Tipos de Estandarizacion en los Bioterios...Tipos de Estandarizacion en los Bioterios GENETIC SCIENCES & COMPLIANCE ANA V. PEREZ, Ph.D. •La Salud del Animal –Libre de patogenos-

Tipos de Estandarizacion en los

Bioterios

GENETIC SCIENCES & COMPLIANCE

ANA V. PEREZ, Ph.D.

• La Salud del Animal – Libre de patogenos- Monitoreo de Salud

– Microbiota

• Medio Ambiente – Condiciones de crianza

– Espacio fisico

– Temperatura

– Disponibilidad de agua y comida

– Enriquecimiento

• La Calidad Genetica del Animal – Integridad Genetica-Monitoreo Genetico

– Genotipacion

– Characterizacion del Fenotipo

Factores Criticos en la Calidad del

Animal de Laboratorio


– Espacio fisico

– Temperatura


– Enriquecimiento

Estandarizacion del Medio Ambiente

• Medio Ambiente

Factores que influyen el Medio

Ambiente

Temperatura y Humedad


– Espacio fisico

– Temperatura


– Enriquecimiento

Factores que influyen el Medio

Ambiente

Espacio Disponible recomendado

Estabdarizacion de Calidad

Genetica

Sistemas de Apareamiento Definidos

Mantenimiento de Datos de la Cepa o Stock

Monitoreo del Fondo Genetico

Verificacion del Genotipo

Evitar Deriva Genica

Cuidadoso Diseno Experimental cuando se usa animales geneticamente modificados

8

Como Mantener la Calidad

Genetica Sistemas de apareamiento definidos

Mantenimiento de datos de la cepa o Stock





9

Ratones y Ratas Consanguineos o

Endogamicos

• Apareamiento hermano x hermana por 20

generaciones

• Todos los genes alelos son homozygotos

• No hay segregacion de genes de manera que la siguiente generacion es equivalente a la anterior

• Cada cepa es aproximadamente copia multiple de un solo individuo. Cada cepa tiene caracteristicas definidas

– C57BL/6, FVB, 129S6, etc

Apareamiento Endogamico –La

Piramide de Taconic

Colonias Heterogeneas –

Apareamientos No consanguineos

• Outbred Stocks • Maxima variedad genetica

– Tamano deseables, pesos, fecundidad, etc.

– A veces se desarrolla el fenotipo not observado en una cepa consanguinea

– Permite el mantenimiento de mutaciones que produce un efecto severo en cepas consanguineas

• Maxima heterogeneidad por alelo – Segregacion de alelos

– Pequenas colonias de exogmicos se tienen que reemplazar frecuentemente

– Derivaciones pueden ocacionar deriva genica

– Monitoreo genetico consiste en chequear la frecuencia de alelos*








1

3

Mantenimiento de Datos

Cepa usada

Nomenclatura

Historia de los

retrocruzamientos

Numero de la Generacion

El mantenimiento de Datos es critico para la precision

de la historia del modelo animal

Historia de la

modificacion

genetica del

modelo animal

Nomenclatura

• Reglas de Nomenclatura

– Mantenidas por un Comite Internacional de Nomenclatura

– Da informacion en el Fondo Genetico

– Da informacion acerca del tipo de manipulacion genetica

– Da informacion acerca del gen de interes

– Da informacion acerca del origen del modelo

http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/index.shtml

• Todo modelo animal debe tener la nomenclatura debida

para publicar el estudio cientifico



Dissecting mutations on the

Gt(ROSA)26

C57BL/6-Gt(ROSA)26Sortm9(Cre/ESR1)Arte

Strain Background

Lab who did it

Locus

Gene trap

26th trap by P. Soriano Trapping vector

Knock-in; here, a

fusion between cre

and a Human

estrogen receptor

Targeted mutation#9

at this locus by this

lab

Como Mantener la Calidad Genetica

Sistemas de apareamiento definidos






1

7

Inbred colony management at

Taconic- The Pyramid

In Isolators

In Isolators

In Barrier

Genetic Risk Point

Genetic Background Testing

• SNP testing using Illumina Platform

– SNP Panels available

• Illumina 1449 SNP Panel –use to test all Inbred Foundation

colonies

• Illumina 377 SNP Panel –not use internally

• Taconic’s 96 SNP Genetic Monitoring Panel –use to test all

other inbred production and outbred colonies

• Taconic’s 96 SNP C57BL/6 sub-strain Panel – use to test

potentially mixed C57BL/6 models

• Taconic’s 96 SNP Rat Panel

MDL (1449) SNP Panel Differences

Verificacion de Cepas – Tecnicas

usadas

• Pruebas Bioquimicas – Pruebas proteicas

• ADN de Microsatelite

• Polimorfismo de Nucleotido – Single Nucleotide

Polymorphisms or SNPs








2

2

Biomarker Data from 96

GenMon Panel: Inbreds

Model

Number Nomenclature

Ptprc (a

or b)

Tyr(+ or

c)

Tyrp1 (+

or b)

Pde6b (+

or rd1 )

4007 B6.SJL-Ptprc<a>/BoyAiTac a + + +

129SVE 129S6/SvEvTac b + + +

AJTAC A/JCrTac b c b +

BALB BALB/cAnNTac b c b +

BALJBO BALB/cJBomTac b c b +

BALBOM BALB/cABomTac b c b +

BLBANU C.Cg/AnBomTac-Foxn1<nu>N20 b c b +

4010 C57BL/10SgSnAiTac b + + +

4011 B10.A-H2<a>H2-T18<a>/SgSnAiTac b + + +

B6 C57BL/6NTac b + + +

B6JBOM C57BL/6JBomTac b + + +

B6NU B6.Cg/Ntac-Foxn<nu>NE10 b + + +

DB BKS.Cg-m+/+Lepr<db>/BomTac b + + +

OB B6.V-Lep<ob>/JBomTac b + + +

C3H C3H/HeNTac b + + rd1

CBA CBA/JBomTac b + + rd1

SOP 3851 SOP 3852

Verificacion del genotipo- verificar

todos los alelos presentes

SOP 3851

SOP 3852

PURO

Top band

amplification

when deleted

Top band

amplification

when deleted

Top band

amplification

when puro

present








2

5

Como Evitar la Deriva Genica

• Con Criopreservacion – Proteccion del ADN

– Reduccion de riesgo

– Extension de la vida

Reproductiva de la colonia

• Con Recuperacion de cepas congeladas – Refresco de la colonia

– Obtener nuevo Stock

26








2

7

© TACONIC BIOSCIENCES PROPRIETARY & CONFIDENTIAL 28

Problemas Geneticos

• Mixed backgrounds of the different genetically

modified mice

• Lack of verification of alleles present

• All lines are not equivalent mice segregation

of the transgene was not verified with

Mendelian ratios


Resultados Inconsistentes

• Deriva Genica del Fondo Genetico

• Posible Variation del Fenotipo

• Difficultad en interpretar los datos debido a la

presencia de alelos no deseados

Estandarizacion Microbiologica

© TACONIC BIOSCIENCES 30

• Usar animales saludables

• Infecciones pueden alterar el resultado de la investigacion cuando no hay sintoma o patologia

• Infecciones alteran la immunologia, fisiologia, reproduccion del animal

• Infecciones pueden interferir con el resultado del estudio

• Algunas infecciones alteran el animal por corto tiempo y otras por muy largo tiempo

Tipo de Microorganismo


• Bacteria- microorganismo unicelular que puede producir

infeccion

– Microbioma

• Virus-microorganismo acelular que se replica dentro de la

celula que infecta

• Parasito-organismo que obtiene nutricion del huesped

Tipos de muestras que se colectan


• Sangre

• Piel

• Nariz

• Conjuntiva del ojo

• Oido medio

• Traquea

• Pulmones

• Contenido cecal o muestra del contenido del intetino grueso

• Vagina

• Glande

• Higado

• Rinon

• Saliva

• Heces

Tipo de Test Microbiologicos


• Cultivo Bacteriologico en placas de Agar

– Cultivo de bacterias aerobicas

– Cultivo de Bacterias anaerobicas

– Sensitividad antibiotica

• Microscopia

• Tincion Gram-

• ELISA- Ensayo de Immunoabsoricon Ligado de Enzimas

• IFA- Ensayo de Immunofluorescencia

• Test Bioquimicos

• PCR- Reaccion de cadena de polimerasa

• Flow Cytometry- Cytometria de Flujo

Medios de Cultivo

• Medio No Selectivo – se usa si el proposito es determinar el perfil de la muestra

– Cuando el cultivo viene de organos patologicamente alterados (bacterias oportunistas)

– Exceso crecimiento de Proteus spp (cecum y genitales), evita anadiendo dtergentes, anesteticos o antibioticos)

– Agar de Sangre 5%- bacterias con demanda de pocos nutrientes (Enterobacteriacea, Micrococcacea) y bacteria que cece en medio enriquecido (Streptococcacea). No suficiente para cultivar Pasteurellaceae o Haemophilus

– Agar de chocolate preferido por Patseurella spp, utilizado para cultivos anaerobicos si se anaden suplementos (Vit K, HCl cysteina)


Medios de Cultivo

• Medio Selectivo

– Contiene ingredientes que inhibe el crecimiento de

unos y permite el crecimiento de otros


…cont Medio de Cultivo


Medios de Cultivo- Incubacion

• Medio No Selectivo – Generalmente se incuba a 37oC, dependiendo que

bacteria se esta buscando-simple incubadora o con CO2

– Aerobico y microaerofilico-Incubacion por 18-24 horas, inspeccion y reincubado por 18-24 horas, re-inspeccion -descarta

– Anaerobico- incubacion por 72 horas antes de abrir el systema

• Medio Selectivo – Depende del Medio y el tipo de bacteria


Aislamiento de Bacteria del Cultivo

Primario


Organo 1 2 3 4

Nariz 1,2,3,4 5,6,7 8,9,10,11 12,13

Traquea 14 15 16,17

Cecum 18,19,20,21 22,23,24 25,26,27,28

29,30,31

32,33,34

Genitalia 35,36 37,38,39 49,41,42 43,44,45,46

Animal

Animal Individual/Organo Individual

Organo 1 2 3 4

Nariz 1,2,3,4 2,4,5 1,2,5,6 9

Traquea 7 7 7,8 7,8

Cecum 9,10,11,12 9,10,11 10,11,12 9,10,11,12,13

Genitalia 14,15 14,15,16 14,15,16,17 16,17

Animal

Animal Agrupados/Organo Individual

Identificacion de Bacteria

• Caracterizacion Inicial

– Tincion Gram

– Forma de la Bacteria

• Rod, racimos de uvas, diplococus, rod elipticos, etc

Anaerobico- incubacion por 72 horas antes de abrir el

systema

– Motilidad

– Aerobico, aeromicrofilico, anaerobico

– Catalasa, citocromo oxidasa, fermentacion de

glucosa

– Formacion de esporas


Test Bioquimicos para deteccion de

Bacteria


• Actividad de Aminoacido Decarboxylasa

• Utilizacion de Citrato

• Actividad de Coagulasa

• Produccion de sulfuro de hidrogeno

• Actividad de triptofanasa

• Actividad de Lecitinasa y Lipasa

• Utilizacion de Malonato

• Reduccion de Nitratos

• Actividad de beta galactosidasa (ONPG)

• Actividad de beta glucoronidasa (PGUA)

• Actividad de beta xylosidasa (PNPX)

• Actividad de Phenilalanina deaminasa

• Formacion de Porfirina

• Utilizacion de tartrato

• Actividad de Ureasa

API Test


Metodos Immunologicos

• Metodos basados en la Reaccion de Antigeno-Anticuerpo – Deteccion de Antigeno, se usan anticuerpos contra

ciento agente para demostrar la presencia del agente • Agglutinacion

• Tecnicas de Immunofluorescencia

– Serologia, usando el agente se demuestra la presencia de anticuerpos

• ELISA-Ensayo de Immunoabsorcion Ligado de Enzimas

• IFA- Ensayo de Immunofluorescencia

• Aglutinacion


Aglutinacion

• Agglutinacion de Antigeno por suero que

contiene anticuerpos contra el antigeno


….cont Aglutinacion


Immunofluorescencia

• Deteccion del antigeno


ELISA


Indirect-ELISA


PCR-Reaccion en Cadena de

Polimerasa


Proceso de

Identificacion

de Agentes

Patogenos


Frequencia y Numero de

Muestras para muestrear

• Depende del tipo de caja que se tiene

– Cajas abiertas

– Cajas con sombrero

– IVC- cajas ventiladas individualmente

• Distribucion de racks


Frequencia y Numero de

Muestras

• Numero de usuarios

• Reglamento de movimiento en las barreras

• Tecnica usada para cambiar las cajas

– Tipo de desinfectante usado


PREGUNTAS

- Descargo de Responsabilidad

Las opiniones y afirmaciones contenidas aquí son propias de los autores y

no deben interpretarse como posición oficial de este curso

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