamantilpiperamida) foram avaliadas apenas na dose 0,3 g. O extrato etanólico do fruto foi diluído em etanol P.A. 95% e a piperina e as piperamidas em clorofórmio P.A. A toxicidade destes solventes para o O. fuscipes foi avaliada com o mesmo volume utilizado para se efetuar as diluições.

RESULTADOS E DISCUSSãO

Os resultados dos experimentos para a determinação da toxicidade do extrato de frutos da pimenta-do-reino e da piperina, em diferentes doses (0,1; 0,2 e 0,3 g), bem como das piperamidas (0,3 g), por ingestão, estão apresentados nas Figuras 2 a 4. Entretanto, diferentes níveis de susceptibilidade dos diplópodos ao extrato, à piperina e às piperamidas foram observados.

Comparando a toxicidade do extrato e da piperina, na dose de 0,3 g (Figuras 2 e 3), observa-se que o primeiro foi mais tóxico, pois, após 4 dias de exposição verificou-se 100 e 70% de mortalidade, respectivamente. Quanto às amidas sintéticas, cuja dose de exposição foi 0,3 g (Figura 4), a mais tóxica foi a diisopropilpiperamida, seguida pela isopentilpiperamida. A adamantilpiperamida foi o composto que apresentou a menor toxicidade para O. fuscipes na dose testada.

13

O

O N

O

(1) (2) R = isopentil; R' = H(3) R = adamantil; R' = H(4) R = R'= isopropil

O

O N

O

R

R'

Figura 1: Mortalidade (%) de Orthoporus fuscipes,

submetidos a diferentes concentrações de extrato

etanólico de Piper nigrum. Experimentos realizados à

temperatura ambiente num período de 17 dias.

Figura 2

-20

0

20

40

60

80

100

120

1 3 5 7 9 11 13 15 17

Dias

Mor

talid

ade

(%) 0,1g/mL

0,2g/mL

0,3g/mL

Figura 1

Figura 2: Porcentagem de mortalidade de Orthoporus fuscipes expostos a diferentes doses do extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino a 25 ± 1 ºC, por 17 dias.

14

Figura 3

Figura 4

0

20

40

60

80

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17

Dias

diisopropilpiperamida

isopentilpiperamida

adamantilpiperamida

Mor

talid

ade

(%)

0

20

40

60

80

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17

Dias

Mor

talid

ade

(%)

0,1g/mL

0,2g/mL

0,3g/mL

Figura 3: Porcentagem de mortalidade de Orthoporus fuscipes expostos a diferentes doses da piperina, a 25 ± 1ºC, por 17 dias.

Figura 1. Fórmulas estruturais da piperina (1) e das amidas sintéticas: isopentilpiperamida (2), adamantilpiperamida (3) e isopropilpiperamida (4).

Etapa 2 - Obtenção das piperamidas: o resíduo obtido na etapa 1 foi dissolvido em THF seco (4 mL) e, a esta solução, foram adicionados cerca de 5 mmol (aproximadamente dois equivalentes) de cada amina (isopentilamina, adamantilamina, diisopropilamina). A mistura reacional foi mantida sob agitação, a 60ºC, durante 1,5 a 2,0 h. Em seguida, o solvente e o excesso da amina foram eliminados em evaporador rotatório. O resíduo obtido foi fracionado em coluna de sílica gel para obtenção das piperamidas 2, 3 e 4 puras. Em cada 1 g de dieta, foi adicionado, em etapas distintas, 1 mL de solução, do extrato da pimenta-do-reino e da piperina em diferentes concentrações 0,1; 0,2 e 0,3 g.mL-1. Para as piperamidas 2, 3 e 4 foi utilizado o mesmo procedimento, no entanto, utilizou-se apenas soluções na concentração 0,3 g.mL-1. O extrato bruto foi diluído em etanol (95%) e a piperina e as piperamidas foram diluídas em clorofórmio.

Testes de toxicidadeOs testes de toxicidade consistiram na exposição

de O. fuscipes a tratamentos com dieta contendo: extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino, piperina, diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e adamantilpiperamida, na temperutura de 25º ± 1ºC, por um período de 17 dias. Como recipientes-teste foram utilizados potes descartáveis de 250 mL. No início dos experimentos, em cada recipiente teste (n=10), forrado com papel filtro umedecido com água destilada, foi adicionado 1 diplópodo e 1 g de alimento acrescido de 1 mL da substância teste. O alimento consistiu numa mistura de farelo de trigo e açúcar na proporção de 9:1. Para evitar o ressecamento da dieta, a cada 24 h eram adicionadas 03 gotas de água destilada. Os recipientes permaneceram tampados durante o período de exposição, já que as tampas eram perfuradas para propiciar a ventilação interna. Ao longo do teste foi observada a mortalidade dos organismos. Para cada tratamento foi realizado um controle experimental.

No ensaio realizado, o extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino e a piperina foram testadas nas doses 0,1; 0,2 e 0,3 g; enquanto que as piperamidas (diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e adamantilpiperamida) foram avaliadas apenas na dose 0,3 g. O extrato etanólico do fruto foi diluído em etanol

P.A. 95% e a piperina e as piperamidas em clorofórmio P.A. A toxicidade destes solventes para o O. fuscipes foi avaliada com o mesmo volume utilizado para se efetuar as diluições.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados dos experimentos para a determinação da toxicidade do extrato de frutos da pimenta-do-reino e da piperina, em diferentes doses (0,1; 0,2 e 0,3 g), bem como das piperamidas (0,3 g), por ingestão, estão apresentados nas Figuras 2 a 4. Entretanto, diferentes níveis de susceptibilidade dos diplópodos ao extrato, à piperina e às piperamidas foram observados.

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)41

O

O N

O

(1) (2) R = isopentil; R' = H(3) R = adamantil; R' = H(4) R = R'= isopropil

O

O N

O

R

R'

Figura 1: Fórmulas estruturais da piperina (1) e das amidas sintéticas: isopentilpiperamida (2), adamantilpiperamida (3) e isopropilpiperamida (4)

Etapa 2 - Obtenção das piperamidas: o resíduo obtido na etapa 1 foi dissolvido em THF seco (4 mL) e, a esta solução, foram adicionados cerca de 5 mmol (aproximadamente dois equivalentes) de cada amina (isopentilamina, adamantilamina, diisopropilamina). A mistura reacional foi mantida sob agitação, a 60ºC, durante 1,5 a 2,0 h. Em seguida, o solvente e o excesso da amina foram eliminados em evaporador rotatório. O resíduo obtido foi fracionado em coluna de sílica gel para obtenção das piperamidas 2, 3 e 4 puras. Em cada 1 g de dieta, foi adicionado, em etapas distintas, 1 mL de solução, do extrato da pimenta-do-reino e da piperina em diferentes concentrações 0,1; 0,2 e 0,3 g.mL-1. Para as piperamidas 2, 3 e 4 foi utilizado o mesmo procedimento, no entanto, utilizou-se apenas soluções na concentração 0,3 g.mL-1. O extrato bruto foi diluído em etanol (95%) e a piperina e as piperamidas foram diluídas em clorofórmio.

Testes de toxicidadeOs testes de toxicidade consistiram na exposição

de O. fuscipes a tratamentos com dieta contendo: extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino, piperina, diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e adamantilpiperamida, na temperutura de 25º ± 1ºC, por um período de 17 dias. Como recipientes-teste foram utilizados potes descartáveis de 250 mL. No início dos experimentos, em cada recipiente teste (n=10), forrado com papel filtro umedecido com água destilada, foi adicionado 1 diplópodo e 1 g de alimento acrescido de 1 mL da substância teste. O alimento consistiu numa mistura de farelo de trigo e açúcar na proporção de 9:1. Para evitar o ressecamento da dieta, a cada 24 h eram adicionadas 03 gotas de água destilada. Os recipientes permaneceram tampados durante o período de exposição, já que as tampas eram perfuradas para propiciar a ventilação interna. Ao longo do teste foi observada a mortalidade dos organismos. Para cada tratamento foi realizado um controle experimental.

No ensaio realizado, o extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino e a piperina foram testadas nas doses 0,1; 0,2 e 0,3 g; enquanto que as piperamidas (diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e adamantilpiperamida) foram avaliadas apenas na dose 0,3 g. O extrato etanólico do fruto foi diluído em etanol P.A. 95% e a piperina e as piperamidas em clorofórmio P.A. A toxicidade destes solventes para o O. fuscipes foi avaliada com o mesmo volume utilizado para se efetuar as diluições.

RESULTADOS E DISCUSSãO

Os resultados dos experimentos para a determinação da toxicidade do extrato de frutos da pimenta-do-reino e da piperina, em diferentes doses (0,1; 0,2 e 0,3 g), bem como das piperamidas (0,3 g), por ingestão, estão apresentados nas Figuras 2 a 4. Entretanto, diferentes níveis de susceptibilidade dos diplópodos ao extrato, à piperina e às piperamidas foram observados.

Comparando a toxicidade do extrato e da piperina, na dose de 0,3 g (Figuras 2 e 3), observa-se que o primeiro foi mais tóxico, pois, após 4 dias de exposição verificou-se 100 e 70% de mortalidade, respectivamente. Quanto às amidas sintéticas, cuja dose de exposição foi 0,3 g (Figura 4), a mais tóxica foi a diisopropilpiperamida, seguida pela isopentilpiperamida. A adamantilpiperamida foi o composto que apresentou a menor toxicidade para O. fuscipes na dose testada.

13

O

O N

O

(1) (2) R = isopentil; R' = H(3) R = adamantil; R' = H(4) R = R'= isopropil

O

O N

O

R

R'

Figura 1: Mortalidade (%) de Orthoporus fuscipes,

submetidos a diferentes concentrações de extrato

etanólico de Piper nigrum. Experimentos realizados à

temperatura ambiente num período de 17 dias.

Figura 2

-20

0

20

40

60

80

100

120

1 3 5 7 9 11 13 15 17

Dias

Mor

talid

ade

(%) 0,1g/mL

0,2g/mL

0,3g/mL

Figura 1

Figura 2: Porcentagem de mortalidade de Orthoporus fuscipes expostos a diferentes doses do extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino a 25 ± 1 ºC, por 17 dias.

14

Figura 3

Figura 4

0

20

40

60

80

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17

Dias

diisopropilpiperamida

isopentilpiperamida

adamantilpiperamida

Mor

talid

ade

(%)

0

20

40

60

80

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17

Dias

Mor

talid

ade

(%)

0,1g/mL

0,2g/mL

0,3g/mL

Figura 3: Porcentagem de mortalidade de Orthoporus fuscipes expostos a diferentes doses da piperina, a 25 ± 1ºC, por 17 dias.

Figura 2. Porcentagem de mortalidade de Orthoporus fuscipes expostos a diferentes doses do extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino a 25 ± 1 ºC, por 17 dias.

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)41

O

O N

O

(1) (2) R = isopentil; R' = H(3) R = adamantil; R' = H(4) R = R'= isopropil

O

O N

O

R

R'

Figura 1: Fórmulas estruturais da piperina (1) e das amidas sintéticas: isopentilpiperamida (2), adamantilpiperamida (3) e isopropilpiperamida (4)

Etapa 2 - Obtenção das piperamidas: o resíduo obtido na etapa 1 foi dissolvido em THF seco (4 mL) e, a esta solução, foram adicionados cerca de 5 mmol (aproximadamente dois equivalentes) de cada amina (isopentilamina, adamantilamina, diisopropilamina). A mistura reacional foi mantida sob agitação, a 60ºC, durante 1,5 a 2,0 h. Em seguida, o solvente e o excesso da amina foram eliminados em evaporador rotatório. O resíduo obtido foi fracionado em coluna de sílica gel para obtenção das piperamidas 2, 3 e 4 puras. Em cada 1 g de dieta, foi adicionado, em etapas distintas, 1 mL de solução, do extrato da pimenta-do-reino e da piperina em diferentes concentrações 0,1; 0,2 e 0,3 g.mL-1. Para as piperamidas 2, 3 e 4 foi utilizado o mesmo procedimento, no entanto, utilizou-se apenas soluções na concentração 0,3 g.mL-1. O extrato bruto foi diluído em etanol (95%) e a piperina e as piperamidas foram diluídas em clorofórmio.

Testes de toxicidadeOs testes de toxicidade consistiram na exposição

de O. fuscipes a tratamentos com dieta contendo: extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino, piperina, diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e adamantilpiperamida, na temperutura de 25º ± 1ºC, por um período de 17 dias. Como recipientes-teste foram utilizados potes descartáveis de 250 mL. No início dos experimentos, em cada recipiente teste (n=10), forrado com papel filtro umedecido com água destilada, foi adicionado 1 diplópodo e 1 g de alimento acrescido de 1 mL da substância teste. O alimento consistiu numa mistura de farelo de trigo e açúcar na proporção de 9:1. Para evitar o ressecamento da dieta, a cada 24 h eram adicionadas 03 gotas de água destilada. Os recipientes permaneceram tampados durante o período de exposição, já que as tampas eram perfuradas para propiciar a ventilação interna. Ao longo do teste foi observada a mortalidade dos organismos. Para cada tratamento foi realizado um controle experimental.

No ensaio realizado, o extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino e a piperina foram testadas nas doses 0,1; 0,2 e 0,3 g; enquanto que as piperamidas (diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e adamantilpiperamida) foram avaliadas apenas na dose 0,3 g. O extrato etanólico do fruto foi diluído em etanol P.A. 95% e a piperina e as piperamidas em clorofórmio P.A. A toxicidade destes solventes para o O. fuscipes foi avaliada com o mesmo volume utilizado para se efetuar as diluições.

RESULTADOS E DISCUSSãO

Os resultados dos experimentos para a determinação da toxicidade do extrato de frutos da pimenta-do-reino e da piperina, em diferentes doses (0,1; 0,2 e 0,3 g), bem como das piperamidas (0,3 g), por ingestão, estão apresentados nas Figuras 2 a 4. Entretanto, diferentes níveis de susceptibilidade dos diplópodos ao extrato, à piperina e às piperamidas foram observados.

Comparando a toxicidade do extrato e da piperina, na dose de 0,3 g (Figuras 2 e 3), observa-se que o primeiro foi mais tóxico, pois, após 4 dias de exposição verificou-se 100 e 70% de mortalidade, respectivamente. Quanto às amidas sintéticas, cuja dose de exposição foi 0,3 g (Figura 4), a mais tóxica foi a diisopropilpiperamida, seguida pela isopentilpiperamida. A adamantilpiperamida foi o composto que apresentou a menor toxicidade para O. fuscipes na dose testada.

13

O

O N

O

(1) (2) R = isopentil; R' = H(3) R = adamantil; R' = H(4) R = R'= isopropil

O

O N

O

R

R'

Figura 1: Mortalidade (%) de Orthoporus fuscipes,

submetidos a diferentes concentrações de extrato

etanólico de Piper nigrum. Experimentos realizados à

temperatura ambiente num período de 17 dias.

Figura 2

-20

0

20

40

60

80

100

120

1 3 5 7 9 11 13 15 17

Dias

Mor

talid

ade

(%) 0,1g/mL

0,2g/mL

0,3g/mL

Figura 1

Figura 2: Porcentagem de mortalidade de Orthoporus fuscipes expostos a diferentes doses do extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino a 25 ± 1 ºC, por 17 dias.

14

Figura 3

Figura 4

0

20

40

60

80

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17

Dias

diisopropilpiperamida

isopentilpiperamida

adamantilpiperamida

Mor

talid

ade

(%)

0

20

40

60

80

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17

Dias

Mor

talid

ade

(%)

0,1g/mL

0,2g/mL

0,3g/mL

Figura 3: Porcentagem de mortalidade de Orthoporus fuscipes expostos a diferentes doses da piperina, a 25 ± 1ºC, por 17 dias.

Figura 3. Porcentagem de mortalidade de Orthoporus fuscipes expostos a diferentes doses da piperina, a 25 ± 1ºC, por 17 dias.

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)36 Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)42

14

Figura 3

Figura 4

0

20

40

60

80

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17

Dias

diisopropilpiperamida

isopentilpiperamida

adamantilpiperamida

Mor

talid

ade

(%)

0

20

40

60

80

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17

Dias

Mor

talid

ade

(%)

0,1g/mL

0,2g/mL

0,3g/mL

Figura 4: Mortalidade (%) de Orthoporus fuscipes, submetidos a diferentes concentrações de extrato etanólico de Piper nigrum. Experimentos realizados à temperatura ambiente num período de 17 dias.

Nos controles realizados com a dieta pura, assim como nos controles realizados com os solventes (etanol e clorofórmio), não foi observada mortalidade nos organismos-teste. Tais resultados demonstram que essas condições experimentais não influenciaram na mortalidade dos diplópodos.

Apesar da piperina ser o principal constituinte, em termos quantitativos, do extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino, esta não parece ser a única responsável pela atividade apresentada por este, uma vez que a substância isolada (mais concentrada do que no extrato) apresentou menor atividade. Por outro lado, deve-se considerar que a piperina, agindo sinergicamente com outras substâncias presentes no extrato, possa ter potencializado a toxicidade deste. Entretanto, segundo Paula et al. (28) muito pouco se sabe sobre a relação entre as estruturas das piperamidas e as suas respectivas atividades biológicas.

Tentativas para encontrar um método seguro e eficaz no controle de diplópodos, foram feitas em várias regiões do mundo. Mariconi (29) numa revisão descreveu que os inseticidas DDT, BHC, Clordane e Heptacloro, foram empregados para controle de diplópodos com sucesso, embora o mesmo autor tenha admitido que “há quem se queixe de que todos esses produtos não conduzam a bons resultados”. Entretanto os produtos citados pelo autor, atualmente, tem sua utilização proibida dados os efeitos danosos que causam sobre o ambiente, o homem e os outros animais. Na Austrália, Hopkin e Read (3) citaram que os produtos Baygon e Baysol, apesar de utilizados para o controle do diplópodo Ommatoiulus moreletii, foram considerados pouco eficientes.

Deste modo pelos resultados apresentados e devido às características biológicas dos diplópodos, tais como a presença de um exoesqueleto rígido e calcificado que dificulta a utilização de métodos de aplicação por contato sugere-se, a utilização de iscas tóxicas contendo extrato etanólico bruto de frutos da pimenta-do-reino como

alternativa viável no controle deste grupo animal.Assim, embora este estudo seja preliminar, oferece

importantes subsídios para a condução de novos testes que procurem aprimorar a metodologia utilizada de maneira que esta se torne uma nova tecnologia à disposição no mercado, considerando ser este método seguro e pouco impactante.

AGRADECImENTOS

À Profa. Dra. Carmem Sílvia Fontanetti do Departamento de Biologia da UNESP, Campus de Rio Claro, SP, pela identificação dos diplópodos e ao Prof. Dr. Luiz Cláudio de Almeida Barbosa pela cessão das piperamidas sintetizadas no Laboratório de Análise e Síntese de Agroquímicos – UFV.

RESUmO

A toxicidade do extrato etanólico da pimenta-do-reino (Piper nigrum), da piperina e amidas sintéticas: adamantilpiperamida, isopentilpiperamida e diisopropilpiperamida foi avaliada para o diplópodo Orthoporus fuscipes. Os experimentos consistiram na exposição dos organismos-teste a uma dieta de farelo de trigo e açúcar (9:1) a qual foi adicionada a substância teste em solução observando-se a mortalidade por um período de 17 dias. Verificou-se na dose contendo 0,3 g do extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino e da diisopropilpiperamida, 100% de mortalidade após 04 e 14 dias de exposição, respectivamente. A piperina na concentração de 0,3 g causou 70% de mortalidade após 4 dias, mantendo-se até o final do período de exposição. Dessa forma, dentre os compostos testados, o extrato etanólico do fruto da pimenta-do-reino foi considerado o mais eficiente e promissor no controle de populações de Orthoporus fuscipes, pois foi o que promoveu maior porcentagem de mortalidade para o organismo-teste num menor período de exposição.

Unitermos: diplopoda, controle populacional, pimenta-do-reino

REFERêNCIAS BIBLIOGRáFICAS

1. Hoffman RL, Golovatch SI, Adis J, Morais JW. Myriapoda: Diplopoda. In: Amazonian Arachnida and Myriapoda. Moscow: Pensoft 2002. 505-534.

2. Ruppert EE, Barnes RD, Fox RS. Zoologia dos Invertebrados: uma abordagem funcional evolutiva. 7ª edição. São Paulo: Roca. 2005. 1145p.

3. Hopkin SP, Read HJ. The biology of millipedes. New York: Oxford University Press, 1992. 233p.

4. Anderson JM, Leonard MA. Tree root and macrofauna effects on nitrification and mineral nitrogen losses

Figura 4. Porcentagem de mortalidade de Orthoporus fuscipes expostos à diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e adamantilpiperamida na concentração de 0,3 g/mL, a 25 ± 1ºC, por 17 dias.

Comparando a toxicidade do extrato e da piperina, na dose de 0,3 g (Figuras 2 e 3), observa-se que o primeiro foi mais tóxico, pois, após 4 dias de exposição verificou-se 100 e 70% de mortalidade, respectivamente. Quanto às amidas sintéticas, cuja dose de exposição foi 0,3 g (Figura 4), a mais tóxica foi a diisopropilpiperamida, seguida pela isopentilpiperamida. A adamantilpiperamida foi o composto que apresentou a menor toxicidade para O. fuscipes na dose testada.

Nos controles realizados com a dieta pura, assim como nos controles realizados com os solventes (etanol e clorofórmio), não foi observada mortalidade nos organismos-teste. Tais resultados demonstram que essas condições experimentais não influenciaram na mortalidade dos diplópodos.

Apesar da piperina ser o principal constituinte, em termos quantitativos, do extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino, esta não parece ser a única responsável pela atividade apresentada por este, uma vez que a substância isolada (mais concentrada do que no extrato) apresentou menor atividade. Por outro lado, deve-se considerar que a piperina, agindo sinergicamente com outras substâncias presentes no extrato, possa ter potencializado a toxicidade deste. Entretanto, segundo Paula et al. (28) muito pouco se sabe sobre a relação entre as estruturas das piperamidas e as suas respectivas atividades biológicas.

Tentativas para encontrar um método seguro e eficaz no controle de diplópodos, foram feitas em várias regiões do mundo. Mariconi (29) numa revisão descreveu que os inseticidas DDT, BHC, Clordane e Heptacloro, foram empregados para controle de diplópodos com sucesso, embora o mesmo autor tenha admitido que “há quem se queixe de que todos esses produtos não conduzam a bons resultados”. Entretanto os produtos citados pelo autor, atualmente, tem sua utilização proibida dados os efeitos danosos que causam sobre o ambiente, o homem e os outros animais. Na Austrália, Hopkin e Read (3) citaram que os produtos Baygon e Baysol, apesar de utilizados para

o controle do diplópodo Ommatoiulus moreletii, foram considerados pouco eficientes.

Deste modo pelos resultados apresentados e devido às características biológicas dos diplópodos, tais como a presença de um exoesqueleto rígido e calcificado que dificulta a utilização de métodos de aplicação por contato sugere-se, a utilização de iscas tóxicas contendo extrato etanólico bruto de frutos da pimenta-do-reino como alternativa viável no controle deste grupo animal.

Assim, embora este estudo seja preliminar, oferece importantes subsídios para a condução de novos testes que procurem aprimorar a metodologia utilizada de maneira que esta se torne uma nova tecnologia à disposição no mercado, considerando ser este método seguro e pouco impactante.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Carmem Sílvia Fontanetti do Departamento de Biologia da UNESP, Campus de Rio Claro, SP, pela identificação dos diplópodos e ao Prof. Dr. Luiz Cláudio de Almeida Barbosa pela cessão das piperamidas sintetizadas no Laboratório de Análise e Síntese de Agroquímicos – UFV.

RESUMO

A toxicidade do extrato etanólico da pimenta-do-reino (Piper nigrum), da piperina e amidas sintéticas: adamantilpiperamida, isopentilpiperamida e diisopropilpiperamida foi avaliada para o diplópodo Orthoporus fuscipes. Os experimentos consistiram na exposição dos organismos-teste a uma dieta de farelo de trigo e açúcar (9:1) a qual foi adicionada a substância teste em solução observando-se a mortalidade por um período de 17 dias. Verificou-se na dose contendo 0,3 g do extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino e da diisopropilpiperamida, 100% de mortalidade após 04 e 14 dias de exposição, respectivamente. A piperina na concentração de 0,3 g causou 70% de mortalidade após 4 dias, mantendo-se até o final do período de exposição. Dessa forma, dentre os compostos testados, o extrato etanólico do fruto da pimenta-do-reino foi considerado o mais eficiente e promissor no controle de populações de Orthoporus fuscipes, pois foi o que promoveu maior porcentagem de mortalidade para o organismo-teste num menor período de exposição.

Unitermos: diplópoda, controle populacional, pimenta-do-reino

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008) 37

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Hoffman RL, Golovatch SI, Adis J, Morais JW. 1. Myriapoda: Diplopoda. In: Amazonian Arachnida and Myriapoda. Moscow: Pensoft 2002. 505-534. Ruppert EE, Barnes RD, Fox RS. Zoologia dos 2. Invertebrados: uma abordagem funcional evolutiva. 7ª edição. São Paulo: Roca. 2005. 1145p.Hopkin SP, Read HJ. The biology of millipedes. New 3. York: Oxford University Press, 1992. 233p.Anderson JM, Leonard MA. Tree root and macrofauna 4. effects on nitrification and mineral nitrogen losses from deciduous leaf litter. Rev Ecol Biol Sol 1988; 25(4):373 - 384. Anderson JM,5. Leonard MA, Ineson P, Huish S. Faunal biomass: a key component of a general model of nitrogen mineralization. Soil Biol Biochem 1985; 17:735-737.Boccardo L, Fernandes MN. Toxicidade do Carbamato 6. Methiocarb para os diplópodos Gymnostreptus olivaceus e Plusioporus setiger. Rev Bras Toxicol 2000; 13(2):29-33.Boccardo L, Fernandes MN. Toxicity of the Deltamethrin 7. Pyrethroid on neotropical millipedes, Gymnostreptus olivaceus and Plusioporus setiger. J Adv Zool 2001; 22(1):1-4.Boccardo L, Penteado CHS, Juca-Chagas R. Swarming 8. of millipedes, a new case noticed in the district of Patrocínio - MG - Brazil. J Adv Zool 1997; 18(1):62–63.Boccardo L, Juca-Chagas R, Penteado CHS. Migration 9. and population outbreaks os milipedes in the cofee plantation, region of Alto Paranaíba, MG, Brazil. Holos Environment 2002; 2(2):220-223. Barbosa LCA. Os pesticidas, o homem e o meio 10. ambiente. Viçosa: Editora UFV; 2004. 215p. Bernard 11. et al. Insecticidal defenses of Piperaceae from the neotropics. J Chem Ecol 1995; 21(6):801–814.Scott IM, Jensen H, Scott JG, Isman MB, Arnason JT, 12. Philogéne BJR. Botanical insecticides for controlling agricultural pests: Piperamides and the Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata Say (Coleoptera: Chrysomelidae). Arch Insect Biochem Physiol 2003; 54(4):212-225.Scott 13. et al. Efficacy of Piper (Piperaceae) extracts for controlo f common home and garden insect pests. J Econ Entomol 2004; 97(4):1390-1403.Upadhyay RK, Jaismwal G. Evaluation on biological 14. activities of Piper nigrum oil against Tribolium castaneum. Bull Insectol 2007; 60(1):57-60.Navickiene DHM, Miranda JE, Bortoli SA, Kato MJ, 15. Bolzani VS, Furlan M. Toxicity of extracts and isobutyl

amides from Piper tuberculatum: potent compounds with potential for control of the velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis. Pest Manag Sci 2007; 63:399-403.Scott WP, McKibben GH. Toxicity of black pepper 16. extract to boll weevils. J Econ Entomol 1978; 71(2):343-344.Miyakado M, Nakayama I, Ohno N. Insecticidal 17. unsaturated isobutylamides. In: Arnason JT, Philogéne BJR, Morad P. (eds). Insecticidas of plant origin. ACS Symposium Series; 387. New York: Maple Press. 1989. 173-187.Su HCF. Insecticidal properties of black pepper to rice 18. weevils and cowpea weevils. J Econ Entomol 1977; 70(1):18-21. Su HCF, Horvat R. Isolation, identification, and 19. insecticidal properties of Piper nigrum amides. J Agric Food Chem 1981; 29:115-118. Flores WL, Sampaio LS, Marques OM, Costa JA.20. Efeito dos extratos de pimenta-do-reino e cinamomo e do malation no controle do caruncho Zabrotes subfasciatus (Boheman, 1833) em sementes de feijão (Phaseolus vulgaris L.) armazenadas. Insecta 1993; 2(1):11-22.Boff MIC, Almeida AA. Ação tóxica de extratos de 21. Pimenta-do-reino, Piper nigrum, em ovos de Sitotroga cerealella (Oliv.) (Lepidoptera: Gelechiidae). An Soc Entomol Bras 1996; 25(3):423-429.Ribeiro TS, Freire-de-Lima L, Previato JO, Mendonça-22. Previato L, Norton H, Lima MEF. Toxic effects of natural piperine and its derivates on epimastigotes and amastigotes of Trypanosoma cruzi. Bioorg Med Chem Letters 2004; 14:3555-3558.Paula VF, Barbosa LCA, Demuner AJ, Piló-Veloso D, 23. Picanço MC. Synthesis and insecticidal activity of new amide derivatives of piperine. Pest Manag Sci 2000; 56(2):168-174.Ewete FK, Arnason JT, Durst T, Mackinnon S. Toxicity 24. of gedunin, piperine and crude extracts of their natural products on growth and development of Ostrinia nubilalis Hubner (Lepidoptera: Pyralidae). Discov Innov 2000; 12:67-72.Simas NK, Lima EC, Kuster RM, Lage CLS, Filho 25. AMO. Potential use of Piper nigrum ethanol extract against pyrethroid-resistant Aedes aegypti larvae. Rev Soc Bras Med Trop 2007; 40(4):405-407.Park IK, Lee SG, Shin SC, Park JD, Ahn YJ. Larvicidal 26. activity of isobutilamides identified in Piper nigrum fruits against three mosquito species. J Agric Food Chem 2002; 50:1866-1870.Ikan, R. Natural Products: a laboratory Guide. 2ª edition. 27. San Diego: Academic Press. 1991. 360p.

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)38

Paula VF, Barbosa LCA, Piló-Veloso D, Picanço M. 28. Toxicidade de amidas derivadas da piperina a Ascia monuste orseis (Godart) (Lepidoptera: Peiridae). Rev Bras Entomol 2001; 45(1):7-10.Mariconi FAM. Inseticidas e seu emprego no controle 29. de pragas, TOMO I: Defensivos. 7ª ed. São Paulo: Nobel Editora, 1988. 126p.