TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI LABORATUVAR ...

1

İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ

İSTANBUL TIP FAKÜLTESİ

Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı

TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI

LABORATUVAR UYGULAMALARI

(Tıp Fakültesi 2. sınıf öğrencileri için)

İstanbul, 2014

2

Sevgili Öğrencilerimiz,

Tıp Fakültesi 2. Yıl öğreniminiz sırasında Kan-lenfoid, Metabolizma, Üreme ve ürogenital

dilimlerinde olmak üzere üç ayrı biyokimya uygulaması vardır. Yönetmelik gereği uygulamaların

%80’ine devam zorunludur. İlk dönemde olduğu gibi bir uygulama programı sekiz kere

tekrarlandığından, kendi gününde uygulamaya girememiş olan öğrenci, başka bir gruba

katılabilecektir.

Laboratuvar çalışmalarının yararlı olması, çalışma öncesinde o konuya ilişkin temel bilgiyi

edinmenize bağlıdır. İlişikteki kitapçık, her uygulama için gerekli temel bilgileri içeren bir rehber

niteliğindedir. Bunun yanında uygulamalarda aktif görev alan öğretim kadromuz konuyla ilgili

sorularınız için her zaman yardımcı olacaktır.

Başarı dileklerimizle,

Prof. Dr. Figen Gürdöl

3

İ Ç İ N D E K İ L E R

1- KAN-LENFOİD DİLİMİ UYGULAMASI

A- Kanın yapısı, plazma/serum eldesi, antikoagülanlar ………… 4-9

B- Hemoglobin yapım ve yıkım ürünleri ile ilgili testler ….……10-18

2- METABOLİZMA DİLİMİ UYGULAMASI

A- Karbonhidrat metabolizması ile ilgili testler ………………...19-25

B- Serum lipitleri ve keton cisimleri ………………………..…… 26-30

C- Proteinler ile ilgili testler …………………………………….. 31-36

D- İdrarda amino asit türevleri………………………………… …37-39

3- ÜREME-ÜROGENİTAL DİLİMİ UYGULAMASI

A- İdrar incelemesi ……………………………………………. 40-47

B- Protein dışındaki azotlu bileşikler ……………………..…… 48-49

C- Böbrek fonksiyon testleri ………………………..………….. 50-52

Düzenleyen: Prof. Dr. Figen GÜRDÖL

4

1- KAN-LENFOİD DİLİMİ UYGULAMASI

A- KANIN YAPISI, PLAZMA/SERUM ELDESİ, ANTİKOAGÜLANLAR

Kan, bütün dokulara gerekli maddeleri taşıyan ve metabolizma ürünlerini dokulardan uzaklaştıran,

hücreler ile sıvı fazın karışımından oluşan özelleşmiş vücut sıvısıdır. Kanın sıvı kısmı plazma

olarak adlandırılır. Plazmada kanın hücresel bileşenleri olan eritrosit, lökosit ve trombositler (şekilli

elemanlar) süspansiyon halinde, birçok organik ve anorganik madde ve pıhtılaşma faktörleri ise

çözünmüş olarak bulunur.

Kan vücut içinde sıvı haldedir, vücut dışına çıkınca 5-8 dakikada pıhtılaşır. Pıhtılaşmadan önceki

kana tam kan denir. Tam kandan şekilli elemanların ve pıhtının (fibrin) uzaklaştırılması ile elde

edilen açık sarı, berrak sıvı serumdur. Plazma ise sadece hücrelerin uzaklaştırılmasıyla elde edilen

kısımdır, fibrinojen içerir. Kanda yapılacak laboratuvar incelemelerinin türüne göre tam kan,

plazma veya serum kullanılır.

Tam Kan

- Kapiller kan: Çok az miktarda kan gerektiren mikrometodlarda kullanılır. Kapiller kan

çoğunlukla parmak ucundan, daha seyrek olarak kulak memesinden, bebeklerde ise ayak

başparmağı veya topuktan alınır.

Parmak ucunun etli kısmı eter veya %70 etil alkol ile silinir.

Steril bir gazlı bezle kurulanır veya kendi halinde kurumaya bırakılır.

Usulüne uygun şekilde parmak sıkıca tutulur ve steril bir lanset yardımı ile 2-3 mm

kadar delinir.

İlk damla kan bir pamukla silinerek uzaklaştırılır, daha sonra sıkmadan kanın göllenmesi

beklenir ve kan alınır.

-Venöz kan: Biyokimyasal analiz için en çok kullanılan kan örneğidir. Karbonhidrat, lipit (özellikle

trigliserit) ile ilgili testler için kan sabah aç karnına alınmalı, bu işlemden önce eldiven giyilmelidir. Geniş yaralı veya hematomlu koldan, mastektomili hastada ameliyatlı taraftaki koldan kan

alınmamalıdır.

Hasta oturtulur, kolunu omuzdan bileğe kadar düz olacak şekilde uzatması sağlanır.

Kan alınacak kolun brakial ven bölgesi %70 lik etil alkol ile iyice temizlenir. Antekubital

fossadaki kalın ve yüzeyel venler tercih edilir.

Kan alma bölgesinin 10-15 cm üzerinden turnike bağlanır. Turnikenin uzun süre tutulması kanın

5

bileşimini değiştirir.

Dolgunlaşan venlerden gözlem ve palpasyonla en dolgun ve geniş çaplı olanı saptanır. Venin

kayması sol elin başparmağı ile bastırılarak önlenir. Vene girmek için iğne kan alınacak venle

hizalanır, deriye ~15º açı yapacak şekilde tutulur ve venin içine yavaşça itilir.

Kan tüpün içine akmaya başladığında iğne hareket ettirilmeden turnike gevşetilir.

Kan alma işlemi tamamlandığında, iğne damardan çıkarılır ve sızıntı olmaması için hastaya kuru

gazlı bez veya pamuk verilerek kan alınan bölgeye bastırması ve kolunu yukarıya doğru tutması

söylenir.

Vakumlu tüp sistemi kullanılıyorsa önce katkısız, sonra katkı maddeli tüplere kan alınmalıdır.

Günümüzde rutin analizlerde çalışılan testler farklı özellikte örnek gerektirdiğinden kan alımında

vakumlu tüp sistemi kullanılmaktadır (Tablo 1).

-Arter kanı: Kan gazlarının (oksijen ve karbondioksit) analizi ve kan pH’ının ölçümünde

kullanılır. Bu iş için en uygun arterler sırasıyla radyal, brakiyal ve femoral arterlerdir (bilek, dirsek

ve kasık arterleri). Turnikeye gerek yoktur. Enjektörde hava bulunmamasına özellikle dikkat

edilmelidir.

Arter kanını hekim veya deneyimli hemşire alır.

Uygun arter seçilir. Femoral arterden sızma olasılığı nedeniyle kol arterleri tercih edilir.

Bölge temizlenir, turnike gerekmez.

Steril eldiven giyilir, damar 2 ve 3. parmaklarla palpe edilir ve iki parmak arasında sabitlenir,

enjektör dik tutularak artere girilir.

Heparinize enjektör kullanılır. Enjektör, arterin basıncıyla kendi kendine dolar ve hava kalmaz.

Enjektörün iğnesi kıvrılır ve buz üzerinde, hava alması engellenerek hızla laboratuvara ulaştırılır.

Plazma

Kandan kan hücrelerinin uzaklaştırılmasıyla elde edilen, serumdan farklı olarak fibrinojen ve diğer

pıhtılaşma faktörlerini de içeren sıvıdır. Plazma elde etmek için kanın pıhtılaşması antikoagülan

madde ile engellenmelidir. Antikoagülanlı kan 600 g’de 10 dak. santrifüj edilerek şekilli elemanlar

çöktürülür. Üstte kalan berrak, sarımtrak sıvı plazmadır. Serumda yapılan birçok analiz plazmada

da yapılabilir. Ancak, antikoagülan maddenin uygulanacak testlerle veya ölçülecek maddeyle

etkileşime girebileceği göz önünde tutulmalı ve antikoagülan seçiminde buna dikkat edilmelidir.

Fibrinojen ve protrombin gibi pıhtılaşma faktörleri ve HbA1c tayininde plazma kullanılır.

Antikoagülanların etkisi başlıca iki yolla oluşur:

1) Kandaki Ca2+

antikoagülan tarafından iyon halinde uzaklaştırılır. Kanın oksalat,

etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ve sitrat ile muamele edilmesi Ca2+

’un bağlanmasını

6

sağlayarak pıhtılaşmayı önler.

2) Protrombinin trombine dönüşmesinin engellenmesi için heparin ve diğer bazı

antikoagülanlar kullanılır.

Antikoagülan madde, kanın mL’si başına hesaplanarak önceden tübe konur. Gereğinden az

miktarda eklenen antikoagülan pıhtılaşmayı tamamen durduramadığından kan sayımında ve

sedimentasyonda yanlış sonuç alınmasına yol açar. Oksalat, EDTA, sodyum florür gibi

antikoagülanlar için kanın mL’si başına 1-2 mg yeterlidir.

Oksalatlar: Na+, K

+, NH4

+ veya Li

+-oksalat halinde kullanılır. Oksalat bileşikleri laktat

dehidrojenaz (LDH), amilaz ve asit fosfatazı inhibe eder. Potasyum oksalatlı plazmada eritrositler

büzülüp, amonyum oksalatlı plazmada şişeceğinden hematolojik analizlerde iki antikoagülanın

uygun oranda karışımları kullanılır. Amonyum oksalat, üre azotu ölçümlerinin yanlış çıkmasına

sebep olur.

EDTA (Etilendiamin tetraasetik asit): Sentetik amino asittir. Dipotasyum tuzu (K2-EDTA)

kullanılır. Kalsiyumla kelatlanarak pıhtılaşmayı önler. Plazma K+ düzeylerinin tayininde

kullanılmaz. Kan hücrelerini koruduğu için hematolojik incelemelerde, özellikle trombosit sayımı

ve analizlerinde tercih edilen bir antikoagülandır.

Sodyum sitrat: 9 kısım kana 1 kısım % 3.4-3.8 sodyum sitrat çözeltisi eklenmesi

antikoagülan etki için yeterlidir. Fakat sedimentasyon tayininde kullanılırken bu oran 3:1 olmalıdır.

Sitrik asitle tamponlanmış sitrat plazma pH’ını stabilleştirir. Pıhtılaşma analizlerinde ve trombosit

fonksiyon testlerinde trisodyum sitrat uygun bir seçenektir. Sitratlı kan: a) Proteinsiz süzüntü

eldesinde iyi sonuç vermez ve ürik asit tayinleri etkilenir. b) Transaminazları (ALT, AST) ve alkali

fosfatazı (ALP) inhibe, asit fosfatazı ise stimüle eder. c) Fosfat ölçümlerini bozar.

Heparin: Kimyasal testlerde en az etkileşime giren antikoagülandır. Na+, K

+, NH4

+ ve Li

+

tuzları halinde bulunur. Genellikle kan mL’si başına 20 U kullanılır. Hemolizin önlenmesi ve

ozmotik frajilite testleri için en uygun antikoagülandır. Heparinli kan: a) Hücre kümeleşmesi

yaptığından lökosit ve trombosit sayımında kullanılmaz. b) Asit fosfataz ve LDH’ı inhibe ettiği

bildirilmiştir. c) Serbest T3 ve T4 tayinlerinde yüksek sonuç bulunmasına yol açar.

İyodoasetat: 2 mg/mL konsantrasyonda glikolizi durdurur. Üreaza etki etmediğinden diğer

glikoliz inhibitörü olan sodyum florüre tercih edilir. Kreatin kinaz (CK) dışındaki enzimleri

etkilemez.

Sodyum florür (NaF): Zayıf bir antikoagülandır. Oksalat ile birlikte kullanılır. Florür iyonu

glikolizde görevli enolaz enziminin inhibitörü olduğundan kan glikoz tayinlerinde örnek uzun süre

bekletilecekse sodyum florürlü plazma seçilir. Yüksek konsantrasyonda üreazı inhibe ettiğinden

enzimatik yöntemle üre tayini yapılamaz. ALP, lösin aminopeptidaz (LAP) ve CK’ı inhibe eder.

7

Serum

Serum organizma için gerekli yapı taşlarını, makromolekülleri, vitamin ve hormonları, metabolizma

son ürünlerini, doku enzimlerini, anorganik maddeleri homojen olarak bulunduran, hücrelerden ve

pıhtılaşma faktörlerinden arınmış kan sıvısıdır. Bileşimindeki maddeler organik ve anorganik olmak

üzere iki grupta toplanabilir. Organik maddeler azotlu ve azotsuz bileşiklerden oluşur.

- Azotlu Maddeler:

Albumin, globulin, üre, ürik asit, kreatin, kreatinin, amino asitler, glutatyon, bilirübin

- Azotsuz Maddeler:

Glikoz, trigliserit, kolesterol, serbest yağ asitleri, safra asitleri

Serum eldesi: Damardan alınan kan, hemolizi önlemek için yavaşça bir santrifüj tübüne

boşaltılır. Oda sıcaklığında veya 37oC'lik etüvde kendi haline bırakılır. Kısa bir süre sonra

pıhtılaşma başlar ve 15-20 dakika içinde tüp kenarına yapışan bir pıhtı oluşur. Cam bir baget

yardımıyla pıhtı tüp kenarlarından ayrılır, santrifüj ile pıhtı ve şekilli elemanlar çöktürülür. Üstte

kalan açık sarı, berrak sıvı serumdur. Serum eldesini daha hızlandırmak ve kolaylaştırmak için son

yıllarda özel jel içeren santrifüj tüpleri kullanılmaktadır.

Kan sürekli hareket halinde olduğu için kan hücreleri plazma içinde dağılmış halde tutulur

ve fibrinolitik mekanizmalar sayesinde pıhtılaşma önlenir. Damar dışına çıkan kan pıhtılaşır.

Pıhtılaşmada temel reaksiyon, plazmada bulunan ve çözünür bir protein olan fibrinojenin

çözünmeyen fibrin haline dönüşmesidir. Bunun için yine plazmada bulunan trombin adlı proteine

gerek vardır. Pıhtılaşmada rol oynayan diğer faktörler gibi trombin de kanda inaktif formu olan

protrombin halinde bulunur. Protrombinin trombine dönüşmesi için Ca++

iyonlarına ve pıhtılaşma

faktörlerine ihtiyaç vardır. Karmaşık bir mekanizma ile aktiflenen pıhtılaşma faktörleri protrombini

trombine dönüştürür. Trombin de fibrinojenin fibrine dönüşmesini sağlar. Fibrin, yapışkan ince

iplikler halinde ağsı bir yapıdır; birbirine yapışarak ve kanın şekilli elemanlarını da içine alarak

çöker (pıhtılaşma), geriye sıvı faz (serum) kalır.

Genel olarak her analiz için 50-200 L örnek gerekir. Serum hacminin kan karşılığını

bulmak için üç katı, plazmanın kan karşılığı için gerekli hacmin iki katı alınmalıdır.

Vakumlu tüp sistemi: İlk defa 1947 yılında Joseph Kleiner tarafından damardan kan alınması

için tasarlanmıştır. Adaptör, iğne ve özel vakumlu tüpten oluşan bir sistemdir. Damar yoluyla kan

alınmasında özel tüpler yardımıyla gereken miktarda ve nitelikte kan alınır. Bu tüpler kapak

renkleriyle tanımlanır ve kullanılacağı teste uygun olarak bir kısmı antikoagülan içerir (Tablo 1).

Günümüzde ticari olarak tescillenmiş Vacutainer adıyla anılmaktadır.

8

Tablo 1. Vakumlu tüplerin kapak rengine göre özellikleri ve kullanım yerleri. Parantez içinde

antikoagülan/kan oranları (v/v) görülmektedir.

Kapak

Rengi Antikoagülan Kullanım Yeri

Kırmızı

(sarı) Yok Serum gerektiren analizler

Gri 10 mg K-oksalat +12.5 mg NaF Plazma (glikoz, laktik asit)

Mor %15 K2-EDTA 3.6 mg / 2 mL Tam kan (hematoloji, amonyak)

Mavi %3.8 Na sitrat (1:9) Plazma (pıhtılaşma testleri)

Yeşil Heparin Plazma gerektiren analizler

Lacivert Özel temizlenmiş Eser element analizleri

Siyah %3.8 Sodyum sitrat (1:3) Sedimentasyon

Serumun görünümünü etkileyen faktörler:

-Hemolizli serum/plazma: Hemoliz, eritrosit membran bütünlüğünün bozulması nedeniyle

hemoglobinin hücre dışına çıkmasıdır. Bu durum, fizyolojik sınırı aştığı takdirde serumun rengini

değiştirir ve bazı analizlerin sonucunu etkiler. Hemoglobin içeriği 15-20 mg/dL’yi aşarsa hemoliz

belirgin olur ve serum pembe renkte görünür. Hemolizli serumun rengi, serumun

proteinsizleştirilmesi ile kaybolur. Böylece üre ve bilirübin miktar belirtimi gibi ölçümlerde

serumun renginden doğabilecek hatalar önlenir.

-Lipemik serum/plazma: Lipemik serum genellikle 400 mg/dL’den fazla nötral lipit içerir.

Bu durum serumun berraklığını etkiler ve bulanıklıktan süt beyazlığına kadar değişen bir görünüme

yol açar.

-Bilirübinli serum/plazma: Sarı-turuncu renktedir. Bu durum birçok spektrofotometrik tayini

etkiler. Bilirübin, biliverdine oksitlenir ve kolesterol tayininde (Liebermann-Burchardt metodu)

oluşan yeşil rengi arttırır. Bilirübin dışındaki analizlerde bilirübinli serum sulandırılarak veya deney

körü yapılarak kullanılmalıdır.

Serumun içerdiği anorganik maddelerin başlıcaları şunlardır:

- Katyonlar: Sodyum, potasyum, magnezyum, kalsiyum, amonyum

- Anyonlar: Bikarbonat, sülfat, fosfat, klorür

Bazı deneyler için proteinsiz serum filtratı hazırlanması: Serumda protein konsantrasyonu

diğer bileşenlere göre oldukça fazladır. Bu durum, protein dışı bazı maddelerin tayininde yanlış

sonuçlara neden olabilir. Protein dışı maddelerin tayininde, proteinler çözünmez tuzlar halinde

çöktürülerek uzaklaştırılır. Bunun için asit ortamda katyon olan proteinler tungstat, molibden,

triklorasetik asit gibi anyonlarla; anyonik özellikteki proteinler ise çinko, kadmiyum, cıva, kurşun

9

gibi katyonlarla çöktürülebilir. Protein çöktürüldükten sonra santrifüjle süpernatan ayrılır.

Proteinsizleştirme için en sık kullanılanlar triklorasetik asit (TCA) ve Folin-Wu yöntemleridir.

TCA filtratı eldesi: 1 hacim serum/plazma ve 9 hacim %5'lik TCA iyice karıştırılır, 5 dakika

bekletildikten sonra filtre veya santrifüj edilir.

Yapılacak deney için ortam asitliğinin önemsiz olduğu durumlarda serum üzerine eşit hacimde %20

TCA konulur. En uygun protein denatürasyonu, TCA’nın son konsantrasyonunun %10 olduğu

ortamda gerçekleşir.

Folin-Wu filtratı eldesi: 1 hacim serum/plazma, 8 hacim saf su, 0.5 hacim 1/12 N H2SO4 ve 0.5

hacim % 10'luk Na2WO4 (sodyum tungstat) ağzı kapalı bir tüpte karıştırılır, 10 dakika beklenir,

filtre veya santrifüj edilir. Berrak bir filtrat elde edilmesi için sülfürik asidin taze hazırlanmış olması

gerekir. Kanı proteinsizleştirmek için ise 1 hacim kan, 7 hacim saf su, 1 hacim 1/12 N H2SO4 ve 1

hacim % 10'luk Na2WO4 karışımı kullanılır.

Yoğun filtrat eldesi için proteinsizleştirme: 2 mL serum, 3 mL saf su, 1 mL % 10'luk Na2WO4, 2

mL 0.67 N H2SO4 sırasıyla karıştırılır. 5 dakika santrifüj edilir.

10

B- HEMOGLOBİN YAPIM VE YIKIM ÜRÜNLERİ İLE İLGİLİ TESTLER

İdrarda porfirinler ve porfobilinojen

Porfirinlerin yapısında dört pirol halkasının meten (=CH-) köprüleri ile birbirine bağlanarak

oluşturduğu porfin iskeleti bulunur. Porfirinler pirol halkalarının dış köşelerindeki karbon

atomlarına bağlı sekiz alifatik zincir (ek grup) taşırlar ve bu zincirlerdeki farklılıklara göre değişik

porfirin türleri ortaya çıkar. Üroporfirin 4 asetik asit ve 4 propiyonik asit, koproporfirinler ise 4

metil ve 4 propiyonik asit ek grupları taşımaktadırlar. Hem halka yapısının çekirdeğini oluşturan

protoporfirinlerde ise 4 metil, 2 vinil ve 2 propiyonik asit takıları bulunur.

Organizmada porfirin sentezi aşamalarında çoğunlukla genetik nedene bağlı bozukluklar,

klinikte Porfiria adıyla anılan hastalıkların görülmesiyle sonuçlanır. Bu hastalık grubunda, enzim

yetersizliğinin bulunduğu aşamaya göre, -amino levülinik asit (ALA), porfobilinojen (PBG),

üroporfirin, koproporfirin gibi ara maddelerde artış ve dolayısıyla bu maddelerin idrar (ve dışkı) ile

atılımı görülmektedir. Farklı yollarla vücut dışına atılan porfirinler mor renkli bileşiklerdir. Sekiz

karboksil grubu taşıdığı için suda çözünürlüğü fazla olan üroporfirin idrarla, dört karboksil grubu

taşıyan koproporfirin ise idrar ve dışkı ile atılır. Vücuttan dışkı ile uzaklaştırılan protoporfirin ise iki

karboksil grubu taşımaktadır.

Akut klinik belirtilerle veya deri lezyonları ile ortaya çıkan porfirialarda görülen akut

belirtiler arasında karın ağrısı, kabızlık, hipertansiyon, taşikardi ve nöropsikiyatrik bulgular yer

almaktadır. Işığa duyarlılık, ışık gören vücut bölgelerinde deri lezyonları, pigmentasyon artışı ve

hipertrikoz, cilde ait belirtiler arasındadır. Bazı porfirialarda her iki grup belirti birlikte

görülebilmektedir. Üroprofirinojen, koproporfirinojen ve protoporfirinojen, yapılarında metilen (-

CH2) köprüleri bulunması ve konjuge bağ sistemi olmaması nedeniyle renksizdir. Buna karşılık

porfirinler yapılarındaki konjuge bağ sisteminin rezonans yapma özelliği nedeni ile karakteristik

absorpsiyon spektrumu verir. Kuvvetli asit veya organik çözücülerle ekstre edilen porfirinler

ultraviyole ışıkta kuvvetli pembe-kırmızı floresans verir. Bu özelliklerinden klinik tanıda

yararlanılır.

11

İdrarda Porfobilinojen Aranması (UYGULAMA 1)

Porfobilinojen, hem sentezi sırasında organizmada oluşan bir ön maddedir. İdrarda porfobilinojen

aranması porfiriaların, özellikle hepatik ve eritropoietik porfiriaların ayırıcı tanısında önemlidir.

İdrarda porfobilinojen Watson-Schwartz testi ile aranır. Bu test, porfobilinojenin asit ortamda p-

dimetilaminobenzaldehit ile kırmızı renk oluşturması prensibine dayanır.

Ayıraçlar:

- Ehrlich Ayıracı: 0.7 g p-dimetilaminobenzaldehit 100 mL saf suda çözündürülür, üzerine yavaşça

150 mL derişik HCl eklenir.

- Doymuş sodyum asetat

- Kloroform

Deneyin yapılışı:

2.5 mL taze idrar üzerine eşit hacimde Ehrlich ayıracı konulur, iyice karıştırılır ve 30 saniye kadar

beklenir. Üzerine 5 mL doymuş sodyum asetat eklenir ve karıştırılır. Bu karışımın pH’sı 5.5 civarında

olmalıdır. (Gerekirse doymuş sodyum asetatla pH 5.5’e ayarlanır).

Testin bu aşamasında idrarda porfobilinojen, ürobilinojen veya indol varsa pembe renk görülür.

Pembe renk görülmezse deney sonlandırılır. Pembe renk görülürse:

- Tübe 5 mL kloroform eklenir, karıştırılır. Kısa bir süre sonra tüpte 2 tabaka oluşur; üstte sulu

faz, altta ise kloroform fazı yer alır.

- Sulu fazda pembe renk görülürse idrarda porfobilinojen vardır. (Porfobilinojen kloroformda

çözünmez.)

- Pembe renk kloroform fazında ise, idrarda ürobilinojen vardır.

Bilirübin, ürobilinojen ve ürobilin

Normal yaşam sürelerinin sonunda retiküloendotelyal sistem hücrelerinde parçalanan eritrositlerden

açığa çıkan hemoglobin, hem ve globine ayrılır. Hem halkası bir noktasından açılarak demirini

kaybeder ve biliverdin meydana gelir. Biliverdin dokularda indirgenerek bilirübine çevrilir. Oluşan

bilirübin kan dolaşımı ile karaciğere gelir, burada glikuronik asitle birleşir ve suda çözünebilen

direkt bilirübin haline geçer. Direkt bilirübin karaciğer hücresinden safra yollarına verilir, safra

yollarıyla da ince bağırsağa gelir.

Bilirübin metabolizması dört aşamada incelenebilir:

1) Serbest (indirekt) bilirübin oluşumu

2) Serbest bilirübinin karaciğer hücresine girişi (transport)

3) Bilirübinin glikuronidleşmesi (glikuronik asitle konjugasyon)

12

4) Bağlı bilirübinin safra yollarına verilmesi (ekskresyon)

İdrarda normalde bilirübin bulunmaz. Bilirübinin idrara çıkışına bilirübinüri denir.

Bilirübinüri görülebilmesi için, direkt bilirübinin kanda artması gerekir. Sadece direkt (bağlı)

bilirübin idrara geçebilir. Serbest bilirübin suda çözünmeyen, kan düzeyleri artsa bile idrarda

bulunmayan, kan-beyin engelini kolayca aşabilen bilirübindir. Bağlı bilirübin ise glikuronik asitle

bağlanan, suda çözünen ve kanda düzeyi arttığı hallerde idrara çıkan bilirübindir.

Bilirübin düzeylerinin kanda artmasına hiperbilirübinemi denir. Bilirübin sarı renkli bir

bileşik olduğundan kanda artması halinde özellikle mukozalarda ve gözün sklerasında sarı pigment

artışı görülür. Bu tabloya sarılık (ikter) adı verilir

Bilirübin düzeylerinin kanda yükselmesi aşağıdaki nedenlere bağlı olabilir:

- Vücutta karaciğerin uzaklaştırabileceğinden daha fazla bilirübin oluşumu,

- Karaciğerin normal miktarda oluşan bilirübini uzaklaştırmada yetersiz kalışı,

- Safraya atılan bilirübinin bağırsağa salgılanmasında mekanik bir engel olması.

İkterler, bilirübin metabolizmasındaki bozukluğun ortaya çıktığı aşamaya göre hemolitik,

hepatik, ve mekanik (obstrüktif) ikter olmak üzere üçe ayrılır. Hemolitik ikterlerde karaciğere bağlı

bir neden olmaksızın, eritrositlerin aşırı yıkılmasına bağlı olarak bilirübin oluşumu artar. Bu tip

ikterlerde kanda indirekt yani karaciğerde glikuronidleşmemiş, suda çözünmeyen bilirübin

konsantrasyonu yükselir. Deride ve mukozalarda sararma olduğu halde idrarda bilirübin görülmez,

çünkü artan indirekt bilirübin suda çözünemediği için böbreklerden süzülüp idrarla atılamaz.

Hepatik ikterlerde karaciğer hücresindeki hasar veya hastalık nedeniyle bilirübin, ya

glikuronik asitle bağlanamaz (konjugasyon bozuktur), ya da safra yoluna verilemez (ekskresyon

bozuktur). Bu durumda da hem indirekt, hem de direkt bilirübin artışı olur. İdrarda bilirübin

bulunur.

Mekanik ikterlerde ise safra yollarını tıkayan safra taşı, pankreas veya safra kanalı tümörü

gibi nedenler söz konusudur. Bu durumda bilirübinin çoğu karaciğerde direkt bilirübin haline

geçtiği halde tıkanıklık yüzünden safra yoluyla bağırsağa atılamaz. Bu hastaların kanında artan

direkt bilirübin idrara da geçer ve idrar çay rengini alır. Ayrıca bilirübin tıkanma nedeniyle

bağırsağa geçemediği için, bilirübinden normalde bağırsakta oluşan ve dışkıya rengini veren

sterkobilinojen (ve sterkobilin) de sentezlenemez. Bu hastaların dışkıları renksiz olur.

Normalde kanda total bilirübin % 0.2-1 mg’dır. Direkt bilirübin düzeyi 0.2 mg/dL’yi

geçmez. Direkt bilirübinin idrara geçmesi için kanda %1.2-1.4 mg'ın üzerine çıkması gerekir

(böbrek eşiği). Kanda bilirübin 2-2.5 mg’ı geçtiğinde dokulara yayılır ve sarılık (ikter) görülür.

Bilirübin tayin yöntemleri Diazo reaksiyonu (bilirübin ile diazolandırılmış sülfanilik asidin

birleşerek renkli kompleksler oluşturması) prensibine dayanır. Bağlı bilirübin bu reaksiyonu kolaylıkla

verirken, serbest bilirübin ortama metil alkol, kafein-sodyum benzoat, dimetil sülfoksit gibi bir

13

reaksiyon hızlandırıcı kimyasallar eklendikten sonra bu reaksiyonu verir. Bu nedenle serbest bilirübin

"indirekt", bağlı bilirübin "direkt" bilirübin olarak adlandırılır.

Serumda Bilirübin Tayini

Serumda bilirübin tayini için diazo reaksiyonuna dayanan iki yöntem kullanılmaktadır.

1- Evelyn-Malloy metodunda, bilirübin asit ortamda diazo ayıracı ile kırmızı-mor renk

oluşturur. Klasik Evelyn-Malloy yönteminde serum veya plazma üzerine önce metanol eklenir,

böylece serbest bilirübinin çözünmesi sağlanır. Daha sonra ortama diazolandırılmış sülfanilik asit

eklenmesi ile kırmızı-mor renkli azobilirübin kompleksi oluşur (total bilirübin). Aynı deney metanol

içermeyen bir ortamda yapılırsa sadece direkt bilirübin ölçülür. Total bilirübin ile direkt bilirübin

düzeyleri arasındaki fark ise indirekt bilirübin düzeylerini verir.

2- Jendrassik-Grof metodunda serum veya plazma sodyum asetat, kafein ve sodyum

benzoat içeren bir ortama konur, daha sonra diazolandırılmış sülfanilik asit eklenir. Kırmızı-mor

renkli azobilirübin oluşur. Sodyum asetat ortamda uygun pH’ı, kafein-sodyum benzoat serbest

bilirübinin intramoleküler bağlarının açılmasını ve böylece bilirübinin diazolandırılmış sülfanilik

asitle reaksiyona girmesini sağlar. Daha sonra ortama eklenen askorbik asit reaksiyonu durdurur.

Alkali tartarat eklenmesi ile de oluşan kırmızı-mor renkli azobilirübinler mavi renkli

azobilirübinlere dönüştürülerek spektrofotometrik ölçüm için daha uygun bir ortam yaratılır.

Son yıllarda metanol veya kafein-sodyum benzoat dışında bu görevi yapan dimetil sülfoksit,

2,4-dikloranilin gibi birçok kimyasal bileşik kullanılmaktadır. Bilirübin ışığa duyarlı olduğu için,

deney materyalinin ışığa maruz kalmamasına özen gösterilmelidir.

Evelyn-Malloy Metodu ile Serumda Bilirübin Tayini (UYGULAMA 2)

Ayıraçlar:

- Asitlenmiş Metanol: 58 mL metanol ve 5 mL 1 N HCl alındı ve 100 mL’ye distile su ile

tamamlanır.

- Sülfanilik asit: 0.5 g sülfanilik asit distile ile 100 mL’ye tamamlanır.

- Sodyum nitrit %20’lik:1 g NaNO2, 5 mL distile suda çözünerek hazırlanır.

- Diazo Ayıracı: 6 mL sülfanilik asit ile 20 L sodyum nitrit deneyden hemen önce karıştırılır.

- 0.05 N HCl

14

1- Total Bilirübin Tayini:

Ayıraçlar (mL)

Kör

Deney

Metanol 4.75 4.75

Serum 0.25 0.25

Sülfanilik asit 0.5 -

Diazo ayıracı - 0.5

8 dakika beklenir ve deney tübünde oluşan kırmızı-mor rengin absorbansı köre karşı

spektrofotometrede 570 nm’de okunur. Standart olarak, içerdiği bilirübin miktarı önceden belirlenmiş

serum (standart veya kalibran serum) kullanılır.

2- Direkt Bilirübin Tayini:

Ayıraçlar (mL)

Kör

Deney

0.05 N HCl 4.75 4.75

Serum 0.25 0.25

Sülfanilik asit 0.5 -

Diazo ayıracı - 0.5

1 dakika beklenir, deney tübünde oluşan kırmızı-mor rengin absorbansı köre karşı 570’nm de

spektrofotometrede okunur ve standart serum kullanılarak miktar tayini yapılır.

İdrarda Bilirübin Aranması (UYGULAMA 3)

İdrarda bilirübin iki farklı prensibe dayanan yöntemlerle aranır.

1- Diazolandırma testleri: Bilirübin, diazo ayıracı emdirilerek hazırlanmış olan ticari şeritlerde

renkli kompleksler oluşturur.

Asit

Bilirübin diglikuronid + Diazonium tuzu Azobilirübin (Kahverengi)

2- Oksidasyon testleri: Bilirübinin yeşil renkli bir pigment olan biliverdine oksidasyonuna

dayanır.

Gmelin testi: Bir deney tübüne 2 ml idrar konulur. Tüp eğilir ve kenarından, altında

tabakalanmak üzere, derişik nitrik asit yavaşça dökülür. İdrarda bilirübin varsa, idrarın nitrik asitle

15

değinme yüzeyinin biraz üzerinde yeşil renkli bir halka (biliverdin) oluşur. Bu test bilirübine özel

değildir; indikan, formalin, timol, potasyum iyodür de aynı sonucu verebilir.

Rosin-Trousseau testi: Deney tübünebir miktar idrar konulur. Tüp eğik durumda iken üzerine

birkaç mL %1'lik alkol-iyot karışımı pipetlenerek tabakalanması sağlanır. İdrarda bilirübin varsa,

değinme yüzeyinde belirgin yeşil bir halka oluşur.

İdrarda Ürobilinojen Aranması (UYGULAMA 4)

Bilirübin (36 H) karaciğerde glikuronidleşip, safra yoluyla bağırsağa atıldıktan sonra burada

glikuronidaz enziminin kataliziyleglikuronik asitten ayrılır; bağırsak bakterileri tarafından

indirgenerek önce ürobilinojen (42 H), tekrar indirgendiğinde sterkobilinojen (48 H) denilen

tetrapirol bileşikleri oluşturur. Ürobilinojen, bağırsağın üst kısımlarında enterohepatik dolaşımla

karaciğer hücrelerine geri döner, bu sırada bir miktar ürobilinojen de böbreklerden süzülerek idrara

geçer. Bu nedenle idrarda az miktarda ürobilinojen bulunabilir (< 4 mg/ gün).

Sarılıkların ayırıcı tanısında idrarda ürobilinojen aranması önemlidir. Ürobilinojen ışığa

duyarlı bir bileşik olduğundan taze örnekle çalışılması gerektiği unutulmamalıdır. Ürobilinojen

atılımı gün içerisinde değişiklik gösterdiğinden (diurnal patern) en uygun örnek öğle saatlerindeki

idrardır. Günümüzde idrarda ürobilinojen ölçümünde test stripleri kullanılmaktadır.

Ames ürünleri; p-dimetilaminobenzaldehit (Ehrlich ayıracı) ile oluşan basit renk

reaksiyonuna dayanır. Ancak reaksiyon ürobilinojene özgü değildir. Diğer Ehrlich pozitif ürünler de

(porfobilinojen, PAS) pozitif sonuç verebilir.

Ehrlich reaksiyonu: 3-5 mL idrara birkaç damla Ehrlich ayıracı damlatılır ve çalkalanır.

Ürobilinojen ya da sterkobilinojen varsa, zayıf ya da kuvvetli pembe-kırmızı bir renk görülür (beyaz

zemine tutulan tübün üst kısmından bakılmalıdır). Normal idrarda az miktarda ürobilinojen

çıktığından hafif pembe renk oluşabilir. Daha koyu pembe-kırmızı renk değişimi için + , ++ , +++

olarak değerlendirme yapılır.

Schwartz - Watson testi: Bu test aynı zamanda porfobilinojen aramak için kullanılır.

Ayıraçlar:

- Ehrlich ayıracı: 2 g p-dimetilaminobenzaldehit 50 mL distile suda çözünür, üzerine 50 mL

derişik HCI eklenir.

- Doymuş sodyum asetat

- Kloroform

Deneyin yapılışı:

Bir tübe bir miktar idrar alınır ve üzerine Ehrlich ayıracından eşit hacim katılır, toplam

hacim kadar da doymuş sodyum asetat eriyiği konur, karıştırılır. Kırmızı renk meydana gelirse, bir

miktar kloroform da eklenerek 2 dakika çalkalanır ve organik fazla su fazı ayrışıncaya kadar

16

bekletilir. Üstteki su tabakası pembe-kırmızı kalırsa porfobilinojen vardır. Bu renk kloroform fazına

geçerse ürobilinojen var demektir.

İdrarda Ürobilin Aranması (UYGULAMA 5)

Ürobilin, ürobilinojenin oksitlenmiş şeklidir. Normal idrarda görülmez. Ürobilinojenli idrar

bir süre bekletilirse ürobilinojen ürobiline dönüşür. İdrarda ürobilin Schlesinger ayıracı (çinko asetat

ayıracı) ile aranır. İdrarda bilirübin varsa, ürobilin deneyi için ortamdan bilirübinin uzaklaştırılması

gerekir. 5-10 mL idrara 5 g CaCl2 eklenir, biraz bekletilir ve süzülür. Süzüntüde ürobilin aranır.

Ayıraçlar:

- Lugol Ayıracı: 5 g iyot, 10 g potasyum iyodür 100 mL distile suda çözündürülür.

- Schlesinger Ayıracı: 10 g çinko asetat 100 mL % 90'lık etil alkolde çözündürülür.

Önce ürobiline oksitlenmemiş ürobilinojeni de ürobiline dönüştürmek için idrara lugol ayıracı eklenir.

5 mL idrara 2-3 damla lugol ayıracı damlatılır ve 10 dakika bekletilir. Üzerine 5 mL Schlesinger

ayıracı eklenir, karıştırılır ve filtre kağıdı yardımıyla süzülür. Süzüntünün yeşil floresans vermesi

idrarda ürobilin olduğunu gösterir. Reaksiyon 1-2 saat içerisinde daha da belirginleşir.

Kanda Hemoglobin Ölçümü (UYGULAMA 6)

Kan hemoglobin düzeyi siyanmethemoglobin yöntemi ile tayin edilir. Bunun için Drabkin Ayıracı

kullanılır.

Drabkin Ayıracı: 140 mg potasyum dihidrojenfosfat, 200 mg potasyum ferrisiyanür ve 50 mg

potasyum siyanür 1100 mL suda çözünür.

Deneyin yapılışı: 5 mL Drabkin ayıracı üzerine 20 l EDTA'lı tam kan pipetlenir, birkaç kez

ayıraç çekilip bırakılarak pipet yıkanır. Hemoglobin, ayıraçtaki ferrisiyanür ile methemoglobine

oksitlenir; bu madde potasyum siyanür ile daha dayanıklı bir bileşik olan siyanomethemoglobine

dönüşür. 5 dakika sonra absorbans spektrofotometrede 540 nm'de ayıraç körüne karşı okunur.

Hemoglobin standardı veya ekstinksiyon katsayısı (molar absorptivite) kullanılarak kandaki

hemoglobin değeri hesaplanır.

Ekstinksiyon katsayısı kullanılırsa:

Siyanmethemoglobinin 1/4’ü için milimolar (mM) ekstinksiyon katsayısı= 11

Hemoglobin mol ağırlığının ¼’ü = 16114

17

Kullanılan kan örneğinin sulandırma katsayısı: 1/251’dir. Doğru orantı ile:

Absorbans x 251

11

Formülünden çıkan sonuç (a), kanda milimol/L (milimolar) cinsinden hemoglobini verir. Bunu mg’a

çevirmek için:

1 mM Hb çözeltisi 16 114 mg Hb içerdiğine göre,

(a) mM çözelti x mg Hb içerir.

Absorbans x 251 x 16114

11

işleminin sonucu mg/L cinsinden Hb’i verir.

Bu rakam, 1000’e bölündüğünde g/L, 10000’e bölündüğünde ise g/dL olarak Hb değeri elde edilir.

Formülün son şekli:

Absorbans x 251 x 16114

11 x 10000

Kısaltıldığında: Absorbans x 36.8 = g/dL Hb

Normal Hemoglobin Değerleri: Erkekte: 14-18 g/dL

Kadında: 12-16 g/dL

Hematüri ve Hemoglobinüri (UYGULAMA 7)

Eritrositler yüz yirmi gün dolaşımda kaldıktan sonra retiküloendotelyal sistem (karaciğer, dalak ve

kemik iliği) hücreleri tarafından parçalanır. Bazı patolojik durumlarda eritrositler, normal

ömürlerini tamamlamadan ve henüz dolaşımda iken yıkılır. Bu sırada eritrositlerden plazmaya

geçen hemoglobin plazma proteinlerinden haptoglobine bağlanarak karaciğere taşınır. Hemoglobin-

haptoglobin kompleksinin molekül ağırlığı büyük olduğundan böbrek glomerüllerinden süzülmez.

Böylece hemoglobin (yapısındaki demir) organizmada tutulmuş olur. Haptoglobin bağlama

kapasitesinden fazla hemoglobin varsa idrarla atılır.

İdrarda serbest hemoglobin bulunmasına hemoglobinüri, bütünlüğü bozulmamış eritrosit

bulunmasına hematüri denir.

Normal idrarda hemoglobin ve eritrosit yoktur. Hemoglobinüride ve hematüride idrar koyu

renklidir. İdrarda hemoglobin (eritrosit içinde veya serbest halde) aranması için ticari kâğıt şeritler

kullanılır. Testin sonucu pozitif olan idrarda ikisini ayırdetmek için mikroskopta idrar sedimenti

incelenir. Sedimentte eritrosit hücrelerinin görülmesi hematüri olduğunu kanıtlar, hücre görülmezse

koyu rengin nedeni hemoglobindir.

18

Benzidin deneyi: Hemoglobindeki pseudoperoksidaz aktivitesinin

H2O2 ve benzidin

arasındaki oksidoredüksiyon reaksiyonunu katalizlemesi sonucunda renksiz benzidin, mavi-yeşil

renkli dehidrobenzidine dönüşür. Hem hematüride, hem de hemoglobinüride pozitif sonuç verir.

Deneyin yapılışı:

Benzidin türevleri ve H2O2 içeren kâğıt şeritler kullanılır. Bir tablet, beyaz kâğıt üzerine

konur ve üzerine 1 damla idrar damlatılır. 1-2 dakika sonra kağıda yeşil-mavi bir renk geçmişse

idrarda hemoglobin vardır.

Bu test idrarda lökosit varlığında yanlış pozitif, askorbik asit gibi idrarla atılan bazı antioksidan ilaçları

varlığında ise yanlış negatif sonuç verebilir.

19

2- METABOLİZMA DİLİMİ UYGULAMASI

A- KARBONHİDRAT METABOLİZMASI İLE İLGİLİ TESTLER

Karbonhidrat metabolizması ile ilgili değerlendirmeler, genellikle vücut sıvılarında glikoz düzeyleri

ölçülerek yapılır. Bu amaçla en sık kullanılan örnek kandır. Glikoz düzeyleri tam kan, serum veya

plazmada ölçülebilir. Ölçüm serum veya plazmada yapılacaksa kanın şekilli elemanları hızla

uzaklaştırılmalıdır. Böylece eritrositlerin içerisindeki glikolitik enzimlerin kan glikoz değerini

etkilememesi sağlanır. Tam kan halinde bekletilirse glikoz değeri olduğundan daha düşük bulunur.

Bu nedenle özellikle antikoagulan olarak sodyum florür ile elde edilen plazma tercih edilir. Florür,

glikolitik enzimlerden enolazı inhibe ederek glikozun parçalanmasını engeller; aynı zamanda oda

sıcaklığında 24 saat dayanmasını sağlar. Ölçümler hemen yapılmıyorsa serum veya plazmanın

buzdolabında saklanması uygundur. Oda sıcaklığında ilk 1 saat sonunda kanda glikoz değeri %7

oranında azalır. Buzdolabında bekletildiği takdirde 72 saat dayanıklıdır.

Glikoz tayinleri genellikle 8-12 saatlik bir açlık süresini takiben sabah alınan kan örneklerinde

yapılır. Glikoz tayinleri sulu fazda yapıldığı için, tam kandaki hücre hacminin alınan sıvı hacmini

etkilemesi nedeniyle tam kanda elde edilen glikoz değerleri, serum veya plazma değerlerinden %

10-15 kadar daha düşük bulunur. (Tam kanın % 84'ü, plazmanın ise % 93'ü sudur.) Arter kanında

glikoz venöz kandakinden 5 mg/dL daha yüksektir. Kapiller kan değeri de venöz kandakinden daha

yüksektir. Hemolizli örnekler glikoz tayini için uygun değildir.

Kanda Glikoz Ölçümü İçin Kullanılan Yöntemler

A) Enzimatik Yöntemler

Glikoza özgü hassas yöntemlerdir. Bu amaçla glikoz oksidaz veya heksokinaz enzimleri kullanılır.

1- Glikoz Oksidaz Yöntemi (UYGULAMA 1)

Deneyin prensibi: Glikoz oksitlenerek glikonik aside dönüşürken hidrojen peroksit oluşur. Oluşan

hidrojen peroksit, peroksidaz enziminin kataliziyle suya indirgenirken ortamdaki renksiz kromojen

madde oksitlenerek renkli bir bileşiğe dönüşür.

20

Sonuçta ortamdaki glikoz miktarına eşit olan oksitlenmiş kromojen miktarı spektrofotometrik olarak

ölçülür. Kromojen olarak aminofenazon+fenol kullanılmakla beraber başka seçenekler de vardır (o-

dianisidin gibi).

Ayıraçlar:

1) Tampon: Fosfat tamponu 150 mM

Fenol 10 mM

2) Enzimler: Aminofenazon 0.4 mM

Peroksidaz >300 U/L

Glikoz oksidaz > 15000 U/L

1 ve 2 no'lu ayıraçlar deneye başlamadan önce eşit hacimde karıştırılır.

3) Standart: 200 mg/dL glikoz çözeltisi

Deneyin yapılışı: Üç tüp alınır ve aşağıdaki tabloda belirtilen şekilde hazırlanır.

Tüpler karıştırılır, 370C'de 10 dakika veya 20-25

0C’de 20 dakika inkübe edilir. Reaksiyonu

durdurmak için tüpler soğuk suya konur. Deney ve standart tüplerin absorbansları 505 nm’de ayıraç

körüne karşı okunur. Bu yöntemle ölçülen plazma açlık glikoz değeri 70-110 mg/dL’dir.

Glikoz oksidaz enzimi yalnız-D glikoz ile reaksiyonlaşır. Bu nedenle glikoz tayininde kullanılan

standart solüsyon en az iki saat bekletilir. Çünkü kristal glikoz, anomerik formdadır. Suda

21

çözündüğünde mutarotasyon ile %36 oranında alfa, %64 oranında beta formunu alır. Çok az miktarı

serbest aldehit şeklinde kalır. Bu oranlar glikoz çözeltisinin denge halidir.

2- Heksokinaz Yöntemi:

Deneyin prensibi:

Ortamdaki glikoz, önce fosforillenir.

Fosforillenen glikoz, oksidasyona uğrar.

Ürün olarak açığa çıkan NADH (NADPH)’ın absorbansı spektrofotometrede 340 nm’de

ölçülür.

Ayıraç içinde bulunan heksokinaz ortamdaki bütün heksozların fosforillenmesini sağlar, ancak

glikoz 6-fosfat dehidrojenazın substratı yalnız glikoz 6-fosfattır. Bu nedenle glikoza özgü bir

yöntemdir. Heksokinaz yönteminin maliyeti yüksek olduğundan rutin laboratuvarlarda genellikle

glikoz oksidaz yöntemi kullanılmaktadır.

B) İndirgeme Yöntemleri

Glikozun sıcak ve alkali ortamda indirgeyici özelliğine dayanan yöntemlerdir. Ancak sonuçlar ürik

asit, kreatinin, glutatyon gibi diğer indirgeyici maddeler tarafından da etkilendiği için bu yöntemler

glikoza spesifik değildir. Somogyi-Nelson Yöntemi glikozun indirgeyici özelliğinden yararlanılarak

oluşturulmuş yöntemlerden biridir. Proteinsizleştirilmiş serum filtratında çalışılır. Ortama eklenen

ayıraçtaki Cu2+

, glikoz etkisi ile Cu+'e indirgenir. Cu

+, arsenomolibdik asit ile reaksiyona girerek onu

molibden mavisine çevirir. Oluşan renk şiddeti spektrofotometrede ölçülür.

İdrarda Glikoz aranması, Fehling ve Benedict Testleri

Normal koşullarda idrarda glikoz veya diğer bir monosakkarit bulunmaz. Ancak sütteki disakkarit

olan laktozun gebelik ve lohusalık dönemlerinde idrarda çıkması fizyolojiktir. Monosakkaritler

arasında idrar patolojisi açısından en önemlisi glikozdur. Dolaşımdaki glikoz böbrek

glomerüllerinden süzülür ve tubuluslardan geri emilir. İdrarda glikozun varlığı genellikle kan glikoz

düzeyinin yükseldiğine işaret eder. Normalde kan glikoz düzeyleri 70-100 mg/dL arasındadır.

Kandaki konsantrasyon, glikozun tubuluslardan geri emilimi için böbrek eşiği olan 160 mg/dL'yi

22

aştığında idrara glikoz çıkmaya başlar. İdrarda glikoz bulunmasına glikozüri denir.

İdrarda şeker olup olmadığını anlamak için karbonhidratların indirgeyici özelliklerine

dayanan deneyler uygulanır. Sıcak ve alkali ortamda glikozun indirgeyici olmasından yararlanılarak

geliştirilmiş yöntemlerdir. Bu yöntemler, glikozun yanında laktoz, früktoz, galaktoz, pentoz gibi

karbonhidratlarla ve ürik asit, kreatinin, glutatyon gibi indirgeyici özelliği olan diğer maddelerle

pozitif sonuç verdiği için özgün değildir.

İdrarda glikoz aramak için glikoz oksidaz, peroksidaz ve bir kromojenin (o-toluidin) birlikte

emdirildiği kağıt şeritler de kullanılabilir. Bu şeritler indirgeme yöntemlerinden daha hassastır. Ancak

idrarda askorbik asit ve ürik asit miktarları artmışsa karbonhidratların reaksiyonu baskılanabilir.

Piyasada bulunan bazı kağıt şeritler, indirgeme yöntemlerine göre hazırlanmıştır.

Fehling Testi (UYGULAMA 2)

Ayıraçlar:

- Fehling I : %7 CuSO4

- Fehling II: 350 g Sodyum-potasyum tartarat, 100 g NaOH litreye su ile tamamlanır.

Deneyin yapılışı:

1) Bir tübeeşit hacim Fehling I ve Fehling II ayıraçları konur ve açık alevde kaynatılır. Sıcakta

ayıracın rengi değişmemelidir. Bu durum ortamda indirgen madde olmadığını gösterir.

2) Kaynatılmış tüpe, ayıracın hacmi kadar idrar eklenir ve kaynatmaya devam edilir. Eğer

glikoz varsa turuncu-kırmızı renkli bir çökelti oluşur.

Deneyin prensibi: Her iki ayıraç karıştırıldığında aşağıdaki reaksiyon oluşur:

CuSO4 + 2NaOH Cu (OH)2 + Na2SO4

Oluşan bakır (iki) hidroksit, mavi renklidir. Alkali ortamda çökelir. Bu çökelmeyi önleyen, Fehling II

ayıracındaki tartarat tuzudur. Böylece çözünmüş halde kalan bakır, şeker tarafından indirgenebilir.

(Bakırın indirgenmesine ilişkin açıklamalar için 1. sınıf uygulamalarına bakınız).

Benedict Testi (UYGULAMA 3)

Benedict ayıracı: 173 g sodyum sitrat, 100 g Na2CO3, 17.3 g CuSO4 saf su ile litreye tamamlanır.

Deneyin yapılışı: Bir tübe 5 mL Benedict ayıracı konur. Üzerine 8 damla idrar katılır,

karıştırılır ve kaynar su banyosunda 3 dakika tutulur. (İdrar 8 damladan fazla konulmamalıdır.

Ortamda fazla idrar varsa fosfatlar çökeleceğinden sonuç net olmaz.)

Tüp kaynar su banyosundan çıkarıldıktan sonra aşağıdaki gözleme dayanarak değerlendirme

yapılır:

23

Kül rengi veya beyaz çökelti fosfatlardan ileri gelir.

İdrarda Bulunan Şeker Türünün Saptanması

Glikozdan başka şekerler de indirgeme reaksiyonunu verdiğinden idrarda çıkan şekeri tanımlamak

için ayırıcı deneyler gerekir. Bu amaçla polarimetre, fermentasyon, ozazon oluşumu, her bir

monosakkaride özgü kimyasal testler, kağıt veya ince tabaka kromatografisi gibi yöntemler kullanılır.

Glikoz oksidaz içeren kâğıt şeritler, glikozu diğer şekerlerden ayırt etmekte pratik kolaylık sağlar.

1) Polarimetre: Polarılmış ışığın titreşim düzleminin monosakkarit çözeltileri tarafından

saptırılması prensibine dayanarak şekerleri tanımlamaya yarayan alettir. Polarimetre aletinde,

içinden polarize ışığın geçtiği özel boruya incelenecek idrar veya karbonhidrat çözeltisi konur.

Polarize ışık, tek düzlem üzerinde titreşen ışıktır. Okülerden görünen daire şeklindeki alanda iki

farklı koyuluktaki renk birbirine eşit oluncaya kadar aletin ayar düğmesi sağa ya da sola çevrilir. Bu

çevirme, polarılmış ışığın borudaki sıvı tarafından çevrilmiş olduğu yöne göre değişir. Glikoz

eriyikleri, polarılmış ışığı sağa, früktoz eriyikleri sola çevirir. Bu özellikten yararlanılarak glikoz ve

früktoz kolayca birbirinden ayırt edilir.

2) Fermentasyon: Monosakkaritlerin bira mayasının kataliziyle etil alkol ve karbondioksite

ayrışmasına fermentasyon denir. Bu deney, şekerden alkol yapımının prensibini oluşturur.

Bir şekerin fermentasyon reaksiyonunu vermesi için a) karbon sayısının üç ile tam

bölünebilmesi, b) 3. karbondaki H ve OH gruplarının sterik durumunun (mekandaki üç boyutlu

konfigürasyonları) glikoza benzemesi gereklidir. Örneğin, 5 karbonlu pentoz fermentasyona

uğramaz. Fermentasyon yapan enzimlerin stereospesifik oluşları nedeniyle 3. karbondan itibaren

glikoza benzer olan monosakkaritler fermentasyona uygundur. Glikoz, früktoz, mannoz ve maltoz

fermentasyona uğrar. Galaktoz, laktoz ve pentozlar ise fermentasyona uğramaz.

Bu amaçla, taze bira mayası ile karıştırılmış idrar ve bir miktar toz bira mayası fermentasyon

borusuna kapalı ucunda hava kalmayacak şekilde doldurulur. Etüvde 37-40oC'de 3-4 saat bekletilir.

Bu süre sonunda kapalı uçta bir boşluk oluşursa, fermentasyon deneyi pozitiftir. Bu deney sırasında

bira mayasının katalitik etkisiyle şeker, etil alkol ve CO2’e parçalanır. Boruda oluşan hava boşluğu,

reaksiyonda açığa çıkan karbondioksitten ileri gelir.

24

3) Ozazon deneyi: Özellikle glikozu galaktoz veya laktozdan ayırt etmek için kullanılır.

Fenilhidrazin, karbonil grubu içeren bileşikler ile hafif asit ortamda reaksiyona girerek,

fenilhidrazonları, daha sonra da ozazonları oluşturur. Her şekerin oluşturduğu ozazon kristallerinin

ergime noktası ve şekilleri farklı olduğundan, bu deney şeker türlerinin saptanmasında önem taşır.

Fenilhidrazin ayıracı: 2 g sodyum asetat, 3 g fenilhidrazin HCl, 10 mL su açık alevde karıştırılarak

bulanık bir çözelti elde edilinceye kadar ısıtılır.

Deneyin yapılışı: Deney tüplerine 1 mL idrar ve 2 mL sıcak fenilhidrazin ayıracı konulur.

Tüplerin ağzı pamukla kapatılarak iyice karıştırılır ve kaynar su banyosuna daldırılır. Kristaller

oluştuktan sonra tüpler su banyosundan çıkarılır, oda sıcaklığında soğumaya bırakılır. Kristaller lam-

lamel arasında mikroskopta incelenir.

Glikozazonlar iğne veya çam dalı, laktozazonlar ise deniz kestanesi şeklinde görülür.

Laktozazonlar Glikozazonlar

4) Özel Kimyasal Testler: Bunlar içerisinde en çok bilinenleri früktoza özgü Seliwanoff testi,

pentozlara özgü Bial’in orsinol testi ve laktoz/galaktoza özgü müsik asit testidir.

Seliwanoff testi: Sıcak hidroklorik asit, früktozu hidroksimetil furfurala çevirir. Bu da

rezorsinol ile bağlanarak kırmızı renkli bir bileşik oluşturur.

Ayıraç: 50 mg rezorsinol, 35 mL derişik HCl, su ile 100 mL’ye tamamlanır.

0.5 mL idrar, 5 mL ayıraç üzerine eklenir ve kaynama noktasına kadar ısıtılır. Früktoz 30 saniye içinde

kırmızı renk oluşturur. Ancak glikoz konsantrasyonu ≥2 g/dL ise 30 saniye sonra früktoz gibi sonuç

alınabilir. Früktoz, esansiyel früktozüri denilen genetik bozuklukta idrara çıkar.

Pentozlar için Bial’in orsinol testi: Pentozlar, sulu asitlerle ısıtılınca furfural oluşur. Bu da

orsinol ile kondanse olarak mavi-yeşil renkte ürünler oluşturur. 0.5 mL idrar, 5 mL ayıraca eklenir ve

kaynayana kadar ısıtılır. Pentoz varlığında mavi-yeşil renk oluşur. Test, 100 mg/dL pentoza duyarlıdır.

Früktoz varlığında kırmızı, diğer karbonhidratlarda ise sarı-kahverengi renk görülür.

25

Müsik asid deneyi: Laktoz ve galaktoza özgü bir deneydir. Bir porselen kaba 50 mL idrar ve

10 mL derişik nitrik asit katılır. Kapalı bir ocakta su banyosu üzerinde bu sıvının 1/6'sı kalıncaya

kadar ısıtıldıktan sonra soğumaya bırakılır. Birkaç saat sonra dipte beyaz bir çökelek oluşur.

Çökeleğin üstündeki sıvı dökülerek, tüpte kalan birkaç damla sıvı ile çökelek iyice karıştırılır, lam-

lamel arasında mikroskopta incelenir.

Gebelikte ve süt veren kadınların idrarında laktoz bulunması normaldir. Galaktoz, konjenital

galaktozemi denilen metabolik bozuklukta idrara çıkar.

26

B- SERUM LİPİTLERİ VE KETON CİSİMLERİ

Lipitler, bitkilerden ve hayvansal dokulardan organik çözücüler ile ekstre edilebilen, suda

çözünmeyen, düşük molekül ağırlıklı organik bileşiklerdir. Trigliseritler, fosfolipitler, sfingolipitler,

glikolipitler ve steroidler gibi alt sınıflara ayrılarak incelenirler. Bir dokunun lipit analizi için

öncelikle lipitlerin o dokudan izole edilmesi gerekir. Bu işlem için kullanılan organik çözücüler,

elde edilmek istenen lipite ve doku kaynağına göre değişir. Trigliserit ve steroid gibi polar olmayan

lipitler için kloroform, aseton, eter gibi polar olmayan çözücüler kullanılırken, fosfolipit ve

glikolipit gibi polar lipitler için hekzan-izopropanol karışımı gibi çözücüler kullanılır.

Biyokimya laboratuvarlarında lipoproteinler ile ilgili değerlendirmeler serumda total kolesterol,

trigliserit, LDL-kolesterol ve HDL-kolesterol düzeyleri ölçülerek yapılır. Ayrıca, serumun

buzdolabında bir gece bekletildikten sonra incelenmesi ve serum lipoprotein elektroforezi de

hiperlipoproteinemi türlerinin belirlenmesinde önem taşır.

Serum lipitleri incelenecek kişi, analiz için kan alınmasının 2-3 gün öncesinden başlayarak

normal bir diyetle beslenmeli, lipit düzeylerini etkilediği bilinen ilaçlar (oral kontraseptif, tiroid

hormonu, steroid vb) ve alkol kullanmamalı, normal fiziksel aktivitesinin dışına çıkmamalıdır.

Hastanın akut bir hastalık geçirip geçirmediği (miyokard infarktüsü gibi) sorgulanmalıdır.

Lipit incelemeleri genellikle 12-14 saat süreli bir açlıktan sonra alınan kan örneklerinde yapılır.

Bu amaçla serum veya plazma kullanılabilir. Deneyler aynı gün yapılmayacaksa EDTA`lı plazma

tercih edilmelidir. Lipoproteinleri incelenecek serum +4ºC`de kısa süre, -70º C’de uzun süre

saklanabilir.

Normal serum lipit düzeyleri:

Total kolesterol: < 200 mg/dL

Ateroskleroz risk sınırı: 200-239 mg/dL

Ateroskleroz riski yüksek: >240 mg/dL

VLDL-Kolesterol: Serum trigliserit düzeyi 5’e bölünerek bulunur.

LDL-Kolesterol: Friedwald Formülü ile hesaplanır. Trigliserit düzeyi 400 mg/dL’den yüksekse bu

formül uygulanmaz.

LDL-kolesterol = Total kolesterol - (HDL-kolesterol + Trigliserit / 5) Normal değeri <130 mg/dL

olmalıdır. 130-159 mg/dL arasındaki değerler sınırda ateroskleroz riskini, 160 mg/dL'nin üzerinde ise

yüksek ateroskleroz riskini gösterir.

HDL-kolesterol: Erkekte >45 mg/dL

Kadında >55 mg/dL olmalıdır.

27

40 mg/dL’den düşük HDL-kolesterol düzeylerinde ateroskleroz riski yüksektir.

Trigliserit: Yaşa ve cinsiyete göre değişir. Sağlıklı erişkinde 150 mg/dL’yi geçmemelidir.

150-199 mg/dL orta derecede yüksek, 200-499 mg/dL arası yüksek, 500 mg/dL ve üstü çok yüksek

kabul edilmektedir.

Enzimatik yöntemle serumda total kolesterol ölçümü

Serumdaki lipit fraksiyonlarının miktar belirtiminde en güvenilir ve pratik yol enzimatik

metodlardır. Bunlar için piyasada ticari kitler bulunmaktadır.

Enzimatik yöntemle kolesterol tayininde sırasıyla kolesterol esteraz, kolesterol oksidaz ve peroksidaz

enzimleri reaksiyona girer. Bu yöntem üç aşamalıdır.

1. aşama: Hidrolizle ester kolesteroller serbestleştirilir.

2. aşama: Total kolesterolün oksidasyonuyla hidrojen peroksit oluşturulur.

3. aşama: Kolesterolün oksidasyonuyla açığa çıkan H2O2, ayıraçtaki 4-aminofenazon (4-

aminoantipirin) ile fenol varlığında peroksidaz kataliziyle reaksiyona girer ve absorbansı ölçülecek

renkli bileşiği oluşturur.

Serumda HDL-Kolesterol ölçümü

Serumdaki düşük ve çok düşük dansiteli lipoproteinler (LDL ve VLDL) fosfotungstat-MgCl2 ayıracı

ile çöktürülür. Berrak üst sıvıdaki kolesterol düzeyi tayin edilir. Bulunan değer HDL-kolesterole eşittir.

Son yıllarda LDL- ve HDL-kolesterol düzeylerini direkt olarak ölçen yöntemler geliştirilmiş ve sıklıkla

kullanılmaya başlamıştır.

Enzimatik Yöntemle Serumda Trigliseritlerin Ölçümü

- Trigliseritler lipaz etkisi ile hidroliz edilirerek gliserol serbestleştirilir.

- Gliserol, gliserokinazın kataliziyle ATP varlığında gliserol 3-fosfata dönüşür.

28

- Gliserol 3-fosfat, gliserol 3-fosfat oksidaz etkisiyle dihidroksiaseton fosfata değişir ve H2O2 oluşur.

- H2O2, 4-aminofenazon ve 4-klorofenol ayıraçlarıyla, peroksidazın katalizi ile renkli bileşik

(kinonimin) oluşur.

- Absorbans 500 nm'de spektrofotometrede okunur.

LDL-Kolesterol Düzeylerinin Hesaplanması (Friedwald Formülü):

LDL-Kolesterol = Total kolesterol - (HDL-kolesterol + VLDL-kolesterol)

VLDL-Kolesterol düzeyi serum trigliserit düzeyi 5'e bölünerek bulunduğu için:

LDL-Kolesterol = Total kolesterol - (HDL-kolesterol + Trigliserit / 5)

Serum trigliserit düzeyi 400 mg/dL'in üzerinde olduğu durumlarda bu formül uygulanamaz.

KETON CİSİMLERİ

Canlı organizmanın başlıca enerji kaynağı besinle alınan karbonhidratlardır. Karbonhidratın

bulunmadığı veya vücutta kullanılamadığı hallerde enerji yağ asitlerinden sağlanır. Yağ asitlerinin

yıkımı sonucu oluşan asetil-KoA miktarı karaciğerin oksidatif kapasitesini aştığından ve ortamda

yeterli oksalasetat bulunmadığından sitrik asit siklusu işleyemez. Asetil KoA bu nedenle keton

cisimleri sentezine girer. Keton cisimleri aseton, asetoasetik asit (- ketobutirik asit) ve -

hidroksibutirik asittir. Üç keton cismi de suda çözünebilir. Normal kan düzeyleri 0.5-1.5 mg/dL'dir.

Kan düzeylerinin %75-80'ini -hidroksibutirat, %20'sini asetoasetat ve %2 kadarını aseton

oluşturur. Uzun süren açlıkta, besinde karbonhidrat eksikliğinde veya diabetes mellitus hastalığında

enerji, depo yağları kullanılarak sağlandığından kanda ve idrarda keton cisimleri artar. Keton

cisimleri çizgili kasta ve böbrek korteksinde tekrar asetil Ko-A’ya yıkılır.

Kanda keton cisimlerinin artmasına ketonemi, idrarda keton cisimlerinin çıkmasına ketonüri

denir. Normalde 24 saatlik idrarda 20-70 mg keton cisimleri bulunur. Aseton dışındaki keton

cisimleri asit oldukları için ketonemide serum pH’ı asit yöne kayar. Oluşan klinik tabloya

ketoasidoz adı verilir. Hastaların nefesinde ve idrarında aseton kokusu vardır. Serum pH'ında ufak

bir değişiklik çok önemli sonuçlara yol açabildiğinden ketoasidozun takibinde idrarda keton

29

cisimleri tayini önem taşır. Keton cisimleri serum veya idrarda normal düzeyleri aşmamışsa deneyler

negatif sonuç verir. Keton cisimlerinin üçünü gösterebilen tek yöntem yoktur. Nitroprüssiyat kullanılan

yöntemlerde asetoasetat ve aseton saptanabilir. Ancak bu yöntemler asetonun 15-20 katı asetoasetata

duyarlıdır. -Hidroksibütirat ise nitroprüssiyat yöntemiyle gösterilemez.

Serumda Asetoasetat ve Aseton Aranması (UYGULAMA 4)

Bu amaçla Rothera tozu kullanılır. Rothera tozu, 1 g sodyum nitroprussiyat, 100 g susuz Na2CO3 ve

200 g susuz (NH4)2SO4 karışımından oluşur.

Fındık büyüklüğünde Rothera tozu porselen kaba konur, ortası çukurlaştırılır ve serumdan

bir damla damlatılır. Bir dakika sonra tozdaki renk değişimine bakılır. Normal serum renk değişimi

oluşturmaz. Aseton miktarı artmış olan serumda eflatun ile mor arasında bir renk ortaya çıkar.

Sonuç, oluşan rengin şiddetine göre değerlendirilir.

Hiç renklenme yok: (-)

Kirli mavi renk: (+ _

)

Açık mor-menekşe renk: (+)

Koyu menekşe renk: (++)

Reaksiyonu (++) olan serum, bu renk oluşmayıncaya kadar sulandırılarak test tekrarlanır. Örneğin 4

kez sulandırılmış serumda koyu menekşe renk oluşuyorsa sonuç 4 (++) = (8+) olarak belirlenir.

İdrarda Keton Cisimleri Aranması

Weyl-Legal (nitroprussiyat) Deneyi (UYGULAMA 5)

Bu yöntemde asetoasetat (-ketobutirat) ve aseton reaksiyon verir. -Hidroksibutirat ise sonuç

vermez.

Ayıraçlar: 1 N NaOH, CH3COOH (% 20), sodyum nitroprussiyat (% 5)

Deneyin yapılışı: 2-3 mL idrar bir deney tübünealınarak üzerine NaOH damlatılıp alkalileştirilir.

Sonra Na-nitroprussiyat eklenir ve kırmızı renk oluştuğu gözlenir. Bu renk hem aseton, hem de

idrarın normal bileşeni olan kreatinin nedeniyle oluşur. Ancak kreatininin ayıraçla oluşturduğu

renk, asit ortamda kaybolur. Asetonun oluşturduğu renk ise kaybolmaz. Bunu ayırdetmek için tübe

% 20'lik asetik asit damlatılır. Aseton varsa asit ilavesiyle renk daha koyu kırmızıya döner.

Kreatininin oluşturduğu kırmızı renkli kompleks asit ortamda parçalanır ve renk kaybolur.

30

Gerhardt (demir klorür) Deneyi (UYGULAMA 6)

Asetoasetata özgüdür.

Deneyin yapılışı:

Deney tüpünün 1/3'üne kadar idrar konur, üzerine %10’luk FeCl3 ayıracı damlatılır.

Normal idrarda fosfatların çökmesiyle kirli beyaz bir çökelti oluşur. İdrarda asetoasetat (asetoasetik

asit) varsa, FeCl3 eklenmesi ile kırmızı renk görülür. Asetoasetatın FeCl3 ile verdiği reaksiyon

sonucu oluşan bu renk; idrarda salisilat, fenol ve antipirin gibi bileşikler bulunduğunda da ortaya

çıkar. Bu nedenle aşağıdaki işlemle asetoasetatın ayırıcı tanısı yapılır.

Kırmızı rengin oluştuğu idrar açık alevde kaynatılır. Asetoasetattan ileri gelen renk sıvının

kaynatılması ile kaybolduğu halde, ilaçlardan ileri gelen renk kaynatmakla değişmez. İdrarın

kaynatılması ile rengin kaybolmasının nedeni; asetoasetatın ısı ile asetona dönüşmesi, asetonun da

bu reaksiyonu vermemesidir.

Günümüzde keton cisimleri için kullanılan kâğıt şerit, sodyum-nitroprussiyat reaksiyonu

esasına dayanır. Bu yöntemle aseton ve asetoasetik asit tayin edilebilir, -hidroksibutirik asit tayin

edilemez. Na-nitroprussiyat öncelikle asetoasetik asitle reaksiyona girer. Üç keton cisminden

idrarda en çok miktarda çıkan -hidroksi butirik asittir. Ancak, pratik direkt bir metodu

bulunmadığından rutin idrar analizinde aranmaz.

Hazır Kağıt Şeritler ile Serum ve İdrarda Keton Cisimlerinin Aranması:

Glisin, nitroprüssiyat, Na2HPO4 ve laktoz emdirilmiş özel şeritler asetoasetat ve aseton varlığında

menekşe renge dönüşürler. Bu şeritler (ketostix) keton cisimleri içeren örneğe batırılınca 15 saniye gibi

kısa bir sürede (+) sonuç alınır. İdrarda keton cismi düzeyi arttıkça renk şiddetlenir. Renk şiddeti ticari

şeritleri kullanma kılavuzunda gösterilen renklerle kıyaslanarak yarı kantitatif bir ölçüm yapılabilir.

31

C- PROTEİNLER ile İLGİLİ TESTLER

Serumda kütle olarak en büyük grubu proteinler oluşturur. Serumda total protein miktarı 6.0-8.3

g/dL`dir. Bunun yarıdan fazlası (3.4-5.4 g/dL) albümin, geriye kalanı globülin sınıfına ait proteinlerdir.

Globülin çeşitli proteinleri kapsayan heterojen bir gruptur, total protein miktarından albümin miktarı

çıkarılarak hesaplanabilir. Gerektiğinde bu gruptaki spesifik proteinlerin tayini özel yöntemlerle

yapılabilir.

Klinik Biyokimya laboratuvarlarında genellikle proteinlerle ilgili şu tayinler yapılır:

Serumda total protein miktar belirtimi

Serumda albümin miktar belirtimi

Serum protein elektroforezi

İdrarda proteinlerin kalitatif ve kantitatif değerlendirilmesi

Serum Proteinleri

Serumda Total Protein Miktarbelirtimi

Biüret Yöntemi: Peptid bağlarının alkali çözeltide bakır tuzları ile menekşe renkli kompleks

oluşturmasına dayanan bir reaksiyondur. Yönteme adını veren biüret molekülü, iki üre molekülünün

ısıtılmak suretiyle kondanse olmasıyla meydana gelir. Alkali ortamlarda biüret moleküllerinin amid

grupları Cu++

ile mavi-mor renkli bir kompleks meydana getirirler. Biüret molekülüne yapısal

benzerliği olan polipeptid zincirindeki peptid bağları da aynı koşullarda benzer bir kompleks meydana

getirir. Bu kompleksin oluşması için ortamda en az üç peptid bağının bulunması gerekir. Oluşan rengin

yoğunluğu peptid bağlarının sayısı ile bağıntılıdır. Normal serumda total protein miktarı 6.0-8.3

g/dL`dir.

Peptid bağı ile bakırın kelatlanması

32

Serumda Albümin Miktarbelirtimi

Protein metabolizması hakkında bilgi sahibi olmak için serum total protein miktarı ile birlikte serum

albümin miktarını da bilmek gerekir. Albümin tayini için kullanılan yöntemler, bromkrezol yeşili

(BCG), bromkrezol moru (BCP) ve hidroksiazobenzen benzoik asit (HABA) gibi bazı anyonik boya

maddelerinin belirli pH'da albümin ile kompleks oluşturmalarına dayanır. Oluşan renkli bileşiğin

absorbansı spektrofotometrede okunur. Klinik biyokimya laboratuvarlarında en yaygın kullanılan boya

maddesi BCG'dir. Normal serumda albumin miktarı 3.4-5.4 g/dL`dir.

Proteinsiz Serum Filtratı Eldesi

Serumda protein dışı azotlu bileşiklerin tayininde, öncelikle proteinler erimez tuzlar halinde

çöktürülür. Bunun için asit ortamda katyon gibi davranan proteinlere, tungstat (wolframat),

molibdat, triklorasetik asit gibi anyonlar eklenir. Buna karşılık alkali ortamda anyon gibi davranan

proteinler çinko, kadmiyum, cıva, kurşun gibi çöktürücü katyonlarla da çöktürülebilir ve serumdan

filtrasyon veya santrifüj ile uzaklaştırılır. Proteinsizleştirmek amacıyla en sık kullanılanlar

triklorasetik asit (TCA) ve Folin-Wu ayıraçlarıdır.

TCA Filtratı Eldesi: 1 hacim serum/plazma ile 9 hacim % 5'lik TCA iyice karıştırılır, 5

dakika bekletildikten sonra filtre veya santrifüj edilir.

Folin -Wu Filtratı Eldesi: 1 hacim serum/plazma, 8 hacim distile su, 0.5 hacim 0.67 N

H2SO4 ve 0.5 hacim %10'luk sodyum tungstat (Na2WO4, sodyum wolframat) bir tüpte iyice

karıştırılır. 10 dakika beklenir, filtre veya santrifüj edilir. Bu yöntemde proteinleri çöktüren,

ortamda sodyum wolframat ile sülfürik asidin karışmasıyla oluşan wolframik asittir.

Protein Elektroforezi

İyonlaşabilen moleküller pH’ı belirli bir çözeltide, kendi izoelektrik noktalarına bağlı olarak anyon

(-) veya katyon (+) halinde bulunabilirler. Bu çözeltiden doğru akım geçirildiği zaman, pozitif yük

taşıyanlar (katyonlar) negatif yüklü katoda; negatif yük taşıyanlar (anyonlar) pozitif yüklü anoda

doğru hareket eder. Bu olaya elektroforez denir.

Bütün elektroforez sistemleri üç temel bölümden oluşur:

- Destek ortamı

- Elektroforez tankı

- Enerji kaynağı

Bunlar arasında destek ortamının niteliği elde edilen protein bantları (fraksiyonları) bakımından çok

önemlidir. Elektroforez tankı ve enerji kaynağı ise bütün sistemlerde aynı veya çok benzerdir.

Klinik biyokimya laboratuvarlarında sıklıkla kullanılan destek ortamları selüloz asetat ve agarozdur.

Selüloz asetat elektroforezi düşük akımlarda, hızlı ve kısa sürede iyi ayrışma sağlaması nedeniyle

33

tercih edilen bir elektroforez türüdür. Her iki ortam da, alkali pH’da proteinleri yüklerine göre

ayırır. Ayrılan bantlar amido black veya ponceau S boyalarıyla boyandıktan sonra dansitometre

aracılığı ile okunur. Bu işlemi gerçekleştiren cihazlara veri olarak serum total protein miktarı

girildiğinde fraksiyonların kütle miktarları da hesaplanır.

Serumun pH 8.6'da yapılan elektroforezinde her iki destek ortamında da 5 bant oluşur. Anoda doğru

en hızlı yürüyen albümini sırasıyla, alfa-1, alfa-2, beta ve gama bantları izler. Klinik

değerlendirmelerde bu beş bant esas alınır.

Protein bantları:

Albümin negatif yükü en fazla olduğundan, en hızlı göç eden bantta yer alır. Bu bantta yalnız

albümin bulunur, bu nedenle bant grafiği dar tabanlı ve sivri tepelidir. Sadece karaciğer

hücrelerinde sentez edildiği için albümin monoklonaldir. Boyanıp dansitometrede okunduğunda,

grafikte dar tabanlı, sivri tepeli bir görünüm oluşturur.

Serum protein elektroforezinin dansitometrik görünümü

Globülin fraksiyonları (bantları) heterojendir. Her bantta farklı hücre ve dokulardan kaynaklanan

farklı proteinler vardır. Bunların miktarı albümin miktarına kıyasla çok azdır. Bantlarda yer alan

proteinlerin göç hızları farklı olduğundan (çünkü yükleri farklıdır), grafikteki bant görünümleri

geniş tabanlı, alçak ve yuvarlak tavanlıdır. Bu poliklonal bir grafik görüntüsüdür.

- 1 globülin franksiyonunda 1-antitripsin ve bazı lipoproteinler bulunur.

- 2 globülin bandında serüloplazmin, haptoglobin, 2-makroglobülin ve bazı lipoproteinler göç

eder.

- Globülin franksiyonunda bazı lipoproteinler, transferrin, hemopeksin ve kompleman proteinleri

bulunur.

- globülin bandında immünglobülinler yer alır.

34

İdrar Proteinleri

Protein, normal şartlarda idrarda basit deneylerle saptanamayacak kadar az çıkan bir organik

maddedir. Günlük idrarda 20-150 mg protein bulunması normal kabul edilir. Bazı kaynaklarda üst

sınır 100 mg/gün olarak alınır. Bu miktarın yaklaşık olarak yarısını albümin, geri kalanını distal

tubuluslardan salgılanan üromukoid oluşturur. Pratik olarak idrara protein çıkmadığı kabul edilir ve bu

eser miktardaki proteinler, günlük analizler için kullanìlan protein arama yöntemleri ile gösterilemez.

İdrarda protein çıktığı hallere proteinüri ya da eski adıyla albüminüri denir.

Proteinüriler fonksiyonel veya organik olarak gruplandırılabilir. Fonksiyonel olanlar

herhangi bir hastalığa bağlı olmayıp idrarda az miktarda protein bulunması ve bu durumun gelip

geçici olmasıyla tanınır. Örneğin, ağır egzersizler (maraton koşusu vb), uzun süre ayakta kalma gibi

durumlardan sonra (300 mg/gün) ve gebelikte görülen hafif albuminüri (150 mg/gün) bu grupta yer

alır. Organik proteinüriler ise nedenlerine göre:

Prerenal

Renal

Postrenal proteinüriler olarak sınıflandırılır.

Prerenal proteinürilerin böbrekle bir ilişiği yoktur. Kalp hastalıkları, karında sıvı birikmesi,

karın içi tümörler, karaciğer hastalıkları, ateşli hastalıklar gibi böbrek dolaşımını güçleştiren

durumlarda görülür. Renal proteinüriler, nefrit ve nefroz gibi böbreğin filtrasyon kapasitesinde

bozukluğa yol açan hastalıklarda ortaya çıkar. Postrenal proteinürilerde ise idrar yollarındaki

hastalıklar söz konusudur. Örneğin üreterler, mesane, prostat ve üretranın inflamasyonlu

hastalıklarında, tümör veya travmalarında bu tip proteinüri görülür.

İdrarda Protein Aranması

Kalitatif yöntemlerde proteinler çeşitli ayıraçlarla denatüre edilerek çöktürülür. Oluşan bulanıklığın

şiddeti protein miktarı ile doğru orantılıdır. Bulanıklık oluşturan bu deneyler türbidimetrik yöntemler

olarak da adlandırılır.

Kaynatma Deneyi (UYGULAMA 7)

İdrarda protein aramak için en basit yöntemdir. Deney tübünün yarısına kadar süzülmüş idrar

konularak açık alevde kaynatılır. Patolojik miktarda protein varsa bulanıklık görülür. Ancak idrarda

fazla miktarda fosfat ve karbonat varsa bunlar da kaynatmakla bulanıklık verebilir. Bu ayrımı

yapabilmek için kaynatılmış idrar üzerine birkaç damla %3'lük asetik asit damlatılır ve çalkalanır.

Bulanıklık kalırsa proteinden, kaybolursa fosfat ve karbonatlardan olduğu anlaşılır.

35

Heller’in halka deneyi (UYGULAMA 8)

Deney tübünebir miktar süzülmüş idrar konur. Tüp 45o kadar eğik tutularak bir pipet yardımıyla dipte

toplanacak şekilde yavaşça derişik nitrik asit sızdırılır. Yoğunluğu nedeniyle dipte toplanan nitrik asit

ile idrarın temas yüzeyinde beyaz, bulanık bir halka oluşumu protein varlığını gösterir. Deneyin

prensibi, proteinlerin asit etkisiyle denatüre olması ve çökmesidir.

Sülfosalisilik asit deneyi (UYGULAMA 9)

Protein arama yöntemleri içinde en güvenilir olanıdır. Bir miktar süzülmüş idrarın üzerine 3-4 damla

%20'lik sülfosalisilik asit damlatılır, çalkalanır. Protein varsa, miktarına göre hareli veya net bulanıklık

görülür. Bulanıklığın nedeni, sülfosalisilik asit ile proteinlerin -NH2 (amin) gruplarının bağlanması

sonucu oluşan çözünmeyen komplekstir.

Normal idrarda rutin kalitatif yöntemlerle protein saptanamaz, ama duyarlığı yüksek

deneylerle 24 saatte 300 miligrama kadar protein çıkabileceği gösterilmiştir. Bu değerin üstünde

rutin arama deneyleri pozitif olur.

Türbidimetrik yöntemlerde bakteriüri, radyoopak maddeler ve bazı antibiyotikler (penisilin,

sefalosporinler) nedeniyle yalancı pozitif reaksiyonlar oluşabilir.

Kağıt şeritlerle protein aranması: Hazır kağıt şeritlerin üzerinde proteinlerle reaksiyon vererek renk

oluşturan maddeler vardır. Oluşan renk ve şiddeti, bu şeritlerin kullanma kılavuzunda gösterilen

renklerle karşılaştırılarak yarı kantitatif bir ölçüm yapılabilir.

İdrarda Protein Tayini

Rutin analizde en yaygın yöntem Esbach yöntemidir. Bunun için 24 saatlik idrar kullanılır. Bu

yöntem, çift asitle proteini çöktürerek çöküntünün yüksekliğini okuma prensibine dayanmaktadır.

Duyarlığı düşük olup 0.5 g/L'den az protein miktarını tam göstermez.

Esbach Tübü(Esbach Ürometresi): İdrarda kalitatif deneylerle protein varlığı saptandığı

durumlarda pratik olarak miktar ölçmeye yarayan basit cam alettir. Üzerinde U (urine) ve R

36

(reactive) çizgileri bulunan olan Esbach tüpüne, "U" işaretine kadar süzülmüş idrar, "R" işaretine

kadar da Esbach ayıracı (%1 pikrik asit ve %2 sitrik asit karışımı) konulur. Tüpün tıpası kapatılır, alt-

üst edilerek karıştırıldıktan sonra ayaklığına yerleştirilip, oda sıcaklığında 24 saat bekletilir. Bu süre

sonunda protein dipte çökelir. Çökelti hizasındaki sayı litrede gram (g/L) cinsinden protein miktarını

verir. Bu yöntemle 0.5-12 g/L arasındaki miktarlar ölçülebilir.

İdrarda Patolojik Protein: Bence-Jones Proteini

Normalde görülmeyen, ancak en çok multipl myelomda (plazma hücrelerinin malign hastalığı)

idrarda ve serumda rastlanan bir proteindir. İmmünglobülinlerin hafif zincirlerinin plazmadaki

konsantrasyonu bu hastalıkta artmıştır. Bu proteinler düşük molekül ağırlıklı olduklarından idrara

çıkar. Diğer proteinlerden farklı olarak 600C’de çöker ve 100

0C’de yeniden çözünürler. Idrarda iki

yöntemle aranabilir:

Kaynatma: Bir deney tübünde iyice kaynatılan idrar, filtre kâğıdından süzülür, böylece

100C'de çöken proteinler uzaklaştırılır. pH 5.0'a ayarlanmış ve süzülmüş idrar örneği bir deney

tübünün yarısına kadar konularak su banyosuna yerleştirilir. İdrarda Bence-Jones proteini varsa 50-

600C arasında çökerek bulanıklık oluşturur. Isıtma sürdürüldüğünde 90-100

0C'de tekrar çözünüp

kaybolur. Kaynatılmış tüp soğumaya bırakıldığında, 50-600C'de yine çökelme meydana gelir. Bu

yöntem hassas olmadığından kesin sonuç için immünelektroforezle incelemek gerekir.

İmmünelektroforez: Bence-Jones proteinlerini spesifik olarak gösterir.

37

D- İDRARDA AMİNO ASİT TÜREVLERİ

Melanin

Deri, saç ve gözün rengini veren melanin pigmenti, melanositlerde tirozin amino asidinden birkaç

aşamada sentezlenir. Normal idrarda melanin yoktur. Melanositlerin kanseri olan malign

melanomda fazla miktarda sentezlendiğinden idrarda melanin görülür. İdrar taze iken melanin

aranmalıdır.

Thormahlen Deneyi: Melanin aramak için bir deney tübünealınan 5 mL idrarın üzerine taze

hazırlanan %5’lik sodyum nitroprussiyat (sodyum nitroferrisiyanür) eriyiğinden 2 mL ve 2 mL %25

NaOH eklenince idrarın rengi kırmızıya döner. Ancak bu renk kreatininden veya asetondan da ileri

gelebilir. Sonra 2 mL glasiyal asetik asit eklendiğinde renk mürekkep mavisine dönerse melanin

olduğu söylenir. Kreatinin varlığından ileri gelen kırmızı renk asit ortamda açılır, asetondan ileri

gelen kırmızı renk ise bordoya dönüşür.

Demir Klorür Testi:10 mL idrar üzerine %10 luk FeCl3 eriyiğinden damlatılarak fosfatların

çökmesi sağlanır. %10’luk HCl eklenerek fosfatlar yeniden çözündürülür. Düşük devirde santrifüj

edildikten sonra siyah-gri bir çökelek oluşup oluşmadığı incelenir.

İndikan

İndikan, triptofan amino asidinin transaminasyona girmesiyle başlayan metabolik yolda indol ve

skatol üzerinden oluşan bir son üründür. Bağırsak bakterilerinde bulunan triptofanaz enzimi ise

direkt olarak triptofanı indole yıkar. Triptofanın yan kolu bakterilerdeki enzim tarafından koparılır

ve indol halkası indol ve skatol bileşiklerine dönüşür. Skatol dışkıyla atılır, dışkının kokusunu verir.

İndol karaciğere gider ve orada metabolize olarak indoksil haline döner. Burada H2SO4 ve

glikuronik asitle birleşerek idrara geçer. İndoksilin H2SO4 ile esterlerine veya glikuronik asitle

eterlerine indikan denir. (İndoksil sülfat veya indoksil glikuronatın potasyum tuzu).

Bağırsakta bir tıkanma veya bağırsak bakterilerinde bir artış olduğu (kolit, tümör, bağırsak

felci, bağırsak düğümlenmesi, uzun süren kabızlık, peritonit, pankreas yetersizliği gibi) hallerde

bakteriler tarafından triptofan yıkımı hızlanır ve idrarda fazla miktarda indikan çıkar.

Obermayer Deneyi:100 mL derişik HCl’de çözünmüş 0.2 g FeCl3 (Obermayer ayıracı) ve

kloroform kullanılır.

Deneyin yapılışı: 5 mL idrar, eşit hacimde Obermayer ayıracı ile karıştırılır ve çalkalanır.

Eğer idrarda indikan varsa ayıraçla reaksiyon sonucu indigo bileşiği oluşur. Oluşan indigo bileşiği

suda çözünmeyen mavi bir boya maddesidir. İndigonun kloroform fazına geçmesi için 2 mL

kloroform eklenir, birkaç kez çalkalanır ve her seferinde kloroformun dibe çökmesi beklenir.

38

Emülsiyon oluşacağından şiddetli ve uzun çalkalamamalıdır. Eğer indikan varsa kloroform mavi

renk alır. Kloroformun görevi idrarda oluşan indigo mavisini ekstre ederek görünür hale

getirmektir. Kloroform idrardan ağır olduğu için dipte toplanır.

Bazı durumlarda idrarda iyodür çıkar. İyodürlü idrarda bu deney yapılırsa kloroform kırmızı

renk alır. Kloroformun üstündeki sıvı dökülüp kloroform su ile birkaç kez yıkanır, üzerine NaOH

çözeltisinden birkaç damla konulunca renk kaybolur.

Obermayer ayıracı NaOH

İyodür I2 (kırmızı) İyodür (Renksiz)

oksitlenme indirgenme

Fenil ketonüri

Fenilketonüri, fenilalanin hidroksilaz enziminin aktivitesinde genetik kusur sonucu görülen, ileri

derecede zekâ geriliğine yol açan bir hastalıktır. Kanda fenilalanin düzeyleri yüksektir

(hiperfenilalaninemi). İdrarda fenilalanin türevi keto asitlerin (fenilasetik asit, fenilpiruvik asit ve

fenillaktik asit) çıkması nedeniyle fenilketonüri adı verilen bu bozukluğun tanısının, doğumu

takibeden ilk haftalar içerisinde konulması çok önemlidir. Türkiye, fenilketonüri insidansının en

yüksek olduğu ülkedir (1/2600). (Finlandiya’da bu oran 1/100.000 dir.)

Fenilalanin

Demir Klorür Testi: İdrarda fenil piruvik asit varlığını gösterir. Test taze idrarda

yapılmalıdır. Doğumdan sonraki ilk hafta içinde yanlış negatif sonuç vermesi testin önemli

dezavantajıdır.

Ayıraçlar:

-%10 luk FeCl3

-Fosfat çöktürücü ayıraç: MgCl2 (2.2 g), NH4Cl (1.4 g), derişik NH4OH (2 mL) suda

çözündürülür, 100 mL’ye tamamlanır.

Deneyin yapılışı: 4 mL idrar üzerine 1 mL fosfat çöktürücü karıştırılarak konur. Karışım

süzülür. Süzüntüye 2-3 damla derişik HCl ve FeCl3 eklenir. Her damladan sonra oluşan renk

gözlenir. 2-4 dakika dayanıklı mavi-yeşil renk, testin pozitif olduğunu gösterir.

39

FeCl3 ayıracının idrarda normalde bulunmayan bazı maddeler ile de renk oluşturduğu

unutulmamalıdır (homojentisik asit, melanin, fenasetin, salisilatlar, azogantrisin vb).

Yenidoğanda fenilketonüri tarama testi

Günümüzde yenidoğan tarama testleri arasında PKU testi rutin kullanıma girmiştir. Guthrie testi

yarı kantitatif bir testtir. Kanda yüksek fenilalanin düzeylerini saptayan bu testin prensibi, kültür

ortamında fenilalaninin bakteri büyümesini kolaylaştırıcı özelliğine dayanır.

40

3- ÜREME-ÜROGENİTAL DİLİMİ UYGULAMASI

A- İDRAR İNCELEMESİ

İdrar; böbrek glomerül ve tubuluslarında filtrasyon, reabsorpsiyon, sekresyon ve ekskresyon

mekanizmaları ile oluşan bir sıvıdır. Bileşiminde başlıca üre, ürik asit, kreatinin, sodyum,

potasyum, klor, kalsiyum, fosfat, oksalik asit, sitrik asit, vitaminler, hormonlar ve hormon

metabolitleri bulunur.

Böbrekler, idrar oluşturmanın yanında organizmada şu fonksiyonları üstlenir:

Su-elektrolit ve pH dengesinin sağlanmasında temel rol oynar (sıvı homeostazı).

Metabolizma son ürünlerinin ve karaciğerde zehirsizleştirilen (suda erir hale gelen) toksik ürünlerin

vücuttan atılmasını sağlar (ekskresyon).

Renin, eritropoietin ve kalsitriol hormonlarının ve bazı metabolitlerin (örn. kreatin) sentezinde

görev alır (endokrin ve metabolik fonksiyon).

Normalde her iki böbrekten dakikada geçen plazma miktarı 650 mL’dir (1200 mL kan). Bunun

dakikada 125 mL’si glomerüllerden süzülür ve glomerüler filtratı oluşturur. Glomerüler filtrata plazma

proteinleri ve proteine bağı maddeler dışında kalan tüm maddeler geçer. Daha sonra bu filtratın içeriği

tubulusun farklı kısımlarında değişikliğe uğrar, vücut için gerekli maddeler geri emilirken zararlı veya

yararsız maddeler tubuler filtrata salgılanır. Böylece bu maddelerin idrar yolu ile atılımı sağlanır.

Kısaca idrar, kanın böbrekler tarafından oluşturulan bir ultrafiltratı olarak tanımlanabilir. İdrar,

öncelikle böbrek ve üriner sistem fonksiyonunun göstergesi olarak incelenir. Bunun yanında, bazı

sistemik hastalıklar da idrarın bileşiminde değişikliğe yol açabilir. Bu değişiklik, normalde çıkan

maddelerin konsantrasyonunda değişme veya normalde bulunmayan bazı ürünlerin patolojik atılımı

şeklinde olabilir. İdrar analizi klinik tanıya önemli katkıda bulunur.

İdrarın incelenmesi genellikle üç aşamada gerçekleştirilir:

1) İdrar toplanması

2) Tam idrar tahlili

a) İdrarın fiziksel özelliklerinin incelenmesi

b) İdrarın kimyasal özelliklerinin incelenmesi

c) Mikroskobik inceleme

3) Mikrobiyolojik inceleme

41

İdrar Toplanması

İdrar örneği, hastanın yaşına ve yapılması istenilen analize göre, temiz (tercihen steril) bir kapta

toplanır. İdrar analizi, örnek hastadan alındıktan sonra 30 dakika içinde tamamlanmalıdır. Eğer bu

mümkün değilse, ağzı kapalı bir kapta buzdolabında saklanmalı, gerekirse koruyucu madde

eklenmelidir.

İdrar analizleri için aşağıdaki idrar örnekleri kullanılabilir:

Rastgele idrar örneği (spot idrar): Gün içinde, herhangi bir zamanda elde edilen idrar

örneğidir. İdrarın mesanede ne kadar süreyle kaldığı bilinmediği için elde edilen sonuçların

yorumlanması zordur. İdrar seyreltik olduğunda düşük konsantrasyondaki bileşikler

saptanamayabilir.

Sabah ilk idrar örneği (8 saatlik örnek): Rutin idrar analizleri için tercih edilen örnektir.

Gece yatmadan önce mesane boşaltılır ve sabah ilk idrar toplanır. Bu örnekler rastgele örneğe

kıyasla daha sabit, daha derişik ve asit karakterdedir. Hücrelerin, silindirlerin ve

mikroorganizmaların incelenmesi için uygun bir örnektir.

Sabah ikinci idrar örneği: Bu örnekler daha çok proteinürilerin sınıflandırılmasında ve

mesane mukozasının sitolojik incelemelerinde tercih edilir.

24 saatlik idrar örneği: İdrarda yapılacak bazı kantitatif incelemelerde 24 saatlik idrar

toplanması gerekir. Bunun için hasta ilk gün sabah idrarı hariç, gün ve gece boyu çıkarttığı bütün

idrarı ve ertesi sabah ilk idrarını bir kapta biriktirir. Hastaya verilecek şişe kapaklı, koyu renkte,

temiz ve günlük idrar miktarına yetecek büyüklükte (yaklaşık 2 L) olmalıdır. Yapılacak incelemeye

göre kabın içine uygun koruyucu madde, laboratuvar elemanı tarafından önceden eklenir (HCl ve

Na2CO3 gibi). Koruyucu maddeler idrarda ölçülecek metabolitin bekleme sırasında bozulmamasını

sağlar. Bunun yanında, hastaya topladığı idrarı soğuk bir yerde muhafaza etmesi de önerilir.

İdrarın tam 24 saatlik olduğundan şüphe ediliyorsa, kreatinin miktarı tayin edilir. Çünkü

idrar kreatinini besinsel kaynaklı olmayıp kişinin vücut kas kütlesiyle orantılıdır. 24 saatlik idrarda,

kg vücut ağırlığı başına düşen kreatinin miktarı kadınlarda 14-22 mg, erkeklerde 20-26 mg'dır. Bu

değerler, kişinin vücut ağırlığı ile çarpılarak 24 saatte atılması gereken kreatinin miktarı hesaplanır.

Sediment ve rutin analizler için sabah ilk idrarı kullanılır. Gece boyunca mesanede birikmiş

olan idrar, günün herhangi bir zamanındaki idrara göre daha konsantredir. Çalışılacak örneğin idrar

olduğunu kesinleştirmek için gerektiğinde basit kalitatif deneyler yapılabilir. İdrar klorür, sülfat,

kreatinin ve üre reaksiyonları verir, son iki maddeyi büyük miktarlarda kapsar. Suyu uçurulduğunda

geride üre, ürik asit, hippurik asitten zengin bir artık bırakır. Basit olarak bir sıvının idrar

olduğundan şüphe edildiği takdirde üre veya kreatinin varlığı araştırılmalıdır. Bu iki madde canlı

organizma tarafından sentezlenebilen azotlu son ürünlerdir.

42

İdrarda klorür aranması: İdrar üzerine birkaç damla derişik HNO3 damlatılarak asitlendirilir ve

gümüş nitratın sudaki çözeltisinden birkaç damla katılır. İdrarda klorür varsa gümüş klorürün

çöktüğü ve beyaz bulanıklık oluştuğu görülür.

İdrarda sülfat aranması: Bir miktar idrarın üzerine birkaç damla derişik HCl damlatılıp üzerine

baryum klorür katılırsa baryum sülfat oluşumuna bağlı beyaz bulanıklık görülür.

İdrarda üre aranması: İdrar üzerine biraz sodyum hipobromit damlatılır, çalkalanır, ufak beyaz

kabarcıklar çıktığı görülür. Bunlar ürenin parçalanmasıyla serbestleşen azot gazından ibarettir.

İdrarda kreatinin aranması: İdrar üzerine pikrik asidin sudaki çözeltisinden damlatılır ve alkali

oluncaya kadar NaOH katılır. Kırmızı-turuncu renk oluşursa kreatinin vardır (Jaffe reaksiyonu).

Tam İdrar Tahlili

Biyokimya laboratuvarlarında yapılan bu işlem üç aşamalıdır.

a) Fiziksel inceleme: İdrarın görünüm, koku, yoğunluk ve pH’sının değerlendirilmesidir.

Görünüm: İdrarın görüntüsü ve rengi cam silindirde incelenir. Taze idrar kehribar sarısıdır.

Bu rengi ürokromlar verir. Az miktarda üro- ve koproporfirin de renge katkıda bulunur. İdrar

rengindeki değişmeler patolojik durumlar hakkında ipucu verir.

Açık renkli idrar fazla su atılmasına bağlıdır, genellikle düşük yoğunlukla birlikte olur.

Normal idrar örneği bekletilirse ürokrom pigmenti oksitlendiği için koyu renk alır.

Çay renginde idrar, bilirübin veya kan varlığını düşündürür.

Bekletilmekle siyahlaşan idrarda homojentisik asit (alkaptonüri) veya melanin pigmenti

varlığı düşünülmelidir.

İdrarda normalden fazla ürobilin varsa renk koyu sarı-turuncu olur, beklemekle

kahverengine değişir.

İdrarın görüntüsü normalde berrak olmalıdır. Bulanık veya tortulu idrarda patolojik maddeler

olduğu düşünülür. İdrarda bulanıklığa yol açan haller:

Çok fazla epitel hücresi çıkması

İdrarda yağ ve lenf sıvısı bulunması

İdrarda bakteri bulunması

Koku: İdrarın kendine özgü kokusu vardır. Bu koku idrardaki fenollerden kaynaklanır.

Bunun dışında bazı patolojik durumlarda idrarın kokusu değişir. Örneğin kontrol edilemeyen

diyabet hastalığında keton cisimleri çıktığı için idrarda aseton kokusu alınır. Bekletilmiş ve bakteri

üremiş idrarda amonyak kokusu olur. Bunun nedeni bakteride bulunan üreaz enziminin üreyi

parçalayarak amonyak oluşturmasıdır.

Hacim: Sağlıklı bir kişide bir günde 700-2000 mL idrar çıkar. Bu miktar, diğer yollarla

kaybedilen su miktarıyla ve günlük alınan suyla yakından ilişkilidir. Günlük ortalama idrar miktarı

43

erkeklerde 1500 mL, kadınlarda 1200 mL’dir. Hacmi ölçülecek idrar, büyük bir ölçü silindirine

köpürtülmeden konur. Üst hizasındaki ölçü çizgisi (mL) okunur. İdrar miktarı 24 saatlik idrar

toplandığında anlamlıdır. Bir miksiyonluk idrarın miktarı fazla önem taşımaz.

İdrar hacmindeki değişiklikler için aşağıdaki tanımlar kullanılır.

Poliüri: 24 saatlik idrar miktarının 2000 mL'yi geçmesidir. Poliüri nedenleri:

Kanda miktarı artan bazı maddeleri idrarla atabilmek için çok idrar çıkartılır. Örneğin

diabetes mellitus hastalığında böbrek eşiğini aşan kan glikoz konsantrasyonunda glikoz

idrarla atıldığından idrar hacmi artar. Bu nedenle hastalar çok su içme gereksinimi duyar

(polidipsi).

Şekersiz diyabet (diabetes insipidus) hastalığında böbrekten suyun geri emilimi

bozulduğundan çok fazla miktarda idrar çıkartılır.

Vücutta ödemlerin çözülmesi sırasında, doku aralıklarında biriken sıvı idrarla atılır ve

idrar hacmi artar.

Fazla su içilmesi veya fazla sulu gıda alınmasında idrar miktarı artar.

Bazı psikolojik bozukluklarda çok su içilmesine bağlı poliüri görülür.

Oligüri: 24 saatlik idrar miktarının 400 mL'den az olmasıdır. Az su içmek, çok terlemek,

diyare ve kusma gibi sıvı kaybının çok olduğu durumlar, yaygın ödeme yol açan haller, kanama,

şok, kalp yetmezliği gibi böbrek kan akımının azaldığı durumlar ve böbrek yetmezlikleri oligüri

nedenleridir.

Anüri: 24 saatlik idrar miktarının 50 mL'nin altında olmasına veya yokluğuna denir. Taş,

tümör, hipertrofik prostat gibi nedenlerle idrar akışının önlendiği durumlarda, böbrek yetmezliğinde

görülür.

Pollaküri: Genellikle 24 saatte 4-5 kez idrara çıkılır. İdrar miktarında artış olmadan idrara

çıkma sıklığının artmasına pollaküri denir. Psikojenik veya organik nedenlerle (üriner sistem

enfeksiyonları, sistit) görülür.

Yoğunluk (dansite): Normal idrar yoğunluğu 24 saatlik örnekte 1015-1020 g/L’dir. Günün

herhangi bir saatinde alınan idrar örneğinin dansitesi 1005-1020 g/L’dir. İdrar yoğunluğu ürometre

(dansitometre) adı verilen gereçle ölçülür. Filtre edilmiş idrar bir ölçü silindirine konur ve ürometre

idrarın içine yavaşça bırakılır. Ürometrenin dengeye gelmesi ve sabit durması beklenir. Bu işlem

sırasında ürometrenin cam silindirin çeperlerine değmemesine dikkat edilir. İdrarın üst yüzeyinin

ürometre üzerindeki seviyesi okunur. Ürometre 150C’lik sıvı için ayarlanmıştır. Daha sıcak veya

soğuk bir idrarın gerçek dansitesi hesapla bulunur. Bunun için idrarın sıcaklığı bir termometreden

okunur. 150C üzerindeki her 3

0C’lik sıcaklık farkı için okunan yoğunluğa 1 eklenir, l5

0C'nin

altındaki her 30C için 1 çıkartılır. Örneğin 21

0C'deki idrarın okunan dansitesi 1005 ise, gerçek

dansitesi 1007 g/L olacaktır.

44

Plazma ozmolalitesine eşit ozmolalitede idrar çıkarılmasına izostenüri denir (250-350 mosm/L).

Böyle bir idrarın dansitesi 1010 g/L’dir. İdrar dansitesinin artması (1035-1040 g/L) hiperstenüri;

dansitenin 1010 g/L’den düşük olması hipostenüri varlığına işaret eder.

Hiperstenüri nedenleri:

İdrarda çözünmüş maddelerin artması, örneğin çok miktarda NaCl, protein veya glikoz

çıkması (idrarda madde fazının artması) .

Az su içilmesi veya terleme nedeniyle normalde atılan maddelerin çok az idrarla

çıkarılması (İdrarda sulu fazın azalması).

Hipostenüri nedenleri:

Normalde çıkarılması gereken maddelerin idrarla atılamaması (böbrek fonksiyon

bozukluğu)

Çok fazla su içilmesi sonucunda idrar yoğunluğunun azalması (çözünmüş madde

miktarının idrar hacmine oranının azalması).

Vücut fonksiyonlarındaki bozukluklar sonucu, vücudun su tutma yeteneğinin ortadan

kalkması (diabetes insipidus).

pH: İdrar pH'ı beslenmeye bağlı olarak değişmekle birlikte, normal beslenme koşullarında

idrar hafif asittir. Normal idrar pH'ı 5-8, ortalama 6'dır. İdrar pH'ı genellikle yapısındaki primer

fosfatlardan ileri gelir. İdrar örneği beklemekle alkalileşeceğinden, pH taze idrarda tayin

edilmelidir. Keton cisimlerinin varlığı pH'ı düşürür. Üreyi parçalayıp amonyak oluşturan bakteriler

idrar pH'ını alkalileştirir.

İdrar pH'ı turnusol ve endikatör kâğıtları yardımı ile ölçülür. Endikatör kâğıdı üzerine idrar

değindirildiğinde ortaya çıkan renk skaladan karşılaştırılarak pH saptanır. Turnusol kâğıdı ile

idrarın asit veya alkali olduğu anlaşılabilir.

b) Kimyasal inceleme: Klinik biyokimya laboratuvarlarında, idrarda protein, glikoz,

bilirübin, ürobilinojen, keton cisimleri gibi bileşiklerin varlığı öncelikle kalitatif metotlarla

araştırılır. Daha sonra gerekirse bu bileşiklerin düzeyleri kantitatif yöntemlerle tayin edilir.

Uygulaması kolay ve hızlı sonuç verdiği için rutin idrar analizinde tercih edilen bir yöntem de idrar

stripleridir. İdrar stripleri, uygun ayıraçlar emdirilerek hazırlanmış şeritlerdir. Glikoz, keton

cisimleri gibi tek bir analiz için geliştirilmiş olanların yanı sıra idrar dansitesi, lökosit, eritrosit,

nitrit, keton cisimleri, bilirübin, ürobilinojen, protein ve glikoz varlığını gösteren tipleri de

mevcuttur. Bu stripler üreticiler tarafından belirtilen süre boyunca idrar içinde tutulur, bu sürenin

sonunda şerit üzerinde oluşan renk değişikliği kutu üzerindeki renklerle karşılaştırılarak sonuçlar

semikantitatif olarak saptanır.

45

Strip idrara daldırılır. İdrarın fazlası süzülür.

Oluşan renk şiddeti karşılaştırılır.

Süreli deneyler için kronometre kullanılır.

c) Mikroskobik inceleme (idrar sedimentinin incelenmesi): 5-10 mL idrar 3-5 dak. 600

g’de santrifüj edilir, üst faz atılır. Çökelti (sediment), tüpte kalan bir-iki damla idrar içerisinde iyice

karıştırılır. Karışımdan bir damla temiz bir lam üzerine alınır, üzerinde hava kabarcığı olmamasına

dikkat edilerek lamel kapatılır ve mikroskop altında incelenir. Normal idrarda sadece birkaç epitel

hücresi ve az sayıda kristaller görülür. İdrar sedimentinde eritrosit görülmesi hematüri, lökosit

görülmesi piyuri, bakteri görülmesi bakteriüri, protein silindirleri görülmesi silindirüri, ürat,

oksalat, fosfat gibi tuzların kristallerinin görülmesi kristalüri olarak adlandırılır.

İdrar sedimentinde görülebilen hücreler şunlardır:

Eritrosit: Çok soluk sarı renkte, homojen, ışığı kıran, yuvarlak veya iki tarafı oyuk bir disk

şeklinde, çekirdeksiz hücrelerdir. Normal idrarda eritrosit bulunmaz.

Lökosit: Eritrositlerden daha büyük, heterojen, yuvarlak, renksiz, çekirdekli hücrelerdir.

Normal sedimentte kadınlarda 1-5, erkeklerde 1-2 adet görülebilir.

Epitel hücresi: Daima lökositten büyük, renksiz, nukleuslu, çeşitli şekillerde olabilen

hücrelerdir. Dış genital organ epiteli, normal idrar sedimentinin en büyük hücresi olup yassı

epiteldir. Kadın idrarında çok, erkek idrarında ise az sayıda bulunur. Böbrek ve idrar yolları epiteli

ise normal idrar sedimentinde bulunmaz, ciddi böbrek hastalıklarında çıkar. Bunlardan başka

46

mantarlar ve maya denilen renksiz çift duvarlı oval veya armut biçiminde mikroorganizmalar da

görülebilir. Eritrositin katılan birkaç damla sulu asetik asitle erimesi, buna karşılık maya

hücrelerinin erimemesi ayırıcı tanıda yararlı olur. Bekletilmiş idrarda bakteri üreyebilir.

Silindirler: Silindirler protein yapıda, böbrekte oluşan ve bu nedenle şekilleri böbrek

tubulusuna benzeyen idrar sedimenti elemanlarıdır. Genellikle protein reaksiyonu pozitif olan

idrarın sediment incelemesinde görülür ve patolojinin böbrekte olduğuna işaret ederler. İdrarın

mikroskobik incelemesinde, kenarları paralel, çevreleri keskin göründüğü için bulunduğu

düzlemden ayrılır. Büyüklük, boy ve kalınlıkları değişir. Düz, büküntülü, spiral, kıvrık olabilirler.

Silindirin temelini hiyalin bir matriks oluşturur, bazen şekilsiz ince veya kalın granüller içerir.

Başlıca dört tip silindir vardır:

Hiyalin silindir: Saydam, ince, uzun, çevresi az keskin, yüzeyi homojendir.

Balmumsal silindir: Donuk sarımtrak renkli, ince veya kalın, çevresi koyu ve çok keskin,

yüzeyi homojendir.

Granüler silindir: Koyu renkli, uzun veya kısa, çevresi keskin, yüzeyi irili ufaklı

taneciklerle kaplıdır.

Hücresel silindir: Eritrosit, lökosit veya epitel hücrelerinin yan yana yapışması ile meydana

gelirler. İçerdikleri hücreye göre adlandırılırlar.

Silindirlerden daha ince ve uzun, saydam ve şeride benzeyen oluşumlara silindiroidler denir.

Kenarları paralel olmayıp genellikle bir ucu sivri bir ucu yuvarlaktır. Klinik açıdan önemli değildir.

İdrarın bazı kimyasal maddelerle doygunluğa ulaşması bu maddelerin çökelmesine ve

sedimentte kristallerin görülmesine yol açar. En sık rastlanılanlar tuzların oluşturduğu kristallerdir.

Amino asit metabolizma bozukluklarında lösin, tirozin, sistin kristalleri, ilaç tedavisi nedeniyle ilaç

kristalleri görülebilir. Bunlardan yaygın olanı amorf sülfonamid kristalleridir. Patolojik sedimentte

bakteri, mantar, parazit ve parazit kistleri görülebilir.

Fosfat kristalleri: Alkali idrarda bulunan renksiz amonyum veya magnezyum fosfat

kristalleridir. Tersiyer fosfat kristalleri tabut kapağı, sekonder kalsiyum fosfatlar ise kama veya

iğnelerden oluşmuş rozet şeklindedir.

Ürat kristalleri: Asit idrarda bulunan, sarı veya kahverengi pigmentli amonyum ürat

kristalleridir. İrili ufaklı yuvarlaklar veya dikenli atkestanesi gibi görünürler.

Ürik asit: Asit idrarda bulunur, sarı veya kahverengidir. Fıçı, prizma, iğne, ekmek dilimi,

rozet gibi görünürler.

Oksalat kristalleri: Renksiz kalsiyum oksalat kristalleri halinde asit ve nötral idrarda

bulunur. Mektup zarfı biçimindedir.

İdrar sedimentinde az sayıda ürat, fosfat ve oksalat kristallerinin bulunması normaldir.

47

Eritrosit Lökosit

Lökosit silindir Hiyalin silindir

Fosfat taşı Oksalat taşı

Eritrosit silindirleri

48

B- PROTEİN DIŞINDAKİ AZOTLU BİLEŞİKLER

Serumda protein olmayan azotlu bileşikler için arka azot (nonprotein nitrojen=NPN) deyimi kullanılır.

Bu bileşiklerin başlıcaları üre, ürik asit, kreatinin, kreatin, amino asitler, indikan, pürin bazları ve

amonyaktır. Normal koşullarda serumda protein dışındaki azotlu bileşiklerin konsantrasyonu 25–45

mg/dL’dir. Bu bileşiklerden özellikle üre ve kreatinin miktar belirtimleri böbrek fonksiyonlarının

değerlendirilmesi amacıyla rutin analizlerde yer alır.

Serumda Üre Miktarbelirtimi

Üre amino asit metabolizmasının son ürünüdür. Karaciğerde sentez edilerek genel dolaşıma verilen üre

böbrek glomerüllerinden tamamen süzülür, tubuluslardan %40’ı geri emildikten sonra kalanı idrarla

atılır. Serumda üre miktarı genellikle BUN (kan üre azotu) olarak verilir. Ürenin bir molü 60 g olup,

bunun 28 gramı azota aittir.

60

= 2.14 olduğuna göre: Üre (mg) = BUN (mg) x 2.14 dir.

28

Normal serumda BUN konsantrasyonu 8-20 mg/dL, üre konsantrasyonu 20-40 mg/dL’dir.

Serumda ve İdrarda Kreatinin Miktar Belirtimi (UYGULAMA 1)

Kreatin karaciğer ve böbreklerde arginin, glisin ve metyonin amino asitlerinden sentez edilerek genel

dolaşıma verilir. Özellikle kaslar ve beyin tarafından alınan kreatin burada fosforillenerek kreatin

fosfata dönüşür ve ortama kolaylıkla ATP verebilen yüksek enerji deposu olarak görev yapar.

Kreatinin, kreatin bileşiğinin "anhidr" şeklidir. Kreatinden bir günde oluşan kreatinin miktarı

organizmadaki toplam kreatin miktarının %2’sidir. Kreatinin böbrek glomerüllerinden tamamen filtre

olur, geri emilime uğramaz, plazma düzeyi çok yükselmedikçe tubuluslardan sekrete edilmez. Bir

böbrek hastalığı söz konusu değilse, kreatinin sentezi ve atılımı oldukça sabittir. Bu nedenle idrar

örneğinin 24 saatlik olup olmadığının kontrolünde de kullanılır.

Normal serum değerleri: Vücut kas kütlesi cinsiyete bağlı değişiklik gösterdiğinden serumda

kreatinin konsantrasyonu erkekte: 0.6-1.2 mg/dL; kadında: 0.5-1.1 mg/dL’dir.

Günümüzde kreatinin tayini için kullanılan yöntemler Jaffe reaksiyonuna dayanır. Kreatinin

alkali ortamda pikrik asit ile turuncu-kırmızı renkli kreatinin-pikrat bileşiği oluşturur. Jaffe reaksiyonu

kreatinine özgü değildir. Protein, glikoz, askorbik asit, guanidin, aseton gibi organizmada doğal olarak

bulunan maddeler ve bazı ilaçlar (sefalosporinler) pikrik asit ile reaksiyona girebilir. Proteinin etkisini

önlemek için proteinsizleştirilmiş serum filtratı kullanılmalıdır. Folin-Wu filtratı uygundur. İdrarda

49

kreatinin tayini de benzer yöntemle 100 kez sulandırılmış idrar örnekleri kullanılarak yapılır.

İdrarda kreatinin atılımı erkeklerde 1.0-2.0 g, kadınlarda ise 0.8-1.8 g/gün’dür.

Ayıraçlar:

% 10 luk sodyum tungstat

0.67 N H2SO4

Pikrik asit (0.04 M): 10.5 g pikrik asit sıcak suda çözündürülür, soğutulur, litreye tamamlanır.

0.75 M NaOH

Kreatinin depo standardı (1 mg/mL): 100 mg kreatinin ve 0.8 mL derişik HCl 100 mL'ye saf su ile

tamamlanır. Çalışma standardı (10 g/mL) için 1 mL’si 100 mL’ye tamamlanır.

Deneyin yapılışı:

Serum (2 mL) üzerine 3 mL su, 1 mL % 10'luk sodyum tungstat, 2 mL 0.67 N H2S04 konur, iyice

karıştırılır, 5-10 dak sonra süzülür (proteinsiz serum filtratı). Bu filtrattan deney için 3 mL kullanılır.

Ayıraçlar (mL)

Kör

Standart

Deney

Serum filtratı - - 3

Standart - 3 -

Distile su 3 - -

0.04 M Pikrik asit 1 1 1

0.75 N NaOH 1 1 1

Bütün tüpler karıştırılır, oda sıcaklığında 20 dakika bekletilir ve 520 nm'de ayıraç körüne karşı okunur.

Hesap:

Önce deney tübündeki serum hacmi hesaplanır.

2

x 3 = 0.75 mL

8

3 mL standart ile çalışıldığından standart tübün absorbansı 30 g kreatinine aittir.

D absorbans

x 30 = (a)g 0.75 mL serumdaki kreatinin

St absorbans

0.75 mL serumda (a) g kreatinin varsa

100 mL serumda x g

Bulunan değer g cinsindendir. 1000’e bölünerek mg/dL birimiyle ifade edilir.

50

C- BÖBREK FONKSİYON TESTLERİ

Klirens

“Temizlenme” anlamına gelen bu sözcük tıpta böbreğin süzme kapasitesini ifade etmek için

kullanılır. Böbreğin süzme fonksiyonu glomerül kapillerlerine ait bir fonksiyondur. Birim zamanda

(1 dak.) böbrekten geçen plazmadan böbreğin oluşturduğu süzüntünün hacmi, tek başına böbreğin

yeterli çalıştığını göstermez. Asıl önemli olan, süzüntünün içerdiği metabolit miktarıdır. Çünkü

böbreğin başlıca fonksiyonu kandan bazı maddelerin uzaklaştırılarak vücuttan atılmasını

sağlamaktır (ekskresyon fonsiyonu). Kanda bulunan ve aşağıda belirtilen özelliklere uygun bir

metabolitin idrar ve kan konsantrasyonlarının aynı anda ölçülmesi ile böbrek ekskresyon

fonksiyonu (glomerüler filtrasyon hızı) değerlendirilebilir. Bu amaçla kullanılacak olan maddede şu

özellikler bulunmalıdır:

Plazma proteinlerine bağlanmamalıdır.

Glomerüllerden tamamen süzülmelidir.

Tubuluslardan geri emilmemeli ve tubuler sekresyonu olmamalıdır.

Bir dakikalık süre içerisinde belirli bir maddeden temizlenen plazma miktarı (mL/dak),

böbrek glomerül filtrasyon fonksiyonunun (hızının) göstergesidir.

Klinikte kullanılan klirens testlerinde eksojen ve endojen maddelerden yararlanılmaktadır.

İnülin ve mannitol eksojen, üre ve kreatinin endojen maddelere örnektir.

Glomerül filtrasyon hızının ölçülmesinde en sık kullanılan endojen madde kreatinindir.

Kreatinin, sentez ve atılım hızı sabit, plazma proteinlerine bağlanmayan, tubuluslarda değişikliğe

uğramayan, diyet ve protein metabolizmasından bağımsız olan çok uygun bir klirens maddesidir.

Ancak plazma kreatinin düzeyleri yükseldiği durumlarda tubuluslardan sekrete edilebilir.

Kreatinin klirensi testi sabah uygulanır. Klirens hesabı için aşağıdaki bilgiler gereklidir:

Dakikada çıkarılan idrar miktarı (mL): Bunun için hastaya iki bardak su içirilir. 30 dak.

sonra mesanesini tamamen boşaltması istenir. Bunu takip eden iki saatlik sürede idrar toplanır. İki

saatlik idrar hacmi ölçülür ve dakikadaki hacim hesaplanır. (24 saatlik idrar toplanarak dakikada

oluşan idrar mL’si de hesaplanabilir).

İdrar kreatinin konsantrasyonu: Toplanmış olan idrar 100 kez sulandırılarak kreatinin

ölçümü yapılır. Dakikada böbrekten atılan kreatinin miktarını bulmak için idrarın kreatinin miktarı

(U, mg/mL) ile dakikadaki idrar hacmi (V, idrar oluşum hızı) çarpılır. (U.V= Kreatinin atılım hızı)

Normal çalışan bir böbrekte bu değer, plazma (serum) kreatinin değerinden ortalama 60-70 kat fazla

olmalıdır.

51

Plazma kreatinin konsantrasyonu: Hastadan 1. saatin sonunda alınan kanda ölçülür.

Kreatinin atılım hızı, plazma kreatinin konsantrasyonuna bölünerek bir dakikada böbrek

glomerüllerinde kreatininden temizlenen plazma hacmi (klirens) bulunur.

Klirens (mL/dak) U

Px V

U= Ölçülen maddenin idrar konsantrasyonu (mg/dL)

P= Ölçülen maddenin plazma konsantrasyonu (mg/dL)

V= İdrar hacmi (mL/dak)

Normal değerler: Erkekte 105±20 mL/dak

Kadında: 95±20 mL/dak.

Özellikle çocuklarda klirens değerleri için vücut alanına göre düzeltme yapılmalıdır. Bunun için

kişinin ağırlığına ve boyuna göre düzenlenmiş özel grafiklerden yararlanılarak vücut alanı (A)

bulunur ve şu formül uygulanır:

Klirens U

Px V x

1.73

A

1.73/A faktörü, kreatinin ekskresyonundaki kas kütlesine bağlı değişimler nedeniyle klirensi

ortalama vücut yüzeyine göre normalize eden bir sayıdır. Böylece standart vücut alanına göre bir

dakikada temizlenen plazma miktarı hesaplanır.

Klinikte üre klirensi de kullanılmaktadır. Ancak üre beslenme ve protein metabolizmasından

etkilendiği ve tubuluslardan kısmen reabsorbe olduğu için uygun bir klirens maddesi değildir.