Aus der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer-,Gesichtschirurgie des Universitätsklinikums Erlangen Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. F.W. Neukam Tierexperimentelle Studie zur Knocheneinheilung chemisch oberflächenmodifizierter Implantate im Typ- 2 diabetischen Schwein Inaugural-Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae dentariae der Medizinischen Fakultät der der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Tobias Möst aus Füssen Erlangen, Januar 2011
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Tierexperimentelle Studie zur Knocheneinheilung chemisch ...€¦ · IX. Summary 8 II. SUMMARY 1. Background Diabetes mellitus is currently classified as a relative contraindication
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Aus der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer-,Gesichtschirurgie
des Universitätsklinikums Erlangen
Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. F.W. Neukam
Tierexperimentelle Studie zur Knocheneinheilung chemisch
oberflächenmodifizierter Implantate im Typ- 2 diabetischen Schwein
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae dentariae
der Medizinischen Fakultät der
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Tobias Möst
aus
Füssen
Erlangen, Januar 2011
Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-
Universität Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler
Referent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Karl Andreas Schlegel
Koreferent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. Friedrich Wilhelm
III. Einleitung..................................................................................................................10 1. Diabetes und Auswirkungen auf die Implantologie..............................................10 2. Implantatoberflächen im Wandel der Zeit...............................................................11 3. Einheilung dentaler Implantate...................................................................................12
IV. Ziele der Arbeit........................................................................................................14
V. Material und Methode ............................................................................................15 1. Implantatsystem ...............................................................................................................15 2. Versuchstiere, Versuchstieranzahl und Bildung der Versuchstiergruppen.15 3. Induktion des experimentellen Diabetes .................................................................18 4. Art, Durchführung und Dauer des Eingriffs .............................................................19 5. Opferung der Versuchstiere..........................................................................................21 6. Aufbereitung der Prüfkörper .......................................................................................21 6.1. Röntgen, Fixierung, Dehydrierung, Infiltration, Einbettung................................... 21 6.2. Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner............................................ 22
7. Histologie: Toluidinblau-O- Färbung .........................................................................23 8. Immunhistochemie ..........................................................................................................26 8.1. Anfertigung der Schnitte mit dem Rotationsmikrotom............................................ 28 8.2. Färbevorgang .............................................................................................................................. 28 8.3. Auswertung der Immunhistologie ..................................................................................... 31
9. Statistik ................................................................................................................................33
VI. Ergebnisse.................................................................................................................34 1. Knochen-Implantat-Kontakt.........................................................................................34 1.1. Kalotte ............................................................................................................................................ 34
XI. Danksagung ..............................................................................................................74
IX. Zusammenfassung 6
I. ZUSAMMENFASSUNG
1. Hintergrund
Diabetes Mellitus wird als relative Kontraindikation für Implantatbehandlungen
klassifiziert. Ein Grund dafür liegt in der erhöhten Verlustrate, die bei
diabetischen Patienten verglichen mit der gesunden Bevölkerung beobachtet
werden kann. Ziel dieser Studie ist, die periimplantäre Knochenneubildung am
diabetischen Tiermodell zu untersuchen und die Unterschiede der
Osseointegration zwischen modifizierten (SLActive®) und konventionellen
(SLA®) Titanimplantaten zu evaluieren.
2. Methoden
In 15 Hausschweinen (4 gesunde Kontroll- und 11 diabetische Schweine) wurden
Implantate in die Kalotte und den Unterkiefer inseriert, nachdem in den
diabetischen Schweinen eine signifikante Veränderung im Hart- und
Weichgewebe verifiziert werden konnte. 30 und 90 Tage nach der Implantation
wurde der Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) anhand von 30 µm dicken,
Toluidinblau-O gefärbten Schliffpräparaten ermittelt. Zusätzlich wurde mittels
immunhistochemischer Färbemethode die Expression der Knochenmatrixproteine
Collagen Typ-I und Osteocalcin zu beiden Opferungszeitpunkten evaluiert.
3. Ergebnisse
Der KIK war in der diabetischen Gruppe sowohl in der Kalotte als auch im
Unterkiefer nach 30 und 90 Tagen vermindert. SLActive® Implantate zeigten im
Vergleich zu SLA® Implantaten einen höheren KIK in beiden Modellen. Die
Expression des Knochenmatrixproteinsproteins Collagen Typ-I war in der Kalotte
der diabetischen Versuchstiergruppe zu beiden Untersuchungszeitpunkten erhöht
(30 Tage SLA®: 24,19 ± 9,94 vs. 28,26 ± 7,71 SLActive®: 23,75 ± 9,89 vs. 22,54
± 6,06 90 Tage SLA®: 25,51 ± 2,77 vs. 25,80 ± 5,02 SLActive®: 21,15 ± 5,43 vs.
21,97 ± 8,47). Die Expression des Knochenmatrixproteins Osteocalcin war in der
Kalotte der diabetischen Versuchstiergruppe an beiden Opferungszeitpunkten
nach der Implantatinsertion verringert (30 Tage SLActive®19,94 ± 5,44 vs. 17,64
± 6,23 90 Tage SLA® 25,36 ± 5,70 vs. 20,21 ± 4,73).
IX. Zusammenfassung 7
4. Praktische Schlussfolgerungen
Dieser Studie kann entnommen werden, dass die unbehandelte
Stoffwechselerkrankung Diabetes Mellitus einen negativen Einfluss auf die
Osseointegration von dentalen Implantaten hat. Dieser pathologischen
Nebenwirkung kann durch neu entwickelte Implantatoberflächen entgegengewirkt
werden. Die modifizierte SLA®- Oberfläche bewirkt eine beschleunigte
Osseointegration dentaler Implantate, so dass eine Diabeteserkrankung in
unbehandelter Form keine Kontraindikation für eine Implantatinsertion darstellt.
IX. Summary 8
II. SUMMARY
1. Background
Diabetes mellitus is currently classified as a relative contraindication for implant
treatment. One reason is the higher failure rate, which can be observed in diabetic
patients compared to the general population. Aim of this study was to investigate
peri-implant bone formation in a diabetic animal model and to evaluate the
differences between modified (SLActive®) and conventional (SLA®) titanium
implants on the osseointegration.
2. Methods
In 15 domestic pigs (4 healthy controls and 11 diabetic) implants were inserted in
the calvaria and lower jaw after significant histopathological changes in the hard
and soft tissue could be verified in the diabetic animals. 30 and 90 days after
implant placement the bone-implant-contact (BIC) was appraised by 30µm thick,
toluidinblue-O stained grinded supplements. Additionally the expression of bone-
matrix-proteins collagen type-I and osteocalcin were evaluated at both times of
devotement by using immunohistochemical-staining methods.
3. Results
BIC in the calvaria and lower jaw was reduced in the diabetic group after 30 days
and after 90 days. SLActive®-implants showed a higher BIC in the calvaria as
well as in the lower jaw compared to the SLA® implants. Collagen type-I protein
expression was higher in the diabetic group at both time points of sacrifice (30
days SLA®: 24,19 ± 9,94 vs. 28,26 ± 7,71 SLActive®: 23,75 ± 9,89 vs. 22,54 ±
6,06 90 days SLA®: 25,51 ± 2,77 vs. 25,80 ± 5,02 SLActive®: 21,15 ± 5,43 vs.
21,97 ± 8,47). After the insertion of the implants the expression of the bone-
matrix-protein osteocalcin was reduced in the diabetic group at both times of
sacrifice. (30 days SLA®: 16,48 ± 5,24 vs. 22,10 ± 3,44 SLActive®: 19,94 ± 5,44
vs. 17,64 ± 6,23 90 days SLA®: 25,36 ± 5,70 vs. 20,21 ± 4,73 SLActive®: 20,80 ±
5,81 vs. 20,80 ± 5,14) .
IX. Summary 9
4. Practical Conclusions
The negative impact of untreated diabetes mellitus on osseointegration of dental
implants is revealed in this study. This pathologic adverse reaction could be
prevented by new developed implant surfaces. The modified SLA® surface
provokes an accelerated osseointegration of dental implants. This is why
untreated diabetes is no longer a contraindication for implant insertion.
IX. Einleitung 10
III. EINLEITUNG
1. Diabetes und Auswirkungen auf die Implantologie
Diabetes Mellitus ist ein Sammelbegriff für Störungen des Zuckerstoffwechsels, deren Leitbefund durch einen zu hohen Blutzuckerspiegel charakterisiert ist. Diese Hyperglykämie ist das Ergebnis einer defekten Insulinsekretion, Insulinantwort oder beidem gleichzeitig. Beim „primär insulinabhängigen Diabetes mellitus“ (Typ-I Diabetes) handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung, bei der das körpereigene Immunsystem die insulinproduzierenden β-Zellen des Pankreas zerstört. Es resultiert ein zunehmender Insulinmangel, der sich bei 80-90% der zerstörten β-Zellen als Typ-I Diabetes manifestiert. Im Gegensatz dazu steht der „Nicht primär insulinabhängiger Diabetes mellitus“ (Typ-II Diabetes). Hierbei handelt es sich um eine Störung am Zielort, z.B. an der Zellmembran eines Muskels. Das vorhandene Insulin ist in seiner Wirkung ineffizient und die gewünschte Wirkung bleibt aus (Insulinresistenz). Die Internationale Diabetes Federation (IDF) schätzt, dass im Jahr 2010 weltweit 239 Millionen an Diabetes leiden. Diese Summe wird innerhalb der nächsten 15 Jahre auf 380 Millionen zunehmen. Der steigende Lebensstandard und das fehlerhafte Ernährungsbewusstsein sind Gründe für die Diabeteserkrankung von etwa 7,4 (2007) Millionen Menschen in Deutschland. Im internationalen Vergleich reiht sich Deutschland damit auf den 5. Platz nach Indien, China, USA und Russland ein. Laut der IDF betrug die nationale Prävalenz 11,8 % aller deutschen Bundesbürger zwischen dem 20. und 79. Lebensjahr. Leider ist dieser Trend nicht rückläufig und Berechnungen zur Folge wird 2025 in dieser Bevölkerungsgruppe die nationale Prävalenz auf 13,3% ansteigen [74]. Dieser Tendenz entsprechend nimmt die Anzahl der an Diabetes erkrankten Patienten, die zahnärztliche und/oder Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgische Versorgung benötigen, stetig zu. Da sich eine Implantatinsertion als effektive Methode zur Versorgung von teilbezahnten und zahnlosen Patienten etabliert hat, wird auch in diesem Bereich ein stetiger Patientenzuwachs zu beobachten sein [5, 8, 78]. Klinische Studien konnten zeigen, dass Implantate bei diabetischen Patienten erfolgreich gesetzt werden können [8, 10, 34, 44], die Erfolgsrate aber im Vergleich zu gesunden Patienten verringert ist [35, 36, 79, 86]. Dabei scheint der Diabetes wesentliche Voraussetzungen für eine erfolgreiche Osseointegration von Implantaten zu beeinflussen. Es konnte gezeigt werden, dass
IX. Einleitung 11
sich Diabetes sowohl auf die Knochenneubildung wie auch auf die Knochendichte und –mineralisation nachteilig auswirkt [30, 38, 46, 111]. Entscheidend für eine regelrechte Knochenheilung und –mineralisation ist eine frühe Vaskularisierung durch Gefäßneubildung (Neoangiogenese) [20, 37]. Gerade im Fall des Diabetes ergibt sich hierbei die Problematik, dass Angiopathien bei diesem Krankheitsbild die häufigste Sekundärkomplikation darstellen [72]. Pathophysiologisch sind diese Angiopathien unter anderem gekennzeichnet durch einen veränderten Blutfluss, eine gesteigerte Gefäßpermeabilität, eine veränderte Endothelfunktion und eine verminderte Mikrozirkulation. Die daraus resultierenden Wundheilungsstörungen im Bereich des Weich- und Hartgewebes stellen somit eine der Hauptkomplikationen der diabetischen Stoffwechsellage dar.
2. Implantatoberflächen im Wandel der Zeit
Implantationen im Bereich des Schädels sind keine Entwicklung, die ihren
zeitlichen Ursprung im 20. Jahrhundert finden. Ein aus Stein simpel hergestellter
unterer Schneidezahn, der in den Alveolarfortsatz eingebracht wurde zeigt, dass
bereits vor der „Entdeckung Amerikas“ im Honduras bereits „Implantologie“
betrieben wurde. Dort gefundene Schädel beweisen dies [6]. Seit Beginn des 19.
Jahrhunderts werden Implantate im Kieferbereich aus unterschiedlichsten
Materialien beschrieben. Die damals verwendeten Werkstoffe waren Blei, Silber,
Gold, Platin, Guttapercha, Gummi, Kautschuk, Porzellan u.a.[13, 41]. Da primär
geglaubt wurde, dass Edelmetalle verträglicher seien, wurden die Implantate in
diesem Zeitraum aus sehr „edlen“ Legierungen hergestellt (z.B.Platin-Irridium).
Erst 1940 kamen korrosionsbeständige Stahlimplantate (Vittalium u.a.) auf den
Markt. Keramiken und das „nicht-edle“ Titan, welches heute bevorzugt wird,
gelten seit 1960 als geeignete Biomaterialien für enossale Implantate [27]. Studien
konnten bewiesen, dass Implantatoberflächen mit Mikrostrukturen, die man z.B.
durch den Prozess des Sandstrahlens oder des Ätzens mit Säuren erhält, eine
höhere Erfolgsrate und beschleunigte Osseointegraton aufweisen als
unbehandelte, glatte Oberflächen [4, 56, 65, 73]. Gesteigerte Zellproliferation und
–migration [118], ebenso wie gesteigerte Knochenapposition [14] und Knochen-
Implantat-Kontakt [60] sind Auffälligkeiten, welche die Überlegenheit von
mikrostrukturierten Oberflächen unterstreichen. Diese Erkenntnisse bilden die
Grundvoraussetzung für die heutige Forschung an dentalen Implantatoberflächen.
Neueste Erkenntnisse aus der Physik, Chemie und Biologie werden für die
IX. Einleitung 12
Oberflächenentwicklung dentaler Implantate herangezogen. Mit der Entwicklung
von sich selbstorientierenden Titanröhrchen (TiO2-nanotubes), konnte von
Wilmowsky C. 2007 an einer experimentellen Studie am Schwein zeigen, dass
Oberflächen mit dieser Beschichtung, im Durchmesser von 30 nm, einen positiven
Einfluss auf die Osteoblastenaktivität haben [107]. Unlängst wurden
Wissenschaftler auf den Mechanismus der Interaktion zwischen extrazellulärer
Matrix und Zellmembranrezeptoren aufmerksam [7, 69]. Dabei fiel auf, dass die
Aminosäurensequenz Arginin-Glycin-Aspartat (RGD) die Zelladhäsion der
Osteoblasten beschleunigt [114]. Seitdem wird diese Sequenz für eine
Biofunktionalisierung von Implantatoberflächen genutzt [91]. Durch Weitere
Modifikationen der Oberflächentextur der Implantate kann deren Einheilung
zusätzlich verbessert werden [22, 26, 39, 64]
Die Firma Straumann reagierte auf die bereits oben beschriebene Entwicklung der
Implantatoberflächen mit einer „Aktivierung“ der von ihnen entwickelten SLA®
Beschichtung, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde.
3. Einheilung dentaler Implantate
Die wissenschaftliche Grundlage der knöchernen Einheilung dentaler Implantate
beschreibt Brånemark mit dem Prozess der Osseointegration. Dieser Begriff
bezeichnet den direkten und funktionellen Verbund zwischen dem organisierten
lebenden Knochen und der Oberfläche des belasteten Implantats [17]. Bezüglich
des Einheilmodus werden zweiphasige von einphasigen Implantatsystemen
unterschieden. Im Rahmen dieser Studie heilten die Implantate submukosal ein,
was der zweiphasigen Methode entspricht. Seit der Einführung oraler enossaler
Implantate hat sich eine unbelastete Einheilungsphase von drei bis sechs Monaten
je nach Qualität des Implantatlagers etabliert. Obwohl der exakte Mechanismus
des Knochen- Implantat Verbundes bislang nicht vollständig geklärt ist, kann
davon ausgegangen werden, dass die sich bildende Passivierungsschicht des
Titans maßgeblich die knöcherne Einheilung beeinflusst [57]. Bei der
Implantation kommt es initial zu einer Adsorption von Proteinen, Thrombozyten
und anderen Makromolekülen an der Implantatoberfläche [88, 97]. Über diese
Schicht läuft die Osseointegration der Implantate ab [19, 97]. Hierbei spielen die
an der Oberfläche freigesetzten Zytokine (Mitogene und Morphogene) eine
wichtige Rolle für die Attraktion von osteogenen Zellen, welche als Ostetoblasten
IX. Einleitung 13
die Oberfläche besiedeln und durch diesen unmittelbar nach der Implantation
stattfindenden Prozess eine Kontaktosteogenese der Implantate ermöglichen [28,
88]. Dieser Prozess der Osteokonduktion korreliert mit der Beschaffenheit der
Implantatoberfläche. Die sich anschließende Knochenneubildungskaskade kann in
einen mehrstufigen Prozess untergliedert werden. In der frühen Phase der
Osseointegration sezernieren differenzierende osteogene Zellen eine
Kollagenmatrix, die als Gerüst für die spätere Mineralisation dient [95]. Der
gebildete, unreife Geflechtknochen ist charakterisiert durch eine zufällige
Anordnung von Kollagenfasern und zahlreiche, unregelmäßig geformte
Osteozyten. Diese Knochenvorstufe entwickelt sich später zu lamellären Knochen
weiter, der sich durch einen hohen Mineralisationsgehalt und dicht gepackte,
parallel angeordnete Kollagenfaserschichten mit alternierenden
Verlaufsrichtungen auszeichnet [93]. Die letzte Phase der Osseointegration
beschreibt der Prozess des „bone remodelling“ [28]. Diese Phase ist
charakterisiert durch eine funktionelle Anpassung des Knochens an die Belastung.
Im Rahmen dieser Studie sind die Knochenmatrixproteine Collagen Typ-I und
Osteocalcin von besonderem Interesse, da durch sie die voranschreitende
Osseointegration beschrieben werden kann.
IX. Ziele der Arbeit 14
IV. ZIELE DER ARBEIT
Ziele dieser experimentellen Großtierstudie sind:
- Evaluation der Unterschiede bezüglich des Knochen-Implantat-Kontakts
und der Osseointegration im diabetischen und stoffwechselgesunden
Schwein.
- Unterschiede des Knochen-Implantat-Kontakts bei der Anwendung zweier
verschiedener Implantatoberflachen (SLA® und SLActive®) der Firma
Straumann zu zwei unterschiedlichen Opferungszeitpunkten (nach 30
Tagen und 90 Tagen).
- Immunhistochemische Untersuchung der periimplantären Region mit
besonderem Augenmerk auf die für die Osseointegration
charakteristischen Proteine Collagen Typ-I und Osteocalcin.
IX. Material und Methode 15
V. MATERIAL UND METHODE
1. Implantatsystem
Die bone level Implantate entsprechen dem „Straumann Standard Implantat“ mit
einer Länge von 10 mm und einem Durchmesser Ø =4,1 mm.
Bei den SLA®-Oberflächen werden durch grobes Sandstrahlen mit Korund-
Partikeln eine Makrorauheit der Titanoberfläche erreicht. Danach folgt für einige
Minuten ein starkes Säurebad mit einer Mischung aus HCl und H2SO4 bei
erhöhter Temperatur. Dadurch entstehen die feinen 2–4 µm großen
Mikrogrübchen, die in der grob gesandstrahlten Fläche eingelagert sind [98].
SLActive® -Oberflächen hingegen sind molekular optimierte SLA®-Oberflächen.
Die Oberfläche zeichnet sich durch eine große Hydrophilie und einen hohen
Betrag von freier Oberflachenenergie aus. Diese Eigenschaften sind das Resultat
der besonderen Behandlung der SLA®-Oberfläche, die einerseits durch eine
Hydroxylierung und Hydratisierung der Ti- Oberfläche unter N2 Atmosphäre und
andererseits durch eine anschließende Lagerung in isotonischer Salzlösung
erreicht wird. Bei dieser Form der Aufbewahrung gehen Cl- Ionen der
isotonischen Lösung elektrostatische Bindungen mit der aktivierten Oberfläche
ein und sichern damit die optimale Vorbehandlung der Implantatoberfläche.
2. Versuchstiere, Versuchstieranzahl und Bildung der
Versuchstiergruppen
Das Schwein ist als Großtier ebenso wie Schaf und Hund für die experimentelle
Knochenchirurgie geeignet [3, 48, 94, 112]. Eine wichtige Voraussetzung dafür
ist, dass die morphologischen, anatomischen und physiologischen Gegebenheiten
eines Versuchstieres möglichst eng mit den Bedingungen beim Menschen
übereinstimmen, um tierexperimentell gewonnene Ergebnisse auch auf den
Menschen übertragen zu können. Die Knochenneubildungsrate des Schweins
beträgt 1,2 - 1,5 µm/die. Im Vergleich zum Hund (1,5 - 2,0 µm/die) entspricht sie
damit nahezu der Knochenregenerationsgeschwindigkeit des Menschen mit 0,8 -
1,0 µm/die [61]. Gewebedurchblutung, zirkulatorische Vorgänge und
Frakturheilung sind mit den Verhältnissen beim Menschen zu vergleichen. Auch
IX. Material und Methode 16
mikroskopisch lassen sich hinsichtlich der Knochenstruktur zwischen der Dicke
der Spongiosabälkchen (267 zu 276 µm) und dem Durchmesser der
intertrabekulären Markräume (1418 zu 322 µm) in den Femur- bzw.
Tibiametaphysen zwischen Mensch und Schwein geringere Unterschiede
nachweisen als beispielsweise zwischen Mensch und Hund (267 zu 282 µm, bzw.
1418 zu 258 µm) [12]. Daher wurde das Hausschwein gewählt, da sich knöcherne
Regenerationsvorgänge verlässlich auf den Menschen übertragen lassen [32, 33].
Nach Genehmigung des Tierversuches durch die zuständige
Tierversuchskommision der Regierung von Mittelfranken, Ansbach
(Genehmigungsnr. 54-2531-25/07) wurden 15 Tiere in die Studie eingeschlossen,
die hier auf 4 Versuchsgruppen aufgeteilt wurden. Es gab 2 Opferungszeitpunkte
in der jeweils diabetische und gesunde Schweine geopfert wurden. Am ersten
Opferungstermin (nach 30 Tagen Einheilung) wurden 7 Tiere (2 mit gesunder und
5 mit diabetischer Stoffwechsellage) geopfert. Nach 90 Tagen post
implantationem wurden die übrigen Tiere (2 mit gesunder und 6 mit diabetischer
Stoffwechsellage) geopfert.
IX. Material und Methode 17
Abbildung 1: Übersicht über den zeitlichen Verlauf der Doktorarbeit
IX. Material und Methode 18
3. Induktion des experimentellen Diabetes
Entsprechend der Studie von Koopmann et al. wurde Streptozotocin (Pharmacia
& Upjohn Company, Kalamazoo, MI) in einer physiologischen Kochsalzlösung
auf 1g/10ml, 90 mg/kg Körpergewicht verdünnt und über einen Zugang an der
Ohrvene über 30 min infundiert [58]. Die Kanülenapplikation und Infusionsgabe
fanden nach Medikation mit Midazolam (1mg/kg/KG) (Dormicum®, Hoffmann-
La Roche, Grenzach-Wyhlen) und Ketavet® (10mg/kg/KG) (Ketavet®,
Pharmacia, Erlangen) in Sedierung statt.
Die Applikation des Medikaments wurde 4-5 Stunden nach der morgendlichen
Fütterung durchgeführt. Während der ersten 3 Tage nach der Streptozotocin
Behandlung wurde Futter ad libitum gewährt um eine Hypoglykämie zu
vermeiden [42]. Über die folgenden 4 Tage wurde das Futter weiter ad libitum
gegeben, allerdings von 06:00 bis 07:00 Uhr und von 15:00 bis 16:00 Uhr, um die
Futteraufnahme in Relation zur 24h Urin-Glukose Ausscheidung der diabetischen
Schweines setzen zu können. Damit wurde sichergestellt, dass die Schweine
täglich Futter im isoenergetischen Level von 1045 kJ ME/kg Körpergewicht
aufnehmen. Ab dem 8.Tag nach Streptozotocin Behandlung wurden die Schweine
mit einem begrenzten und isoenergetischen Level von 1045 kJ ME/kg KG pro
Tag während der gesamten Studie gefüttert.
Vom Zeitpunkt der Gabe von Streptozotocin bis zur Implantation der Implantate
wurde ein Zeitraum von 15 Monaten gewählt. Die gewählte Streptozotocin
Konzentration entsprach in dieser Studie 90 mg/kg Körpergewicht. Marshall et al.
konnten in ihrer Studie zeigen, dass eine Gabe von 60 mg Streptozotozin/kg
Körpergewicht, nach einer initialen Behandlung über 8 Tage mit 30 mg
Streptozotozin/kg Körpergewicht, die beste Methode darstellt um einen deutlichen
Insulinmangel künstlich zu induzieren [70, 71]. Neben der Hypoglycämie und der
verminderten Insulinantwort konnte Marshall eine signifikante Zunahme an
Triglyceriden und ein Rückgang des Albuminspiegels im Blutplasma nachweisen
[70].
Da Marshall et al. eine Dosierung von 60 mg/kg Körpergewicht gewählt hat, war
davon auszugehen, dass bei der von uns vorgesehenen Streptocotozin-Dosierung
von 90 mg/kg Körpergewicht ebenfalls pathologischen Veränderungen beobachtet
werden können. Die induzierten pathologischen Folgeerkrankungen können mit
IX. Material und Methode 19
den Kriterien der Diabetesdefinition der American Diabetes Association 2006
(ADA) und World Health Organisation 1999 (WHO) erklärt werden:
- oftmaliges Urinieren
- ungewöhnlich größer Durst, Hunger
- ungewöhnlicher Gewichtsverlust
- Taubheitsgefühl an den Extremitäten
- verzögerte Wundheilung
- multiple Entzündungen
4. Art, Durchführung und Dauer des Eingriffs
Die Insertion der dentalen Implantate erfolgte bei den Versuchstieren in die
Schadelkalotte (Os frontale) und in den Unterkiefer (Mandibula). Durch einen
perkutanen Zugang im Bereich der Kalotte und der Mandibula wurde die Haut
inzidiert, das subcutane Bindegewebe und das Periost mobilisiert, sodass die
knöchernen Anteile des Os frontale bzw. der Mandibula dargestellt werden
konnten. Die Insertionstechnik unterschied sich in beiden Zielregionen nicht und
entspricht dem Procedere, welches von der Firma Staumann (Straumann Holding
AG, Basel, Schweiz) empfohlen wird.
Die Implantate wurden daraufhin in die Zielregion mittels einer Handratsche (35
Ncm) inseriert und das Implantatinnengewinde mit einer Verschlussschraube
gesichert. Das Periost wurde abschließend wieder repositioniert und wie die Haut
mit resorbierbaren Vicrylfäden (Vicryls 3.0®, Ethicon GmbH & Co. KG,
Norderstedt, Deutschland) vernäht. Zur postoperativen Schmerzkontrolle erhielt
jedes Tier 3 Tage lang alle 12 Stunden 0,1 mg/kg KG Buprenorphin (Temgesic®,
Essex Pharma GmbH, München, Deutschland) s.c.. Zusätzlich wurde eine
Antibiotikaprophylaxe mit Streptomycin (15mg/kg) (Streptomycin "Grünenthal" 1
g®, Grünethal, Stolberg, Deutschland) für 3 Tage eingeleitet.
Insgesamt wurden 136 Implantate inseriert. Dabei fanden an der Kalotte 58 und
an der Mandibula 78 randomisierte Implantationen statt.
IX. Material und Methode 20
Abbildung 2: vereinfachte Darstellung der Implantatlokalisation im Unterkiefer
Abbildung 3: vereinfachte Darstellung der Implantatlokalisation in der Kalotte
IX. Material und Methode 21
Abbildung 4: Intraoperatives Bild der Implantatinsertion. links: Kalotte, rechts:
Unterkiefer
5. Opferung der Versuchstiere
Nach Erreichen der geplanten Einheilzeit der Implantate erfolgte die Opferung der
Tiere zur Materialgewinnung. Die Schweine erhielten zur Sedierung eine i.m.-
Injektion in die Nackenregion mit Azaperone (1 mg/kg) (Stresnil®, Janssen-Cilag
GmbH, Neuss, Deutschlandund) und Midazolam (1 mg/kg) (Dormicum®,
Hoffmann-La Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland). Danach erfolgte die
Tötung durch eine intravasale Injektion von 20%-iger Pentobarbitallösung in die
Ohrvene bis zum Herzstillstand. Nun wurden die Kalotten und Mandibulae
entnommen und bis zum Beginn der mikroradiographischen und
immunhistochemischen Aufbereitung bei -80 Grad Celsius tiefgefroren.
* Basislösung wurde vor Verwendung mit Hilfe von Aluminiumoxid entstabilisiert
Herstellung der Gebrauchslösungen aus den Technovit- Komponenten
Materialnummer 1 2 3 4 5
Bezeichnung Basis-Lösung
PMMA- Pulver Härter 1 Härter 2 Regler
Präinfiltration 200 ml 1 g Infiltration ad 250 ml 20 g 1 g Stammlösung A ad 500 ml 80 g 3 g Stammlösung B ad 50 ml 4 ml 2 ml
Rezept der Toluidinblau-O Färbelösung
Ansatz A 800ml AquaDest 8 g Natrium- Tetraborat 8 g Toluidinblau-O (Chroma 1B481) 15 min Rühren Ansatz B 200ml AquaDest 2 g Pyronon G (Merck 107518) 15 min Rühren
15 min Ansatz A und Ansatz B mischen und anschließend 2x filtrieren
12 Tage Lichtgeschützte Reifung der Lösung
IX. Anhang 72
Färberezept Toluidinblau-O Lösung Zeitdauer: Anwendung: Einsortieren von ja 10 Objektträgern in die Glasküvette 15 min Schliffpräparate in 30 % H2O2 schwenken 5 min Fließendes Leitungswasser Trocknen der Präparate mit Papiertüchern 15 min Färbung in Toluidinblau-O (Rezept siehe unten) 5 min Fließendes Leitungswasser Lichtgeschützte Lagerung der Präparate
Färberezept Collagen Typ-I
manuell: 3 x 20 min Entacrylierung in MEA
5 x 3min absteigende Alkoholreihe (Ethanolkonz.: 100%, 100%, 97%,90%,70%)
3 min Aqua dest 20 min Entkalken in 10%iger EDTA-Lösung 10 min Ausspülen unter fließendem Leitungswasser
3 x 2 min Aqua dest 3 x 2 min DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4
25 min Kochen im Citrat-Puffer mit pH 6,0 bei 95°C 25 min Abkühlen im Citratpuffer mit pH 6,0
3 x 2min DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4
im Autostainer: 15 min Avidin (DAKO X0590)
Spülen mit Aqua dest 15 min Biotin (DAKO X0590)
Spülen mit Aqua dest 20 min Proteinblock (DAKO X 0909)
60 min Primärantikörper Osteocalcin 1:10´000 verdünnt mit Antibody Diluent
Spülen mit Aqua dest 15 min biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung A)
Spülen mit Aqua dest 15 min Streptavidin-AP-Komplex (Lösung B)
Spülen mit Aqua dest 8 min Chromogen RED (DAKO K5005)
Spülen mit Aqua dest 4 min Chromogen RED (DAKO K5005)
10 min Spülen mit Aqua dest
manuell: 5 min Gegenfärbung mit Hämalaun (DAKO S3301) 5 min Ausspülen unter fließendem Leitungswasser 5 min Aqua dest
Mit Aquatex eindecken
IX. Anhang 73
Färberezept Osteocalcin
manuell: 3 x 20 min Entacrylierung in MEA
5 x 3min absteigende Alkoholreihe (Ethanolkonz.: 100%, 100%, 97%,90%,70%)
3 min Aqua dest 20 min Entkalken in 10%iger EDTA-Lösung 10 min Ausspülen unter fließendem Leitungswasser
3 x 2 min Aqua dest 3 x 2 min DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4
25 min Kochen im Citrat-Puffer mit pH 6,0 bei 100°C 25 min Abkühlen im Citratpuffer mit pH 6,0
3 x 2min DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4
im Autostainer: 15 min Avidin (DAKO X0590)
Spülen mit Aqua dest 15 min Biotin (DAKO X0590)
Spülen mit Aqua dest 30 min Proteinblock (DAKO X 0909)
60 min Primärantikörper Osteocalcin 1:10´000 verdünnt mit Antibody Diluent
Spülen mit Aqua dest 15 min biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung A)
Spülen mit Aqua dest 15 min Streptavidin-AP-Komplex (Lösung B)
Spülen mit Aqua dest 8 min Chromogen RED (DAKO K5005)
Spülen mit Aqua dest 6 min Chromogen RED (DAKO K5005)
10 min Spülen mit Aqua dest
manuell: 5 min Gegenfärbung mit Hämalaun (DAKO S3301) 5 min Ausspülen unter fließendem Leitungswasser 5 min Aqua dest
Mit Aquatex eindecken
IX. Danksagung 74
XI. DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. K.A. Schlegel für
die Planung des Versuchsvorhabens sowie für Motivation, Gespräche und Hilfe
über die Dissertation hinaus. Seine Anleitung zur wissenschaftlichen Tätigkeit
und seine zuverlässige Betreuung hat wesentlichen Anteil am Gelingen dieser
Arbeit.
Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. F.W. Neukam, Direktor der Klinik
und Poliklinik für Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie der Friedrich Alexander
Universität Erlangen-Nürnberg gilt mein Dank für die Schaffung der notwendigen
Vorraussetzungen zur Durchführung dieser Arbeit im S1-Labor der Klinik.
Ein besonderer Dank gilt meinem Betreuer, Herrn Dr. med. dent C. von
Wilmowsky für die gewissenhafte Betreuung und die fachliche Beratung. Mein
persönlicher Dank gilt meinem Projektpartner und Freund Christian Seidl für die
freundschaftliche und erfolgreiche Zusammenarbeit.
Ich danke Frau Dr. J. Ries, Frau S. Schönherr, Frau H. Heider und Frau E. Diebel
für die wertvolle Einarbeitung und tatkräftige Unterstützung im Labor. Ihre
Ratschläge und Anregungen waren mir stets eine große Hilfe.
Am Ende gilt ein ganz besonderer Dank meinen lieben Eltern. Durch ihre unent-
wegte Hilfe und großzügige Unterstützung in allen Jahren haben sie die vorlie-