UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE AMINTAS FIGUEIRÊDO LIRA TOXICIDADE AGUDA E ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO EXTRATO AQUOSO E ÓLEO ESSENCIAL DA Hyptis pectinata (L.) POIT (SAMBACAITA), EM MODELO MURINO DE ARTRITE INDUZIDA POR CRISTAIS DE URATO DE SÓDIO. ARACAJU – SE 2006
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TOXICIDADE AGUDA E ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO … · cromatografia gasosa e espectrômetro de massa, ... Espectometria de Massa miligrama mililitro Íon Sódio Nicotinamida Adenina
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AMINTAS FIGUEIRÊDO LIRA
TOXICIDADE AGUDA E ATIVIDADE
ANTINOCICEPTIVA DO EXTRATO AQUOSO E ÓLEO ESSENCIAL DA Hyptis pectinata (L.) POIT
(SAMBACAITA), EM MODELO MURINO DE ARTRITE INDUZIDA POR CRISTAIS DE URATO DE SÓDIO.
ARACAJU – SE 2006
AMINTAS FIGUEIRÊDO LIRA
TOXICIDADE AGUDA E ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO EXTRATO AQUOSO E ÓLEO
ESSENCIAL DA Hyptis pectinata L. POIT (SAMBACAITA), EM MODELO MURINO DE ARTRITE INDUZIDA POR
CRISTAIS DE URATO DE SÓDIO.
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe para obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde
Área de Concentração: Estudos Clínicos e Laboratoriais em Saúde
ORIENTADOR: Prof. Dr. ÂNGELO ROBERTO ANTONIOLLI
ARACAJU – SE 2006
Lira, Amintas Figueirêdo Toxicidade aguda e atividade antinociceptiva do extrato aquoso e óleo essencial do Hyptis pectinata L. (sambacaita), em modelo murino de artrite induzida por cristais de urato de sódio. / Amintas Figueirêdo Lira.-- Aracaju, 2006 68 f. Orientador: Prof. Dr. Ângelo Roberto Antoniolli Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Núcleo de Pós-Graduação em Medicina. 1. Hyptis pectinata L. 2. Toxicidade aguda 3. Antinocicepção 4. artrite gotosa I. Título
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AMINTAS FIGUEIRÊDO LIRA
TOXICIDADE AGUDA E ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO
EXTRATO AQUOSO E ÓLEO ESSENCIAL DA Hyptis pectinata L. POIT (SAMBACAITA), EM MODELO MURINO DE ARTRITE INDUZIDA POR
CRISTAIS DE URATO DE SÓDIO.
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe, para obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde
Área de Concentração: Estudos Clínicos e Laboratoriais em Saúde
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________________ Orientador: Prof. Dr. ÂNGELO ROBERTO ANTONIOLLI
________________________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. LAURO XAVIER FILHO
________________________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dr. MURILO MARCHIORO
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A meus pais.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida, pelas oportunidades que tem me proporcionado e pelos milagres realizados. Ao Prof. Dr. Ângelo Antoniolli pela orientação, confiança e incentivo. Ao Núcleo de Pós-Graduação em Medicina, pela oportunidade de realizar este curso. À Prof.ª Dra Flávia Teixeira, por ter cedido o Laboratório de Fisiologia Comportamental para a execução dos experimentos. Ao Prof. Dr. Adauto Ribeiro, do Departamento de Biologia, pela identificação botânica da planta. Aos Profs. Drs. Arie e Fátima Blank e Polyana Ehlert, do Departamento de Agronomia, pela contribuição técnica e instrumental na extração do óleo essencial. Ao Prof. Dr.Péricles Alves, do Departamento de Química, responsável pela análise química do óleo essencial. À Prof ª. Dra. Maria da Paz, pelo auxílio na triagem fitoquímica do extrato aquoso. À Prof ª. Jeane Vilar, do Departamento de Biologia, pela orientação na determinação da DL50. Aos Profs. Drs. Murilo Marchioro, Rosilene Marçal, Josemar Batista, Vívian Andrade, Ricardo Fakouri, Sócrates Cavalcanti, Rogéria Nunes e Marcio Roberto, pelo apoio e contribuições científicas compartilhadas durante este período de convivência. Aos alunos de iniciação cientifica e estagiários do Laboratório de Farmacologia, pela colaboração prestada. Aos funcionários D. Edína, Seu Oswaldo e D. Jane, pela colaboração e atenção . À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes/MEC), pela concessão de Bolsa durante a realização do curso. Aos colegas do curso de Mestrado em Ciências da Saúde: Venâncio, Edna, Silvia, Sheila, Silvan e Cleonice, pelo companheirismo e incentivo . À minha madrinha Maria, à minha família e aos amigos pelo carinho e incentivo. A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho.
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"Depois de algum tempo você aprende que não importa onde já chegou,
mas aonde está indo."
(W. Shakespeare)
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RESUMO
A Hyptis pectinata L. Poit. (Lamiaceae), vulgarmente conhecida como sambacaitá, é
um exemplo de planta comumente utilizada na medicina popular; diversos efeitos
biológicos estão associados aos seus extratos, tais como analgésico, antiinflamatório
e antimicrobiano. Vários estudos in vivo e in vitro têm avaliado estes efeitos
promovidos pelo extrato aquoso e óleo essencial das folhas da planta, cujas
composições químicas, constituem os seus compostos solúveis em água e os seus
compostos voláteis respectivamente. Este trabalho objetivou dar continuidade a
esses estudos, determinando os constituintes químicos e a toxicidade aguda da
amostra de extrato aquoso e óleo essencial utilizados, para estudar o efeito
antinociceptivo (analgésico) dos extratos citados, em uma condição inflamatória
articular aguda, similar a um ataque de artrite aguda como o ocorrido na gota. Os
estudos fitoquímicos do extrato aquoso identificaram a presença de alcalóides,
taninos e flavonóides. A análise dos constituintes do óleo essencial se deu por
cromatografia gasosa e espectrômetro de massa, revelando como principais
constituintes: β-cariofileno e germacreno-D. A avaliação da toxicidade aguda foi
representada pela determinação da DL50, em camundongos swiss, obtida pelo
método dos probitos; não foi possível mensurar a DL50 do extrato aquoso, devido a
sua baixa toxicidade, já o óleo essencial, obteve uma DL50 de 1,1 g/kg. O efeito
antinociceptivo foi estudado usando o modelo de artrite induzida por cristais de urato
de sódio, em ratos wistar, proposto por Coderre e Wall. O extrato aquoso apresentou
efeito antinociceptivo significativo na dose de 50 mg/Kg, o qual foi revertido pelo
antagonista opióide, naloxona (5mg/kg). O óleo essencial não apresentou efeito
antinociceptivo nas doses testadas. Os resultados mostraram que o extrato aquoso
possui baixa toxicidade e apresenta atividade antinociceptiva numa condição
reumática, semelhante à artrite gotosa; enquanto o óleo essencial apresenta
toxicidade média e não apresenta atividade antinociceptiva na condição reumática
proposta.
Palavras-chave: Hyptis pectinata L. Poit.; toxicidade aguda; antinocicepção; artrite
gotosa.
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ABSTRACT Hyptis pectinata L. Poit. (Lamiaceae), widely known as Sambacaitá, is an example of
a plant commonly used in folk Medicine; various biological effects are associated with
its extracts, such as: analgesic, anti-inflammatory, and anti-microbial. Many studies
“in vivo” and “in vitro” has assessed the effects promoted by the aqueous extract and
essential oil of the leaves of the plant, whose chemical composition constitute their
water soluble compounds and their volatile compounds, respectively. This study
aimed at keeping on these studies, determining the chemical constituents and the
acute toxicity of the sample of the aqueous extract and essential oil used to study the
analgesic effect of these extracts in an acute articular inflammatory condition, similar
to an episode of acute arthritis as in Gout. The phyto-chemical studies of aqueous
extract identified the presence of alkaloid, tannin and flavonoid. The analysis of the
constituents of the essential oil was made by gas chromatography and mass
spectrometer, showing as main constituents: β- cariofilene and Germacrene-D. The
evaluation of acute toxicity was represented by the establishment of DL50 in Swiss
mice, obtained by the probits method, it was not possible to measure the DL50 of the
aqueous extract due to its low toxicity, as for the essential oil, it was obtained a 1.1
g/kg DL50. The analgesic effect was studied using the sodium urate crystals induced
arthritis model, in Wistar mice, as proposed by Coderre and Wall; the aqueous
extract presented expressive analgesic effect with the 50 mg/kg doses, which was
reverted by the opioid antagonist, naloxone (5 mg/kg). The essential oil did not
present analgesic effect with the tested doses. The results showed that the aqueous
extract has low toxicity and it presents analgesic effect in a rheumatic condition,
similar to Gout arthritis, while the essential oil presents medium toxicity and it does
not show analgesic effect in the proposed rheumatic condition.
ainda, uma diferença significativa quando comparando os grupos E.A.50 e E.A.50 +
Naloxona (q0,05(1);4,29 = 6,17; p<0,01).
Tabela 6 – Efeito do E.A. de H. pectinata no tempo de latência ao calor em ratos Tratamento / dose (mg/kg) Média ± EPM Redução do ∆ T (%)
Controle (Salina) 4,85 ± 0,62 -
E.A. 50 0,07 ± 0,59 a 98,55
E.A. 50 + Naloxona 5 4,09 ± 0,83 15,7
E.A. 100 3,93 ± 0,68 18,96
E.A. 200 3,17 ± 0,45 34,63
ANOVA: [F 0,05(1); 4,29 = 8,139; p = 0,0002]; a p<0,001; n=6. Teste de Tukey.
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Óleo Essencial: Não foram detectadas reduções significativas nas médias dos deltas. A
única alteração significativa observada foi a do grupo experimental O.E. 100, que
apresentou aumento significativo da sua média para acima da média do controle
(q0,05(1);3,23 = 4,79; p<0,05).
Tabela 7 – Efeito do O.E. de H. pectinata no tempo de latência ao calor em ratos Tratamento / dose (mg/kg) Média ± EPM Redução do ∆ T (%)
Controle (PPG) 2,99 ± 0,66 -
O.E. 50 1,1 ± 0,4 63,21
O.E. 100 5,3 ± 0,56 c -77,25
O.E. 200 2,22 ± 0,27 25,75
ANOVA: [F 0,05(1); 3,23 = 12,62; p < 0,0001]; c p<0,05; n=6. Teste de Tukey.
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6. Discussão No estudo de toxicidade aguda, o extrato aquoso da H. pectinata não
levou a óbito nenhum dos camundongos que receberam a solução do extrato na
dose de 5 g/kg (v.o.), não sendo possível determinar a sua DL50. Segundo
DIETRICH (1983), uma droga que não apresente letalidade a animais de laboratório
na dose de 5 g/kg, possui baixa toxicidade. Esse dado confirma a baixa toxicidade
do extrato aquoso da H. pectinata já relatado por BISPO e col. (2001); corroborando
com o conhecimento popular que não atribui qualquer efeito tóxico ao chá de
sambacaitá.
O óleo essencial da H. pectinata, ao contrário do seu extrato aquoso,
apresentou efeito tóxico. A partir da percentagem de óbitos provocados pelo óleo
essencial nas três doses inicialmente utilizadas (1 g/kg: 33,33% de mortos, 3 g/kg:
83,33% e 5 g/kg: 100%), foram escolhidas outras duas doses para completar o
número de doses necessárias para o cálculo da DL50, através do método dos
probitos. A provável localização da DL50 entre as doses 1 e 3 g/kg levou à escolha
das doses 1,5 e 2 g/kg. A DL50 estimada pelo método dos probitos foi de 1,1 g/ kg.
Não foi objetivo do trabalho estudar a causa mortis dos animais, nem
avaliar as alterações comportamentais ocorridas após a administração do óleo
essencial; no entanto, chamou a atenção logo após a administração deste, um
quadro de letargia na maioria dos camundongos, seguido de perda de reflexo
postural e perda da consciência, seguindo-se na dose mais alta por apnéia e morte
em um período inferior a uma hora após a administração; sugerindo um efeito
depressor do óleo essencial.
A triagem fitoquímica do extrato aquoso revelou a presença de alcalóides,
taninos e flavonóides. Não foi revelada a presença de saponinas, nem de esteróides
e/ou terpenóides, no caso dos terpenóides, por serem extremamente voláteis o
próprio processo de obtenção do extrato aquoso pode ter influenciado a sua
ausência na amostra.
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Para a análise da composição química do óleo essencial, os seus
constituintes foram separados no cromatógrafo a gás (CG) e, em seguida, o
espectrômetro de massa (MS) informou a estrutura de cada um dos componentes.
Foram obtidos noventa e um constituintes isolados, destes, apenas quinze
apresentaram concentração acima de 1% na amostra, os que se encontraram abaixo
desta percentagem foram descartados para evitar que possíveis ruídos do aparelho
fossem tratados como constituintes químicos.
Para a identificação dos componentes do óleo essencial foram
necessários os índices de retenção fornecidos pelo cromatógrafo a gás, e os
padrões de espectro de compostos isolados dos bancos de dados do espectrômetro
de massa, o cruzamento entre esses dados forneceu a identificação dos compostos
químicos. A ausência de um padrão correspondente a um determinado composto
prejudicara a identificação do mesmo. Quatro dos quinze constituintes relatados não
foram identificados, pela ausência de seus respectivos padrões nos bancos de
dados do espectrômetro de massa.
Os constituintes identificados em maior quantidade foram o ß-cariofileno e
o germacreno-D, eles apresentaram percentagem de 29.28% e 16.84%,
respectivamente. O ß-cariofileno, é um sesquiterpeno que faz parte do mecanismo de
defesa nas plantas, apresenta efeito repelente contra insetos e antifúngico
(CAI,2002). Em estudos in vivo e in vitro demonstrou atividade analgésica local
(GHELARDINI, 2001), e também alérgena (SKÖLD,2006). O germacreno-D, outro
sesquiterpeno, é um poderoso ferormonio que exerce quimioatração a várias classes
de insetos (MOZURAITIS, 2002).
Para a análise dos dados do estudo antinociceptivo foi utilizado análise
estatística paramétrica, por se tratar de uma pesquisa quantitativa e por ter variáveis
não-ordinais. Os dados obtidos obedeceram à distribuição gaussiana, sendo
submetidos, em seguida, ao Teste de Kolmogorov-Sminov (Teste da Normalidade) e
ao pós-Teste de Tukey. O Teste de Tukey é a alternativa mais indicada nos estudos
em que há a comparação com um grupo controle, para os efeitos de um dado
experimento (BARROS e REIS, 2003).
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Na avaliação do efeito antinociceptivo dos controles, o propilenoglicol não
apresentou efeito antinociceptivo, como já era esperado, isso permitiu o uso dele
como veículo para a administração do óleo essencial e conseqüentemente como
controle negativo do mesmo.
A colchicina não apresentou efeito antinociceptivo. Relatos na literatura a
respeito do emprego da colchicina em modelos de artrite, induzida por cristais de
urato de sódio, em humanos e animais, demonstraram essa ausência de
antinocicepção, indicando que a ação analgésico não ocorre quando ela é
administrada como pré-tratamento de um quadro de artrite ainda não totalmente
estabelecido, mas apenas como tratamento da artrite já estabelecida (CODERRE e
WALL, 1987).
Em uma condição clínica, a ação analgésica da colchicina se dá de forma
indireta, pela redução do processo inflamatório. Ela se liga à tubulina, principal
proteína que constitui o citoesqueleto celular, promovendo a sua despolimerização,
impedindo assim, a diapedese de leucócitos para o foco inflamatório articular e
periarticular (CANNELLA et al, 2005). Com isso, diminui a liberação pelos leucócitos
de prostaglandinas no local da inflamação. As prostaglandinas in loco agem sobre
receptores para bradicinina, nas terminações nervosas, sensibilisando-os para
potencializar a ação da própria bradicinina. (RANG et al, 2001).
A morfina diminuiu significativamente o delta do tempo de retirada de pata,
do grupo em que foi administrada, indicando um efeito antinociceptivo central, o qual
não foi revertido significativamente pela naloxona.
O extrato aquoso demonstrou uma significante resposta antinociceptiva na
dose de 50 mg/kg de animal, apresentando uma redução no delta do tempo de
latência, em relação ao controle, de 98,55% (p<0,001). Esse efeito foi revertido
significativamente quando animais tratados com esta mesma dose do extrato aquoso
foram pós-tratados com um antagonista opióide (naloxona), sugerindo uma possível
via de ação através de receptores opióides, de um ou mais constituintes do extrato
aquoso.
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O óleo essencial da H. pectinata não apresentou efeito antinociceptivo em
nenhuma das doses utilizadas, apesar de estudos anteriores indicarem esse efeito
nos modelos: contorção abdominal induzida por ácido acético a 0,6 %, e hot plate
(BLANK,2005).
Este trabalho contribui para a compreensão dos efeitos do óleo essencial
e extrato aquoso da Hyptis pectinata L. e sugere a necessidade de se obter novos
conhecimentos em estudos complementares futuros para o uso seguro como
fitoterápico. Contudo, outros estudos complementares deverão ser realizados para
melhor elucidação dos mecanismos de ação das substâncias que compõem o óleo
essencial e extrato aquoso da planta em estudo.
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7. CONCLUSÃO
Conforme os resultados obtidos na presente investigação, foi possível
concluir que:
- As principais classes de metabólitos identificados na amostra de extrato aquoso
foram alcalóides, taninos, e flavonóides;
- Os principais constituintes químicos identificados na amostra do óleo essencial
foram ß-cariofileno e germacreno-D, ambos de estrutura terpênica;
- O extrato aquoso da Hyptis pectinata (L.) Poit. apresentou baixa toxicidade, na
administração por via oral, não sendo possível determinar sua DL50;
- O Óleo essencial da Hyptis pectinata (L.) Poit. apresentou alta toxicidade
quando administrado por via oral. DL50 1,1 g/Kg;
- O extrato aquoso da Hyptis pectinata (L.) Poit. apresentou efeito antinociceptivo
central no modelo utilizado;
- O óleo essencial da Hyptis pectinata (L.) Poit. não apresentou efeito
antinociceptivo no modelo proposto;
- A ação do extrato aquoso da Hyptis pectinata (L.) Poit. sugere envolver a
participação de receptores opióides.
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8. REFERENCIAL TEÓRICO
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9. ANEXOS Anexo 1 - Declaração do CEPA (Conselho de Ética em Pesquisa com Animais).
63
Anexo 2 - Cálculos para obtenção para equação da reta e dose letal 50% 1– Valor probíticos provisórios:
Dose A == > 6/6 - 4/6 = 2/6 = 0,3333 < ½ Vide tabela 08 - Não existe na Tabela 03 o
quantil simples.
9/28 = 0,3214 Vide :. 9/28 na Tabela 03 = 0,4637
2/6 = 0,3333
10/29 = 0,3448 Vide :. 10/29 na Tabela 03 = 0,3993
0,0644
Interpolação
(9 + 10) / (28 + 29) = 19/57 (19 + 1)/57 = 20/57
Como 2/6 é menor que ½, subtrair o afastamento normal de 5. Então:
5 – [ 0,3993 + 20/57 (0,0644) ] = 4,5781
Dose B == > 6/6 - 2/6 = 4/6 = 0,6666 > 1/2 Somar o afastamento da normal a 5
1/1 – 4/6 = 2/6 Vide tabela 03 = 0,4219 então 5 + 0,4219 = 5,4219
Dose C == > 6/6 – 1/6 = 5/6 = 0,8333 > 1/2 Somar o afastamento da normal a 5
1/1 – 5/6 = 1/6 Vide tabela 03 = 0,9674 então 5 + 0,9674 = 5,9674
Dose D == > 6/6 – 1/6 = 5/6 = 0,8333 > 1/2 Somar o afastamento da normal a 5
1/1 – 5/6 = 1/6 Vide tabela 03 = 0,9674 então 5 + 0,9674 = 5,9674
Dose E == > Não calculado (não houve sobreviventes)
2 – Coeficiente de regressão provisório:
b = 3 (D – A) + (C – B) / 3² + 1²
b = 3 (1,3893) + 0,5455 / 10 = 0,4713
b ≈ 0,47
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Probite provisório: A = 4,5781
B = 5,4219
C = 5,9674
D = 5,9674
E = -
3 – Probite esperado (y):
Menor probite esperado = b x nº de intervalos entre as doses
0,47 x 4 = 1,88
Menor probite provisório esperado =
maior probite esperado – coeficiente de regressão provisório x intervalo =
menor probite provisório esperado
5,9674 – (0,47 x 4) = 5,9674 – 1,18 = 4,08 ≈ 4,1
A B C D E A = 4,1
4,1 4,5 4,9 5,3 5,7 B = A + 0,4 = 4,1 + 0,4 = 4,5
C = B + 0,4 = 4,5 + 0,4 = 4,9
D = C + 0,4 = 4,9 + 0,4 = 5,3
E = D + 0,4 = 5,3 + 0,4 = 5,7
4 – Probite operacional (y) – trabalhar com a Tabela 09, coeficiente de ponderação e
valores probíticos para ajustes finos.
Solução A — Probite esperado → 4,1
Probite max. operacional → 7,1665
Intervalo → 3,7582 . (4/6) = 2,5055
7,1665 – 2,5055 = 4,661
Solução B — Probite esperado → 4,5
Probite max. operacional → 6,4640
Intervalo → 2,8404 . (2/6) = 0,9468
6,4640 – 0,9468= 5,5172
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Solução C — Probite esperado → 4,9
Probite max. operacional → 6,2599
Intervalo → 2,5192 (1/6) = 0,4199
6,2599 – 0,4199= 5,8400
Solução D — Probite esperado → 5,3
Probite max. operacional → 6,3018
Intervalo → 2,6220 . (1/6) = 0,4370
6,3018 – 0,4370= 5,8648
Solução E — Probite esperado → 5,7
Probite max. operacional → 6,4749
5. Ponderação (ω) = coeficiente de ponderação x n , onde n = 6 número de animais
Muitas frações com denominadores maiores podem ser rapidamente obtidas por simples interpolação entre valores adjacentes; por exemplo, de 5/13 e 7/18 devido a (5+7) / (13+18) = 12/31, o afastamento normal para 12/31 é julgado como sendo 0,2822 + (13/31).(0,0112) = (0,286897). O valor correto é 0,286894. Cada trigésimo é marcado com um asterisco. Para converter em valores probíticos subtraia de 5, e para frações λ maiores do que ½, adicione a 5 o valor para 1- λ.
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Anexo 4 - Probitos
Tabela 9 - Probitos - Coeficientes de ponderação e valores probíticos para serem utilizados em ajustes finos (adaptado de Bliss, 1935).
Em toxicologia, os valores probíticos utilizados são encontrados adicionando-se 5 ao afastamento normal. O coeficiente de ponderação Z2 / PQ para qualquer teste é derivado do próbite Y dado por alguma fórmula provisória. O resultado apropriado para um teste em que uma proporção ρ observada morre e q sobrevive é yc, onde q = (Y-P/Z) + p/Z = (Y+Q/Z) – q/Z = q(Y-P/Z) + p(Y+Q/Z).