Tomáš Erban a kol. Hodnocení vlivu xenobiotik na … vlivu xenobiotik na včely v průběhu ontogeneze metodami proteomické, metabolomické a genomické analýzy Tomáš Erban

Tomáš Erban a kol.

Hodnocení vlivu xenobiotik na včely v průběhu

ontogeneze metodami proteomické, metabolomické a

genomické analýzy

CERTIFIKOVANÁ METODIKA

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i.

2016

Tomáš Erban a kol. – Hodnocení vlivu xenobiotik na včely ©

Hodnocení vlivu xenobiotik na včely v průběhu

ontogeneze metodami proteomické, metabolomické a

genomické analýzy

Tomáš Erban a kolektiv

Autorský tým:

Tomáš Erbanф,

Martin Kamlerƚ

Klára Šulcováф,Ѳ

Dalibor Titěraƚ

Marcela SeifrtováѠ

Kateřina RiddellováѠ

Jan Hubertф

Bronislava Hortováф

Taťána HalešováѠ

фVýzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., Drnovská 507/73, Praha 6-Ruzyně, 161 06

ƚVýzkumný ústav včelařský, s. r. o., Máslovice-Dol 94, p. Libčice nad Vltavou, 525 66

ѠALS Czech Republic, s. r. o., Na Harfě 336/9, Praha 9-Vysočany, 190 00

ѲČeská zemědělská univerzita v Praze, Katedra ochrany rostlin, Kamýcká 129, Praha 6-Suchdol, 165 21

RNDr. Tomáš Erban, Ph.D, [email protected]; [email protected]

Oponenti:

Mgr. Hana Kubátová-Hiršová, Ph.D. – specialista POR, Sekce zemědělských vstupů, Odbor přípravků

na ochranu rostlin, Oddělení rizik a účinnosti POR, Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, Brno

Ing. Michal Bednář – aktivní včelař a bývalý pracovník ve výzkumu včel; přírodovědní analytik-

diagnostik, Pracoviště chromatografických metod, Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, Brno

Vydal:

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., Praha, 2016

ISBN 978-80-7427-210-3

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]


Financování:

Tato certifikovaná metodika je výsledkem projetu TA ČR č. TA04020267

s názvem „Minimalizace rizik spojených s dopadem výskytu chemických látek

v životním prostředí na užitečné organismy: Metodiky hodnocení znečištění

životního prostředí pesticidy zejména ve vztahu k opylovatelům, především včele

medonosné“ řešeného v období 2014–2017.

Určení pro využití v praxi:

Metodika je určena pro státní správu s využitím pro laboratoře zabývající se zdravím včel a

ekotoxikologií. Metodika bude po překladu do anglického jazyka využita také mezinárodními

organizacemi jako EEA (European Environment Agency; Evropská agentura pro životní prostředí),

EPA (United States Environmental Protection Agency; Agentura pro ochranu životního prostředí

USA) či EFSA (European Food Safety Authority; Evropský úřad pro bezpečnost potravin) řešícími

hodnocení rizik na včely a jiné opylovače. Předkládaná metodika má souvislosti s nařízeními komise

ES týkající se hodnocení a povolování přípravků na ochranu rostlin. Využití této metodiky je i pro

výrobce pesticidních látek a jiných agrochemikálií, kterým umožní exaktně vyloučit negativní vliv

pesticidních látek na včely.

Metodika má význam pro světovou včelařskou komunitu, neboť umožňuje exaktní hodnocení vlivu

xenobiotik na včelu medonosnou.

Certifikace:

Metodice bylo uděleno osvědčení MZe ČR č. 67510/2016-MZE-17221.

O uplatnění metodiky byla dne 07. 11. 2016 uzavřena smlouva č. TA04020267/Nmet1 podle podle

ustanovení § 1746 odst. 2 zákona č. 89/2012 Sb., občanský zákoník.

Oponentní posudky vypracovali Mgr. Hana Kubátová-Hiršová, Ph.D., a Ing. Michal Bednář.

Prohlášení:

Předkladatel metodiky prohlašuje, že zpracovaná metodika nezasahuje do práv jiných osob z průmyslového

nebo jiného duševního vlastnictví.

Poděkování: Autoři děkují včelmistru Ing. Peteru Kérimu za přípravu oddělků včel po dobu prováděných

experimentů souvisejících s touto metodikou. Za analýzu LC-MS/MS dat v proteomických studích

děkujeme Mgr. Karlu Harantovi. Poděkování dále patří Martinu Markovičovi, Mgr. Julii Chalupníkové,

Veronice Souralové a Ing. Janu Tylovi za technickou pomoc. V neposlední řadě děkuje autorský tým také

recenzentům metodiky za podnětné a cenné připomínky.


Anotace

Včela medonosná je využívána jako jeden z klíčových modelových organismů pro hodnocení rizik

přípravků na ochranu rostlin na necílové organismy. V posledních letech je významná mezinárodní priorita

získat exaktní metody pro hodnocení rizik agrochemikálií a jiných xenobiotik na opylovače, zejména včelu

medonosnou, ale i čmeláky a samotářské včely. Tato metodika umožňuje kombinací proteomické,

metabolomické a genomické analýzy různých typů vzorků včel získaných z jednoho expozičního

experimentu prokázat exaktně negativní vliv xenobiotik včetně jejich metabolitů na vývoj včelího plodu,

dospělé dělnice, matky, či trubce a predikovat tak další osud včelí kolonie v případě kontaminace

xenobiotikem. Důležitým prvkem metodiky je umožnění hodnocení více faktorů v rámci jedné biologické

expozice ve včelstvu najednou. Klíčové typy vzorků v metodice představují stádia zavíčkovaná v buňce

plástu, která již nepřijímají potravu s případným xenobiotikem dodávaným larvám včelami krmičkami.

Právě na těchto vzorcích, ve kterých zároveň probíhá metamorfóza v dospělce jsou proteomickým přístupem

nejlépe kvantifikovatelné negativní vlivy reziduálního působení xenobiotik. V metodice lze včelu

medonosnou vnímat především jako modelový organismus, na kterém se demonstrují environmentální

rizika testovaných xenobiotik z komplexního pohledu. Ačkoliv se uvedený metodický postup týká pouze

včely medonosné, obdobné postupy lze s jistými modifikacemi aplikovat i na jiné opylovače zejména

z čeledi Apidae a případně i na jiné necílové organismy. Metodika je využitelná v oblastech státní správy,

v soukromých laboratořích i ve výzkumné činnosti při hodnocení environmentálních rizik xenobiotik na

necílové organismy. Aplikací metodického postupu lze do jisté míry vyloučit budoucí environmentální

rizika při registraci nových přípravků a tudíž má tato metodika potenciál být využívána při testování nových

látek určených na ochranu rostlin před jejich registrací.


Title

Assessing influence of xenobiotics to honeybees during ontogenesis using proteomic, metabolomic and

genomic analysis

Annotation

Honeybee (Apis mellifera) is used as one of the key model species for the risk assessment of plant protection

products to non-target organisms. Currently, the priority international task is the development of methods

for the risk assessment of agrochemicals and other xenobiotics to pollinators particularly honeybees, and

bumblebees and solitary bees, too. This methodology combines proteomic, metabolomics and genomic

analysis of different kinds of samples obtained during the single exposure experiment and gives the evidence

of negative impact of xenobiotics and their metabolites to the development of all members of hive such as

honeybee brood, adult workers, queens and drones; thereby the future destiny of the honeybee colony can

be predicted. The major advantage of this methodology is the possibility to measure many factors during

the sole biological exposition of the hive to harmful compounds at once. The key sample type for the

quantification of detrimental residual effect of pesticides using proteomic approach is the honeybee

developmental stage capped in the cell but being no longer fed by nurse bees with xenobiotic-containing

diet just on the verge of metamorphosis of juvenile form into the adulthood stage. In the presented

methodology the complex environmental risk of xenobiotics is demonstrated using honeybee as a model

organism but it is applicable with some slight modifications to other pollinators from Apidae family or even

to other species of non-target organisms, therefore it is beneficial for government institutions, private

laboratories as well as further research organizations. The methodology can be then used for environmental

hazard of xenobiotics evaluation and examination as a constituent part of new plant protection products

registration procedure to better assess and prevent the future environmental risks.


Obsah

1. Cíl ...................................................................................................................................................... - 1 -

2. Úvod .................................................................................................................................................. - 1 -

2.1 Kauzalita některých environmentálně nebezpečných pesticidů ................................................ - 1 -

2.2 Hodnocení vlivu pesticidů na necílové organismy .................................................................... - 4 -

2.2.1 Úskalí nových látek ........................................................................................................... - 4 -

2.2.2 Platná legislativa Evropské unie – Úřední věstník EU ...................................................... - 4 -

3. Vlastní popis metodiky ...................................................................................................................... - 5 -

3.1 Metodický postup ...................................................................................................................... - 8 -

3.1.1 Příprava včelstev ............................................................................................................... - 8 -

3.1.2 Průběh experimentu s xenobiotikem ................................................................................. - 9 -

3.1.3 Periodické dávkování xenobiotika a zaručení produkce plodu ....................................... - 10 -

3.1.4 Odběr vzorků ................................................................................................................... - 10 -

3.1.5 Laboratorní zpracování vzorků ........................................................................................ - 13 -

3.1.5.1 Potřebné vybavení, chemikálie, instrumentace pro homogenizaci, proteomické a

metabolomické analýzy ................................................................................................................... - 13 -

3.1.5.2 Potřebné vybavení, chemikálie, instrumentace pro analýzu mikrobiomu ....................... - 15 -

3.1.6 Typy analýz a informace, které nám analýza jednotlivých vzorků poskytne .................. - 16 -

4. Srovnání novosti postupů ................................................................................................................ - 21 -

5. Uplatnění metodiky ......................................................................................................................... - 22 -

6. Ekonomické zhodnocení metodiky ................................................................................................. - 22 -

7. Publikace, které předcházely metodice ........................................................................................... - 24 -

9. Schematické uspořádání metodického postupu ............................................................................... - 25 -

10. Seznam literatury ............................................................................................................................. - 26 -

11. Obrazová příloha ............................................................................................................................. - 33 -


- 1 -

1. Cíl

Cílem této metodiky bylo vyvinout metodický postup pro spolehlivou analýzu vlivu pesticidů a jiných

xenobiotik na včelu medonosnou (Apis mellifera). Cílem vyvinuté metodiky bylo také usnadnit přístup a

předložit exaktní hodnocení environmentálních rizik pesticidů a jiných xenobiotik na necílové organismy.

Důležitým prvkem při tvorbě metodiky bylo předložit takový postup, který umožní hodnotit více faktorů

v rámci jedné biologické expozice ve včelstvu najednou. Zvláštní pozornost byla věnována sledování vlivu

cizorodých látek na včely v průběhu metamorfózy pomocí proteomických metod. Metodický postup

využívá i kvantitativní analýzy metabolomických metod ke zjištění zastoupení sledované látky a jejích

vybraných metabolitů. Dále je v postupu využito metod sekvenace nové generace jako genomické metody

pro zjištění, zda má testované xenobiotikum vliv na mikrobiom úlových včel představující významnou

charakteristiku imunity včelstva. Uvedený metodický přístup je s modifikacemi aplikovatelný i na jiné

necílové organismy zejména z čeledi Apidae. Aplikace tohoto metodického postupu do praxe by měla vést

k objasnění, ale i předejití problemů se stávajícími nebo novými xenobiotiky. Tento metodický postup má

zvláštní využití při odhalení xenobiotik představující skryté nebezpečí pro životní prostředí. Prezentovaný

metodický postup povede k jednoznačnějšímu určení environmentálních rizik látek a jejich metabolitů a

bude tak eliminována kontroverznost výsledků z jiných, méně sofistikovaných postupů.

2. Úvod

Uvádí se, že pro optimální opylení více než 70 % plodin je zapotřebí hmyzu. V Evropě je zhruba 80 %

volně rostoucích rostlin odkázaných na opylování hmyzem a tyto rostliny navíc slouží jako potrava pro řadu

organismů. Opylení zpostředkované hmyzem má významný vliv na biodiverzitu přírody (COST 2013). Na

výskyt organismů a jejich diverzitu v prostředí má vliv lidská činnost a jedním z hlavních faktorů je

intenzifikace zemědělství, která je od 50. let 20. století spojena s užíváním řady pesticidních látek (Wheeler

2002). Používání pesticidních látek přináší na jednu stranu výhody, ale může přinášet a přináší i nevýhody

zejména v podobě environmentálních rizik, jako vlivu na necílové organismy včetně člověka.

2.1 Kauzalita některých environmentálně nebezpečných pesticidů

V této kapitole jsou uvedeny kauzality některých pesticidních přípravků, které byly po řadě studií

zahrnující různé experimentální přístupy zakázány, nebo jejichž používání bylo omezeno. Studie prováděné

v různý čas, různou instrumentací a různými vědeckými týmy nejsou zcela srovnatelné, a proto je velkou

výhodou možnost provedení více typů analýz z jednoho expozičního experimentu, jak umožňuje tato

metodika.


- 2 -

Přes často dlouholetou enormní oblibu byly později některé z přípravků na ochranu rostlin pro jejich

environmentální a zdravotní rizika v řadě zemí zakázány, nebo se zvažuje regulace jejich používání.

V některých případech jsou skutečná rizika odhalena až po intenzivním studiu metabolismu látek, kdy

vzniklé metabolity mohou být nebezpečnější než původní látky mateřské. Exemplárním příkladem je

insekticid DDT, dnes klasifikovaný Stockholmskou úmluvou o perzistentních organických znečišťujících

látkách jako jeden z perzistentních organických polutantů (UNEP 2001). Bylo zjištěno, že DDT funguje

jako endokrinní disruptor (Kelce et al. 1995; Sierra-Santoyo et al. 2000), je mu přisuzován negativní vliv

na reprodukci živočichů (Ware 1975; Ottoboni et al. 1977) a DDT je také skrze vliv na hormony přisuzován

podíl na rakovině prsu (Cohn et al. 2015). Ukázalo se, že nebezpečí nespočívá jen v samotné mateřské

molekule DDT, ale i v jejích metabolitech. Konkrétně bylo zjištěno, že p,p′-DDE, který je metabolitem

DDT, funguje jako antagonista androgenního receptoru (Kelce et al. 1995).

Další případ prokázaného negativního vlivu na živočichy a životní prostředí představují např.

chloracetanilidové herbicidy, z nichž alachlor a acetochlor jsou nyní zakázané v Evropské unii (EU) pro

teratogenní a karcinogenní účinek, a protože fungují jako endokrinní disruptory (Ashby et al. 1996; Heydens

et al. 1999; Crump et al. 2002; Li et al. 2009). Podobně jako v případě DDT i případ acetochloru dokládá,

že mateřská látka nemusí být tak nebezpečná, jako její metabolity. Bylo totiž prokázáno, že mnohakrokovou

přeměnou vzniká v mikrosomech u lidí a potkanů DNA-reaktivní, karcinogenní, metabolit 2-methyl-6-

ethylbenzoquinon imin (Jefferies et al. 1998; Coleman et al. 2000).

V současnosti je vzhledem k environmentálním a zdravotním rizikům prověřován širokospektrý

herbicid glyfosát, který si získal enormní popularitu nejen u profesionálních zemědělců, ale i u běžných

spotřebitelů. Několik let od svého uvedení na trh, což bylo v roce 1974 (Franz et al. 1997), se stal glyfosát

celosvětově nejužívanějším herbicidem (Duke & Powles 2008). Ačkoliv mechanismus účinku glyfosátu na

rostliny je skrze šikimátovou metabolickou dráhu, která není známa u živočichů (Amrhein et al. 1980),

pozdější výsledky vědeckého bádání značily, že glyfosát má na živočichy neblahý vliv. Například byl

prokázán negativní vliv glyfosátu na navigaci (Balbuena et al. 2015) a potravní chování (Herbert et al. 2014)

včel, vývoj sladkovodního plže Pseudosuccinea columella (Tate et al. 1997), žížaly Aporrectoden caliginom

(Springett & Gray 1992) nebo mšice Metopolophium dirhodum (Saska et al. 2016). Na druhou stranu ve

studii Thompson et al. (2014) nebyl pozorován vliv glyfosátu na vývoj včelího plodu a ve studii Lindsay &

French (2004) byl kontroversně popřen vliv aplikace glyfosátu na abundanci nebo složení komunity

necílových půdních bezobratlých organismů (Lindsay & French 2004). Několik studií na myších a

potkanech indikovalo karcinogenní potenciál glyfosátu (např. George et al. 2010; Séralini et al. 2012, 2014;

George & Shukla 2013). Hlavní metabolit glyfosátu AMPA navíc zřejmě přispívá ke genotoxickému

potenciálu glyfosátu, jak bylo ukázáno na rybě Anguilla anguilla (Guilherme et al. 2014) nebo myších


- 3 -

(Mañas et al. 2009). Nicméně Li et al. (2013) ve své práci kuriózně zjistili inhibici růstu rakovinových buněk

působením glyfosátu a AMPA, indikovali tak inhibici proliferace a podpoření apoptózy, čímž látky glyfosát

a AMPA mohou principielně fungovat jako protirakovinné látky (Li et al. 2013). Uvádíme však, že zmíněný

vliv na proliferaci a apoptózu značí pravděpodobný vliv na vývoj. Jedno je jisté, ať už má glyfosát

karcinogenní nebo kuriozně protikarcinogenní potenciál, je evidentní jeho vliv na živočišný metabolismus,

což nebylo v době jeho povolení k uvedení na trh vzhledem k cílení účinku na šikimátovou cestu rostlin

předpokládáno. Glyfosát byl Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny (IARC; anglicky International

Agency for Research on Cancer) nyní zařazen mezi látky s endokrinně disruptivními vlastnostmi (IARC

2016) a zákaz či omezení jeho užívání se zvažuje nejen pro běžné spotřebitele, ale v budoucnu i pro

profesionální zemědělce.

Vzhledem k opylovačům jsou v posledních letech velmi intenzivně skloňovány neonikotinové

insekticidy. Výhoda těchto pesticidů je v jejich systémovém použití, díky němuž chrání rostliny proti

bezobratlým, hlavně hmyzím, škůdcům nepřetržitě (Elbert et al. 1991). Používání této skupiny pesticidů se

však dostalo do problémů pro jejich velmi vysokou toxicitu vzhledem k opylovačům. Samotná výhoda

systémového účinku neonikotinoidů se navíc otočila proti této skupině látek a to z důvodu, že se dostávají

nejen z rostlin, ale později i z kontaminované půdy opět skrze rostliny do nektaru a pylu, čímž negativně

ovlivňují opylovače (Rortais et al. 2005; Halm et al. 2006; Krischik et al. 2007; Aliouane et al. 2009; Dively

& Kamel 2012). Evropská komise (EK) kvůli environmentálním rizikům a vzhledem ke vědecké zprávě

Evropského úřadu pro bezpečnost potravin (EFSA; anglicky European Food Safety Authority) (EFSA

2013b) omezila používání třech neonikotinoidů (imidaklopridu, klothianidinu a thiamethoxamu) po dobu

dvou let od 1. prosince 2013 (EK 2013). Poté, co EFSA prověřila nebezpečí pro včely, přibyl k těmto třem

neonikotinoidům také fipronil (EFSA 2013a). Podobně jako v případech dříve uvedených pesticidů bylo i

v případě neonikotinoidů zjištěno, že nebezpečí nespočívá pouze v mateřské látce, ale také v metabolitech.

Nejnebezpečnějším neonikotinoidem je, zdá se imidacloprid, který je nejtoxičtější ze všech těchto látek

(Blacquière et al. 2012; Seifrtova et al. 2016). Zřejmě vlivem různé detoxikační kapacity se akutní LD50

imidaklopridu na včely může pohybovat v rozmezí 5 až 500 ng na včelu (Suchail et al. 2001b). Navíc bylo

ukázáno, že imidacloprid má vůči včelám vyšší toxicitu po orálním, než po kontaktním podání (Suchail et

al. 2000, 2001b). V případě imidaklopridu bylo zjištěno, že jeden z jeho metabolitů, imidaklorpid-olefin je

až desetkrát toxičtější vůči hmyzu než imidakloprid (Nauen et al. 1998, 1999; Suchail et al. 2001c). Navíc

bylo zjištěno, že imidakloprid-olefin vznikající v rostlinách (Seifrtova et al. 2016) je jeden z metabolitů,

který poměrně rychle vzniká také ve včelách (Suchail et al. 2001a, 2004a, b). Nutno podotknout, že i další

metabolity imidaklopridu ukázaly vůči včelám toxický efekt, i když byl nižší než v případě imidacloprid-

olefinu (Suchail et al. 2001b). A konečně v případě imidaclopridu byly pozorovány neobvyklé toxické

efekty v závislosti na dávce (Suchail et al. 2001b).


- 4 -

Existují další v současnosti environmentálně nepřijatelné nebo těžko přijatelné pesticidy, kupř.

atraziny či organofosfáty. Navíc obdobná environmentální rizika představují nebo mohou představovat

vedle pesticidů i jiná xenobiotika.

2.2 Hodnocení vlivu pesticidů na necílové organismy

2.2.1 Úskalí nových látek

Z příkladů uvedených v předchozí kapitole je patrno, že ačkoliv se může účinná látka přípravku na

ochranu rostlin při uvádění na trh jevit jako relativně nebo málo nebezpečná pro životní prostředí, necílové

organismy, či dokonce člověka a její (unikátní) mechanismus účinku je vítán nejprve s nadšením, další

studium osudu této látky a vznik potenciálně nebezpečných metabolitů však může prokázat opak. Je velmi

důležité zvažovat vliv pesticidních látek nejen na cílové, ale i na necílové organismy. Správné kritické

hodnocení environmentálních rizik je samozřejmě lepší provést před uvedením účinné látky na trh, než

později zkoumat a srovnávat příčiny již nastalého negativního vlivu na životní prostředí, na necílové

organismy, popřípadě člověka. Je zřejmé, že takové toxikologické studie jsou velmi náročné nejen na čas

ale i na finance. Pozdější prokázání nežádoucích účinků může také souviset s technologickým pokrokem a

aktuálním poznáním v dané oblasti. Jedno je jisté, že pokud jsou na trh uváděny farmaceutické přípravky,

musí projít velmi složitými mnohaletými klinickými testy. Ještě složitější je situace v případě pesticidních

látek, se kterými se člověk, ale i jiné organismy dostávají do kontaktu skrze rezidua v potravinách, vodě,

vzduchu či prachu. Hodnocení rizik v konkrétních organismech v přírodě, ve kterých by mohl daný

přípravek eventuelně způsobit vážnější škody není snadné, a proto je využíváno pro hodnocení rizik

modelových organismů. Každý pesticid anebo pesticidní přípravek (tj. pesticid ve formulaci) však před

uvedením na trh projde řadou testů vlivu na životní prostředí i člověka, přičemž je zvažována i smysluplnost

jeho použití. Legislativně je určeno maximální povolené množství konkrétních pesticidů v potravinách.

Avšak jak historie i přítomnost ukazují, negativní vedlejší vliv látek je zjištěn většinou až po mnoha letech.

Látky jsou již často v prostoru a trvá někdy až dekády, než se životní prostředí přirozeně detoxikuje.

2.2.2 Platná legislativa Evropské unie – Úřední věstník EU

V úředním věstníku EU v nařízení komise EU č. 546/2011 (EK 2011c) se praví, že existují jednotné

zásady pro hodnocení a povolování přípravků na ochranu rostlin. Podle nařízení Evropského parlamentu a

Rady (ES) č. 1107/2009 (EP & Rada ES 2009) musí jednotné zásady pro hodnocení a povolování přípravků

na ochranu rostlin zahrnovat požadavky podle přílohy VI směrnice 91/414/EHS ze dne 15. července 1991

o uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh (Rada EHS 1991). Jednotné zásady pro hodnocení a

povolování přípravků na ochranu rostlin podle čl. 29 odst. 6 nařízení (ES) č. 1107/2009 platné od 14. 6.

2011 jsou stanoveny v příloze tohoto nařízení (EP & Rada ES 2009). Ve zkratce lze říci, že se hodnotí:


- 5 -

i) účinnost

ii) absence nepřijatelných účinků na rostliny nebo rostlinné produkty

iii) dopad na zdraví lidí nebo zvířat zahrnující dopad na zdraví lidí nebo zvířat plynoucí z

přípravku na ochranu rostlin a dopad na zdraví lidí nebo zvířat plynoucí z reziduí

iv) vliv na životní prostředí zahrnující osud (relevantní metabolity, produkty odbourávání, reakční

produkty) a distribuci (biokoncentrace účinné látky a případných metabolitů) v životním

prostředí včetně dopadu na necílové druhy, přičemž se dle nařízení komise (EU) č. 546/2011

(EK 2011c) bere při hodnocení v úvahu především toxicita pro nejcitlivější relevantní

testovaný organismus

v) analytické metody navržené pro účely kontroly a sledování po registraci

vi) fyzikální a chemické vlastnosti přípravku zahrnující např. stabilitu a obsah účinné látky

Z hlediska tematického zaměření této metodiky je nejpodstatnější oblast hodnocení vlivu pesticidních

látek na necílové druhy, konkrétně včelu medonosnou. Celkově se při hodnocení přihlíží ke všem

relevantním informacím o přípravku na ochranu rostlin podle přílohy nařízení (EU) č. 545/2011 (EK

2011b). Také se přihlíží ke specifickým informacím, které se týkají toxikologických studií na různé

organismy podle přílohy nařízení (EU) č. 544/2011 (EK 2011a) a výsledkům jejich hodnocení. Při

navržených podmínkách použití se hodnotí možnost expozice a pokud tato možnost existuje, hodnotí

se rozsah krátkodobého i dlouhodobého rizika pro ptáky a ostatní suchozemské obratlovce, vodní

organismy, včelu medonosnou a jiné necílové členovce, žížaly a další necílové půdní makroorganismy,

necílové rostliny a mikrobiální aktivitu půdy. Pro některé organismy, zvláště ptáky a suchozemské

obratlovce, ryby, vodní bezobratlé a žížaly je hodnoceno riziko pro reprodukci, případně chování či

vývoj a reprodukci.

3. Vlastní popis metodiky

Vlastní metodika se týká inovativního metodického přístupu pro zjištění vlivu pesticidních látek

(účinných látek včetně metabolitů) na plod včel zejména v průběhu metamorfózy, ale i v dospělci pomocí

proteomických metod, přičemž jsou pro tvorbu doprovodných výsledků využity metabolomické a

genomické analýzy. V metodice lze včelu medonosnou vnímat především jako modelový organismus, na

kterém se demonstrují environmentální rizika testovaných xenobiotik z komplexního pohledu.

Včely jsou ještě více než svými produkty významné opylováním, neboť touto činností zvyšují

produkci komerčních plodin a přispívají k diverzitě rostlin. Zdraví včel je díky tomu celosvětově

významným problémem, přičemž jsou každoročně řešeny úhyny včelstev, které mohou mít různé příčiny.

Včely jsou vystaveny mnoha vlivům, které mají negativní vliv na jejich zdraví. Celkem bylo rozpoznáno 61


- 6 -

faktorů ovlivňujících zdraví včely medonosné a přispívajících ke kolapsu včelstev (CCD; anglicky Colony

Collapse Disorder) (vanEngelsdorp et al. 2009). Jeden z hlavních faktorů ovlivňujících zdraví včely

medonosné je environmentální zatížení množstvím pesticidů, jejich metabolitů a jinými xenobiotiky,

zejména agrochemikáliemi. Tyto látky ovlivňují zdraví včel buď přímo z fyziologického hlediska, nebo i

nepřímo zvýšeným výskytem patogenů (vanEngelsdorp et al. 2009; Pettis et al. 2013). Výskyt pesticidů a

jejich metabolitů v prostředí však má vliv také na další opylovače, konkrétně čmeláky či samotářské včely

(Whitehorn et al. 2012; Sandrock et al. 2014; Moffat et al. 2015). Analýzy působení těchto xenobiotik na

opylovače se v současné době provádí mezinárodně uznávanými metodami. Vliv pesticidů na včely se

sleduje pomocí laboratorních a klíckových testů, pokusů v polních podmínkách a tunelových testů. Další

metody pak zahrnují také inhalační testy či dlouhodobou expozici (EPPO 1992).

Každý přípravek na ochranu rostlin musí před uvedením na trh v členské zemi EU projít

schvalovacím procesem dle Evropského úřadu pro bezpečnost potravin (EFSA; anglicky European Food

Safety Authority) (EFSA 2013c). Při tomto procesu se hodnotí akutní orální a kontaktní toxicita daného

xenobiotika na dospělce a také chronická toxicita tohoto xenobiotika na dospělce a na larvy. Kromě toho

dokument EFSA také doporučuje testování vlivu pesticidů na hltanové žlázy včel. Ve Spojených

státech (USA) se pak dle nově navržené metodiky provádí hodnocení především u včely medonosné, ale

jsou známé i postupy používané při testování jiných opylovačů, přičemž se hodnotí akutní a chronická orální

a kontaktní toxicita a také vliv daného pesticidu obsaženého v potravě na larvy (US EPA et al. 2012, 2014).

Některé vědecké práce pak také poukazují na nepříznivý vliv pesticidů na včelí matky a kladení vajíček

(Williams et al. 2015). Klasické sledování toxicity však podléhá značnému rozptylu v závislosti na

detoxifikační kapacitě včelstev (Suchail et al. 2001b). Kromě výše popsaných metod je možné k hodnocení

vlivu pesticidů na včely využít také sledování srdeční aktivity (Papaefthimiou et al. 2013), případně i další

faktory, jako např. životaschopnost spermií (Chaimanee et al. 2016; Pettis et al. 2016). Dále se u dospělých

včel (1 a 7 dní po vylíhnutí) pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR) sledují změny

v expresi vybraných genů jako ribosomal protein S5, cytochrome P450 (306A1, 4G11, 6AS14) catalase,

superoxide dismutase, hymenoptaecin, hexamerin 70b, apidaecin type 22, NimC1 easter-like, thireodoxin

peroxidase1, leucine-rich repeat-containing protein 16A-like, vitellogenin, nebo také výskyt včelího

patogena viru deformovaných křídel (Chaimanee et al. 2016).

V případech úhynu včel se provádí identifikace pesticidů ve včelách, pylu anebo medu pomocí

analýzy instrumentací LC-MS/MS. Tento přístup je využitelný zejména pro monitoring reziduí pesticidů ve

včelách (Kasiotis et al. 2014). Kromě toho však lze pro detekci patogenů v uhynulých včelách použít také

proteomickou analýzu také za použití LC-MS/MS (Bromenshenk et al. 2010), ačkoliv tato citovaná studie

obsahovala chybné proteomické vyhodnocení (Foster 2011). Proteomické analýzy využívající

instrumentace LC-MS/MS nebo dvourozměrné elektroforézy v kombinaci s detekcí hmotnostní


- 7 -

spektrometrií MS/MS se používají také pro analýzu patogenních virů a proteinů pocházejících ze včel

v parazitickém roztoči Varroa destructor (Erban et al. 2015).

Vysokokapacitní LC-MS/MS (shotgun) proteomická analýza dokáže poskytnout až tisíce

identifikovaných proteinů, avšak pro vyhodnocení takové analýzy je zapotřebí proteinové databáze

vycházející většinou z celých anotovaných genomů organismů – pokud jsou však anotované genomy

k dispozici. Alternativně je možno při vyhodnocování využít databáze na úrovni RNA, kterou poskytuje

transkriptom organismu (Erban et al. 2017). Ačkoliv je vyhodnocování proteomických dat na základě

transkriptomické databáze dosti náročné na čas a intelekt, v některých případech se vyplatí, neboť poskytuje

ještě vyšší úroveň výsledků, než klasické vyhodnocení z DNA genomové databáze (Erban et al. 2017).

Databáze pro vyhodnocování proteomických dat bývají dosti obsáhlé, u eukaryotických organismů obsahují

řádově desetitisíce záznamů (např. konkrétně pro Apis mellifera bylo k datu 17. 9. 2016 v proteinové

databázi NCBInr 28799 záznamů), a proto je následné vyhodnocení časově poměrně náročné a interpretace

výsledků není jednoduchá. Určité zjednodušení vyhodnocení umožňuje cílená analýza, kdy jsou sledovány

nebo vyhodnocovány pouze vybrané proteinové markery, u nichž je předpoklad kvantitativních změn

v xenobiotiky stresovaných jedincích oproti kontrolním nebo jinak stresovaným jedincům. Takové

proteinové markery, u nichž je předpoklad kvantitativních změn, pak tvoří jednodušší databázi pro metodu

monitorování vybraných reakcí (SRM, anglicky selected reaction monitoring nebo MRM, anglicky multiple

reaction monitoring). SRM nabízí oproti klasické shotgun LC-MS/MS proteomické analýze vyšší citlivost

a selektivitu v komplexních vzorcích (Doerr 2011, 2013; Boja & Rodriguez 2012). Vhodné markery pro

cílenou proteomickou analýzu metamorfujícího plodu včel jsou uvedeny v patentové přihlášce PV 2016-

654 (Erban et al. 2016a).

Pro sledování metamorfózy včel v dospělce zahrnující fyziologické změny jsou nejvhodnější stádia

mladuška (právě vylíhlá včela) a kukla ve stádiu červené oči, a to pro jednotnost těchto stádií v proteinové

skladbě a snadnému rozpoznání těchto stádií v čase (Erban et al. 2014, 2016b). Předložená metodika

využívá těchto stádií, tedy právě se líhnoucí včelí dělnice (mladušky) a kukly ve stádiu červené oči jako

klíčových vzorků pro odhalení negativního vlivu xenobiotik včetně pesticidů na plod. Tyto vzorky v době

odběru vzorků již nepřijímají potravu a byly de facto kontaminovány z prostředí úlu skrze potravu včelami

krmičkami a xenobiotikum se v takových vzorcích vyskytuje pouze reziduálně. Nedetekování xenobiotika

v takovýchto vzorcích nutně neznamená, že vzorek není na molekulární úrovni ovlivněn. Ve vzorcích, které

jsou analyzované na zmíněné změny v expresi proteinů odhalující defekty ve vývoji, je taktéž ověřován

obsah sledovaných látek včetně metabolitů. Dále je pro přesné určení koloběhu látek v úlu, které mohou mít

na vývoj plodu skrze potravu vliv, prováděno testování úlových včel na obsah sledovaných látek a také

ověřování dalších případných cizorodých látek, které by mohly mít na testování skrytý vliv. Vzorky úlových

včel buď celí jedinci nebo jejich části jako hlavy, mozky, tykadla, hltanové žlázy, střeva či části střev, jsou


- 8 -

dle metodiky využívány pro sledování vlivu testovaných látek na včelstvo. Konkrétně analýzou tykadel na

zastoupení proteinů je možné zjistit vliv testované látky na orientaci včel, analýzou včelích hlav či dokonce

vypreparovaných mozků je možno sledovat cíleně vliv na nervovou funkci, analýzou trávicího traktu/střev

či jeho jednotlivých částí je možno zjistit vliv na trávicí funkci, ale také na produkci proteinů ze symbiontů,

analýzou hltanových žláz je možno sledovat změny expresi proteinů v tomto kompartmentu. Obecně nám

analýzy poskytnou také informaci o detoxikaci xenobiotik skrze změny v expresi detoxikačních enzymů a

přítomnost metabolitů. Jako základní parametr toxicity xenobiotika v dané dávce nám poslouží údaj o počtu

uhynulých včel v izolátoru, zároveň je z takového vzorku vhodné zjišťovat perzistenci xenobiotika a

případných metabolitů. A konečně jsou úlové včely dle této metodiky vyšetřovány na složení symbiotických

bakterií, čímž je získána informace o vlivu testovaných látek na symbiotické organismy včel představující

významnou složku imunity včelstva. Jako další možnost se naskýtá odběr matek, které mohou být

analyzovány na změny v expresi proteinů obdobně jako vzorky kukel, mladušek či úlových včel, je však

zapotřebí mít v paměti, že odběrem matek se vzdáváme dalšího odběru vzorků a pokračování

v experimentu, např. sledování, zda konkrétním xenobiotikem kontaminované úly přežijí zimu.

V následujícím textu je podrobně a v bodech uveden postup přípravy a odběr vzorků, účel daných vzorků

pro analýzy a také jsou uvedeny metody, kterými jsou dané vzorky pro daný účel analyzovány. Celkový

metodický postup je pro přehlednost zobrazen ve schématickém uspořádání, viz Obr. 1. Je nezbytné uvést,

že analytické postupy včetně instrumentace se mohou mezi jednotlivými laboratořemi značně lišit, ačkoliv

získaný výsledek je obdobný. Pro účely této metodiky uvádíme odkazy na typické používané postupy, které

využívá vědecká komunita.

3.1 Metodický postup

3.1.1 Příprava včelstev

1. Pro testování vlivu xenobiotik na včelstvo připravíme dostatečný počet oddělků zahrnující jak

kontrolní, tak testované varianty.

POZN.: Je nezbytné, aby matky testovaných včelstev v rámci jednoho experimentu byly sestry.

2. Včelstva o obdobném počtu jedinců, ideálně o síle cca 5000 jedinců jsou umístěna do izolátorů se

síťovinovou kapucí (Obr. 2A,B).

3. Včelstva jsou po dobu 1 měsíce krmena cukerným roztokem cukr/voda 1:1 (Obr. 2C).

4. Pro zajištění kontinuální produkce plodu je včelstvům po dobu držení v izolátorech dodáván

mražený rozemletý rouskovaný pyl.


- 9 -

3.1.2 Průběh experimentu s xenobiotikem

5. Experiment začíná aplikací testované látky do cukerného roztoku, anebo v případě kontroly je

použit čistý cukerný roztok.

6. Koncentrace aplikované látky se řídí dvěma základními pravidly:

a) vychází ze známých hodnot chronického a akutního účinku, přičemž je upřednostňována

dávka chronického účinku

b) je určen realistický výskyt pesticidu ve včelstvu při dodržení maximální povolené polní

dávky

c) celková dávka xenobiotika aplikovaná do včelstva je rozpočítána na celkový počet jedinců

d) zohledňujeme rozpustnost účinné látky ve vodě, přičemž u přípravků může být tato

vlastnost odlišná

Jako příklad dávkování xenobiotik do včelstva lze uvést testování následujících látek ze známých

faktů, při kterých však zohledňujeme, že podstatná část zásob je ukládána a včelstvo pracuje

také se zásobami z předešlého období:

(i) Imidakloprid: orální LD50 pro imidacloprid se dle literatury pohybuje v rozmezí

3,7–40 ng na včelu, pro testování volíme pravidelnou kalkulovanou dávku o

koncentraci 5 ng na včelu.

(ii) Deltamethrin: orální LD50 pro deltamethrin se dle literatury pohybuje v rozmezí 50–

79 ng na včelu a podle jiného zdroje 280 ng na včelu – pro testování volíme dávku

na spodní hranici tohoto rozsahu, a v pravidelných dávkách je včelstvu dodáváno

v cukerném roztoku 50 ng deltamethrinu na včelu.

(iii) Kresoxim-methyl: orální LD50 se uvádí v hodnotě 14 μg na včelu – takováto dávka

na včelu by byla příliš veliká, a proto pro testování volíme maximální pravidelnou

dávku 5 μg na včelu, takováto dávka zároveň představuje dle našeho doporučení

maximální doporučenou dávku pro jakýkoliv pesticid v obdobném experimentu.

7. Všechny přípravky na ochranu rostlin nebo čisté účinné látky se ředí do vodného roztoku pro

vyloučení vlivu rozpouštědel v experimentu a posléze se dávkují do cukerného vodného roztoku.

Pro pravidelné dávky je připraven zásobní roztok s přesně definovanou koncentrací xenobiotika,

ten se pak v menších dávkách zamrazí, a to v objemech potřebných pro jednotlivé aplikace, např.

připravíme 20 x 10 ml dávky, pokud každá jednotlivá dávka obsahujícící požadovaný obsah aktivní

látky je 10 ml a menší (např. 7,8 ml obsahuje 5μg kresoxim-methylu = 1 dávka). Pokud aplikovaná

látka tvoří v zásobním roztoku suspenzi, tak před aplikací zásobní roztok řádně protřepeme a do

cukerného roztoku pipetujeme po rozvíření pipetou se špičkou.


- 10 -

3.1.3 Periodické dávkování xenobiotika a zaručení produkce plodu

1. Experiment začíná první dávkou xenobiotika v cukerném roztoku.

2. Cukerný roztok obsahující definovanou dávku xenobiotika nebo kontrolní cukerný roztok jsou

aplikovány do včelstva v intervalu 3x až 4x týdně minimálně po dobu čtyř týdnů, kdy je zahájen

první odběr plodu.

POZN.: Jednotlivé dávkování xenobiotik (ať už analytických standardů nebo ve formulaci) do

včelstev probíhá ideálně z předem připravených dávek, které jsou před samotným použitím

převedeny do vodného roztoku a zmraženy. Z těchto vodných roztoků (výjimečně suspenzí) je

xenobiotikum dávkováno do cukerného roztoku, kterým je pak včelstvo v experimentu krmeno.

POZN.: Je důležité chránit cukerný roztok před slunečním zářením (Obr. 2D).

3. Spotřebovaný cukerný roztok mezi jednotlivými dávkami pro každé včelstvo je zaznamenáván.

4. Je kontrolován obsah pylu ve včelstvech pro zachování plodování a v případě potřeby je pyl doplněn

formou mraženého rozemletého rouskovaného pylu.

3.1.4 Odběr vzorků

Ideálně 4 týdny po zahájení experimentu jsou odebírány vzorky včel, které poskytnou potřebné

informace. Pro získání odpovědi na konkrétní otázky je možno odebírat pouze některé typy vzorků, ale

také všechny uvedené typy vzorků pro získání uceleného komplexního obrazu o vlivu xenobiotika na

včelstvo. Metodický způsob žádným způsobem ještě další rozšíření o typy vzorků neomezuje.

Potřebné vybavení:

Pinzety pro odběr vzorků – vyšší počet pinzet (např. 10) usnadňuje, urychluje odběr vzorků.

Čistý etanol a kahan nebo zapalovač – pro sterilizaci pinzet.

Dřevěná párátka – pro otevírání buněk plástu.

Vzorkovnice typu Eppendorf – pro odběr jednotlivých včel a případně odběr částí včel.

Vzorkovnice cca 50 ml – pro odběr většího počtu včel.

Pořadač na vzorky – pro přehledné uchovávání vzorků.

Tužka a předpřipravený formulář – pro evidenci odběru vzorků.

Nesmyvatelné fixy – pro popis vzorkovnic.

Jednorázové rukavice – pro minimalizaci kontaminace materiálu.

Polyetylenové sáčky ideálně 30 x 40 cm – pro odběr úlových včel.

Polystyrenové krabice se suchým ledem – pro usmrcení, uchovávání a převoz vzorků.

Jemné chirurgické nůžky – pro disekci vzorků.


- 11 -

Ochranné včelařské pomůcky.

Klíčové vzorky a jejich odběr:

1. Kukla ve stádiu červené oči: Je vyhledán plodový plást. Z plodového plástu jsou oklepem

odstraněny včely zpět do včelstva, pokud nejsou tyto vzorky také odebírány na analýzy. Plodový

plást je umístěn na podložku v šikmé poloze a je proveden průzkum plodu na výskyt požadovaných

vzorků, tj. kukel ve stádiu červené oči (Obr. 3). Víčko buňky je odstraněno nejlépe krouživým

pohybem ostřejším předmětem, např. párátkem. Kukla se správnou pigmentací očí je vyjmuta

sterilní pinzetou a umístěna do předem popsané sterilní vzorkovnice, typicky zkumavky typu

Eppendorf, a vzorek je umístěn na suchý led, čímž je biologický materiál usmrcen a zároveň

zamražen.

Pokud analyzujeme změny v expresi proteinů na úrovni jedince, odebereme alespoň 12 jedinců

z každého včelstva a v následné analýze použijeme minimálně 6 jedinců a zbylých 6 jedinců

uchováme pro případ potřeby opakování analýzy experimentu.

Pokud analyzujeme rezidua xenobiotik a z téhož biologického vzorku, analyzujeme také změny

v expresi proteinů, odebereme minimálně 3 x 12 jedinců z každého včelstva.

POZN.: Při odběru vzorků je velmi důležité dbát na to, aby vzorky vykazovaly identický stupeň

pigmentace očí, aby byl co nejvíce eliminován vliv stupně vývoje na výsledek následujících analýz.

POZN.: Jako pomocné vodítko při odběru vzorků lze sledovat kromě pigmentace očí i pigmentaci

ocelli, ty by měly vykazovat minimální stupeň pigmentace.

2. Mladuška – líhnoucí se včelí dělnice: Je vyhledán plodový plást, ze kterého jsou oklepem

odstraněny včely, pokud je pozorováno, že se mladuška prokousává víčkem nebo opuští buňku

(Obr. 4), je takovýto jedinec opatrně sterilní pinzetou odebrán do předem popsané sterilní

vzorkovnice, typicky zkumavky typu Eppendorf, a vzorek je umístěn na suchý led, čímž je

biologický materiál usmrcen a zároveň zamražen.

Pokud analyzujeme změny v expresi proteinů na úrovni jedince, odebereme alespoň 12 jedinců

z každého včelstva a v následné analýze použijeme minimálně 6 jedinců a zbylých 6 jedinců

uchováme pro případ potřeby opakování experimentu.

Pokud analyzujeme rezidua xenobiotik a z téhož biologického vzorku, analyzujeme také změny

v expresi proteinů, odebereme minimálně 3 x 12 jedinců z každého včelstva.

POZN.: Mladušku je nezbytné odebrat před tím, než jí jiná včela poskytne potravu nebo než se

sama nakrmí z prostředí úlu. Proto je ideální odebrat mladušku, která se právě prokousává skrze

víčko, takové mladušce je možno pomoci tak, že se odhalí víčko například párátkem.


- 12 -

POZN.: Plodový plást pro odběry vzorků by neměl zůstat mimo včelstvo déle než 20 minut, aby

bylo eliminováno poškození plodu pro další odběry. Proto před dalším odběrem umístíme plást zpět

do úlu a průzkum pro další odběr vzorků opakujeme s časovým odstupem v řádu desítek minut a

více.

3. Včely z plodového plástu: Z plodového plástu jsou do připraveného plastového pytle sklepnuty

včely (Obr. 5). Pytel je poté umístěn na suchý led, čímž jsou jedinci usmrceni a zároveň zamraženi.

Rozebírání vzorků dle plánovaných analýz probíhá později v laboratoři na suchém ledu. Počet

odebraných včel se odvíjí od potřeb konkrétní analýzy. Pro potřeby metodického postupu, kdy

analyzujeme mikrobiom včel a obsah xenobiotika v nich, je zapotřebí 6 x 30 jedinců, tj. celkem 180

jedinců. Pro analýzu vlivu xenobiotika na proteiny v tykadlech je zapotřebí 3 x 100 včel, po ustřižení

tykadel z jedinců je tedy získáno 3 x 200 tykadel. V případě analýzy vlivu xenobiotika na proteiny

v hlavách úlových včel se použije 3 x 30 hlav, které v ideálním případě tvoří pozůstatek po odběru

tykadel.

V případě vyšetřování vlivu xenobiotika na proteiny v trávicím traktu a případné interagující

proteiny ze symbiontů odebereme minimálně 5 x 10 střev nebo jejich jednotlivých částí na každé

včelstvo. Tento typ vzorků je nezbytné odebrat z ještě živých včel, a proto odběr probíhá

bezprostředně po nasbírání včel. Odběr střev provedeme tak, že zafixujeme včelu v oblasti hrudi a

pinzetou uchopíme poslední článek zadečku a pomalu vytáhneme trávicí trakt, poté ostrými

nůžkami odstřihneme potřebnou část střeva, např. žaludek, a vzorek umístíme do zkumavky typu

Eppendorf v suchém ledu. Do každé vzorkovnice odebereme po 10 kusech střev nebo jejich

jednotlivých částí.

POZN.: Při odběru včel, tedy sklepávání z plástu je velmi důležité vyvarovat se kontaminace

biologických vzorků zásobami. Zásobami kontaminovaný vzorek by zkresloval výsledky, zvláště

pokud by obsahoval testované xenobiotikum.

POZN.: Vzorky včel před zpracováním zvážíme, čímž získáme jeden parametr pro vyhodnocení

dat. Pro co největší vypovídající hodnotu tohoto výsledku přebíráme a vážíme vzorky bezprostředně

po převozu do laboratoře.

POZN.: Nástroje, kterými odebíráme vzorky mezi jednotlivými odběry, čistíme opláchnutím

v čistém etanolu a následně opálením nad kahanem.

POZN.: Dáváme pozor, aby se peletka suchého ledu nedostala do vzorkovnice, aby nedošlo

k explozi po jejím uzavření.

POZN.: Se vzorky včel usmrcenými v polyetylenovém pytli na suchém ledu manipulujeme

opatrně, aby nedošlo k poškození křehkých vzorků, jako např. ulomení jednotlivých částí včel.


- 13 -

Případně použijeme do analýzy pouze vzorky kompletní. Z důvodu možného poškození vzorků

odebíráme vždy větší počet včel, než je teoretický.

4. Včely nalézající se mimo úl/oddělek: 2 dny před odběrem vzorků jsou izolátory vyčištěny od

veškerých mrtvých včel nacházejících se mimo úl. V den odběru, tedy 4 týdny po počátku aplikace,

jsou pinzetou do vzorkovnice sbírány a zároveň počítány mrtvé včely (Obr. 6). Navíc jsou odebrány

vzorky živých včel nalézajících se v izolátoru mimo úl (Obr. 7) a to v minimálním počtu 30 jedinců.

Vzorky ve vzorkovnicích jsou uloženy na suchý led.

3.1.5 Laboratorní zpracování vzorků

3.1.5.1 Potřebné vybavení, chemikálie, instrumentace pro homogenizaci, proteomické a

metabolomické analýzy

Potřebné vybavení bude nutně vycházet z vybavení konkrétních analytických laboratoří, zároveň je

možno využít libovolného vhodného protokolu používaného jak pro proteomickou analýzu, tak pro

detekci xenobiotika či případných metabolitů.

1. Homogenizace pro proteomickou analýzu

H2O čistoty LC-MS / reagent grade– pro homogenizaci a přípravu pufrů.

Pufr obsahující detergent – pro homogenizaci/dohomogenizování vzorku pro proteomickou

analýzu; vhodný pufr je např. triethylamonium bikarbonátový nebo Tris-HCl, vhodný detergent

je např. sodium deoxycholát (SDC) nebo sodium dodecyl sulfát (SDS).

POZN.: Detergentů je nezbytné se následně zbavit vhodnou metodou, v případě SDS viz

protokol dostupný online na adrese: http://www.biochem.mpg.de/226356/FASP, a v případě

SDC se provádí acidifikace (Lin et al. 2010).

Vzorkovnice typu Eppendorf – pro sběr homogenátů a jejich centrifugaci.


Jednorázové rukavice – pro minimalizaci kontaminace materiálu.

Krabička anebo stojánek na uskladnění vzorků v mrazicím boxu – pro přehledné uchovávání

vzorků.

Pipety o objemu 2 μl, 10 μl, 100 μl, 1 ml a 10 ml – pro přesné dávkování.

Homogenizéry – pro homogenizaci vzorků jsou vhodné např. skleněné Potter-Elvehjem

homogenizéry s teflonovým pístem, pro jednotlivce o objemu 2 ml, 5 ml a pro více včel o

objemu 30 ml.

Chlazená centrifuga – pro centrifugaci homogenizovaných vzorků.

http://www.biochem.mpg.de/226356/FASP


- 14 -

2. Proteomická analýza

Redukční a alkylační činidla – pro usnadnění štěpení proteinů, způsobí rozrušení

třídimenzionální struktury proteinů fixované disulfidickými můstky; vhodné redukční činidlo

je dithiothreitol (DTT), methyl methanethiosulfonát (MMTS) nebo tris (2-

carboxyethyl)phosphine (TCEP), a vhodné alkylační činidlo je iodocetamid (IAA).

Kit pro stanovení koncentrace proteinů – ve vzorcích určených pro proteomickou analýzu je

nezbytné kvantifikovat proteiny, na výběr je řada kitů fungujících na různém principu, např.

Bradford či Lowry.

Enzym pro štěpení proteinů na peptidy – typicky se využívá štěpení prasečím trypsinem, ale je

možné využít i jiných enzymů, jako chymotrypsin, atd.

Mobilní fáze pro proteomickou separaci – typicky se skládá z kyseliny mravenčí, acetonitrilu,

trifluoroctové kyseliny a H2O, vše čistoty LC-MS.

Kolony pro nanoLC separaci peptidů – kolony lze volit různé dle výrobce a použitého systému

nanoLC.

NanoLC kapalinový chromatograf – pro proteomickou separaci.

Hmotnostní detektor pro proteomickou analýzu – využije se vysoce rozlišovacího hmotnostního

spektrometru, přičemž je typicky využita technologie Orbitrap či QTOF.

Vyhodnocovací proteomický software – existuje celá řada komerčních software pro

vyhodnocení dat, nicméně kvantitativní LC-MS/MS data je v současné době nevhodnější

vyhodnocovat freeware softwarem MaxQuant (Cox et al. 2014).

3. Analýza xenobiotika a případných metabolitů

Rozpouštědla – pro extrakci sledovaných látek

QuEChERS (Anastassiades et al. 2003) – pro přípravu vzorků před UHPLC separací.

Mobilní fáze pro separaci pomocí UHPLC – volí se dle povahy analyzovaných látek.

Centrifugační zkumavky 50 ml – pro lyofylizaci vzorků určených pro analýzu

Kolony pro UHPLC separaci xenobiotik a případných metabolitů – kolony lze volit různé dle

metody, výrobce a použitého systému UHPLC.

Lyofylizátor – pro lyofylizaci vodného homogenitu před extrakcí ve zvoleném rozpouštědle/

QuEChERS

UHPLC kapalinový chromatograf – pro separaci.

Hmotnostní detektor pro metabolomickou analýzu – lze využít jak instrumentace trojitý

kvadrupól, tak vysoce rozlišovací hmotnostní spektrometr obdobný jako u proteomické analýzy

(viz výše), nicméně cílená analýza pomocí trojitého kvadrupólu poskytuje vyšší citlivost.


- 15 -

Software pro vyhodnocení metabolomické analýzy – je odvislý od výrobce LC-MS systému,

který byl při analýze použit.

3.1.5.2 Potřebné vybavení, chemikálie, instrumentace pro analýzu mikrobiomu

Potřebné vybavení bude nutně vycházet z vybavení konkrétních analytických laboratoří. Je možné

využít řady protokolů pro extrakci a také různých kitů, avšak výhodou chloroform-fenolové extrakce

DNA je její možnost využití na velké objemy vzorků odpovídající např. 10 včelám, jako je

doporučeno v této metodice.

Na chlorform-fenolovou extrakci je zapotřebí 3-molární octan sodný, etanol,

fenol/chloroform/isopropanol (1:1:1), kit na čištění DNA, směs chloroform/isopropanol (24:1),

KH2PO4 (dihydrogenfosforečnan draselný), KCl (chlorid draselný), Na2HPO4

(hydrogenfosforečnan disodný), detergent tween® 20.

Chloroform-fenolová extrakce probíhá dle postupu uvedeného např. v publikacích Hubert et al.

(2016a, b), při práci s hrubým homogenátem předzpracovaným v H2O 0,5 ml/ 1 včelu je potřeba

s tímto krokem kalkulovat.

Fluorescenční barvivo, např. SYBR green – pro vizualizaci PCR produktů.

Eubakteriální primery – k ověření přítomnosti bakteriální DNA ve vzorcích po izolaci DNA se

použijí eubakteriální primery 27F (5´- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG – 3´) 1492R (5´-

CGGTTACCTTGTTACGACTT – 3´) podle studie Weisburg et al. (1991).

Chemikálie použité při sekvenačním postupu budou odvislé od zvolené instrumentace –

v zásadě je zapotřebí komerčního mixu pro PCR, vybavení pro přečištění PCR produktů,

komerční kit pro sekvenaci vzorků a kit pro tvorbu DNA knihovny.


Centrifugační zkumavky 50 ml – pro práci s materiálem a odstředění materiálu.

Vzorkovnice typu Eppendorf 1,5 ml – pro sběr homogenátů a jejich centrifugaci.

Pipety o objemu 1 a 10 ml – pro přesné dávkování.

Speedvac – na vysušení vzorků.

Centrifuga s otáčkami minimálně 10 000 xg – pro odstředění materiálu.

Homogenizér, polypropylenové homogenizační flakony, rozbíjecí skleněné a granátové kuličky

o velikosti 0,1–1 mm – pro homogenizaci či dohomogenizování vzorků.

Termocykler – pro provedení amplifikační reakce.

Horizontální elektroforéza se zdrojem napětí – pro separaci PCR produktů.

Dokumentační systém – pro dokumentaci výsledku PCR.


- 16 -

Sekvenátor nové generace – lze využít jedné z několika běžně užívaných platform v současnosti

– Illumina, Solid, Ion Torrent a 454 Life Technologies, přičemž nejužívanější je instrumentace

výrobce Illumina.

Postup sekvenace na jedné z instrumentací – Illumina MiSeq popisuje např. Chiodini et al.

(2015).

Software pro vyhodnocení dat ze sekvenace nové generace – výsledky se mohou zpracovat

jakýmkoliv uznávaným softwarem. V současnosti jsou nejvíce používané volně přístupné

programy MOTHUR (Schloss et al. 2009), UPARSE (Edgar 2013), případně jejich kombinace.

Podrobný návod k použití programu MOTHUR je uveden na webových stránkách

http://www.mothur.org/wiki/MiSeq_SOP a v práci Kozich et al. (2013). Postup zpracování

sekvencí pomocí programu UPARSE je popsán v publikaci Edgar (2013) a postup je uveden na

webových stránkách http://drive5.com/usearch/manual/upp_ill_pe.html. Před vlastní analýzou

je nutné získat aktuální referenční list z databáze SILVA (Quast et al. 2013), který je dostupný

na webových stránkách programu MOTHUR a aktuální databázi RDP (Cole et al. 2014), která

je dostupná na webových stránkách UPARSE.

3.1.6 Typy analýz a informace, které nám analýza jednotlivých vzorků poskytne

Typy analýz volíme podle informací, které nás zajímají. V zásadě můžeme analyzovat celou řadu

různých vzorků a dokonce můžeme volit metodické přístupy, kterými tyto vzorky analyzujeme.

Uvedený postup v této metodice nabízí také unikátní přístup založený na analýze jednoho biologického

vzorku více metodami.

1. Vzorky typu kukla ve stádiu červené oči a mladuška jsou analyzovány kvantitativním LC-MS/MS

proteomickým přístupem na změny v expresi proteinů. Tyto vzorky mohou být zároveň

analyzovány LC-MS/MS instrumentací na rezidua testovaných xenobiotik včetně jejich metabolitů.

a) Kvantitativní LC-MS/MS proteomická analýza na úrovni jedinců

Vzorky jsou v tomto uspořádání homogenizovány a analyzovány jako jedinci, výsledek nám

poskytne informaci o případných rozdílech na individuální úrovni.

Analýza poskytne informace o tom, zda testované xenobiotikum způsobuje v daném

dávkování změny v metamorfóze dělnice včely medonosné, tedy kdy jedinci nepřijímají

potravu.

Vzorky jsou v tomto experimentálním uspořádání homogenizovány libovolným

proteomickým protokolem optimalizovaným v laboratoři, kde je analýza prováděna.

http://www.mothur.org/wiki/MiSeq_SOP

http://drive5.com/usearch/manual/upp_ill_pe.html


- 17 -

b) Kvantitativní LC-MS/MS proteomická analýza a kvantitativní LC-MS/MS analýza na

rezidua testovaných látek a jejich případných metabolitů z jednoho biologického vzorku

Velkou výhodou tohoto postupu je, že jeden a týž biologický vzorek je analyzován nejen na

změny v hladinách proteinů, ale také na rezidua sledovaných látek. Výsledky jsou pak lépe

srovnatelné, než kdybychom vzorky homogenizovali a dvěma přístupy analyzovali separátně.


dávkování změny v metamorfóze dělnic včely medonosné, zároveň jsou však získány

informace o výskytu reziduí xenobiotika a jeho případných metabolitů ve stádiích, která

nepřijímají potravu.

Vzorky jsou v tomto uspořádání homogenizovány po 12 jedincích a takový vzorek

představuje jeden biologický vzorek.

Každý biologický vzorek je homogenizován ve vodném roztoku, poměr je kalkulovaný jako

0,5 ml H2O na 1 včelu.

Po iniciální homogenizaci v H2O je vzorek, který představuje celkem 12 včelích jedinců,

rozdělen na díly odpovídající 2 a 10 včelám. Díl odpovídající 2 jedincům se použije dále na

proteomickou kvantitativní LC-MS/MS analýzu, zatímco díl odpovídající 10 včelám se použije

na metabolomickou analýzu.

Pro proteomickou analýzu jsou do iniciálního vodného homogenátu přidány chemikálie

jako detergent, pufr, apod. pro docílení požadované koncentrace látek dle zvoleného protokolu

a vzorek je dohomogenizován.

POZN.: Pro docílení finální koncentrace je nezbytné kalkulovat s tím, že vzorek byl již naředěn

H2O v poměru 0,5 ml H2O na kuklu nebo mladušku.

Pro kvantitativní LC-MS/MS analýzu na rezidua testovaných látek a jejich případných

metabolitů je iniciální homogenát lyofylizován v centrifugační zkumavce, a pak je takový

vzorek extrahován a dále zpracován dle libovolného protokolu, který je rutinně používán v

analytické laboratoři.

2. Vzorky typu včely z plodového plástu jsou analyzovány LC-MS/MS instrumentací na koloběh

testovaných xenobiotik včetně jejich metabolitů ve včelí kolonii. Tyto vzorky mohou být

analyzovány po oddělení příslušného dílu homogenátu zároveň na změny v proteinech, ale dokonce

také na změny v symbiotických organismech. Proteomické změny jsou vyšetřovány buď v celých

jedincích, nebo v jednotlivých kompartmentech úlových včel. Velmi vhodné kompartmenty

úlových včel pro zjišťování konkrétních změn jsou tykadla, hlavy či části střeva.

POZN.: Dospělé včely není vhodné analyzovat na úrovni jedince, neboť mezi jedinci dospělých

včel existují značné rozdíly v proteinové skladbě, a to dokonce pokud jsou včely obdobného stáří.


- 18 -

Jednou z možností je označit včely při jejich vylíhnutí a pak s odstupem času odebírat včely

stejného stáří, takto však lze odebrat pouze omezený počet včel.

POZN.: U včel odebíraných z plodového plástu je předpokládáno, že většina plní obdobnou funkci,

tj. jedná se především o včely krmičky. Odběrem dostatečného množství jedinců na jeden

biologický vzorek a dostatečným počtem biologického opakování je zajištěn co nejsprávnější

výsledek.

a) Kvantitativní LC-MS/MS analýza na rezidua testovaných látek a jejich případných

metabolitů, analýza mikrobiomu a případně také proteomická analýza z jednoho

biologického vzorku

Velkou výhodou tohoto postupu je, že jeden a týž biologický vzorek je analyzován nejen na

koloběh/rezidua testovaných látek včetně metabolitů ve včelstvu, ale navíc je ze stejného vzorku

zjištěn vliv na mikrobiom úlových včel a dokonce je možno v rámci jednoho a téhož

biologického vzorku získat informaci o změnách proteomu včel. Výsledky různého charakteru

jsou pak lépe srovnatelné, než kdybychom vzorky homogenizovali a různými přístupy

analyzovali separátně.

Analýza poskytne informace o tom, v jakých koncentracích se testované xenobiotikum a

jeho případné metabolity vyskytují ve včelstvu, což indikuje i riziko přenosu těchto látek na

plod a ovlivnění jeho vývoje včetně metamorfózy, zároveň jsou získány informace o vlivu

xenobiotika a jeho případných metabolitů na mikrobiom včel, který je významnou složkou

imunitního systému a konečně při analýze další díly homogenátu proteomickými metodami jsou

získány informace o vlivu xenobiotik na proteom úlových včel.

Vzorky jsou v tomto uspořádání homogenizovány po 30 jedincích na jeden biologický

vzorek.

Každý biologický vzorek je homogenizován ve vodném roztoku, poměr je kalkulovaný jako

0,5 ml H2O na 1 včelu.

Po iniciální homogenizaci v H2O je každý biologický vzorek, který představuje celkem 30

včelích jedinců, rozdělen na 3 díly, každý odpovídající určitému počtu včel. Každý ze třech dílů

se použije na jeden typ analýzy, tj. metabolomickou LC-MS/MS analýzu, analýzu mikrobiomu

metodou sekvenace nové generace, anebo na kvantitativní LC-MS/MS proteomickou analýzu.

Ideálně se použije díl odpovídající 15 včelám na metabolomickou analýzu, díl o 10 včelách se

použije na analýzu mikrobiomu a nejmenší díl, odpovídající 5 včelím jedincům se použije na

proteomickou analýzu.

Pro kvantitativní LC-MS/MS analýzu na rezidua testovaných látek a jejich případných

metabolitů je iniciální homogenát lyofylizován v centrifugační zkumavce a pak je takový


- 19 -

vzorek extrahován a dále zpracován dle libovolného protokolu, který je rutinně používán v

analytické laboratoři.

Pro analýzu mikrobiomu metodou nové generace sekvenování je příslušná část homogenátu

odpovídající 10 včelám dále zpracována chloroform-fenolovou extrakcí DNA.

POZN.: Je nezbytné kalkulovat s tím, že vzorek byl již naředěn H2O v poměru 0,5 ml H2O na

vzorek úlové včely.

Pro proteomickou analýzu jsou do iniciálního vodného homogenátu přidány chemikálie

jako detergent, pufr, apod. pro docílení požadované koncentrace látek dle zvoleného protokolu

a vzorek je dohomogenizován.

POZN.: Pro docílení finální koncentrace je nezbytné kalkulovat s tím, že vzorek byl již naředěn

H2O v poměru 0,5 ml H2O na vzorek úlové včely.

b) Kvantitativní LC-MS/MS proteomická analýza jednotlivých kompartmentů úlových včel

Výhodou analýzy jednotlivých kompartmentů včel je lokalizace výsledků na konkrétní

kompartmenty a také dosažení citlivější analýzy pro konkrétní markery v daných

kompartmentech.


dávkování změny v kvantitativním či kvalitativním zastoupení proteinů v určitém

kompartmentu včel.

Vzorky jsou v tomto experimentálním uspořádání homogenizovány libovolným

proteomickým protokolem optimalizovaným v laboratoři, kde je analýza prováděna. Extrakce

se může pro jednotlivé kompartmenty lišit.

Každý vzorek tvoří kompartmenty z většího počtu jedinců. Pro jeden biologický vzorek je

vhodných např. 200 tykadel, 30 hlav nebo 10 střev či jejich částí.

POZN.: Jsou-li sbírány vzorky tykadel, je vhodné část hlav použít na další typ analýzy, tedy

při sběru 200 tykadel je použito 100 hlav, z nichž se náhodným výběrem 30 použije na další

homogenizaci.

Proteomická analýza tykadel poskytne informace cílené na změny v komunikaci včel

vlivem testovaného xenobiotika.

Proteomická analýza hlav poskytne informace cílené na vliv testovaného xenobiotika na

nervovou soustavu.

POZN.: Je možno provést disekci mozku a analyzovat tento kompartment samostatně, avšak

taková příprava vzorku je poměrně náročná a neposkytne krom cílenější analýzy více informací,

než analýza celé hlavy.


- 20 -

Proteomická analýza střev poskytne informace cílené na změny v trávicích proteinech a

také jak na proteinové úrovni reagují na xenobiotika symbiotické bakterie.

3. Vzorky typu včely nalézající se mimo úl – živé a mrtvé – jsou analyzovány LC-MS/MS

instrumentací na přítomnost xenobiotik a případných metabolitů. Navíc je vyšetřován počet

mrtvých včel mimo včelstvo poté, co byl 2 dny před odběrem vzorků izolátor vyčištěn.

POZN.: Pro analýzy tohoto typu vzorků je nezbytné pracovat s biologickými vzorky zahrnující

alespoň 30 jedinců pro jednu analýzu.

Vzorky mrtvých a živých včel jsou analyzovány kvantitativní metodou LC-MS/MS na

obsah xenobiotika a jeho případné metabolity, čímž je získána informace o přetrvávání látek

v mrtvých včelách oproti včelám živým nalézajícím se mimo úl. Takovýto výsledek je také

důležitý pro pochopení, zda množství zemřelých včel souvisí/nesouvisí s vyšší dávkou

xenobiotika na tyto včely.

Důležité je také porovnání kvantity testovaného xenobiotika a případných metabolitů mezi

včelami nalézajícími se mimo úl a úlovými včelami.

Počet mrtvých včel mimo úl poskytuje základní informaci o akutním toxickém vlivu

xenobiotika na včelstvo, což je velmi důležitý parametr pro vyhodnocení dat. Pokud je mortalita

nízká, potvrzujeme tím, že účinek xenobiotika v experimentu byl chronický.

4. Další možné typy vzorků pro proteomickou analýzu

Vzhledem k dalším otázkám, na které chceme nalézt odpověď vzhledem k testovanému xenobiotiku,

odebereme ze včelstva další libovolné typy vzorků, např. různá další vývojová stádia – kromě kukel

a líhnoucích se včel také vajíčka, larvy nebo kasty – kromě včelích dělnic také trubce či matky.

Analýza matek napoví hodně o tom, jakým způsobem xenobiotikum ovlivňuje

nejdůležitější součást včelstva. Matka má specifikum, že je krmena po celou dobu svého života

mateří kašičkou, která je vyráběna hltanovými žlázami včel.

POZN.: Při analýze tohoto typu vzorku je nutno si uvědomit, že jeho odběrem celý experiment

končí, a další sledování včelstva pozbývá smyslu. Dále je nezbytné provést dostatečný počet

opakování úlů, aby byl zajištěn dostatečný počet matek pro analýzu, analýza na úrovni jedné

nebo i dvou matek je ze statistického hlediska nesmyslná.

Trubci mají některé proteiny odlišné od dělnic, a i délka jejich vývoje je odlišná, a proto

analýza různých stádií vývoje trubců obdobně jako u dělnic může být pro hodnocení vlivu

xenobiotika na včelstvo důležitá. Pokud existuje podezření, že by xenobiotikum mohlo

ovlivňovat specificky trubce, záskává analýza tohoto typu vzorků smysl. Příprava trubčích

vzorků způsobem obdobným jako je uvedeno v této metodice u dělnic, je však podstatně


- 21 -

náročnější, neboť včelstvo produkuje trubce pouze v omezeném množství a v určitém stupni

vývoje včelího společenství.

Dalším vhodným vzorkem pro zjištění vlivu xenobiotika na včely jsou vajíčka. Proteomické

analýza vajíček může mít značný význam při prokazování teratogenity xenobiotika.

Larvální stádia mohou také poskytnout významnou informaci o vlivu xenobiotika na vývoj

včel, u tohoto typu vzorku je však obtížnější než v případě kukly ve stádiu červené oči a právě

líhnoucích se včel, zachytit přesně identické stádium tak, aby nebyly výsledky ovlivněny

změnami ve vývoji.

4. Srovnání novosti postupů

Tato metodika jako první svého druhu zahrnuje sledování vlivu xenobiotik na vývoj včely

medonosné včetně analýzy dalších klíčových typů vzorků. Četné studie využívají různých metodických

přístupů a experimenty jsou prováděny na vzorcích připravených v různý čas a z různých genetických linií

biologického materiálu, a proto mohou být výsledky odlišné a navzájem nesrovnatelné. Využitím postupu

v této metodice lze provést sérii analýz na včelích koloniích obdobného genetického materiálu a v tentýž

časový okamžik, a tak je získaný výsledek srovnatelný a je tak zajištěna jejich exaktnost. Kombinací

proteomické, metabolomické a genomické analýzy různých vzorků lze prokazatelně dokázat negativní vliv

xenobiotika včetně jeho metabolitů na vývoj včelího plodu, matek, dělnic či trubců a predikovat tak další

osud včelstev v případě kontaminace. Hlavní a unikátní zaměření metodiky je na metamorfózu včely

medonosné, kterou představuje stádium kukly až líhnoucí se včely – mladušky. Sledování vlivu xenobiotik

na tato stádia, která po zavíčkování do buňky od posledního larválního stádia skrz kuklu až do prokousání

buňkou nepřijímají potravu, poskytují uníkátní vhled na problematiku vlivu xenobiotik na včelu

medonosnou. Vliv xenobiotika a případných metabolitů na metamorfózu je vyhodnocován kvantitativním

proteomickým přístupem, který poskytuje exaktní hodnocení vlivu testovaných látek na metamorfózu včel.

Jako doprovodné výsledky je dále sledován výskyt reziduí xenobiotika a případných metabolitů ve stádiu

kukly a líhnoucího se dospělce. Metabolomická analýza včel z plodového plástu poskytuje informace o

koloběhu xenobiotika a případných metabolitů ve včelstvu, zároveň je tak získána informace o možném

transferu těchto látek včelami krmičkami na plod a na matku. V souvislosti s vlivem xenobiotik je navíc

cíleně sledován vliv xenobiotika na mikrobiom včel představující významnou složku imunitního systému.

Metodika navíc umožňuje sledování změn v proteinech úlových včel jako celku, ale i v jednotlivých

kompartmentech, jako např. tykadlech, hlavách/mozcích, či trávicím traktu. Je tedy možno získat dále

informace o vlivu testovaného xenobiotika na komunikaci včel, nervovou funkci, ale také interakci

s trávicím traktem včel včetně symbiotických bakterií. V rámci jednoho experimentu je z mrtvých včel


- 22 -

mimo úl zároveň získána informace o míře akutního účinku dané dávky xenobiotika a srovnáním těchto

hodnot se živými jedinci mimo úl je potvrzena informace, zda za úmrtím včel stojí konkrétní xenobiotikum.

5. Uplatnění metodiky

Metodika je určena pro státní správu s využitím pro laboratoře zabývající se zdravím včel, a

ekotoxikologií. Metodika bude po překladu do anglického jazyka využita také mezinárodními organizacemi

jako EEA (European Environment Agency; Evropská agentura pro životní prostředí), EPA (United States

Environmental Protection Agency; Agentura pro ochranu životního prostředí USA) či EFSA (European

Food Safety Authority; Evropský úřad pro bezpečnost potravin) řešícími hodnocení rizik na včely a jiné

opylovače. Předkládaná metodika má souvislosti vzhledem k nařízením komise ES týkající se hodnocení a

povolování přípravků na ochranu rostlin. Využití této metodiky je i pro výrobce pesticidních látek, kteří

díky této metodice mohou exaktně vyloučit nebo prokázat negativní vliv pesticidních látek na včely.

Význam metodického postupu je pro světovou včelařskou komunitu, neboť tato metodika umožňuje exaktní

hodnocení vlivu xenobiotik na včelu medonosnou. Vzhledem k tomu, že metodický přístup je přenositelný

i na jiné necílové organismy má tato metodika uplatnění i mimo včelařskou obec.

6. Ekonomické zhodnocení metodiky

Cenové nároky na experimenty provedené v metodice jsou poměrně vysoké vzhledem

k přístrojovému vybavení potřebnému k analýzám. Cenu takového komplexního experimentu však

vyvažuje váha výsledků a obrovské penzum exaktních informací, které jsou takovou analýzou

získány. Jen obtížně jsou vyčíslitelné úspory na životním prostředí, v případě, kdy by bylo díky

aplikaci metodiky předejito kontaminaci životního prostředí nebezpečným xenobiotikem se

skrytými negativními účinky na dlouhé roky. Proto je srovnání nákladové ceny metodického

postupu této metodiky a v minulosti nebo v současnosti užívaných postupů, které nehodnotí účinky

na necílové organismy zdaleka tak exaktně, jen těžce srovnatelné. Do kalkulace nákladů na

experiment je nezbytné zahrnout vstupní cenu chemikálií, testovaných látek, cenu oddělků a

krmiva, 2 měsíce práce včelaře, cenu 2 dnů práce 4 pracovníků při odběru vzorků, zpracování

vzorků pro různé typy analýz (cca 500 Kč/vzorek), zpracování vzorků pro sekvenaci nové

generace, proteomickou nebo metabolomickou analýzu (na každý typ analýzy 100 až 200

Kč/vzorek), proteomická LC-MS/MS analýza (cca 5 000 až 10 000 Kč/vzorek), sekvenace DNA

nové generace (600 až 2 200 Kč/ vzorek, dle zvoleného typu analýzy), metabolomická analýza na

sledovanou látku a screening látek dalších (3 000 až 4 000 Kč/vzorek). Do celkové ceny je vhodné


- 23 -

započítat také setup experimentu a vyhodnocení proteomických, metabolomických dat ze

sekvenace nové generace včetně celkové interpretace dat. Cena této práce by se mohla pro

experiment standartního rozsahu uvedeného níže pohybovat v ceně 100 000 Kč.

Jako příklad kalkulace ceny komplexního experimentu o 4 včelstvech, která budou komplexně

analyzována na 3 xenobiotika včetně 1 kontrolního experimentu bez xenobiotika, uvádíme: 1)

proteomický experiment: kukly, mladušky a tykadla a hlavy úlových včel = 4 (včelstva) x 4 (typy

vzorků) x 3 (biologická opakování na vzorek) x 5 000 Kč až 10 000 Kč = 240 000 Kč až 480 000

Kč; 2) metabolomická analýza na koloběh sledované látky v úlových včelách = 4 (včelstva) x 6

(biologické opakování) x 3 000 Kč (až 4 000 Kč) = 72 000 Kč až 96 000 Kč; 3) ověření existence

reziduí xenobiotika a případných metabolitů v kuklách a mladuškách = 4 (včelstva) x 2 (typy

vzorků) x 3 (biologická opakování na vzorek) x 3 000 Kč až 4 000 Kč = 24 000 Kč až 32 000 Kč;

4) Analýza mrtvých a živých včel mimo úl = 4 (včelstva) x 2 (typy vzorků) x 3 (biologická

opakování na vzorek) x 3 000 Kč až 4 000 Kč = 24 000 Kč až 32 000 Kč; 5) analýza mikrobiomu

v úlových včelách = 4 (včelstva) x 6 (biologické opakování) x 600 až 2 200 Kč = 14 400 až 52 800

Kč; 6) 4 oddělky = 4 x 3 000 Kč = 12 000 Kč; 7) práce včelaře a pracovníků sbírajících vzorky =

50 000 Kč; 8) zpracování všech vzorků = 27 000 Kč 9) setup experimentu, bioinformatické

vyhodnocení a interpretace celkových dat = 100 000 Kč. Celková cena takového komplexního

experimentu, pokud by byl zadán jako služba se tedy může pohybovat v ceně cca 600 000 Kč až

900 000 Kč, a to dle zvoleného typu analytických přístrojů a specifikace analýz.


- 24 -

7. Publikace, které předcházely metodice

Erban T., Halešová T., Seifrtová M., Kamler M., Titěra D. 2016a. Způsob určení vlivu

xenobiotika/xenobiotik na plod včely, zejména včely medonosné, v průběhu její metamorfózy.

Přihláška patentu číslo PV 2016-654 podaného dne 19. 10. 2016, č. j. E274567. Úřad průmyslového

vlastnictví, Praha, Česko.

Erban T., Harant K., Hubalek M., Vitamvas P., Kamler M., Poltronieri P., Tyl J., Markovic M., Titera D.

2015. In-depth proteomic analysis of Varroa destructor: detection of DWV-complex, ABPV,

VdMLV and honeybee proteins in the mite. Sci. Rep. 5: 13907. DOI: 10.1038/srep13907.

Erban T., Harant K., Chalupnikova J., Kocourek F., Stara J. 2017. Beyond the survival and death of the

deltamethrin-threatened pollen beetle Meligethes aeneus: an in-depth proteomic study employing a

transcriptome database. J. Proteomics 150: 281–289. DOI: 10.1016/j.jprot.2016.09.016.

Erban T., Harant K., Kamler M., Markovic M., Titera D. 2016b. Detailed proteome mapping of newly

emerged honeybee worker hemolymph and comparison with the red-eye pupal stage. Apidologie

47 (6):805–817. DOI: 10.1007/s13592-016-0437-7.

Erban T., Petrova D., Harant K., Jedelsky P. L., Titera D. 2014. Two-dimensional gel proteome analysis of

honeybee, Apis mellifera, worker red-eye pupa hemolymph. Apidologie 45 (1): 53–72.

Hubert J., Bicianova M., Ledvinka O., Kamler M., Lester P. J., Nesvorna M., Kopecky J., Erban T. 2016a.

Changes in the bacteriome of honey bees associated with the parasite Varroa destructor, and

pathogens Nosema and Lotmaria passim. Microb. Ecol. (in press). DOI: 10.1007/s00248-016-0869-

7.

Hubert J., Kamler M., Nesvorna M., Ledvinka O., Kopecky J., Erban T. 2016b. Comparison of Varroa

destructor and worker honeybee microbiota within hives indicates shared bacteria. Microb. Ecol.

72 (2): 448–459.

Seifrtova M., Halesova T., Sulcova K., Riddellova K., Erban T. 2016. Distributions of imidacloprid,

imidacloprid-olefin and imidacloprid-urea in green plant tissues and roots of rapeseed (Brassica

napus) from artificially contaminated potting soil. Pest Manag. Sci. (in press). DOI:

10.1002/ps.4418.


- 25 -

9. Schematické uspořádání metodického postupu

Obrázek 1. Schematické znázornění experimentu, odebíraných vzorků, analýz a výsledků.


- 26 -

10. Seznam literatury

Aliouane Y., El Hassani A. K., Gary V., Armengaud C., Lambin M., Gauthier M. 2009. Subchronic

exposure of honeybees to sublethal doses of pesticides: effects on behavior. Environ. Toxicol.

Chem. 28 (1): 113–122.

Amrhein N., Deus B., Gehrke P., Steinrücken H. C. 1980. The site of the inhibition of the shikimate pathway

by glyphosate: II. Interference of glyphosate with chorismate formation in vivo and in vitro. Plant

Physiol. 66 (5): 830–834.

Anastassiades M., Lehotay S. J., Štajnbaher D., Schenck F. J. 2003. Fast and easy multiresidue method

employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the

determination of pesticide residues in produce. J. AOAC Int. 86 (2): 412–431.

Ashby J., Kier L., Wilson A. G., Green T., Lefevre P. A., Tinwell H., Willis G. A., Heydens W. F., Clapp

M. J. 1996. Evaluation of the potential carcinogenicity and genetic toxicity to humans of the

herbicide acetochlor. Hum. Exp. Toxicol. 15 (9): 702–735.

Balbuena M. S., Tison L., Hahn M.-L., Greggers U., Menzel R., Farina W. M. 2015. Effects of sublethal

doses of glyphosate on honeybee navigation. J. Exp. Biol. 218 (17): 2799–2805.

Blacquière T., Smagghe G., van Gestel C. A., Mommaerts V. 2012. Neonicotinoids in bees: a review on

concentrations, side-effects and risk assessment. Ecotoxicology 21 (4): 973–992.

Boja E. S., Rodriguez H. 2012. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving

sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics 12 (8): 1093–1110.

Bromenshenk J. J., Henderson C. B., Wick C. H., Stanford M. F., Zulich A. W., Jabbour R. E., Deshpande

S. V., McCubbin P. E., Seccomb R. A., Welch P. M., Williams T., Firth D. R., Skowronski E.,

Lehmann M. M., Bilimoria S. L., Gress J., Wanner K. W., Cramer R. A. Jr. 2010. Iridovirus and

microsporidian linked to honey bee colony decline. PLoS One 5 (10): e13181. DOI:

10.1371/journal.pone.0013181.

Cohn B. A., La Merrill M., Krigbaum N. Y., Yeh G., Park J. S., Zimmermann L., Cirillo P. M. 2015. DDT

exposure in utero and breast cancer. J. Clin. Endocrinol. Metab. 100 (8): 2865–2872.

Cole J. R., Wang Q., Fish J. A., Chai B., McGarrell D. M., Sun Y., Brown C. T., Porras-Alfaro A., Kuske

C. R., Tiedje J. M. 2014. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA

analysis. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue): D633–D642.

Coleman S., Linderman R., Hodgson E., Rose R. L. 2000. Comparative metabolism of chloroacetamide

herbicides and selected metabolites in human and rat liver microsomes. Environ. Health Perspect.

108 (12): 1151–1157.

COST. 2013. Memorandum of Understanding for the implementation of a European Concerted Research

Action designated as COST Action FA1307: SUPER-B: SUstainable Pollination in Europe: joint

Research on Bees and other pollinators. COST 060/13, 22 November 2013. European Cooperation

in the field of Scientific and Technical Research (COST). Brussels, Belgium. URL:

http://w3.cost.eu/fileadmin/domain_files/FA/Action_FA1307/mou/FA1307-e.pdf

http://w3.cost.eu/fileadmin/domain_files/FA/Action_FA1307/mou/FA1307-e.pdf


- 27 -

Cox J., Hein M. Y., Luber C. A., Paron I., Nagaraj N., Mann M. 2014. Accurate proteome-wide label-free

quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.

Mol. Cell. Proteomics. 13 (9): 2513–2526.

Crump D., Werry K., Veldhoen N., Van Aggelen G., Helbing C. C. 2002. Exposure to the herbicide

acetochlor alters thyroid hormone-dependent gene expression and metamorphosis in Xenopus

laevis. Environ. Health Perspect. 110 (12): 1199–1205.

Dively G. P., Kamel A. 2012. Insecticide residues in pollen and nectar of a cucurbit crop and their potential

exposure to pollinators. J. Agric. Food Chem. 60 (18): 4449–4456.

Doerr A. 2011. Targeted proteomics. Nat. Methods 8 (1): 43–43.

Doerr A. 2013. Mass spectrometry–based targeted proteomics. Nat. Methods 10 (1): 23–23.

Duke S. O., Powles S. B. 2008. Glyphosate: a once-in-a-century herbicide. Pest Manag. Sci. 64 (4): 319–

325.

Edgar R. C. 2013. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat. Methods

10 (10): 996–998.

EFSA. 2013a. EFSA assesses risks to bees from fipronil. Press Release, 27 May 2013. European Food

Safety Authority (EFSA), Parma, Italy. URL: http://www.efsa.europa.eu/en/press/news/130527

EFSA. 2013b. EFSA identifies risks to bees from neonicotinoids. Press Release, 16 January 2013. European

Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy. URL:

http://www.efsa.europa.eu/en/press/news/130116

EFSA. 2013c. Guidance on the risk assessment of plant protection products on bees (Apis mellifera, Bombus

spp. and solitary bees). EFSA J. 11 (7): 3295. DOI: 10.2903/j.efsa.2013.3295.

EK. 2011a. Nařízení Komise (EU) č. 544/2011 ze dne 10. června 2011, kterým se provádí nařízení

Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1107/2009, pokud jde o požadavky na údaje o účinných

látkách, text s významem pro EHP. Úřední věstník Evropské unie, L 155/1, 11. 6. 2011. URL:

http://eur-lex.europa.eu/eli/reg/2011/544/oj

EK. 2011b. Nařízení Komise (EU) č. 545/2011 ze dne 10. června 2011, kterým se provádí nařízení

Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1107/2009, pokud jde o požadavky na údaje o přípravcích

na ochranu rostlin, text s významem pro EHP. Úřední věstník Evropské unie, L 155/67, 11. 6. 2011.

URL: http://eur-lex.europa.eu/eli/reg/2011/545/oj

EK. 2011c. Nařízení Komise (EU) č. 546/2011 ze dne 10. června 2011, kterým se provádí nařízení

Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1107/2009, pokud jde o jednotné zásady pro hodnocení a

povolování přípravků na ochranu rostlin, text s významem pro EHP. Úřední věstník Evropské unie,

L 155/127, 11. 6. 2011. URL: http://eur-lex.europa.eu/eli/reg/2011/546/oj

EK. 2013. Prováděcí nařízení Komise (EU) č. 485/2013 ze dne 24. května 2013, kterým se mění prováděcí

nařízení (EU) č. 540/2011, pokud jde o podmínky schválení účinných látek klothianidin,

thiamethoxam a imidakloprid, a kterým se zakazuje použití a prodej osiva ošetřeného přípravky na

ochranu rostlin obsahujícími uvedené účinné látky, text s významem pro EHP. Úřední věstník

Evropské unie, L 139/12, 25. 5. 2013. URL: http://eur-lex.europa.eu/legal-

content/CS/TXT/?qid=1484755697880&uri=CELEX:32013R0485.






http://eur-lex.europa.eu/legal-content/CS/TXT/?qid=1484755697880&uri=CELEX:32013R0485

http://eur-lex.europa.eu/legal-content/CS/TXT/?qid=1484755697880&uri=CELEX:32013R0485


- 28 -

Elbert A., Becker B., Hartwig J., Erdelen C. 1991. Imidacloprid – ein neues systemisches Insektizid.

Pflanzenschutz-Nachr. Bayer 44 (2): 113−136.

EP, Rada ES. 2009. Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1107/2009 ze dne 21. října 2009 o

uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh a o zrušení směrnic Rady 79/117/EHS a 91/414/EHS.

Úřední věstník Evropské unie, L 309/1, 24. 11. 2009. URL: http://eur-

lex.europa.eu/eli/reg/2009/1107/oj

EPPO. 1992. Guideline on test methods for evaluating the side-effects of plant protection products on

honeybees; EPPO Bull. 22 (2):203–215.

Erban T., Harant K., Chalupnikova J., Kocourek F., Stara J. 2017. Beyond the survival and death of the

deltamethrin-threatened pollen beetle Meligethes aeneus: an in-depth proteomic study employing a

transcriptome database. J. Proteomics 150: 281–289. DOI: 10.1016/j.jprot.2016.09.016.

Erban T., Halešová T., Seifrtová M., Kamler M., Titěra D. 2016a. Způsob určení vlivu

xenobiotika/xenobiotik na plod včely, zejména včely medonosné, v průběhu její metamorfózy.

Přihláška patentu číslo PV 2016-654 podaného dne 19. 10. 2016, č. j. E274567. Úřad průmyslového

vlastnictví, Praha, Česko.

Erban T., Harant K., Hubalek M., Vitamvas P., Kamler M., Poltronieri P., Tyl J., Markovic M., Titera D.

2015. In-depth proteomic analysis of Varroa destructor: detection of DWV-complex, ABPV,

VdMLV and honeybee proteins in the mite. Sci. Rep. 5: 13907. DOI: 10.1038/srep13907.

Erban T., Harant K., Kamler M., Markovic M., Titera D. 2016b. Detailed proteome mapping of newly

emerged honeybee worker hemolymph and comparison with the red-eye pupal stage. Apidologie

47 (6):805–817. DOI: 10.1007/s13592-016-0437-7.

Erban T., Petrova D., Harant K., Jedelsky P. L., Titera D. 2014. Two-dimensional gel proteome analysis of

honeybee, Apis mellifera, worker red-eye pupa hemolymph. Apidologie 45 (1): 53–72.

Foster L. J. 2011. Interpretation of data underlying the link between colony collapse disorder (CCD) and an

invertebrate iridescent virus. Mol. Cell. Proteomics 10 (3): M110.006387. DOI:

10.1074/mcp.M110.006387.

Franz J. E., Mao M. K., Sikorski J. A. 1997. Glyphosate: a unique global herbicide. ACS monograph 189.

American Chemical Society, Washington, DC, USA.

George J., Prasad S., Mahmood Z., Shukla Y. 2010. Studies on glyphosate-induced carcinogenicity in mouse

skin: a proteomic approach. J. Proteomics. 73 (5): 951–964.

George J., Shukla Y. 2013. Emptying of intracellular calcium pool and oxidative stress imbalance are

associated with the glyphosate-induced proliferation in human skin keratinocytes HaCaT cells.

ISRN Dermatol. 2013: 825180. DOI: 10.1155/2013/825180

Guilherme S., Santos M. A., Gaivão I., Pacheco M. 2014. DNA and chromosomal damage induced in fish

(Anguilla anguilla L.) by aminomethylphosphonic acid (AMPA)—the major environmental

breakdown product of glyphosate. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (14): 8730–8739.

Halm M. P., Rortais A., Arnold G., Taséi J. N., Rault S. 2006. New risk assessment approach for systemic

insecticides: the case of honey bees and imidacloprid (Gaucho). Environ. Sci. Technol. 40 (7):

2448−2454.




- 29 -

Herbert L. T., Vázquez D. E., Arenas A., Farina W. M. 2014. Effects of field-realistic doses of glyphosate

on honeybee appetitive behaviour. J. Exp. Biol. 217 (19): 3457–3464.

Heydens W. F., Wilson A. G., Kier L. D., Lau H., Thake D. C., Martens M. A. 1999. An evaluation of the

carcinogenic potential of the herbicide alachlor to man. Hum. Exp. Toxicol. 18 (6): 363–391.

Hubert J., Bicianova M., Ledvinka O., Kamler M., Lester P. J., Nesvorna M., Kopecky J., Erban T. 2016a.

Changes in the bacteriome of honey bees associated with the parasite Varroa destructor, and

pathogens Nosema and Lotmaria passim. Microb. Ecol. (in press). DOI: 10.1007/s00248-016-0869-

7.

Hubert J., Kamler M., Nesvorna M., Ledvinka O., Kopecky J., Erban T. 2016b. Comparison of Varroa

destructor and worker honeybee microbiota within hives indicates shared bacteria. Microb. Ecol.

72 (2): 448–459.

Chaimanee V., Evans J. D., Chen Y., Jackson C., Pettis J. S. 2016. Sperm viability and gene expression in

honey bee queens (Apis mellifera) following exposure to the neonicotinoid insecticide imidacloprid

and the organophosphate acaricide coumaphos. J. Insect Physiol. 89: 1–8.

Chiodini R. J., Dowd S. E., Chamberlin W. M., Galandiuk S., Davis B., Glassing A. 2015. Microbial

population differentials between mucosal and submucosal intestinal tissues in advanced Crohn's

disease of the ileum. PLoS One 10 (7): e0134382. DOI: 10.1371/journal.pone.0134382.

IARC. 2016. Glyphosate. In: IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. Volume

112: Some organophosphate insecticides and herbicides: diazinon, glyphosate, malathion,

parathion, and tetrachlorvinphos. Lyon, France: 3–10 March 2015. International Agency for

Research on Cancer (IARC), Lyon, France. URL:

http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol112/mono112-09.pdf

Jefferies P. R., Quistad G. B., Casida J. E. 1998. Dialkylquinonimines validated as in vivo metabolites of

alachlor, acetochlor, and metolachlor herbicides in rats. Chem. Res. Toxicol. 11 (4): 353–359.

Kasiotis K. M., Anagnostopoulos C., Anastasiadou P., Machera K. 2014. Pesticide residues in honeybees,

honey and bee pollen by LC-MS/MS screening: reported death incidents in honeybees. Sci. Total

Environ. 485–486: 633–642.

Kelce W. R., Stone C. R., Laws S. C., Gray L. E., Kemppainen J. A., Wilson E. M. 1995. Persistent DDT

metabolite p,p'–DDE is a potent androgen receptor antagonist. Nature 375 (6532): 581–585.

Kozich J. J., Westcott S. L., Baxter N. T., Highlander S. K., Schloss P. D. 2013. Development of a dual-

index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq

Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17): 5112–5120.

Krischik V. A., Landmark A. L., Heimpel G. E. 2007. Soil-applied imidacloprid is translocated to nectar

and kills nectar-feeding Anagyrus pseudococci (Girault) (Hymenoptera: Encyrtidae). Environ.

Entomol. 36 (5): 1238−1245.

Li Q., Lambrechts M. J., Zhang Q., Liu S., Ge D., Yin R., Xi M., You Z. 2013. Glyphosate and AMPA

inhibit cancer cell growth through inhibiting intracellular glycine synthesis. Drug Des. Devel. Ther.

7: 635–643.

http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol112/mono112-09.pdf


- 30 -

Li W., Zha J., Li Z., Yang L., Wang Z. 2009. Effects of exposure to acetochlor on the expression of thyroid

hormone related genes in larval and adult rare minnow (Gobiocypris rarus). Aquat. Toxicol. 94 (2):

87–93.

Lin Y., Liu Y., Li J., Zhao Y., He Q., Han W., Chen P., Wang X., Liang S. 2010. Evaluation and optimization

of removal of an acid-insoluble surfactant for shotgun analysis of membrane proteome.

Electrophoresis 31 (16): 2705–2713.

Lindsay E. A., French K. 2004. The impact of the herbicide glyphosate on leaf litter invertebrates within

Bitou bush, Chrysanthemoides monilifera ssp rotundata, infestations. Pest Manag. Sci. 60 (12):

1205–1212.

Mañas F., Peralta L., Raviolo J., García Ovando H., Weyers A., Ugnia L., Gonzalez Cid M., Larripa I.,

Gorla N. 2009. Genotoxicity of AMPA, the environmental metabolite of glyphosate, assessed by

the Comet assay and cytogenetic tests. Ecotoxicol. Environ. Saf. 72 (3): 834–837.

Moffat C., Pacheco J. G., Sharp S., Samson A. J., Bollan K. A., Huang J., Buckland S. T., Connolly C. N.

2015. Chronic exposure to neonicotinoids increases neuronal vulnerability to mitochondrial

dysfunction in the bumblebee (Bombus terrestris). FASEB J. 29 (5): 2112–2119.

Nauen R., Reckmann U., Armborst S., Stupp H.-P., Elbert A. 1999. Whitefly-active metabolites of

imidacloprid: biological efficacy and translocation in cotton plants. Pestic. Sci. 55 (3): 265−271.

Nauen R., Tietjen K., Wagner K., Elbert A. 1998. Efficacy of plant metabolites of imidacloprid against

Myzus persicae and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). Pestic. Sci. 52 (1): 53−57.

Ottoboni A., Bissell G.D., Hexter A. C. 1977. Effects of DDT on reproduction in multiple generations of

beagle dogs. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 6 (1): 83–101.

Papaefthimiou C., Papachristoforou A., Theophilidis G. 2013. Biphasic responses of the honeybee heart to

nanomolar concentrations of amitraz. Pestic. Biochem. Physiol. 107 (1): 132–137.

Pettis J. S., Lichtenberg E. M., Andree M., Stitzinger J., Rose R., vanEngelsdorp D. 2013. Crop pollination

exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema

ceranae. PLoS One 8 (7): e70182. DOI: 10.1371/journal.pone.0070182.

Pettis J. S., Rice N., Joselow K., vanEngelsdorp D., Chaimanee V. 2016. Colony failure linked to low sperm

viability in honey bee (Apis mellifera) queens and an exploration of potential causative factors.

PLoS One 11 (2): e0147220. DOI: 10.1371/journal.pone.0147220.

Quast C., Pruesse E., Yilmaz P., Gerken J., Schweer T., Yarza P., Peplies J., Glöckner F. O. 2013. The

SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.

Nucleic Acids Res. 41 (Database issue): D590–D596.

Rada EHS. 1991. Směrnice Rady 91/414/EHS ze dne 15. července 1991 o uvádění přípravků na ochranu

rostlin na trh. Úřední věstník Evropských společenství L 230, 19. 8. 1991. URL: http://eur-

lex.europa.eu/legal-content/CS/TXT/?uri=OJ:L:1991:230:TOC

Rortais A., Arnold G., Halm M.-P., Touffet-Briens F. 2005. Modes of honeybees exposure to systemic

insecticides: estimated amounts of contaminated pollen and nectar consumed by different categories

of bees. Apidologie 36 (1): 71−83.

http://eur-lex.europa.eu/legal-content/CS/TXT/?uri=OJ:L:1991:230:TOC

http://eur-lex.europa.eu/legal-content/CS/TXT/?uri=OJ:L:1991:230:TOC


- 31 -

Sandrock C., Tanadini L. G., Pettis J. S., Biesmeijer J. C., Potts S. G., Neumann P. 2014. Sublethal

neonicotinoid insecticide exposure reduces solitary bee reproductive success. Agric. Forest

Entomol. 16 (2): 119–128.

Saska P., Skuhrovec J., Lukáš J., Chi H., Tuan S.-J., Honěk A. 2016. Treatment by glyphosate-based

herbicide alters life history parameters of the rose-grain aphid Metopolophium dirhodum. Sci. Rep.

6: 27801. DOI: 10.1038/srep27801.

Seifrtova M., Halesova T., Sulcova K., Riddellova K., Erban T. 2016. Distributions of imidacloprid,

imidacloprid-olefin and imidacloprid-urea in green plant tissues and roots of rapeseed (Brassica

napus) from artificially contaminated potting soil. Pest Manag. Sci. (in press). DOI:

10.1002/ps.4418.

Séralini G.-E., Clair E., Mesnage R., Gress S., Defarge N., Malatesta M., Hennequin D., de Vendômois J.

S. 2012. Long term toxicity of a Roundup herbicide and a Roundup-tolerant genetically modified

maize. Food Chem. Toxicol. 50 (11): 4221–4231.

Séralini G.-E., Clair E., Mesnage R., Gress S., Defarge N., Malatesta M., Hennequin D., de Vendômois J.

S. 2014. Republished study: Long-term toxicity of a Roundup herbicide and a Roundup-tolerant

genetically modified maize. Environ. Sci. Eur. 26: 14. DOI: 10.1186/s12302-014-0014-5

Schloss P. D., Westcott S. L., Ryabin T., Hall J. R., Hartmann M., Hollister E. B., Lesniewski R. A., Oakley

B. B., Parks D. H., Robinson C. J., Sahl J. W., Stres B., Thallinger G. G., Van Horn D. J., Weber

C. F. 2009. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported

software for describing and comparing microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23):

7537–7541.

Sierra-Santoyo A., Hernández M., Albores A., Cebrián M. E. 2000. Sex-dependent regulation of hepatic

cytochrome P-450 by DDT. Toxicol. Sci. 54 (1): 81–87.

Springett J. A., Gray R. A. J. 1992. Effect of repeated low doses of biocides on the earthworm Aporrectodea

caliginosa in laboratory culture. Soil Biol. Biochem. 24 (12): 1739–1744.

Suchail S., Debrauwer L., Belzunces L. P. 2004a. Metabolism of imidacloprid in Apis mellifera. Pest Manag.

Sci. 60 (3): 291−296.

Suchail S., De Sousa G., Rahmani R., Belzunces L. P. 2004b. In vivo distribution and metabolisation of 14C-

imidacloprid in different compartments of Apis mellifera L. Pest Manag. Sci. 60 (11): 1056−1062.

Suchail S., Guez D. Belzunces L. P. 2000. Characteristics of imidacloprid toxicity in two Apis mellifera

subspecies. Environ. Toxicol. Chem. 19 (7): 1901−1905.

Suchail S., Guez D., Belzunces L. P. 2001a. Degradation of imidacloprid in Apis mellifera. In: Belzunces

L. P., Pélissier C., Lewis G. B. (eds.) Hazards of pesticides to bees: Avignon (France), September

07−09, 1999. 7th International Symposium of the ICP-BR Bee Protection Group co-organised by

INRA and ACTA. Institut national de la recherche agronomique, Paris, France, pp. 298−299.

Suchail S., Guez D., Belzunces L. P. 2001b. Discrepancy between acute and chronic toxicity induced by

imidacloprid and its metabolites in Apis mellifera. Environ. Toxicol. Chem. 20 (11): 2482−2486.

Suchail S., Guez D., Belzunces L. P. 2001c. Toxicity of imidacloprid and its metabolites in Apis mellifera.

In: Belzunces L. P., Pélissier C., Lewis G. B. (eds.) Hazards of pesticides to bees: Avignon (France),

September 07−09, 1999. 7th International Symposium of the ICP-BR Bee Protection Group co-


- 32 -

organised by INRA and ACTA. Institut national de la recherche agronomique, Paris, France, pp.

121−126.

Tate T. M., Spurlock J. O., Christian F. A. 1997. Effect of glyphosate on the development of Pseudosuccinea

columella snails. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 33 (3): 286–289.

Thompson H. M., Levine S. L., Doering J., Norman S., Manson P., Sutton P., von Mérey G. 2014.

Evaluating exposure and potential effects on honeybee brood (Apis mellifera) development using

glyphosate as an example. Integr. Environ. Assess. Manag. 10 (3): 463–470.

UNEP. 2001. Stockholm convention on persistent organic pollutants. Secretariat of the Stockholm

Convention. United Nations Environmental Programme (UNEP) chemicals. Geneva , Switzerland.

URL: http://www.pops.int/documents/convtext/convtext_en.pdf

US EPA, et al. 2012. White paper in support of the propřed risk assessment process for bees. Submitted to

the FIFRA Scientific Advisory Panel for review and cement, September 11 – 14, 2012. Office of

Chemical Safety and Pollution Prevention, Office of Pesticide Programs, Environmental Fate and

Effects Division, Environmental Protection Agency, Washington DC, USA; Environmental

Assessment Directorate, Pest Management Regulatory Agency, Health Canada, Ottawa, ON,

Canada; California Department of Pesticide Regulation, Sacramento, CA, USA. URL:

http://www.cdpr.ca.gov/docs/emon/surfwtr/presentations/epa_whitepaper.pdf

US EPA, et al. 2014. Guidance for assessing pesticide risks to bees. Office of Pesticide Programs, United

States Environmental Protection Agency, Washington, DC, USA; Health Canada, Pest Management

Regulatory Agency, Ottawa, ON, Canada; California Department of Pesticide Regulation,

Sacramento, CA, USA. URL: https://www.epa.gov/sites/production/files/2014-

06/documents/pollinator_risk_assessment_guidance_06_19_14.pdf

vanEngelsdorp D., Evans J. D., Saegerman C., Mullin C., Haubruge E., Nguyen B. K., Frazier M., Frazier

J., Cox-Foster D., Chen Y., Underwood R., Tarpy D. R., Pettis J. S. 2009. Colony collapse disorder:

a descriptive study. PLoS One 4 (8): e6481. DOI: 10.1371/journal.pone.0006481.

Ware G. W. 1975. Effects of DDT on reproduction in higher animals. Residue Rev. 59: 119–140.

Weisburg W. G., Barns S. M., Pelletier D. A., Lane D. J. (1991) 16S ribosomal DNA amplification for

phylogenetic study. J. Bacteriol. 173 (2): 697–703.

Wheeler W. B. 2002. Role of research and regulation in 50 years of pest management in agriculture.

Prepared for the 50th anniversary of the Journal of Agricultural and Food Chemistry. J. Agric. Food

Chem. 50 (15): 4151–4155.

Whitehorn P. R., O'Connor S., Wackers F. L., Goulson D. 2012. Neonicotinoid pesticide reduces bumble

bee colony growth and queen production. Science 336 (6079): 351–352.

Williams G. R., Troxler A., Retschnig G., Roth K., Yañez O., Shutler D., Neumann P., Gauthier L. 2015.

Neonicotinoid pesticides severely affect honey bee queens. Sci. Rep. 5: 14621. DOI:

10.1038/srep14621.

http://www.pops.int/documents/convtext/convtext_en.pdf

http://www.cdpr.ca.gov/docs/emon/surfwtr/presentations/epa_whitepaper.pdf

https://www.epa.gov/sites/production/files/2014-06/documents/pollinator_risk_assessment_guidance_06_19_14.pdf

https://www.epa.gov/sites/production/files/2014-06/documents/pollinator_risk_assessment_guidance_06_19_14.pdf


- 33 -

11. Obrazová příloha

Obrázek 2. Izolátory se síťovinovou kapucí s experimentálními včelstvy o obdobném počtu jedinců,

ideálně o síle cca 5 000 jedinců.

(Foto: Martin Kamler)

Legenda: A) celkový pohled na izolátory s experimentálními včelstvy; B) pohled do izolátoru zvenčí;

C) dávkování cukerného roztoku s aplikovaným xenobiotikem; D) testované xenobiotikum je chráněno před

slunečním zářením.


- 34 -

Obrázek 3. Kukly ve stádiu červené oči. Při odběru tohoto typu vzorku je nezbytné dbát na stejnost

červenosti očí a ocelli u všech typů vzorků, které budou analyzovány. Protože jsou kukly umístěny v buňce

plástu, může se v závislosti na sklonu světla zdát, že jsou oči světlejší nebo tmavší. Proto odebíráme pouze

ty vzorky, o kterých jsme předvědčeni, že po vytažení z buňky mají správnou pigmentaci očí a ocelli.

(Foto: Veronika Souralová) (Foto: Veronika Souralová)

Obrázek 4. Líhnoucí se včely – mladušky.

(Foto: Julie Chalupníková) (Foto: Veronika Souralová)


- 35 -

Obrázek 5. Včely z plodového plástu jsou sklepnuty do plastového pytle.

(Foto: Tomáš Erban)

Obrázek 6. Odběr mrtvých včel nalézajících se mimo úl do vzorkovnice.

(Foto: Julie Chalupníková)


- 36 -

Obrázek 7. Živé včely nalézající se mimo úl.

(Foto: Julie Chalupníková)

Hodnocení vlivu xenobiotik na včely

Tomáš Erban a kol. Hodnocení vlivu xenobiotik na … vlivu xenobiotik na včely v průběhu ontogeneze metodami proteomické, metabolomické a genomické analýzy Tomáš Erban

Documents