TM 05 Sel Inang Dan Vektor Kloning (Biologi Molekuler 2014)

1

SEL INANG DAN VEKTOR

2

Learning Outcome (LO)

LO 21: menjelaskan sel inang yang digunakan dalam kloning genLO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning genLO 23: menjelaskan transformasi LO 24: menjelaskan transfeksiLO 25: menjelaskan metode mikroinjeksi dan biolistik

3

Tiga hal yang harus dilakukan untuk mengisolasi gen tertentu dari koleksi urutan DNA rekombinan: molekul rekombinan individu harus secara fisik

terpisah satu sama lain, urutan rekombinan harus diperbanyak untuk

menyediakan cukup bahan untuk analisis lebih lanjut

fragmen target tertentu harus dipilih melalui metode yang didasarkan atas urutan basa spesifik.

Kloning gen berkaitan dengan pemilihan dan penggunaan: vektor (molekul pembawa) sel inang (host) di mana vektor dapat diperbanyak.

Sel Inang dan Vektor

LO 21: menjelaskan sel inang yang digunakan dalam kloning gen

4

Tipe sel inang


Jenis sel inang yang digunakan untuk aplikasi tertentu tergantung terutama pada tujuan percobaan kloning. Jika untuk mengisolasi gen untuk analisis struktur,

maka gunakan sistem yang sederhana dan mudah Jika untuk mengekspresikan informasi genetik dalam

eukariot tingkat tinggi seperti tanaman, maka gunakan sistem yang lebih spesifik

5

Tipe sel inang


6

Sel inang ideal harus: mudah ditangani dan ditumbuhkan (propagasi) tersedia dalam berbagai galur (strain) genetik dapat menerima berbagai vektor

Escherichia coli memenuhi persyaratan sebagai sel inang yang ideal

Bakteri lain yang dapat digunakan sebagai sel inang untuk eksperimen kloning gen: Bacillus Pseudomonas Streptomyces

Sel inang prokariotik


7

Salah satu kelemahan menggunakan E. coli sebagai sel inang untuk kloning gen eukariotik: gen eukariotik tertentu mungkin tidak berfungsi dalam E. coli sel inang prokariotik mungkin tidak menghasilkan protein

eukariotik yang berfungsi penuh.Sel inang eukariotik:

Yeast (S. cerevisiae)Aspergillus nidulansNeurospora crassaAlgae (Chlamydomonas reinhardtii )Plant cellsAnimal cells

Sel Inang Eukariotik

LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen

8

Tipe vektor

Plasmid Bakteriofaga (faga) Cosmid Phagemid (phasmid) Yeast episomal plasmids (YEps) Yeast integrative plasmids (YIps) Yeast replicative plasmids (YRps) Yeast centromere plasmids (YCps) Yeast artificial chromosomes (YACs) Bacterial artificial chromosomes (BACs)

Vektor berukuran cukup kecil asal replikasi (ori) penanda seleksi minimal satu situs restriksi

Fitur penting vektor


9

ditemukan di alam pada bakteri dan beberapa ragi. molekul DNA sirkular ekstrakromosomal. sering memberi ciri-ciri (seperti resistensi antibiotik)

pada organisme inang. Gen-gen resistensi antibiotik dikode oleh DNA plasmid

(pDNA) sering digunakan dalam konstruksi vektor Penamaan plasmid:

P = menunjuk plasmid, dan ini biasanya diikuti dengan inisial pembuatnya (s)

bilangan digunakan untuk mengklasifikasikan isolat khusus.

Contoh: pBR322 dikembangkan oleh Francisco Bolivar dkk

Plasmid


10

Fitur plasmid pBR322 Berat molekul rendah Gen-gen resisten antibiotik asal replikasi (origin of replication, ori) Beberapa situs pengenalan enzim restriksi

tunggal

Plasmid pBR322

Fig. 5.1. Map of plasmid pBR322. Important regions indicated are the genes for ampicillin and tetracycline resistance (Apr and Tcr) and the origin of replication (ori). Some unique restriction sites are given. The hatched region shows the two fragments that were removed from pBR322 to generate pAT153.


11

memiliki ori memiliki gen resisten ampisilin memiliki gen lacZ (fragmen -

peptida dari -galactosidase) untuk skrining klon rekombinan

memiliki polylinker atau multiple cloning sites (MCS) di dalam gen lacZ

Skrining klon rekombinan menggunakan substrat X-gal

Plasmid pUC18

Fitur plasmid pUC18

Fig. 5.2. Map of plasmid pUC18.


12

13

Note: There are hundreds of variants available from many different suppliers. A good source of information is the supplier’s catalogue or website. Apr–ampicillin resistance; Tcr–tetracycline resistance; Neor–neomycin resistance (selection using kanamycin in bacteria, G418 in mammalian cells); MCS – multiple cloning site; SP6/T7 are promoters for in vitro transcription; lacZ – -galactosidase gene; CMV – human cytomegalovirus. The terms pGEM, pCI and pCMV-Script are trademarks of the suppliers.


14

Bakteriofaga digunakan sebagai vektor kloning karena kemampuannya memasukkan (menginfeksikan) DNA ke bakteri.

Dua jenis bakteriofaga, dan M13, banyak digunakan untuk kloning.

Bakteriofaga (Faga)

Fig. 5.3. Structure of bacteriophages and M13. Fag memiliki kapsid atau kepala yang membungkus genom DNA beruntai ganda. Daerah ekor diperlukan untuk adsorpsi ke sel inang. M13 memiliki struktur yang lebih sederhana, dengan genom DNA beruntai tunggal yang dibungkus dalam mantel (coat) protein.


15

Bakteriofaga Pemanfaatan fag sebagai vektor kloning didasarkan pada kenyataan

bahawa tidak semua dari genom sangat penting bagi fungsi faga.

Fig. 5.4. Peta genom faga . Beberapa gen ditunjukkan. Daerah fungsional ditunjukkan oleh garis horizontal. Daerah non-esensial (blok hitam) dapat dimanipulasi dalam konstruksi vektor.

Panjang genom faga = 48.5 kb, berisi 46 gen.

Pada kedua ujung genom linier terdapat daerah untai tunggal (12 basa) yang dikenal sebagai situs cos (cos site.


16

(a) Vektor insersi (insertion vector) ditunjukkan dalam bagian i. Vektor tersebut memiliki situs restriksi tunggal (RS). Untuk menghasilkan DNA rekombinan, fragmen DNA dimasukkan ke situs ini. Ukuran fragmen yang dapat disisipkan ditentukan oleh perbedaan antara ukuran vektor dan ukuran fragmen maksimum packagable (Max).

(b) Sebuah vektor pengganti (replacement vector) ditunjukkan pada bagian i. Vektor ini memiliki situs restriksi dua (RS) yang mengapit sebuah wilayah yang dikenal sebagai fragmen stuffer. Jadi bagian dari genom faga diganti fragmen DNA, seperti yang ditunjukkan pada bagian ii. Pendekatan ini memungkinkan kloning fragmen DNA yang lebih besar.

Bakteriofaga dibagi dalam dua kelas utama:(i) Vektor insersi (Contoh: gt10 and Charon 16A)(ii) Vektor pengganti (substitusi) (Contoh: EMBL4 and Charon 40)

Fig. 5.7. Insertionand replacement phage vectors


17LO 22: menjelaskan vektor yang digunakan dalam kloning gen

18

Genom M13: DNA beruntai tunggal sirkular berukuran 6407 basa.

Faga hanya akan menginfeksi E. coli yang memiliki F-pili.

Ketika DNA memasuki sel, DNA untai tunggal akan diubah menjadi DNA beruntai ganda yang dikenal sebagai bentuk replikatif atau RF.

Genom untai tunggal diproduksi dan dikeluarkan dari sel sebagai partikel M13.

Bakteriofaga M13

Fig. 5.10. Map of the filamentous phage vector M13mp18. The double-stranded replicative form is shown. The polylinker region (MCS) is the same as that found in plasmid pUC18 (Fig. 5.2). Genes in the REP region encode proteins that are important for DNA replication. The CAP and MOR regions contain genes that specify functions associated with capsid formation and phage morphogenesis, respectively. The vector M13mp19 is identical except for the orientation of the polylinker region.



20

Cosmid merupakan gabungan plasmid situs cos fag . Berukuran 4-6 kb, karena itu dapat mengakomodasi

fragmen DNA 47 kb. Bersifat seperti plasmid dalam E. coli. kapasitas kloning dua kali lipat lebih besar daripada

vektor pengganti (replacement vector). Phagemid (phasmid): vektor hibrid plasmid/faga f1

Contoh: ZAP pEMBL9 pBluescript

Cosmid dan Phagemid (phasmid)




23

Berbagai vektor yang digunakan dalam sel ragi telah dikembangkan. Yeast episomal plasmids (YEps) didasarkan atas plasmid 2 m

ragi, dan dapat mereplikasi secara mandiri atau mengintegrasikan ke kromosom.

Yeast integrative plasmids (YIps) dirancang untuk mengintegrasi ke kromosom dalam cara yang mirip dengan plasmid YEp,

Yeast replicative plasmids (YRps) tetap sebagai plasmid independen dan tidak mengintegrasikan

Yeast centromere plasmids (YCps) mengandung urutan dari seluruh wilayah sentromerik dari kromosom dan perilaku dasarnya sebagai minikromosom.

Vektor yang digunakan dalam sel eukariotik


24

Tujuan rekayasa genetika pada eukariota tingkat tinggi ada dua: untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel tanaman

dan hewan dalam kultur jaringan, untuk penelitian dasar pada ekspresi gen atau untuk produksi protein

untuk mengubah susunan genetik organisme dan menghasilkan transgenik, di mana semua sel akan membawa modifikasi genetik.

Vektor yang digunakan untuk sel tumbuhan dan hewan dapat dimasukkan ke dalam sel langsung dengan teknik tertentu virus atau agen infeksi lainnya seperti Agrobacteria.

Beberapa contoh dari jenis sistem yang telah digunakan dalam pengembangan vektor untuk sel tumbuhan dan hewan diberikan dalam Tabel 5.5.



26

Pengembangan vektor untuk kloning fragmen DNA berukuran sangat besar adalah penting untuk memungkinkan proyek-proyek sekuensing genom besar..

YACs memungkinkan fragmen DNA berukuran megabase dapat dikloning

YACs memiliki daerah centromeric dan telomeric.

DNA rekombinan dipertahankan sebagai kromosom ragi..

Yeast artificial chromosomes (YACs)

Fig. 5.11. Map of the yeast artificial chromosome vector pYAC2


27

BAC didasarkan pada plasmid F, yang jauh lebih besar dari vektor kloning plasmid standar sehingga mempunyai potensi untuk mengkloning fragmen berukuran lebih besar.

BAC dapat disisipi fragmen DNA dari sekitar 300 kb BAC lebih stabil dibanding YACs dalam sel inang bakteri. Sebagian besar urutan genom manusia telah dicapai dengan

menggunakan perpustakaan BAC rekombinan.

Bacterial artificial chromosomes (BACs)


28

Transformasi: pengambilan DNA plasmid oleh sel inang Sel inang perlu dibuat kompeten.

sel-sel inang diberi perlakukan kalsium klorida (CaCl2) dingin Transformasi sel kompeten dilakukan

dengan mencampur DNA plasmid dengan sel inkubasi pada es selama 20-30 menit memberikan heat shock singkat (2 menit pada 42 ° C)

Sel-sel transforman biasanya diberi media pertumbuhan (LB cair) dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 60-90 menit.

Sel-sel kemudian ditumbuhkan di media selektif Efisiensi transformasi sekitar 106 atau 107 CFU/g DNA

Transformation

LO 23: menjelaskan transformasi

CFU = colony forming units

29LO 23: menjelaskan transformasi

30

Transfeksi: pemasukan DNA faga ke sel inang bakteri. Pemasukan DNA faga

ke sel E. coli memerlukan packaging in vitro

packaging in vitro memerlukan komponen capsid dan endonuklease

Transfection

LO 24: menjelaskan transfeksi

Fig. 5.12. Phage DNA and packaging(a) A concatemeric DNA molecule composed of wild-type phage DNA (+). The individual genomes are joined at the cos sites. (b) Recombinant genomes ( rec) are shown being packaged in vitro.

31

Sebuah alternatif untuk prosedur transformasi adalah untuk memasukkan DNA ke dalam sel menggunakan jarum yang sangat halus dan menyuntikkan DNA langsung ke inti sel (nukleus).

Teknik ini telah digunakan dengan sukses pada sel tumbuhan dan hewan.

Teknik ini membutuhkan mikromanipulator mekanik dan mikroskop, dan banyak praktek!

Mikroinjeksi

LO 25: menjelaskan metode mikroinjeksi dan biolistik

Fig. 5.13. Microinjection of a protoplast-derived potato cell

32

Teknik penembakan ke dalam sel

Biolistic

LO 25: menjelaskan metode mikroinjeksi dan biolistik

• DNA ini dilapiskan ke microprojectiles, yang dipercepat oleh macroprojectile pada pistol.

• Di halte pelat macroprojectile yang masih dipertahankan dalam ruangan dan microprojectiles membawa ke jaringan target.

Fig. 5.14. Biolistic apparatus

33

Kloning Gen

Vektor

menggunakan

Sel inang

memerlukan

Prokariot Eukariot

• E. coli• B. subtilis

• S. cerevisiae• Sel tanaman• Sel hewan

Memasukan DNA terklon

• Transformasi• Transfeksi• Packaging in

vitro• Mikroinjeksi• Biolistic

• An origin of replication

• Selectable marker(s)

• Single restriction site

• Multiple cloning site

• Expression signals

dimasukkan dalam sel inang

Plasmids Phages Cosmids Phagemids Yeast

artificial chromsomes

Viruses

molekul DNA sirkuler

dibuat secara spesifik

M13

Insertionvectors

• λgt10• Charon

16A

Replacementvectors

• EMBL4• Charon 40

dan

meliputi

seperti seperti

memerlukan metode untuk

seperti

dapat mempunyai

harus mempunyai

dengan cara

dan dapat

tipe lain

berupaseperti

dua tipeyang

seperti seperti

dua tipe

TM 05 Sel Inang Dan Vektor Kloning (Biologi Molekuler 2014)

Documents