INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA “Toxicidad y bioacumulación del plomo en Macrobrachium americanum” TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE PRESENTA JOAQUÍN REYES CHÁVEZ GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE 2012
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
“Toxicidad y bioacumulación del plomo en
Macrobrachium americanum”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
JOAQUÍN REYES CHÁVEZ
GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE 2012
II
III
IV
V
Este trabajo de tesis se llevó a cabo en el Departamento de Acuacultura del
Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR)
Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). Bajo la dirección del Dr. Juan
Carlos Sainz Hernández y M.C. Juan Pablo Apún Molina. El presente trabajo recibió
financiamiento del IPN a través del proyecto SIP, con número de registro 20121065.
El autor agradece el apoyo brindado por el IPN como becario PIFI y del programa de
becas posgrado, así como al Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología
(CONACYT) por la beca otorgada con clave 366434 durante la realización de la
presente investigación.
VI
DEDICATORIA.
A mi familia: Con toda la fuerza de mi corazón. …
Les pido perdón por todo el tiempo que les falte, para culminar esta tesis
VII
AGRADECIMIENTOS.
Al creador de la vida, por darme la oportunidad de vivir y poder alcanzar mis metas. A mi director de tesis, el Dr. Juan Carlos Sainz Hernández, agradezco infinitamente todo su apoyo, por compartir desinteresadamente sus conocimiento, experiencias, consejos y su amistad, más que un profesor y director; un gran amigo. Mi compa ya estas “misión cumplida”. A mi Co-director M.C. Juan Pablo Apún Molina, por el apoyo brindado. Al equipo de trabajo que colaboró de alguna forma en el trabajo de campo, laboratorio y bioensayos: Genaro, Jazz, Arturo, Ely Sara, Polanco, Daniel. A los señores; “El che” y don “Jesús” del poblado El Opochi, Sinaloa de Leyva por la captura de los organismos. A mis compañeros y amigos de generación; oh-John, Che-luís, Magnolia, José Pedro, Tomas, Lizet, Lalo, shio, Styl, José, Samuel, Jorge, Juan Carlos, Porfirio †, Sheila, Liz, Fátima, Eli, Irene, Alfredo; y Abraham, Carlos, Viri, Carmen, Judith, Dámaris. A Dorín, Don Roberto, Ricardo y Celestino; por ser nuestros centinelas en la vida estudiantil. A la Secretaría de Marina-Armada de México, por darme la oportunidad de superarme profesionalmente. A la empresa CLARVI Lideres en Tratamientos de Agua, en la Ciudad de Los Mochis, Sinaloa. Por abrirme sus puertas al realizar una estancia de investigación; en el asesoramiento y uso de técnicas de AAG. ¡Muchas gracias a todos!
VIII
ÍNDICE GENERAL
CONTENIDO PÁGINAS
ÍNDICE GENERAL……………………………………………………………..
VIII
ABREVIATURAS………………………………………………………………. X
GLOSARIO……………………………………………………………………… XII
ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………. XIV
ÍNDICE DE CUADROS………………………………………………………... XVI
RESUMEN………………………………………………………………………. XVII
ABSTRACT……………………………………………………………………... XVIII
I.
INTRODUCCIÓN………………………………………………………...
1
II. ANTECEDENTES………………………………………………………. 5
II.1 Toxicidad…………………………………………………………. 5
II.2 Bioacumulación………………………………………………….. 5
II.3 Expresión de proteínas quelantes (metalotioneínas)……….. 6
II.4 Sistema de secuestro y detoxificación de metales………….. 7
III. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………... 8
IV. HIPÓTESIS………………………………………………………………. 9
V. OBJETIVOS……………………………………………………………... 10
V.1 Objetivo general…………………………………………………. 10
V.2 Objetivos específicos…………………………………………… 10
VI. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………... 11
VI.1 Colecta, transporte y aclimatación de los animales…………. 11
VI.2 Diseño experimental…...……………………………………….. 12
VI.2.1 Laboratorio…….………………………………………. 12
VI.2.2 Determinación de parámetros fisicoquímicos….….. 12
VI.2.3 Bioensayo I (Exposición aguda)…………………….. 12
VI.2.4 Bioensayo II (Exposición crónica)…………………... 13
VI.3 Cuantificación de plomo……………...………………………… 13
IX
VI.4 Ingesta……………………………………………………………. 15
VI.5 Análisis del sistema inmunológico…………………………...... 15
VI.5.1 Obtención de la hemolinfa….……………..………… 15
VI.5.2 Coagulación…………………………………...………. 16
VI.5.3 Cuantificación de proteína…………………………... 16
VI.5.4 Hemocitos totales………………………………..…… 16
VI.5.5 Medición de fenoloxidasa (FO) y profenoloxidasa
(proFO)….……..……………………………………….
17
VI.6 Método estadístico……………………………………………… 18
VII. RESULTADOS………………………………………………………….. 20
VII.1 Bioensayo I………………………………………………………. 20
VII.1.1 Concentración letal (CL50)……………………...……. 20
Según Díaz 2001 los intervalos óptimos para el cultivo de langostino en
ambientes controlados son: oxígeno disuelto de 5.0 a 6.0 mg L-1; pH de 7.5 a 8.5 y
temperatura de 26 a 32 °C.
Los parámetros fisicoquímicos (Cuadro 6) en el bioensayo I presentó los
siguientes valores promedios, la temperatura (29.84 ± 2.29 °C), oxigeno disuelto
(5.53 ± 0.46 mg L-1) y pH (8.16 ± 0.06 UpH). En el bioensayo II registró los siguientes
valores promedios, la temperatura (24.11 ± 2.09 °C), oxigeno disuelto (5.81 ± 0.86
mg L-1) y pH (8.10 ± 0.04 UpH).
35
Cuadro 6. Parámetros fisicoquímicos del bioensayo I y II. Dosis de
plomo expuesto (0.186 µg mL-1), temperatura, oxígeno disuelto y
potencial de hidrógeno. Promedio EE.
TRATAMIENTOS TEMPERATURA
(° C) OXÍGENO DISUELTO
(mg L-1) pH
(UpH)
Bioensayo I Control 28.08±1.67 5.98±0.38 8.21±0.07
Dosis de plomo replica 1 30.41±2.19 5.44±0.33 8.14±0.05 Dosis de plomo replica 2 31.03±1.94 5.17±0.22 8.13±0.05
Dosis de plomo replica 3 28.41±2.83 5.28±0.22 8.10±0.05 Bioensayo II
Control 25.91±0.61 6.82±0.27 8.10±0.01
Dosis de plomo replica 1 25.01±2.70 6.08±0.55 8.10±0.01
Dosis de plomo replica 2 26.30±3.39 5.47±0.99 8.10±0.01
Dosis de plomo replica 3 26.27±2.66 5.55±0.75 8.10±0.01
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VIII. DISCUSIONES
Explorar, comprender e identificar las dosis necesarias para llevar a cabo los
experimentos fueron las bases más solidas para desarrollar los bioensayos tóxicos in
vitro. De acuerdo con Bliss (1935), estadísticamente se puede calcular la
concentración letal al 50% (CL50). En el presente trabajo se emplearon diferentes
dosis de plomo (acetato de plomo) empleando a un organismo biológico como
centinela “Macrobrachium americanum” dando como respuesta un efecto de
mortalidad a las 96 hrs. Estos resultados fueron calculados obteniendo una CL50 de
0.398 µg mL-1 a 96 horas, demostrando que M. americanum es altamente sensible al
plomo. Aquí cabe señalar que la NMX-001-ECOL-1996 de la Calidad del Agua para
la Protección de la Vida Acuática en ríos, el grado máximo permitido es de 0.400 µg
mL-1 promedio mensual, por lo que se sugiere una revisión de la norma para una
protección real de la vida acuática.
Se encontraron resultados similares en trabajos reportados por Qing Wang et
al., (2009), en un estudio con la almeja M. meretrix evaluaron la toxicidad con plomo
encontrando una CL50 de 0.353 µg mL-1 en etapa larvaria. Así mismo, Benediet et al.,
(2008) realizaron un estudio para determinar los límites de toxicidad de plomo donde
también se encontró una similitud en Cyclop sp, con 0.300 µg mL-1. Camacho y
Gamboa (2003), trabajando con postlarvas de M. rosenbergii encontraron una CL50
de 0.165 µg mL-1 a 48 horas con plomo.
Los resultados de la prueba estadística de Bliss (1935), indican que la
concentración sub-letal del mínimo efecto fue al 11% (CSL11), con una concentración
de 0.186 µg mL-1 a 24 horas. Este parámetro presentó resultados muy similares a lo
recomendado en la NOM-001-ECOL-1996 de la calidad del agua en el uso y
aprovechamiento del agua en ríos para la protección de la vida acuática, cuya
concentración es de 0.200 µg mL-1 como promedio diario. Además Benediet et al.,
(2008) también encontraron límites de toxicidad del plomo en Daphnia magna
mostrando una concentración de 0.190 µg mL-1. Bajo este mismo criterio,
37
recientemente Ayala Rodríguez (2009) encontró en el Río Sinaloa concentraciones
máximas de 0.130 µg mL-1 en la sindicatura de Los Quemazones, Guasave.
La CSL11 calculada y empleada en este trabajo resultó ser apropiada para la
descripción del comportamiento de algunas variables que intervienen en la toxicidad
del plomo en M. americanum.
Uno de los primeros signos observados en los organismos expuestos fue la
disminución de la ingesta hasta un 12% con respecto a la semana uno. Conforme los
organismos controles iban creciendo, la ingesta aumentó de forma continua hasta
llegar a un aumento del 36% al final del experimento.
Las moléculas de plomo tienen la capacidad de unirse a sitios específicos de
aminoácidos que tienen en su cadena azufre (cisteínas). Además son altamente
inhibidoras de enzimas que necesitan un co-factor (Zn, Fe, Cu, Ca) para activarse
(Castillo-Rodríguez, 2005). De acuerdo con Sritunyalucksana y Söderhäll (2000) la
coagulación de la hemolinfa es una respuesta de defensa en los crustáceos, para
sellar sus heridas evitando la entrada de partículas extrañas. Ellos describen que el
ion calcio (Ca++) es un factor limitante para que se lleve a cabo con mayor eficiencia
la coagulación, por lo que podemos relacionar en este estudio los organismos
tratados con plomo resultaron afectados ya que resultó que disminuyó la capacidad
de coagulación de 21 a 100 segundos, conforme aumentaba el tiempo de explosión
del plomo. Debido a la acción tóxica del plomo impidió que se llevará a cabo una
serie de reacciones enzimáticas proteolíticas en el plasma de la hemolinfa donde se
sustituyo el Calcio por el Plomo. Por lo tanto se infiere que el plomo tuvo la
capacidad de desplazar al Calcio (Ca+2) y la afinidad para sustituirlo por tener un
radio iónico muy similar (Pb+2), cambiando la funcionalidad de la moléculas y
haciéndola menos efectiva ya que el tiempo de coagulación se prolongó hasta los
100 segundos (Reyes-Gil 1999, Boada et al., 2007).
38
Los hemocitos forman parte importante de la coagulación de la hemolinfa,
gracias a la enzima Transglutaminasa (TGasa) que se encuentra en el interior de las
células hialinas (hemocitos), el cual solo es liberada al plasma en presencia de
alguna herida (Yeh et al., 1998). En el presente trabajo, los hemocitos aumentaron
paulatinamente durante todo el experimento, lo cual hace pensar que había
suficiente TGasa y que el mal funcionamiento de la coagulación fue dada por la
sustitución del calcio por el plomo.
La distribución del plomo en los tres tejidos y en la hemolinfa del organismo
presentó un orden cumulativo decreciente de la siguiente manera: Hepatopáncreas˃
Exosqueleto˃ Músculo˃ Hemolinfa. Observándose dos grupos con comportamientos
diferentes: Grupo I.- El hepatopáncreas y exosqueleto, desarrollaron una
acumulación creciente durante las seis semanas. Grupo II.- El músculo y hemolinfa
desarrollaron una baja acumulación durante las cuatro semanas que posteriormente
se origino una depuración en la semana cinco5.
Según lo reportado por Soto-Jiménez et al., (2011), encontraron que el plomo
dentro de la cadena trófica produce una red de bioacumulación donde principalmente
recae en dos niveles tróficos; en los peces hasta 3.4 µg g-1 y en camarones hasta 3.5
µg g-1. En el presente trabajo se relaciona de igual manera la bioacumulación del
plomo en el hepatopáncreas de M. americanum iniciando desde una concentración
no detectable hasta 2.15 µg g-1.
Por otra parte se han reportado valores de plomo en organismos silvestres.
Según Nguyen (2008) en hepatopáncreas, exosqueleto y músculo de M. rosenbergii,
en un rango de 0.011 a 0.109 µg g-1, 0.026 a 0.134 µg g-1 y 0.002 a 0.025 µg g-1,
respectivamente. Además, Ala et al., (2010) encontraron concentraciones en hígado
y músculo de Clarias gariepinus desde 5.51 a 20.73 µg g-1 y 5.89 a 14.51 µg g-1,
respectivamente. Resultados similares se encontraron en el presente estudio en el
exosqueleto y musculo de M. americanum, según Nguyen (2008) y por debajo según
lo reportado por Ala et al., (2010).
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El sistema ProFO actúa ante la presencia de materiales extraños (Vargas-
Albores; 1996), sin embargo, para la eliminación de materiales tóxicos que no son
reconocidos directamente por el sistema ProFO como los metales pesados, existen
varias vías de desintoxicación entre las que destaca la quelación de los metales
divalentes como el plomo por una proteína llamada Metalotioneína (Roesijadi 1992),
la cual después de atrapar el plomo expone un sitio que es reconocido por la FO. La
Metalotioneína una vez reconocida u opsonizada por la FO, es fagocitada por los
hemocitos, los cuales forman vacuolas y desintoxican al organismo (Ahearn et al.,
2004). La metalotioneína puede remover hasta 5-7 moles de metales pesados por
mol de proteína (Fatemeh y Shahab 2011).
En el presente trabajo, los hemocitos aumentaron continuamente de manera
significativa hasta el final del experimento, al mismo tiempo la proteína del plasma
disminuyó regularizándose en la cuarta semana, mientras que la proteína aumento
en los hemocitos. La cantidad de proteína en el plasma es 100 veces mayor que en
los hemocitos y la disminución puede estar relacionada con la disminución en la
ingesta, por lo que no se detecta una relación con la generación o consumo de
proteína ligada al plomo. Sin embargo, el aumento de proteína en los hemocitos
concuerda con la fagocitosis de la metalotioneína que queló el plomo hasta la tercera
semana. Esta explicación concuerda con los niveles de actividad de la FO y proFO,
la primera semana se consumió la FO de manera significativa aunque también hubo
un aumento de su producción en la ProFO. La tercera semana es clave en el proceso
de desintoxicación, aquí se encontraron las máximas concentraciones de proFO y
FO y proteína dentro de las células y en la cuarta semana también las máximas
concentraciones de plomo en hemolinfa y músculo. Para la quinta semana los niveles
de plomo en hemolinfa y musculo descendieron a cero, lo que significa que el
proceso de desintoxicación vía metalotioneína funcionó adecuadamente.
A partir de la cuarta semana, los datos sugieren que se detuvo el proceso de
desintoxicación por metalotioneína y se activó otro proceso diferente. Ahearn et al.,
(2004) hace referencia a diferentes procesos de secuestro y desintoxicación por
metales pesados en crustáceos. Ellos proponen un mecanismo de transporte de
40
cationes en la glándula digestiva en donde los metales pesados se absorben por el
epitelio de la glándula digestiva para secuestrarlas en las mitocondrias o en
lisosomas como un precipitado insoluble. En el presente trabajo no se tiene evidencia
clara del proceso que siguió después de la desintoxicación en la tercer semana,
únicamente se tiene el dato de un aumento progresivo de plomo en la glándula
digestiva, lo cual nos da indicios de la participación de esta glándula en el secuestro
del plomo. Como dato adicional, las glándulas digestivas de los langostinos
expuestos, se melanizaron (tornando una apariencia más obscura) y fueron de
menor tamaño que los controles (Anexo 3).
En el exoesqueleto también se detectó hasta 10 veces más plomo que en la
hemolinfa y se concentró en forma continua hasta la sexta semana, esto nos dice
que el plomo que se inserta en el exoesqueleto, tomando el lugar del calcio, no se
retira sino hasta que el organismo muda, quedando el plomo disponible para ser
ingerido por el mismo langostino u otros organismos que ingieren el exoesqueleto
(Soto-Jiménez et al., 2010).
41
IX. CONCLUSIONES
OBJETIVO 1.
La CL50 y CSL11 obtenidas por el método estadístico de Bliss fueron de 0.398
µg mL-1 y 0.186 µg mL-1 respectivamente, estas concentraciones son menores
que las concentración marca en la NMX-001-ECOL-1996 tanto para el máximo
promedio mensual y máximo promedio diario.
M. americanum puede utilizarse como organismo centinela por tener
sensibilidad al plomo al expresar una CL50 y CSL11 más bajo que las normas
ambientales mexicanas (NMX-001-ECOL-1996).
OBJETIVO 2.
El hepatopáncreas desarrolló la mayor bioacumulación de plomo.
En el músculo y hemolinfa se desarrolló la menor bioacumulación de plomo.
OBJETIVO 3.
La CSL11 de plomo (0.186 µg mL-1) tuvo un efecto crónico sin mortalidad en M.
americanum lo cual permitió el estudio del efecto de la ingesta y las variables
inmunológicas.
Los organismos expuestos al plomo tuvo una disminución de la TCA hasta un
36% con respecto al control.
Los organismos expuestos al plomo disminuyo su capacidad de coagulación
retardándose hasta 100 segundos.
El sistema de inmunológico innato del M. americanum no reconoció y eliminó
el material tóxico del plomo, por lo que la desintoxicación fue por la vía de la
quelación del plomo por la Metalotioneína que expone un sitio específico para
42
poder ser reconocida y opsonizada por la FO y posteriormente fagocitada por
los hemocitos y almacenada en las vacuolas.
43
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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XI ANEXOS
Anexo1. Tabla. Relación entre el Probit empírico y el porcentaje de mortalidad (Bliss, 1935).