TÓM T ẬN ÁN TIẾ ỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Ạ T

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH

HỌC LOÀI BỜI LỜI NHỚT LITSEA GLUTINOSA (LOUR.) C.B.

ROB. HỌ LONG NÃO (LAURACEAE) VÀ LOÀI NHÃN DÊ

(LEPISANTHES RUBIGINOSA (ROXB.) LEENH.) HỌ BỒ HÒN

(SAPINDACEAE) CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾ ỌC

HÀ NỘI, 2018

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

T T Ầ V

T T Ầ T T ẢO

Phản biện 1: ...............................................................................

Phản biện 2: ...............................................................................

Phản biện 3: ...............................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp

Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng

… năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

1

I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Ngày nay, cùng với sự phát triển kinh tế là sự phát triển ồ ạt của các ngành

công nghiệp đồng thời kéo theo nhiều vấn đề về môi trường, sinh thái ảnh hưởng

nghiêm trọng đến sức khoẻ con người. Thế giới luôn phải đối mặt với nhiều bệnh

hiểm nghèo và dịch bệnh có khả năng lan rộng thành đại dịch ở quy mô toàn cầu

như HIV/AIDS, ung thư, viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm

lợn H1N1 và các bệnh về tim mạch v.v.... Thực tế đó đã thúc đẩy chúng ta luôn

luôn phải tìm ra các thuốc chữa bệnh mới, có hiệu quả cao và tác dụng chọn lọc

hơn, giá thành rẻ và thân thiện với môi trường. Một trong những con đường hữu

hiệu để phát hiện ra các chất có hoạt tính, để phát triển thành thuốc chữa bệnh cho

người, gia súc và phòng dịch bệnh cho cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên.

Chi Bời lời (Litsea Lam.) họ Long não (Lauraceae) và chi Gió khơi

(Lepisanthes Blume.) họ Bồ hòn (Sapindaceae) là 2 chi mọc khá phổ biến ở nước

ta đặc biệt là ở các vùng đồi núi trung du. Các công bố nghiên cứu về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc 2 chi này cho thấy rất phong phú

về cấu trúc hóa học và nhiều hoạt tính sinh học lý thú. Để nhằm tìm kiếm phát

hiện những hoạt chất mới và những chất có hoạt tính sinh học có giá trị cao cho

việc nghiên cứu phát triển thuốc cũng như thực phẩm chức năng, chúng tôi tiến

hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài Bời lời

nhớt [Litsea glutinosa (Lour.) C.B. Rob.] họ Long não (Lauraceae) và loài Nhãn

dê [Lepisanthes rubiginosa (Roxb.)] họ Bồ hòn (Sanpindaceae) của Việt Nam’’.

2 Đối tượng nghiên cứu của luận án

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Bời lời nhớt

thuộc chi Bời lời (Litsea Lam.) họ Long não (Lauraceae) và loài Nhãn dê chi Gió

khơi (Lepisanthes Blume.) họ Bồ hòn (Sapindaceae) của Việt Nam’’.

3. Những đóng góp mới của luận án

● Lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Bời

lời nhớt [Litsea glutinosa (Lour.) C. B. Rob.] và loài Nhãn dê (Lepisanthes

rubiginosa (Roxb.) Leenh.) được nghiên cứu.

- Từ mẫu thu hái tại tỉnh Thừa Thiên – Huế: đã chiết tách và xác định cấu

trúc hóa học của 14 hợp chất trong đó có 7 alkaloide khung aporphin, 4 flavonoid

glycoside, hai megastigmane và một sterol.

- Từ mẫu thu hái tại Thái Nguyên đã chiết tách và xác định cấu trúc hóa

học của 10 hợp chất trong đó có 03 alkaloide khung aporphin (2 chất trùng với

mẫu Thừa Thiên -Huế), số còn lại là các dẫn xuất của acid và alcol béo.

- Có 15 chất từ hai mẫu này lần đầu tiên được phân lập từ loài Bời lời

nhớt (Litsea glutinosa).

- Đã chiết tách và xác định cấu trúc hoa học của 11 hợp chất, trong đó có

2

04 chất mới là các glycoside của acid oleanoic [Lepisanthes A (ND8),

Lepisanthes B (ND9)] và 02 chất là các pentaglycoside của farnesol [Lepisanthes

C (ND10), Lepisanthes D (ND11)] và 9 chất lần đầu tiên được phân lập từ loài

này.

● Về hoạt tính sinh học

- Đã thử hoạt tính hạ đường huyết trên động vật thực nghiệm của dịch

chiết EtOH 80% của mẫu Bời lời nhớt thu tại Thừa Thiên -Huế. Kết quả cho thấy:

với liều 250 và 500mg dịch chiết /kg thể trọng chuột thì hoạt tính hạ đường huyết

có ý nghĩa thống kê với nhóm đối chứng. Trong đó liều 500mg dịch chiết /kg thể

trọng chuột hoạt tính tương đương thuốc Acarbose liều 5mg/kg thể trọng.

- Đã xác định được độc tính cấp của dịch chiết EtOH 80% của mẫu Bời

lời nhớt Thừa Thiên- Huế với liều LD50 là 20g/kg thể trọng và thuộc loại không có

độc.

- Đã thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư, hoạt tính kháng oxy hóa và hoạt

tính ức chế enzym α- glucosidase của 11 chất sạch tách được. Một số chất có hoạt

tính ở mức trung bình đến khá. Dịch chiết BuOH của loài Nhãn dê thể hiện hoạt

tính ức chế tốt cả 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm là KB, HepG2, MCF-7 và Lu-

1.

II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN

MỞ ĐẦU: Đề cập đến ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án.

C 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phần tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu trong nước và Quốc tế về

các vấn đề liên quan đến 2 chi và 2 loài thực vật nghiên cứu bao gồm: Thực vật

học

1.1. Đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một

số loài thực vật thuộc chi Bời lời (Litsea Lam.).

1.2. Đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một

số loài thực vật thuộc chi ió khơi (Lepisanthes Blume.)

C 2: T ỰC Ệ

2 1 óa chất và thiết bị nghiên cứu

2 2 ẫu thực vật

● Cành và vỏ loài Bời lời nhớt được thu hái tại Thái Nguyên vào tháng

10/2014. Do nhà Thực vật học Ngô Văn Hải, viện Sinh Thái và Tài nguyên Sinh

vật giám định tên khoa học là Litsea glutinosa (Lour.).C.B.Rob. thuộc họ Long

não (Lauraceae). Mẫu tiêu bản vỏ thân và lá (PTN01) được lưu giữ tại Phòng

THHC, viện Hóa học-Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam.

● Mẫu lá và vỏ loài Bời lời nhớt được thu hái tại Thừa Thiên-Huế (tháng

10/2015). Mẫu do nhà Thực vật học Ngô Văn Hải, viện Sinh Thái và Tài nguyên

3

Sinh vật giám định tên khoa học là Litsea glutinosa (Lour.).C.B.Rob. thuộc họ

Long não (Lauraceae). Mẫu tiêu bản vỏ thân và lá (PTN02) được lưu giữ tại

Phòng THHC, Viện Hóa học-Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam.

● Mẫu lá và cành loài Nhãn dê được thu hái tại huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa

Thiên -Huế vào tháng 10 năm 2014. Mẫu do Tiến sĩ Đỗ Xuân Cẩm (đại học Nông

lâm Huế) xác định tên khoa học (Lepisanthes rubiginosa (Roxb.) Leenh.) Mẫu

tiêu bản thân và lá (ND) được lưu giữ tại Phòng THHC, Viện Hóa học-Viện Hàn

lâm KH & CN Việt Nam.

2 3 hương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp chiết tách

2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc

2.3.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Phương pháp thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH; Phương pháp thử hoạt tính

gây độc tế bào in vitro; Phương pháp thử hoạt tính hạ đường huyết; Phương pháp

đánh giá hoạt tính hạ đường huyết trên chuột được tiêm alloxan (in vivo); Phương

pháp thử độc tính cấp của cao chiết cồn nước (80/20) trên chuột thí nghiệm.

2 4 Chiết tách, tinh chế các hợp chất từ hai loài nghiên cứu

2.4.1. Loài Bời lời nhớt (Litsea glutinosa (Lour.) Rob.)

2.4.1.1. Phân lập các chất từ loài Bời lời nhớt thu hái tại tỉnh Thừa Thiên- Huế

Mẫu lá loài Bời lời nhớt sấy khô, nghiền nhỏ thu được 2,2 kg bột mịn chiết

với EtOH/nước (80/20) ở nhiệt độ phòng (4 × 3lít). Dịch chiết được cất loại dung

môi dưới áp suất giảm thu được cặn dịch chiết. Cặn dịch chiết được phân lớp với

n-hexan, ethyl acetat (4 × 0,5 lit). Các dịch chiết được cô quay cất loại dung môi

dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng (Sơ đồ Hình 2.1).

* Các chất phân lập từ dịch nước

● Hợp chất BL01 (Nicotiflorin) ở dạng bột màu vàng; IR (KBr) νmax (cm-1):

3339; 2929; 1655; 1554; 1361; 1058; UV (MeOH), λmax (nm): 212,1; 265,8; 349,0

nm; (+) ESI-MS m/z: 617.1 [M+Na]+; (-) ESI-MS m/z: 593,1 [M-H]

-; các số liệu phổ

1H,

13C-NMR, 1D, 2D, của BL01 phù hợp với công thức phân tử và tài liệu [152]. ● Hợp chất BL02 (Rutin) là chất bột màu vàng; IR (KBr) νmax (cm

-1): 3392;

1614; 1518; 1455; 1244; 1007; UV (MeOH) λmax (nm): 206,9; 257,3; 358,0; (+) ESI-

MS m/z: 611,0 [M+H]+; (-) ESI-MS m/z: 609,1 [M-H]


1H,

13C-NMR,

1D, 2D của BL02 phù hợp với công thức phân tử và tài liệu [153].

● Hợp chất BL03 (Afzelin) là chất bột màu vàng; IR (KBr) νmax (cm-1): 3379;

3100; 2920; 1646; 1562; 1459; 1074; UV (MeOH) λmax (nm): 206,9; 265,4; 316,6; (+)

ESI-MS m/z: 432,8 [M+H]+; (-) ESI-MS m/z: 431,0 [M-H]


1H,

13C-

NMR, 1D, 2D của BL03 phù hợp với công thức phân tử và tài liệu [154].

http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/tro-50009183

4

Hình 2.1: Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết lá loài Bời lời nhớt thu hái tại tỉnh

Thừa Thiên- Huế

* Các hợp chất phân lập từ dịch chiết ethyl acetat

● Hợp chất BL04 (Quercitrin) thu được dưới dạng bột màu vàng; Phổ IR

(KBr) νmax (cm-1): 3415, 3253, 2970, 1655, 1557, 1471, 1052; UV (MeOH), λmax

(nm): 206,9 nm); (+) ESI-MS m/z: 471,0 [M+Na]+; (-) ESI-MS m/z: 447,0 [M-H]

-

; các số liệu phổ 1H,

13C-NMR, 1D, 2D của BL04 phù hợp với công thức phân tử

và tài liệu [155].

2.4.1.2. Phân lập các chất từ vỏ và cành loài Bời lời nhớt thu hái tại tỉnh

Thừa Thiên- Huế

Mẫu vỏ và cành loài Bời lời nhớt sấy khô, xay nhỏ thu được 1,7 kg; ngâm

chiết với Cồn/nước (80/20) ở nhiệt độ phòng (4 x 2,5 lít) thu được cặn dịch chiết

Ethanol tổng. Dịch chiết tổng tiếp tục được chiết lần lượt với các dung môi n-

hexan; ethyl acetat; n-butanol, các dịch chiết được cất loại dung môi thu được cặn

chiết tương ứng (Sơ đồ Hình 2.2).

5

Hình 2.2: Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết vỏ và cành loài

Bời lời nhớt thu hái tại tỉnh Thừa Thiên -Huế

* Các hợp chất phân lập từ dịch nước

● Hợp chất BL05 (Magnocurarine chloride) thu được dưới dạng bột màu

vàng. Phổ HR-ESIMS m/z: 314,1751 [M-Cl]+ (tính toán cho công thức phân tử

C19H24NO3+ 314.1756). Các số liệu phổ

1H,

13C-NMR, 1D, 2D của BL05 phù hợp

với công thức phân tử và tài liệu [156].

* Các hợp chất phân lập từ dịch chiết n-butanol

Hợp chất BL 06 (Oblongine chloride) thu được dưới dạng bột màu vàng nâu;

Phổ IR (KBr) νmax (cm-1): 3482, 3239, 2989, 1656, 1556, 1061; UV (MeOH),

λmax (nm): 204,8; 245,3; 295,2; Phổ ESI-MS m/z: 314,0 [M-Cl]+; positive HR-ESIMS

m/z: 314,1741 [M-Cl]+ (calcd. for C19H24NO3

+ 314,1756); Các số liệu phổ

1H,

13C-

NMR, 1D, 2D của BL 06 phù hợp với công thức phân tử và tài liệu [157]. Hợp chất BL07 (Boldine methochloride) thu được dưới dạng bột màu

vàng nâu: Phổ ESI-MS m/z: 342,0 [M-Cl]+; Các số liệu phổ

1H,

13C-NMR, 1D, 2D

của BL07 phù hợp với công thức phân tử và tài liệu [158, 159].

Hợp chất BL08 (Pallidine) thu được dưới dạng bột màu nâu: Phổ ESI-

MS m/z: 328.0 [M+H]+; negative ESI-MS m/z: 326,0 [M-H]

-; Các số liệu phổ

1H,

6

13C-NMR, 1D, 2D của BL08 phù hợp với công thức phân tử và tài liệu [160]

Hợp chất BL09 (Predicentrine) thu được dưới dạng bột màu vàng: Phổ

ESI-MS m/z: 342,0 [M+H]+. Các số liệu phổ

1H,

13C-NMR, 1D, 2D của BL09 phù

hợp với công thức phân tử và tài liệu [158, 159].

Hợp chất BL10 (Criptorodine) thu được dưới dạng bột màu vàng. Phổ

ESI-MS m/z: 309,9 [M+H]+; Các số liệu phổ

1H,


hợp với công thức phân tử và tài liệu [161].

Hợp chất BL11 (Reticuline) thu được dưới dạng bột màu vàng. Phổ ESI-

MS m/z: 330,0 [M+H]+; Các số liệu phổ

1H,



● Hợp chất BL12 (Aripuanin) thu được dạng dầu màu vàng; Phổ (+)-ESI-

MS m/z: 267,0 [M+Na]+; Các số liệu phổ

1H,



● Hợp chất BL13 (Blumenol A) thu được dạng dầu màu vàng; Phổ (+)-

ESI-MS m/z: 247 [M+Na]+; Các số liệu phổ

1H,



* Các hợp chất phân lập từ dịch chiết n-hexan.

● Hợp chất BL14 (2-phyten-1-ol) thu được dưới dạng chất rắn màu trắng:

Các số liệu phổ 1H,

13C-NMR, 1D, 2D của BL14 phù hợp với công thức phân tử

và tài liệu [165].

2.4.1.2. Phân lập các chất từ loài Bời lời nhớt thu hái tại Thái Nguyên

Mẫu vỏ và cành (5 kg) sau khi được sấy khô, nghiền nhỏ được chiết lần

lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, ethyl acetat, methanol

và methanol/nước =1:1). Dung môi được làm bay hơi dưới áp suất giảm thu được

các cặn dịch chiết n-hexan, ethyl acetat, methanol và methanol-nước có khối

lượng tương ứng (Sơ đồ Hình 2.3).

7

Hình 2.3: Sơ đồ phân lập các chất từ vỏ và cành loài

Bời lời nhớt thu hái tại Thái nguyên

* Các hợp chất Phân lập từ dịch chiết ethyl acetat

ợp chất BL15 (cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid methyl este) thu

được dưới dạng dầu màu vàng. Phổ IR (KBr, cm-1): 2923,11 (CH); 1740,14

(COO). Phổ ESI-MS m/z: 317,0 (25 %, [M+H]+). Các số liệu phổ

1H,

13C-NMR,

1D, 2D của BL15 phù hợp với công thức phân tử và tài liệu [166].

Hợp chất BL16: Spatozoate

Hợp chất 16 thu được dưới dạng dầu màu vàng. Phổ IR (KBr, cm-1): 2964

(C-H), 1724 (COOR- este), 1283 (C-O). Phổ ESI-MS (m/z, %): 313,0 (98 %)

[M+H]+. (C19H20O4): Các số liệu phổ

1H,

13C-NMR, 1D, 2D của BL16 phù hợp

với công thức phân tử và tài liệu [167].

● Hợp chất BL17: β-sitosterol; Các số liệu phổ 1H,

13C-NMR, 1D, 2D của

BL17 phù hợp với công thức phân tử và tài liệu [168].

● Hợp chất BL18: Daucosterol; Các số liệu phổ 1H,

13C-NMR, 1D, 2D của

BL18 phù hợp với công thức phân tử và tài liệu [169].

* Các hợp chất phân lập từ dịch chiết n-hexan

● Hợp chất BL19 (1-heptadecanol) thu được dưới dạng chất rắn màu trắng.

Phổ ESI-MS m/z: 256,1 (98 %), [M]+, công thức phân tử C17H36O. Các số liệu

phổ 1H,

13C-NMR, 1D, 2D của BL19 phù hợp với công thức phân tử và tài liệu

[170, 171].

8

● Hợp chất BL20 (1-eicosanol) thu được dưới dạng chất rắn màu trắng.

Phổ ESI-MS m/z: 298,2 (15 %) [M]+, 338,2 (80 %) [M+K+H]

2+, công thức phân

tử C20H42O; Các số liệu phổ 1H,

13C-NMR, 1D, 2D của BL20 phù hợp với công

thức phân tử và tài liệu [170, 171].

Hợp chất BL21 (Glycerol 1,3-di-(9Z, 12Z-octadecadienoate) 2-

hexadecanoate) thu được dưới dạng dầu màu vàng. Phổ ESI-MS m/z: 875,7 (98

%) [M+H2O+3H]+; 595,4 (10 %) [M+3H-CO(CH2)14CH3)]

+; công thức phân tử

C55H98O6. Các số liệu phổ 1H,

13C-NMR, 1D, 2D của BL21 phù hợp với công

thức phân tử và tài liệu [172].

* Phân lập các chất từ dịch chiết tổng alkaloid của vỏ loài Bời lời nhớt thu

hái tại Thái Nguyên

Gộp dịch chiết MeOH và MeOH:H2O; 1:1 hòa tan hoàn toàn bằng nước sau

đó dùng axit HCl 30% nhỏ từ từ xuống hỗn hợp vừa nhỏ vừa khuấy để chuyển

alkaloid tự do về dạng muối, điều chỉnh pH ≈ 4 để khoảng 5-10 phút. Dùng

EtOAc chiết để tách riêng phần không alkaloid. Dịch nước còn lại chứa alkaloid

dạng muối được kiềm hóa bằng NH3 (nhỏ từ từ NH3 vừa nhỏ vừa khuấy điều

chỉnh pH ≈ 8 để khoảng 5-10 phút) rồi chiết bằng CH2Cl2 (chiết lặp lại 4 lần) thu

được 12 gam cao dịch chiết tổng alkaloid (Sơ đồ Hình 2.4).

Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết alkaloid tổng của vỏ và cành loài

Bời lời nhớt thu hái tại Thái nguyên

Kết quả phân lập đã thu được các hợp chất BL09 (Predicentrine); BL10

(Criptodorine) và BL11 (Reticuline) có trong dịch n-butanol của Bời lời thu tại Huế.

2.4.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ loài Nhãn dê (Lepisanthes

rubiginosa)

Lá và cành Nhãn dê 1,5 kg đã được sấy khô ở nhiệt độ 40 C, xay nhỏ và

chiết với hỗn hợp dung môi MeOH:H2O 80:20. Dịch chiết được quay cất loại

9

dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không thu được cặn dịch.

Cặn dịch chiết được pha loãng thêm bằng nước cất, dùng n-hexan; ethyl acetat, n-

butanol chiết phân lớp. Các dịch chiết được cất loại dung môi thu được các cặn

dịch chiết tương ứng (Sơ đồ Hình 2.5).

* Các hợp chất phân lập từ dịch chiết ethyl acetat của loài Nhãn dê

Hợp chất ND1 (lupeol) thu được là chất rắn màu trắng; phổ khối ESI-

MS: m/z 409 (100, [M+1-H2O]+; M = 426 ứng với công thức phân tử

C30H50O. Các số liệu phổ 1H,

13C-NMR, 1D, 2D của ND1 phù hợp với công

thức phân tử và tài liệu [173, 174].

Hình 2.5: Sơ đồ phân lập các chất từ cây Nhãn dê

● Hợp chất ND2 (Diosmetin) thu được dưới dạng dầu màu vàng có công

thức phân tử C16H12O6. Phổ khối ESI-MS: m/z 300,9 [M+H]+ và m/z 298,9

[M-

H]-. Các số liệu phổ

1H,

13C-NMR, 1D, 2D của ND2 phù hợp với công thức phân

tử và tài liệu [175].

● Hợp chất ND3: Heptadecanoic acid (Margaric acid, Daturinic acid). Phổ

khối ESI-MS: m/z 271 [M+H]+; Các số liệu phổ

1H,

13C-NMR, 1D, 2D của ND3

phù hợp với công thức phân tử và tài liệu [176].

● Hợp chất ND4: β-sitosterol

● Hợp chất ND5: Daucosterol

* Các hợp chất phân lập từ dịch chiết n-butanol của loài Nhãn dê

● Hợp chất ND6 dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ ESI-MS của chất ND6

10

cho các pic ion tại m/z 803,4 [M+Na]+; 815,4 [M+Cl

-]

-. Các số liệu phổ

1H,

13C-

NMR, 1D, 2D của ND6 phù hợp với công thức phân tử và tài liệu [178].



-]

-; Các số liệu phổ

1H,

13C-

NMR, 1D, 2D của ND1 phù hợp với công thức phân tử .



-]

-. Phổ khối phân giải cao

HR-ESIMS cho tín hiệu tại m/z 977,5065. Phổ 1H và

13C NMR của chất ND8

trong (Bảng 3.18).

● Hợp chất ND9 dưới dạng rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS của chất ND9

cho các pic ion tại m/z 935,4 [M+Na]+. Phổ khối phân giải cao HR- ESIMS cho

pic ion tại m/z 935,4929 [M+Na]+. Các số liệu phổ

1H-NMR và

13C-NMR của

chất ND9 được trình bày trong (Bảng 3.18).

Hợp chất ND10 dưới dạng rắn màu trắng. Phổ khối ESI-MS cho các pic

tại m/z 963,4 [M+Na]+ và 939,4 [M-H]

- Phổ khối phân giải cao HR- ESI-MS cho

pic ion tại m/z 963,4314 [M+Na]+. Các số liệu phổ

1H-NMR và

13C-NMR của

chất ND10 được trình bày trong (Bảng 3.19).

Hợp chất ND11 ở dạng màu trắng vô định hình. Phổ khối ESI-MS ion

dương của ND11 cho pic ion tại m/z 979; Phổ khối phân giải cao ion dương có

pic ion tại m/z 979,41760. Các số liệu phổ 1H-NMR và

13C-NMR của chất ND11

được trình bày trong (Bảng 3.19).

C 3: ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Loài Bời lời nhớt (Litsea glutinosa)

3.1.1. Hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ loài Bời lời nhớt thu tại

Thừa Thiên - Huế

3.1.1.1. Hoạt tính hạ đường huyết in vitro của các dịch chiết

Dịch chiết cồn nước thu được từ vỏ và lá loài Bời lời nhớt (L. glutinosa) thu

hái tại tỉnh Thừa Thiên Huế đã được thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme -

glucosidase. Các kết quả thu được cho thấy dịch chiết EtOH/H2O (80/20) của cả vỏ

và lá đều cho hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase tương đối tốt ở giá trị IC50 là

194,9 và 197,3 (g/ml), chất chuẩn Acarbose có hoạt tính ức chế là 165,7 g/ml.

3.1.1.2. Hoạt tính hạ đường huyết in vivo của dịch EtOH trên chuột bị tiểu đường

● Ảnh hưởng của dịch EtOH đến trọng lượng chuột bị tiểu đường

Kết quả kiểm tra trọng lượng chuột thí nghiệm trước và sau khi dùng dịch

EtOH (dịch chiết tổng EtOH/H2O (80/20) từ vỏ, lá và cành loài Bời lời nhớt) ở

liều 250 và 500 mg/kg trọng lượng được trình bày ở bảng 7 cho thấy ở liều 500

mg dịch chiết tổng/kg thể trọng chuột hiệu quả chống tăng đường huyết là tương

đương liều 5mg Acarbose/kg thể trọng.

● Ảnh hưởng của dịch EtOH đến nồng độ glucose trong huyết thanh của

chuột bị tiểu đường (Bảng 3.3)

11

Nồng độ glucose trong huyết thanh của chuột thực nghiệm cũng được khảo

sát cho thấy dịch EtOH của vỏ loài Bời lời nhớt ở liều 250 mg/kg và 500 mg/kg

thể trọng đều có tác dụng hạ đường huyết trên chuột thí nghiệm.

3.1.2. Thành phần hóa học của loài Bời lời nhớt

3.1.2.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập từ Bời lời nhớt thu tại

Thừa Thiên- Huế (Từ các bộ phận lá, cành và vỏ của loài Bời lời nhớt thu hái tại

tỉnh Thừa Thiên -Huế đã phân lập được 15 hợp chất, bao gồm: 4 flavonol

glycoside (chất BL01-BL04) và 7 aporphine alkaloid (chất BL05-BL11) cùng 2

megastimane (chất BL12, BL13), và 1 phytol là chất BL14).

3.1.2.2. Cây Bời lời nhớt thu hái tại tỉnh Thái Nguyên (Từ dịch chiết ethyl

acetat, n-hexan của vỏ và cành loài Bời lời nhớt thu hái tại Thái Nguyên đã phân

lập được 10 hợp chất).

Các hợp chất phân lập được từ 2 loài được trình bày trong

Bảng 3.20: Tổng hợp các chất phân lập từ Bời lời tại Thái nguyên và Thừa Thiên Huế

Cây Bời lời Thái Nguyên Cây Bời lời Thừa Thiên Huế

BL15 (Cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid

methyl este)

BL01 (Nicotiflorin)

BL16 (Spatozoate)

BL02 (Rutin)

BL17 (β-sitosterol)

BL03 (Afzelin)

BL18 (Daucosterol)

BL04 (Quercitrin)

12

BL19 (1-heptadecanol)

BL05 (Magnocurarine chloride)

BL20 (1-eicosanol)

BL06 (Oblongine chloride)

BL21 (Glycerol 1,3-di(9Z,12Z-octadecadienoat)-2-

hexadecanoate)

BL07 (Boldine methochloride)

BL08 (Pallidine)

BL09 (Predicentrine)

BL09 (Predicentrine)

BL10 (Criptorodine)

BL10 (Criptorodine)

BL11 (Reticuline)

BL11 (Reticuline)

13

BL12 (Aripuanin)

BL13 (Blumenol A)

BL14 (2-phyten-1-ol)

* Qua tra cứu tài liệu cho thấy trong 21 chất sạch phân lập được từ hai mẫu

Bời lời nhớt có 15 chất (BL01, BL05-BL10, BL12- BL16, BL19- BL21) lần đầu

tiên được phân lập từ loài Bời lời nhớt [(Litsea glutinosa (Lour.) Rob.)].

3.1.3. Hoạt tính sinh học của các chất sạch phân lập được

3.1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất sạch phân lập từ cây Bời lời nhớt

Các chất sạch (từ BL01- BL11) được thử hoạt tính gây độc tế bào trên bốn

dòng tế bào ung thư: KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan), Lu (ung thư

phổi) và MCF-7 (ung thư vú) với đối chứng dương là ellipticine.

Bảng 3.10: Hoạt tính gây độc tế bào của các chất sạch (từ BL01-BL11)

phân lập được từ loài Bời lời nhớt tại Thừa Thiên-Huế

Mẫu IC50 (g/ml)

KB HepG-2 Lu MCF-7

BL01 >128,0 >128,0 >128,0 >128,0

BL02 >128,0 >128,0 >128,0 >128,0

BL03 >128,0 >128,0 >128,0 >128,0

BL04 >128,0 >128,0 >128,0 >128,0

BL05 67,66 117,08 >128,0 >128,0

BL06 68,49 82,75 >128,0 >128,0

BL07 >128,0 >128,0 >128,0 >128,0

BL08 21,29 13,56 >128 29,24

BL09 17,72 25,6 56,32 54,21

BL10 68,39 >128,0 >128,0 >128,0

BL11 >128,0 >128,0 >128,0 >128,0

Ellipticine 0,31 0,38 0,41 0,60

14

Kết quả cho thấy một số alkaloid như hợp chất BL05, BL06, BL08, BL09

phân lập từ cây Bời lời nhớt thu hái tại tỉnh Thừa Thiên- Huế đã thể hiện hoạt tính

gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư KB, HepG2, Lu và MCF7. Đây là công

trình đầu tiên công bố về hoạt tính gây độc tế bào của các aporphine akaloid nêu trên.

3.1.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của một số chất sạch phân lập được

Các flavonoid BL01-BL04 được thử hoạt tính chống oxy hóa với chất tham

khảo là quercetin (IC50 9,45 μg/ml) (Bảng 3.5). Kết quả cho thấy chất BL02

(rutin) và quercitrin (BL04) cho hoạt tính chống oxy hóa tương đối tốt với giá trị

IC50 lần lượt là 23,73 và 38,20 μg/ml. Kết quả nghiên cứu góp phần khẳng định

các hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa trong loài Bời lời nhớt là các flavonoid.

3.1.3.3. Hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase của một số chất sạch phân

lập từ loài Bời lời nhớt.

Các chất sạch từ BL01-BL11 được thử hoạt tính ức chế enzym -

glucosidase. Kết quả cho thấy trong 11 chất được thử chỉ có chất BL04 (quercitrin)

cho hoạt tính ức chế enzym -glucosidase tốt so với chất tham khảo acarbose với

giá trị IC50 149,5 g/ml (chất tham khảo acarbose IC50 165,7 μg/ml). Các chất còn

lại không có hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase (Bảng 3.10). Kết quả này phù

hợp với các nghiên cứu trước đó. Theo tài liệu [142], quercitrin phân lập từ dịch

chiết ethyl acetat của cây Amomum xanthioides được xác định là hoạt chất có tác

dụng ức chế enzyme -glucosidase với khả năng ức chế 55,7 % ở nồng độ 0,5

mg/ml, cao hơn chất tham khảo là acarbose (32,4 %) với cùng nồng độ.

3.1.4. Độc tính cấp dịch chiết EtOH/ H2O của cây Bời lời nhớt

Trong khuôn khổ luận án này chúng tôi tiến hành nghiên cứu độc tính cấp

của cây Bời lời nhớt thu tại Thừa Thiên Huế do cây thu ở Thừa Thiên -Huế có

nhiều hoạt chất hơn (cả về chủng loại lẫn hàm lượng), và đây sẽ là nguồn nguyên

liệu dồi dào cho những nghiên cứu phát triển sản phẩm tiếp theo. Kết quả thu

được cho thấy cao chiết EtOH/ H2O (80/20) (dịch EtOH) của vỏ và cành loài Bời

lời nhớt Thừa Thiên -Huế có độc tính thấp và liều gây chết 50% động vật thí

nghiệm theo đường uống là trên 20g/kg (LD50>20g/kg thể trọng). Theo phân loại

chất độc của GHS mẫu thử thuộc nhóm không độc.

3.2. Cây Nhãn dê [(Lepisanthes rubiginosa (Roxb.)Leenh)]

3.2.1. Hoạt tính sinh học

3.2.1.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thực

nghiệm của dịch chiết n-butanol từ lá loài Nhãn dê (NDL-Bu) được trình bày

trong bảng 3.14.

Bảng 3.14: Hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết n-butanol của cây Nhãn dê

STT Tên mẫu IC50 (µg/ml)

KB HepG2 MCF7 Lu

1. NDL-Bu 21,33 23,42 18,37 20,01

Ellipticine 0,40 0,41 0,48 0,45

15

Các phép thử hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết n-butanol từ cành và lá

của loài Nhãn dê (NDL-BuOH) cho thấy dịch chiết này có hoạt tính ức chế đối

với cả bốn dòng tế bào ung thư KB, HepG2, LU và MCF7. Trong đó hoạt tính ức

chế đối với tế bào MCF7 tương đối tốt (IC50=18,37 µg/ml), tiếp đến là hoạt tính

ức chế sự phát triển của tế bào ung LU (IC50=20,01 µg/ml), hoạt tính ức chế sự

phát triển của tế bào ung KB (IC50=21,33 µg/ml), hoạt tính ức chế sự phát triển

của tế bào HepG2 là (IC50=23,42 µg/ml).

3.2.2. Thành phần hóa học của loài Nhãn dê

Cấu trúc hóa học của 11 hợp chất được phân lập từ loài nhãn dê, trong đó

có 04 chất mới là các glycoside của acid oleanoic ND8, ND9 và 02 chất là các

pentaglycoside của farnesol ND10, ND11và 9 chất lần đầu tiên được phân lập từ

loài này được trình bày trong (Bảng 3.20) (tiếp) dưới đây:

Bảng 3.20. (Tiếp): Các chất phân lập từ loài Nhãn dê (Lepisanthes rubiginosa

(Roxb.) Leenh.)

ND1 (Lupeol)

ND2 (Diosmetin;

5,7,3'-Tryhydroxy-4'-methoxyflavone)

ND3 (Heptadecanoic acid; Magaric

acid; Daturinic acid) ND4 (R=H: β-sitostosterol)

ND5 (R= β-D-glucose; sitosterol-3-O-

β-D-glucopyranoside)

ND6 (3-O-β-sophoroside)

ND7 (3-O-[β-D-xylopyranosyl (1→3)-

β-D-glucopyranosyl-]-oleanoic acid)

16

ND8 (Lepisantheside A) mới

ND9 (Lepisantheside B) mới

Hợp chất ND8: (Chất mới)

Chất ND8 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ ESI-MS của

chất ND8 cho các pic ion tại m/z 977,3 [M+Na]+; 989,4 [M+Cl

-]

-. Phổ khối phân

giải cao HR-ESIMS cho tín hiệu tại m/z 977,5065 (tính toán lý thuyết cho công

thức phân tử C49H48O18Na là 977,5086), ứng với công thức phân tử C49H48O18.

Phân tích số liệu phổ 1H- NMR và

13C- NMR của chất ND8 cho thấy phần

aglycone của hợp chất này hoàn toàn trùng khớp với aglycone của chất ND7

chứng tỏ đây cũng là dẫn xuất của oleanoic acid. Phần đường cho tín hiệu của một

trisaccharide với ba carbon anomer tại δC 110,93; 105,38 và 103,74. Tín hiệu của

ba carbon oxymethylene tại δC 62,76; 63,67 và 65,01. Các tín hiệu của 11 carbon

oxymethine còn lại xuất hiện tại δC 70,19; 72,46; 75,96; 77,58; 77,99; 78,26;

78,31; 78,57; 82,13; 83,32; 87,86. Trên phổ của ND8 còn xuất hiện tín hiệu của

một nhóm acetyl tại δC 172,57 (-OCOCH3) và δH 2,08 (COCH3). Tín hiệu của ba

proton anomer xuất hiện tại δH 4,49 (d; J = 8,0; H-1’); 4,73 (d; J = 8,0; H-1’’); và

5,24 (d; J = 2,0; H-1’’’). Qua so sánh với tài liệu tham khảo [180, 181] cho thấy

phần đường trisaccharide bao gồm một đường β-D-glucopyranose, một đường α-

D-galactopyranose và một đường α-L-arabinofuranose. Đơn vị đường β-D-

glucopyranose được nối với phần aglycone tại vị trí C-3. Điều này được khẳng

định qua tương tác trong phổ HMBC giữa H-1’ (Glu, δH 4,49; d; J = 8,0)/C-3 (δC

92,31) cùng với tương tác của H-3 (δH 3,23; dd; J = 4,0; 10,5 Hz)/C-1’ (δC

103,74). Đơn vị đường α-D-galactopyranose với các tín hiệu đặc trưng tại δC

105,38 (C-1’’’); 72,46 (C-2’’’); 78,26 (C-3’’’); 70,19 (C-4’’’); 77,58 (C-5’’’) và

63,67 (C-6’’’). Tín hiệu của H-1’’’ (δH 5,24; d; J = 2,0) đã khẳng định cấu hình

17

equatorial của proton anomer và qua đó khẳng định đây là đường α-D-

galactopyranose. Đơn vị đường này được kết nối với phân tử glucose ở vị trí C-4’

thông qua tương tác giữa H-1’’’ (δH 5,24)/C-4’ (δC 82,13) cùng với sự dịch

chuyển về phía trường thấp của C-4’. Ngoài ra còn thấy tương tác giữa C-1’’’ (δC

105,38) với H-4’ (δH 3,75; t; J = 9,5 Hz) trong phổ HMBC của ND8. Tín hiệu của

nhóm oxymethylene C-6’ (δC 65,01; δH 4,35 và 4,15) đã dịch chuyển về phía

trường thấp do bị acetyl hóa. Điều này được chứng minh qua các tương tác của

Ha-6’ (δH 4,35; dd; J = 3,0; 11,5) và Hb-6’ (δH 4,16; d; J = 11,5)/C-4’(82,13); C-

5’(77,99) và COCH3 (δC 172,57). Tín hiệu của proton H-5’ do ảnh hưởng của

nhóm acetyl tại C-6’ cũng bị dịch chuyển về phía trường thấp (δH 4,21; dt; J =

3,0; 6,5 Hz). Phân tích các tín hiệu của đơn vị đường thứ 3 cho thấy các đặc trưng

của đường α-L-arabinofuranose tại δC 110,93 (C-1’’); 83,32 (C-2’’); 78,31 (C-

3’’); 87,86 (C-4’’) và 62,76 (C-5’’). Đơn vị đường arabinofuranose được kết nối

với phân tử β-D-glucose tại vị trí C-3’(δC 78,57). Điều này được chứng minh qua

tương tác của H-1’’ (δH 4,73) với /C-3’ (δC 78,57) trong phổ HMBC. Ngoài ra còn

thấy tương tác của H-3’ (δH 3,64, t, J = 9.5 Hz) với C-1’’ (δC 110.93).

Hình 3.34: Phổ dãn HMBC của chất ND8

Qua phân tích các số liệu phổ MS, 1D và 2D NMR và so sánh với chất

tương tự trong tài liệu tham khảo [180] cho thấy chất ND8 là 3-O-{α-L-

arabinofuranosyl-(1→3)-[α-D-galactopyranosyl-(1→4)]–6-O-acetyl-β-D-

glucopyranosyl}-oleanoic acid. Đây là chất mới và được đặt tên là

Lepisantheside A.

18

Bảng 3.18: Số liệu phổ 1H - NMR (500MHz) và

13C- NMR (125 MHz)

của chất ND8 và ND9 trong CD3OD

Vị trí ND8 ND9

δC δH (J = Hz) δC δH (J = Hz)

1 39,80 1,62-1,59 m; 1,03-1,00 m 39,81 1,63-1,61 m; 1,03-1,00 m

2 27,08 1,98-1,97 m; 1,78-1,76 m 27,08 1,99-1,97 m; 1,78-1,73 m

3 92,31 3,23 (dd; J = 10,5; 4,0) 92,31 3,23 dd (J = 12,0; 4,5)

4 40,58 - 40,57 -

5 57,01 0,81-0,79 m 57,01 0,81 -0,79 m

6 19,33 1,62-1,59 m; 1,43-1,42 m 19,32 1,53-1,50 m; 1,43-1,41 m

7 34,02 1,56-1,52 m; 1,23-1,20 m 34,00 1,53-1,50 m; 1,34-1,31 m

8 40,50 - 40,50 -

9 49,51 1,61-1,59 m 49,51 1,59-1,56 m

10 37,89 - 37,88 -

11 24,54 1,92-1,91 m 24,54 1,93-1,91 m

12 123,55 5,26 (brs) 123,55 5,26 (brs)

13 145,32 - 145,33 -

14 42,91 - 42,90 -

15 28,88 1,78-1,76 (m); 1,17-1,13

(m)

28,87 1,78-1,76 m; 1,17-1,13 m

16 24,14 2,00-1,98 m; 1,56-1,52 m 24,21 1,98-1,97 m; 1,59-1,56 m

17 48,49 - 48,49 -

18 42,75 2,87 (d; J = 11,5) 42,88 2, 89 (d; J = 12,0)

19 47,34 1,71-1,68 m; 1,17-1,13 m 47,34 1,71-1,68 m; 1,17-1,13 m

20 31,62 - 31,63 -

21 34,96 1,43-1,41 m; 1,23-1,20 m 34,96 1,43-1,41 m; 1,23-1,208 m

22 33,90 1,52-1,50 m; 1,34-1,32 m 34,01 1,53-1,50 m; 1,34-1,31 m

23 28,32 1,09 s 28,28 1,09 s

24 16,83 0,88 s 16,84 0,89 s

25 15,90 0,97 s 15,91 0,97 s

26 17,78 0,84 s 17,78 0,84 s

27 26,39 1,17 s 26,39 1,17 s

28 181,90 - 181,90 -

29 33,59 0,92 s 33,60 0,92 s

30 24,00 0,96 s 24,00 0,96 s

-OCOCH3 172,57 -

-OCOCH3 20,63 2,08 s

Đường

Glc-1’ 103,74 4,49 (d; J = 8,0) 105,55 4,49 (d; J = 8,0)

2’ 75,96 3,75-3,73 m 78,54 3,74 (m)

3’ 78,57 3,64 (t, J = 9,5) 87,95 3,70 (t, J = 9,0)

4’ 82,13 3,75 (t, J = 9,5) 72,55 3,09 (t, J = 9,5)

5’ 77,99 4,21 (dt; J = 6,5; 3,0) 78,32 3,31-3,29 m

6’ 65,01 4,35 (dd; J = 11,5; 3,0)

4,16 (d, 11,5)

63,66 3,88-3,83 m

3,67 (dd; J = 12,0; 5,0)

Xyl-1’’’ 105,03 4,61 (d; J = 7,5)

19

2’’’ 75,27 3,26-3,28 m

3’’’ 78,27 3,29-3,28 m

4’’’ 77,65 3,52-3,54 m

5’’’ 67,17 3,94 (dd; J = 11,5; 5,5)

3,28-3,31 m

Glu-1’’ 103,18 4,99 (d; J = 7,5)

2’’ 76,19 3,15 (t; J = 9,5)

3’’ 78,43 3,29-3,28 m

4’’ 70,99 3,08 (t; J = 9,5)

5’’ 78,53 3,33-3,31 m

6’’ 62,74 3,84-3,83 m; 3,58-3,55 m

Gal-1’’’ 105,38 5,24 (d; J = 2,0)

2’’’ 72,46 3,23-3,18 m

3’’’ 78,26 3,41-3,39 m

4’’’ 70,19 3,09 (t; J = 9,5)

5’’’ 77,58 3,66-3,65 m

6’’’ 63,67 3,87-3,83 m; 3,59-3,56 m

Ara-1’’ 110,93 4,73 (d; J = 8,0)

2’’ 83,32 3,67-3,66 m

3’’ 78,31 3,89-3,88 m

4’’ 87,86 3,62-3,54 m

5’’ 62,76 3,89-3,88 m; 3,73-3,72 m

Hợp chất ND9: (chất mới):

Chất ND9 được phân lập dưới dạng rắn màu trắng. Phổ khối ESI-MS cho

pic ion tại m/z 935,4 [M+Na]+. Phổ khối phân giải cao HR - ESIMS cho pic ion

tại m/z 935,4929 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức phân tử

C47H76O17Na là 935,4980). Các tín hiệu phổ 1H- và

13C- NMR của chất ND9 và

chất ND8 rất giống nhau. Phần aglycol là hoàn toàn trùng khớp còn phần đường

cho tín hiệu của một đường trisaccharid với ba proton anomer tại δH 4,49 (d; J =

8,0); 4,61 (d; J = 7,5) và 4,99 (d; J = 7,5) và ba carbon anomer tại δC 105,55 và

105,03 và 103,18. So sánh số liệu phổ phần đường của chất ND9 với chất ND7 và

trên cơ sở phân tích phổ hai chiều COSY, HSQC, HMBC và ROESY cho phép

xác định gốc trisaccharid là β-D-glucopyranosyl (1→2)-β-D-xylopyranosyl

(1→3)-β-D-glucopyranosyl. Phổ HMBCcủa chất ND9 cho thấy các tương tác

giữa H1’’’(δH 4,61; d; J = 7,5 Hz) với C-3’ (δC 87,95); H-1’’(δH 4,99; d; J =

7,5Hz) với C-2’ (δC 78,53); H5’’’(3,94 axial; dd; J = 5,5; 11,5 Hz) với C-4’’’ (δC

69,88), C-1’’’ (δC 105,03); Điều này chứng tỏ phân tử β-D-xylopyranose gắn với

C-3’ còn phân tử β-D-glucopyranose thứ hai gắn với C-2’. Ngoài ra còn quan sát

thấy tương tác giữa H-2’ (3,74; m) với C-3’(δC 87,95), C-1’’(δC 105,03); H-2’’(δH

3,15; t; J = 9,5) với C-3’’(δC 78,43) và C-1’’(δC 103,18); H-4’(δH 3,09; t; J = 9,5

Hz) với C-5’(δC 77,65), C-6’(δC 63,66). Phù hợp với kết quả ở phổ HMBC, phổ

20

H, H- COSY của chất ND9 cho thấy tương tác giữa H-1’’(δH 4,99; d; J = 7,5) với

H-2’’(δH 3,15; t; J = 9,5); giữa H-1’’’(δH 4,61; d; J = 7,5 Hz) và H-2’’’(δH 3,26-

3,28; m); giữa H-1’(δH 4,49; d; J = 8,0 Hz) với H-2’(δH 3,74; m); giữa H-5’’’(δH

3,94; dd; J = 5,5; 11,5 Hz) với H-4’’’(δH 3,52-3,54; m). Còn trong phổ ROESY có

tương tác giữa H-1’’(δH 4,99; d; J = 7,5 Hz) với H-2’(δH 3,74; m); giữa H-1’’’(δH

4,61; d; J = 7,5 Hz) với H-3’(δH 3,70; t; J = 9,0 Hz); giữa H-1’(δH 4,49; d; J = 8,0

Hz) với H-3 (δH 3,23; dd; J = 4,5; 12,0 Hz).

Hình 3.44: Phổ dãn HMBC của chất ND9

Từ các số liệu phân tích ở trên, mạch đường của chất ND9 được xác định là: β-

D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside và chất

ND9 có cấu trúc là; 3-O-[β-D-glucopyranosyl–(1→2)-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-β-

D-glucopyranosyl-]-oleanoic acid. Đây là chất mới và được đặt tên là Lepisantheside

B. Số liệu phổ NMR của chất ND9 được đưa ở (Bảng 3.18).


Chất ND10 được phân lập dưới dạng rắn màu trắng. Phổ khối ESI-MS

cho các pic tại m/z 963,4 [M+Na]+ và 939,4 [M-H]

- Phổ khối phân giải cao HR-

ESI-MS cho pic ion tại m/z 963,4314 [M+Na]+

(tính toán lý thuyết cho công thức

phân tử C43H72O22Na có m/z 963,4314). Khi tìm hiểu tài liệu tham khảo chúng tôi

thấy rằng Adesamya và cs. [132] đã phân lập từ vỏ cây Nhãn dê (L. rubiginosa)

thu hái tại Yên châu, tỉnh Sơn La, Việt Nam một tetrasaccharide của farnesol và

đặt tên là rubiginoside. So sánh số liệu phổ NMR của chất ND10 với chất

rubiginoside chúng tôi thấy phần aglycone của ND10 hoàn toàn giống với

aglycone của rubiginoside là farnesol. Sự khác nhau chính là ở phần đường. So

21

sánh phần mạch đường giữa hai chất thì thấy mạch đường của chất ND10 có thêm

một phân tử monosaccharide. Tức là ND10 là một pentasaccharide của farnesol.

Khi so sánh kỹ hơn các tín hiệu cộng hưởng trong phổ NMR của mạch đường có

thể thấy rằng phân tử monosaccharide thứ 5 của chất ND10 là một α-L-

arabinopyranosyl. Các số liệu của mạch đường được xác định cụ thể như sau:

δC/δH 105,46/4,38 (d; J = 7,0 Hz) [Ara I C-1/H-1]; 106,29/4,52 (d; J = 7,0 Hz)

[Ara II C-1/H-1]; 102,19/4,77(s) [Rha I C-1/H-1]; 102,62 /5,19 (s) [Rha II C-1/H-

1]; 101,17/4,40 (d; J = 8,0 Hz) [Gluc C-1/H-1]. Như vậy mạch đường của chất

ND10 gồm một phân tử β-D-glucopyranose, hai phân tử α-L-rhamnopyranose và

hai phân tử α-L-arabinopyranose. Hai phân tử α-L-arabinopyranose được chứng

minh bởi các tín hiệu cộng hưởng tại δC/δH: 67,60/3,64 (trùng lặp) 3,95 (brd; J =

12,5 Hz) [C-5/H-5 Ara-I] và 67,12/3,61 (trùng lặp), 3,90 (brd; 12,5) [Ara II C-

5/H-5]. Vấn đề còn lại là các phân tử monosaccharide kết nối với nhau như thế

nào trong mạch đường. Câu hỏi này được làm sáng tỏ khi phân tích kỹ phổ

HMBC; H, H - COSY và NOESY của chất ND10. Trong phổ HMBC ta thấy rõ

tương tác (pic giao) giữa δH 4,40 (d; J = 8,0) (Glc H-1) và 66,02 farnesyl-C-1) và

87,19 (Glc C-3) cho thấy phần đường glucopyranose gắn với carbon C-1 của

aglycone (farnesol). Ngoài ra còn thấy tương tác giữa H-1 farnesol (δH 4,32; dd; J

= 11,5; 6,5 Hz) với C1-glc (δc 101,17), C-2, C-3-farnesol (δc 121,05) và 142,62.

Một phân tử rhamnopyranose được gắn với C-6 của glucopyranose, điều này

được chứng minh qua pic giao (cross peak) trong phổ HMBC giữa H1-Rham I [δH

4,77(s)] với C6-glc (δc 67,84), C-5-Rham I (δc 69,79), C2-Rham I (δc 72,17) cũng

như C1-Rham I (δc 102,19) với H6a-glc [δH 4,00) (brd; J = 11,0 Hz) trong phổ

HMBC (C→H) cũng như tương tác giữa H1-Rham I với H-2 Rham I (δH 3,83

brs) trong phổ NOESY. Phân tử rhamnopyranose thứ 2 (Rham II) được gắn với

C2-glc thể hiện qua tương tác H1-Rham II [δH 5,19 (s)] với C2-glc (δc 79,81) và

C2-Rham II (δc 71,75); C3-Rham II (δc 82,12). Phân tử α-L-arabinopyranose thứ

nhất được gắn với phân tử Rham II ở vị trí C3-Rham II thông qua tương tác trong

phổ HMBC (H→C) giữa H1-Ara I [δH 4,52 (d; J = 7,0 Hz)] với C3-Rham II (δc

82,12) cũng như tương tác giữa C1-Ara I (δc 106,29) với H3-Rham II [δH 3,73

(dd; J = 3,0; 9,5 Hz)], H2-[Ara I (δH 3,67 (m)]; giữa C3-Rham II (δc 82,12) với

H1-Rham II (δH 5,19), H1-Ara II (δH 4,52), H2-Rham II (δH 4,21 br. s); trong phổ

HMBC (C→H). Phân tử α-L-arabinopyranose thứ hai (Ara II) được gắn với

nguyên tử C3-glc thông qua tương tác giữa H1-Ara II [δH 4,52 (d; J = 7,0; Hz)]

với C3-glc (δc 87,19) trong phổ HMBC (H→C) cũng như tương tác giữa C1-Ara

II (δc 106,29) với H2-Ara II [δH 3,67 (m)], H5-Ara II [δH 3,90 (brd; J = 12,5 Hz)]

và giữa C3-glc (δc 87,19) với H2-glc [δH 3,52 (t; J = 8,0 Hz)], H1-glc [δH 4,40 (d;

J = 8,0 Hz)], H1-Ara II [δH 4,52 (d; J = 7,0 Hz)] trong phổ HMBC (C→H).

22

Hình 3.53: Phổ HMBC giãn của chất ND10- CD3OD

Như vậy, cấu trúc của chất ND10 được xác định là 1-O-α-L-rhamnopyranosyl

(1→6)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2) [α-L-arabinopyranosyl (1→3)]-α-L-

arabinopyranosyl (1→3)]-β-D-glucopyranosyl all-trans-farnes-1-ol. Đây là một

chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên và được đặt tên là

Lepisantheside C. Số liệu phổ NMR của chất ND10 và chất rubiginoside trong tài

liệu [132] được đưa ở (Bảng 3.19).

Bảng 3.19: Số liệu phổ 1H - NMR (500MHz) và

13C- NMR (125 MHz)

của chất ND10 và ND11 trong CD3OD

Vị trí ND10

Rubiginoside

[132] ND11

δc δH δc δH δc δH

1 66,02 4,32 dd (11,5;

6,5; 4,23)

66,9 4,20 dd (7,0; 7,0)

4,30 dd (8,0; 8,0)

66,13 4,22 chồng lấp

4,33 dd; (6,0;

11,5)

2 121,05 5,41 t (6,5) 121,9 5,38; t; (7,0) 121,14 5,42 t (6,5)

3 142,62 143,5 142,49

4 40,67 2,10 t (7,5) 41,6 2,10 (m) 40,65 2,10 d (6,0)

5 27,36 2,13 m 28,2 2,15 (m) 27,40 2,17 t (7,0)

6 125,20 5,11-5,17

(trùng lặp)

126.0 5,05 t (7,0) 125,30 5,19 s

7 136,31 137,2 136,19

8 40,89 2,01 t (7,5) 41,8 2,00 (m) 40,65 2,10 d (6,0)

9 27,84 2,10m 28,7 2,10 (m) 27,40 2,17 t (7,0)

23

10 125,42 5,11-5,17 m

(trùng lặp)

126,3 5,09 t (7,0) 125,88 5,19 trùng lặp

11 132,17 133,0 34,53 1,61 m

12 25,94 1,69 s 26,9 1,67 s 111,53 4,93 s; ≈ 4,80

trùng dung môi

13 17,82 1,62 s 18,7 1,60 s 18,05 1,73 s

14 16,1 1,64 17,1 1,61 s 16,24 1,73 s

15 16,60 1,73 17,5 1,71 s 16,64 1,63 s

Glc

1’ 101,17 4,40 d; (8,0) 102,0 4,38 d (8,0) 101,22 4,40 d (7,5)

2’ 79,81 3,52 t (8,0) 80,6 3,45 dd (8,0; 8,0) 79,81 3,52 t (8,5)

3’ 87,19 3,65 m 88,3 3,65 87,20 3,61 m

4’ 70,04 3,40 m 70,7 3,40 70,08 3,40 m

5’ 76,28 3,41-3,70 m 77,1 3,40 76,32 3,41-3,60 m

6’ 67,84 3,63 m

4,00 d (11,0)

68,6 3,98 67,88 4,00 d (10,5)

3,65 m

RhamI

1’’ 102,19 4,77 brs 103,0 4,75 brs 102,22 4,77 s

2’’ 72,17 3,85 brs 73,0 3,85 72,19 3,85 brs

3’’ 72,36 3,56 m 73,2 3,68 dd 9,0; 4,0) 72,39 3,60 m

4’’ 72,92 3,56-3,70 m 74,9 3,40 72,94 3,52-3,80 m

5’’ 69,79 3,67 m 70,6 3,68 69,81 3,66 m

6’’ 18,05 1,29; (d; 6,0) 19,0 1,27 (d 6,0) 18,05 1,24 (d 6,0)

RhamII

1’’’ 102,62 5,19 s 103,8 5,15 s 102,61 5,19 s

2’’’ 71,75 4,21 brs 72,9 3,98 71,75 4,21 brs

3’’’ 82,12 3,73 dd (3,0;

9,5)

74,0 3,65 82,12 3,73 dd (3,0;

9,5)

4’’’ 74,03 3,38 74,7 3,40 74,08 3,40 m

5’’’ 69,79 4,07 dd (6,0;

9,5)

72,7 3,98 69,81 4,06 dd (6,0;

10,5)

6’’’ 18,05 1,24 d (6,0) 18,9 1,21 d (6,0) 18,05 1,29 d (6,0)

AraI

1’’’’ 105,46 4,38 d (7,0) 106,3 4,36 d (7,0) 105,45 4,38 d (8,5)

2’’’’ 72,17 3,62 m 74,3 3,65 72,39 3,60 m

3’’’’ 74,41 3,55 75,2 3,55 dd (9,0; 3,0) 74,43 3,56

4’’’’ 69,79 3,86 70,6 3,85 69,81 3,90

5’’’’ 67,60 3,64; 3,95 br d

(12,5)

68,6 3,65 67,60 3,62; 3,95 dd

(2,0; 12,5)

AraII

1’’’’’ 106,29 4,52 d (7,0) 106,25 4,52 d (7,0)

2’’’’’ 72,36 3,67 m 72,39 3,65 m

3’’’’ 74,07 3,55 m 74,08 3,55 m

4’’’’’ 69,68 3,83 m 69,67 3,82 m

5’’’’’ 67,12 3,90 br d (12,5)

3,61 m

67,11 3,89 br d(12,0)

3,62 m

24


Chất ND11 được tách ra ở dạng màu trắng vô định hình. Phổ khối ESI-MS

ion dương của ND11 cho pic ion tại m/z 979; Phổ khối phân giải cao ion dương có

pic ion tại m/z 979,41760 (tính toán lý thuyết cho công thức phân tử C43H72O22K là

979,41469). Như vậy công thức của chất ND11 sẽ là C43H72O22 với khối lượng phân

tử là 940. Như thế có thể dự đoán chất ND11 là một đồng phân của chất ND10. Khi

xem xét phổ 1H và

13C-NMR (PL 29) có thể thấy rằng chất ND11 cũng chứa năm

đơn vị monosaccharide. Thành phần và vị trí kết nối giữa năm đơn vị đường với

nhau và với phần aglycone (phân tử farnesol) cũng hoàn toàn giống với chất ND10.

Chất ND10 và ND11 cũng rất sát nhau khi quan sát trên sắc ký bản mỏng với thuốc

thử vanilin/H2SO4 đặc và hơ nóng. Sự khác nhau giữa ND10 và ND11 là ở vị trí

liên kết đôi trong phần aglycone (farnesol).

Ngoài hai nhóm methyl của hai phân tử đường α-L-rhamnopyranose tại δH

1,24 và 1,29 (mỗi tín hiệu gồm 3H; d; J = 6,0 Hz) thì phổ 1H-NMR của ND11 chứa ít

hơn ND10 một nhóm methyl, cụ thể tại δH 1,65ppm (3H; s); 1,73 ppm (6H; s). Thay

vào nhóm methyl thứ tư thì chất ND11 có nhóm methylene (=CH2) tại δH 4,93 (s), ≈

4,80 (trùng với dung môi CD3OD, và δc 111,53. Đồng thời chất ND11 còn có nhiều

hơn ND10 một nhóm methylen alkan thể hiện tại δc 34,53; δH 1,61 (m). Các thông tin

này gợi ý rằng, nhóm isopropyl -CH(CH3)2 [C-11; C-12; C13] trong chất ND10 đã

chuyển thành nhóm isopropylen –C=CH2-CH3 ở chất ND11. Tín hiệu của carbon C-

11 cũng được chuyển dịch về phía trường thấp hơn tại δc 148,85. Điều này được

chứng minh thêm qua phổ HMBC (H→C) cũng như (C→H) của ND11. Trên phổ

HMBC của ND11 thấy có tương tác giữa H-13 (δH 1,73) với C-12 (δc 111,53), C-11

(δc 148,53) (Hình 3.57). Từ các số liệu trên có thể kết luận rằng, cấu trúc của chất

ND11 là 1-O- α-L-rhamnopyranosyl (1→6)-α-L rhamnopyranosyl (1→2) [α-L-

arabinopyranosyl (1→3)]- α-L-arabinopyranosyl (1→3)-β-D-glucopyranosyl all-

trans-farnes-2,6,11 (12)-en-1-ol. Đây là một chất mới và được đặt tên là

Lepisantheside D. Số liệu phổ NMR của chất ND11 được đưa ở (Bảng 3.19).

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH

Kết luận

● Thành phần hóa học của loài Bời lời nhớt [Litsea glutinosa (Lour.) Rob.]

- Từ mẫu thu hái tại tỉnh Thừa Thiên – Huế: đã chiết tách và xác định cấu

trúc hóa học của 14 hợp chất trong đó có 7 alkaloide khung aporphin, 4 flavonoid

glycoside, hai megastigmane và một sterol.

- Từ mẫu thu hái tại Thái Nguyên đã chiết tách và xác định cấu trúc hóa

học của 10 hợp chất trong đó có 03 alkaloide khung aporphin (2 chất trùng với

mẫu Thừa Thiên -Huế), số còn lại là các dẫn xuất của acid và alcol béo.

- Có 15 chất từ hai mẫu này lần đầu tiên được phân lập từ loài Bời lời nhớt

(Litsea glutinosa).

25

● Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Nhãn dê

(Lepisanthes rubiginosa (Roxb.) Leenh.)

- Đã chiết tách và xác định cấu trúc hoa học của 11 hợp chất, trong đó có

04 chất mới là các glycoside của acid oleanoic [Lepisanthes A (ND8), B (ND9)]

và 02 chất mới là các pentaglycoside của farnesol [Lepisanthes D (ND10), C

(ND11)] và 9 chất lần đầu tiên được phân lập từ loài này.

● Về hoạt tính sinh học

- Đã thử hoạt tính hạ đường huyết trên động vật thực nghiệm của dịch chiết

EtOH 80% của mẫu Bời lời nhớt thu tại Thừa Thiên -Huế. Kết quả cho thấy: với

liều 250 và 500mg dịch chiết /kg thể trọng chuột thì hoạt tính hạ đường huyết có ý

nghĩa thống kê với nhóm đối chứng. Trong đó liều 500mg dịch chiết /kg thể trọng

chuột hoạt tính tương đương thuốc Acarbose liều 5mg/kg thể trọng.

- Đã xác định được độc tính cấp của dịch chiết EtOH 80% của mẫu Bời lời

nhớt Thừa Thiên- Huế với liều LD50 là 20g/kg thể trọng và thuộc loại không có độc.

- Đã thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư, hoạt tính kháng oxy hóa và hoạt tính

ức chế enzym α- glucosidase của 11 chất sạch tách được. Một số chất có hoạt tính ở

mức trung bình đến khá. Dịch chiết BuOH của loài Nhãn dê thể hiện hoạt tính ức chế

tốt cả 4 dòng tế bào ung thư thưe nghiệm là KB, HepG2, MCF-7 và Lu-1.

Kiến nghị:

● Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hạ đường huyết của chế phẩm bằng cách

tiến hành thêm một số thí nghiệm sinh hóa đánh giá tác động của dịch chiết cồn

nước từ vỏ của loài Bời lời nhớt trên chuột thí nghiệm, tạo tiền đề ứng dụng sản

phẩm của đề tài làm thuốc hạ đường huyết.

● Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của các chất sạch phân lập từ loài

Nhãn dê (Lepisanthes rubiginosa (Roxb.) Leenh).

Những đóng góp mới của luận án.

- Xác định được thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Bời lời

nhớt (Litsea glutinosa (Lour.) Rob.) thu hái tại Thái Nguyên và Thừa Thiên Huế

cho thấy:

+ Mẫu thu hái tại Thừa Thiên Huế có thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học đa dạng hơn so với mẫu thu hái tại Thái Nguyên

- Trong 21 hợp chất phân lập được từ loài (Litsea glutinosa (Lour.) Rob.)

có 15 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài nghiên cứu.

- Lần đầu tiên công bố về các hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống oxi

hóa và hoạt tính hạ đường huyết của các chất sạch phân lập từ loài Bời lời nhớt.

- Trong 11 hợp chất phân lập được từ loài Nhãn dê (Lepisanthes rubiginosa

(Roxb.) Leenh.) có 4 chất mới và 9 chất lần đầu tiên được phân lập từ loài này.

Lần đầu tiên công bố về hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Nhãn dê.

26

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

L Ê Q ĐẾN LUẬN ÁN

1. Phạm Thị Ninh (2015), “Chemical constituents of the barks of Litsea

glutinosa collected in Thai Nguyen province, Vietnam”, Vietnam Journal

of Chemistry, 53(5) 652-656.

2. Phạm Thị Ninh (2017), “Về thành hóa học từ dịch chiết etyl axetat của cây

Nhãn dê (Lepisanthes rubiginosa) thu hái tại huyện Phú Lộc tỉnh Thừa

Thiên - Huế”, Tạp chí Hóa học, 53 (1): 1-5.

3. Pham Thi Ninh (2017), “Chemical constituents, cytotoxic and alpha-

glucosidase inhibitory activity of the isolated compound from Litsea

glutinosa collected in Thua Thien Hue province, Vietnam”, Accepted by

Chemistry of Natural Compounds.

4. Phạm Thị Ninh (2018), “Hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của cây Bời

lời nhớt (Litsea glutinosa) thu hái tại tỉnh Thái Nguyên và Thừa Thiên Huế”,

Tạp chí Hóa học, 56 (1), tr.60-64.

5. Tran Van Loc, Pham Thi Ninh, Tran Thi Phuong Thao, Tran Van Sung. Two

new oleanolic acid glycoside from Lepisanthes rubiginosa, a mangrove

plant collected from the beach of Thua Thien - Hue province, Vietnam, Nat.

Prod. Res. 2018, submitted.

TÓM T ẬN ÁN TIẾ ỌC

Documents