Tiziana Alberio [email protected]c/o Lab. di Biochimica e Proteomica Funzionale, 1° piano Fisiopatologia del Sistema Immunitario Modulo di Biochimica 1 e 2 – Le molecole del sistema immunitario: Ig, MHC, TCR 3 – Il Complemento 4 – Citochine e Recettori
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La struttura della molecola è garantita da:Interazioni non covalenti tra domini IgPonti disolfuro tra L e H e tra le regioni C di H (cerniera)
VH
CH1CH2
CH3
VLCL
hinge
Struttura generale di un anticorpo
Struttura generale di un anticorpo
Riconoscimento dell’antigene e funzioni effettrici: funzioni spazialmente separate e indipendenti
Esperimenti di clivaggio proteolitico
Esperimenti di clivaggio proteoliticocerniera: zona più suscettibile
all’attacco proteolitico (tra Cγ1 e Cγ2) La proteolisi con papaina genera:Fab antigen-binding, mantiene la capacità di legare l’AgFc, frammento cristallizzabile
La proteolisi con pepsina interessa la regione C-term della cerniera e genera:Fab’ (Fab+cerniera)F(ab’)2 se vengono mantenuti S-S
Fab e F(ab’)2 utili sperimentalmente: legano
l’Ag ma non hanno funzione effettrice
Il dominio immunoglobulinicoIl dominio immunoglobulinico
≈ 110 a.a. che ripiegano in maniera indipendente 2 strati di foglietto β planare (β sandwich) ciascuno composto da 3-5 β-strands (5-10 a.a.) antiparalleli motivo a chiave greca
Stabilizzato da: ponti disolfuro interazioni idrofobiche tra i due foglietti βConservazione di specifici residui (es. Cys e Trp)
La superfamiglia delle immunoglobuline
La superfamiglia delle immunoglobuline
tutte le molecole che contengono il dominio Ig; mediano funzioni di riconoscimento, adesione e legameomologia di sequenza tutti i geni che codificano per domini Ig si sono evoluti da un gene ancestore comuneEvento precoce: duplicazione genica, con divergenza esoni V e C. Evoluzione: 1) Divergenza “V e C” e TCR (sequenza). 2- Capacità di riarrangiare il DNA (per riconoscimento Ag) La funzione dipende dall’interazione tra domini Ig
MHC
TCR
Ab
C e V in catene leggere (L) e pesanti (H)
C e V in catene leggere (L) e pesanti (H)
V= N-termC= C-term
H: V → 1 dominio C → 3 o 4 domini
L: V → 1 dominio C → 1 dominio
V: la sequenza a.a. differenzia gli Ab prodotti da un clone di linfociti B
Segmenti ipervariabili o CDRSegmenti ipervariabili o CDRComplementarity Determining Region: ≈ 10 a.a.CDR3 il più variabile
N-term C-term
Regioni ipervariabili o CDRRegioni ipervariabili o CDR
Le CDR formano delle anse esposte sulla superficie, strutture chimiche uniche → SPECIFICITA’
Sequenze conservate adiacenti → ripiegamenti del dominio Ig
Cause della diversificazioneCause della diversificazione1) Ricombinazione somatica del DNA: diversità combinatoria
L H
Organizzazione genomica nei geni delle catene leggere e pesanti nell’uomo
Diversi esoni per i diversi domini H
Cause della diversificazioneCause della diversificazione2) Diversità giunzionale
3) Inserzione della regione N
V J
V JOH
V GTCAATG J
TdT inserisce nucleotidi
Rottura del DNA
+
V GTCAATG JLigazione
Introne
Catena H Catena L
Segmenti regione V
1000 300
Segmenti regione D
15 -
Segmenti regione J
4 4
Diversità giunzionale
+++ +
Inserzione regione N
++ -
Mutazione Somatica
+ +
totale 1000x15x4= 6 x 104
300x4= 1.2 x 103
associazione 7.2 x 107
Elisione di nucleotidi (nucleasi)
5 classi, che si differenziano per la regione C della catena pesante:IgM Catena IgD Catena IgG Catena IgA Catena IgE Catena
Classi o isotipi delle IgClassi o isotipi delle Ig
IgG1 Catena
IgG2 Catena
IgG3 Catena
IgG4 Catena
IgA1 Catena
IgA2 Catena
uguale sequenza a.a. all’interno della stessa classe o
sottoclasse
SottoclassiSottoclassi
4C
4C
3C
3C
3C
Diverse funzioni EFFETTRICI
Classi delle IgClassi delle Ig
Funzioni EffettriciFunzioni EffettriciPorzione Fc1- viene riconosciuta da specifici R2-può attivare il complemento3- permette il trasporto attivo dell’Ab (latte, secrezioni, circolo fetale...)
IgM e IgA formano polimeriIgM e IgA formano polimeri
IgM e IgA possono formare multimeri Le IgM formano pentameri nel plasma Le IgA formano dimeri nelle secrezioni mucose (necessario per il trasporto attraverso gli epiteli)Contengono una coda C-term di 18 a.a. con un residuo Cys necessario alla polimerizzazione Un polipeptide aggiuntivo (J: joining) di 15 kDa favorisce la polimerizzazione legando la Cys
Lo switch isotipicoLo switch isotipico
Nel corso delle risposte umorali, il clone di linfociti B stimolato dall’Ag può produrre anticorpi di isotipo diverso (switch isotipico):CH cambia V, e quindi la specificità, no
VDJ riarrangiato si collega ad un gene C più a valle e il DNA frapposto viene eliminato
Regioni di scambio, 5’ di ciascun locus CH con sequenze ripetute altemente conservate
Linfocita B maturo: contemporanea espressione sulla membrana di IgM e IgD, mediante splicing alternativo e poliadenilazione selettiva
Linfocita B attivato: a seconda dello stimolo potrà produrre IgE, IgA o IgG
Occupazione di CD40Citochine
Lo switch isotipicoLo switch isotipico
Classi o isotipi delle IgClassi o isotipi delle Ig
2 classi (o isotipi), che si differenziano per la regione C-term della catena leggera: κ λ
Ogni molecola anticorpale possiede o 2κ o 2λCκ e Cλ sono omologhe tra loro e omologhe a Vκ e a Vλ
Non sono note differenze funzionali60% κ e 40% λ nell’uomo
Sito di legame per l’antigeneSito di legame per l’antigene
VHVL
Ag
Ab
VL+ VH
2 per ogni molecola di anticorpo
Legame all’antigeneLegame all’antigeneLa flessibilità degli anticorpi (grazie alla regione CERNIERA) permette il legame a porzioni di antigeni multivalenti distanti
Cerniera: ≈ 10/60+ a.a.La sequenza assume una conformazione casuale; la molecola fa una torsione tra CH1 E CH2La flessibilità è influenzata anche dalla capacità di VH di ruotare attorno a CH1
Legame all’antigeneLegame all’antigene
Legame reversibile e non covalenteIl contributo di ciascuna forza dipende dalla struttura del sito di legame e da quella del determinante antigenico
forza di legame tra un singolo sito combinatorio e un epitopo antigenico. Si esprime come costante di dissociazione (Kd). Tra 10-7 e 10-11 M.
AFFINITA’:
AVIDITA’: forza di legame complessiva tra Ag e Ab (aumento geometrico) (rilevante per IgM)
isotipi: Riconosciute da Ab anti-isotipo le immunoglobuline dello stesso isotipo di una specieallotipi: L’Ab riconosce in modo specifico solo alcune Ig dello stesso isotipo della stessa specie. Le differenze sono dovuti a diversi alleli per la regione C (polimorfismi)idiotipi: L’Ab riconosce in modo specifico la regione V dell’Ig