Thrombospondin Type-1 Domain-Containing 7A in Idiopathic Membranous Nephropath

BY:

CRISTINA BENJUMEA

NATALIA ZAPATA L.

INTRODUCTION

Idiopathic membranous nephropathy is an

autoimmune disease and a common cause of the nephrotic syndrome in

adults

The phospholipase A2 receptor 1 (PLA2R1) was discovered as the major antigen involved in

the pathogenesis of adult idiopathic membranous

nephropathy.

30% of the patients with this disease have no obvious secondary cause of the disease

is thought that other endogenous

glomerular antigens may be involved in

these cases.

They analyzed serum samples from patients with :

idiopathic membranous nephropathy patients

other glomerular diseases

healthy controls

to identify circulating antibodies against

glomerular antigens other than PLA2R1

THROMBOSPONDIN TYPE 1

• It is a protein that in humans is encoded by the THBS1 gene.• This protein is an adhesive glycoprotein that mediates cell-to-cell and cell-

to-matrix interactions. It can bind to fibrinogen, fibronectin, laminin and type V collagen

FUNCTIONS

•  Natural inhibitor of neovascularization and tumorigenesis (apoptosis) in healthy tissue.

•  Positive and negative modulation of endothelial cell adhesion, motility, and growth.

• Affecting neuronal migration in the rostral migratory stream.• Interacts with numerous proteases involved in angiogenesis• Inmune system regulation

THROMBOSPONDIN TYPE 1

Nephropathy

 Damage or disease of a kidney

 Nephrosis: is non-inflammatory nephropathy

Nephritis is inflammatory kidney disease.

Bowel incontinenceBladder incontinenceCoordination problemsDiarrheaDysphagiaHypotensionImpotenceNauseaProblems with balanceTachycardiaVomiting

IDIOPATHIC MEMBRANOUS NEPHROPATHY

• Is one of the principal causes of nephropathy. It is caused by the thickening of part of the glomerular basement membrane which helps filter the blood.

• The thicker glomerular membrane does not work normally. As a result, Large amounts of protein are lost in the urine.

• 70% of the times is associated with PLA2R1, the other 30% is still unknown .

IDIOPATHIC MEMBRANOUS NEPHROPATHY

Symptoms :• Edema • Fatigue• Poor appetite• Urination, excessive at night• Weight gain

IDIOPATHIC MEMBRANOUS NEPHROPATHY

30% of the patients with this disease have no

obvious secondary cause of the

disease

Scientist are evaluating circulating

antibodies against glomerular antigens

THBS1

Can be one of the genes affected on

this disease

OBJECTIVE

Find circulating antibodies against glomerular antigens other than PLA2R1, that can explain the other 30% of the patents that are still an unknown process

Materiales y métodos: pacientes

• Dx de IMN Biopsia renal.

Muestras de suero

Nefropatía membranosa

65

Otras enfermedades glomerulares

76

Control

44

Anticuerpos anti-PLA2R1

ELISA

Western blot

Materiales y métodos: pacientes

• Muestras excluidas cuando: <18 añosEdad, género o proteinuria no disponibleProteinuria <1 g/dL

Materiales y métodos: tejido renal

Ext

ract

o de

pro

teín

a gl

omer

ular

Riñones nefrectomizados Porción sana

Riñones de donantes Corteza

Materiales y métodos: Western blot/inmunoblot

Detectar proteínas específicas en una muestra determinada

Electroforesis en gel: se separan proteínas según su tamaño

Se transfieren a una membrana de PVDF* o nitrocelulosa para buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella

Materiales y métodos: Western blot/inmunoblot

• Para usarse como primer anticuerpo, el suero fue diluido en proporción 1:100

• Para detectar la THSD7A, se usó un anticuerpo policlonal del conejo en una dilución 1:1000

Materiales y métodos: Western blot/inmunoblot

Materiales y métodos: Inmunoprecipitación

• Demuestra la existencia de anticuerpos que provocan la precipitación de sus antígenos cuando ambos están solución

Aísla una proteína de interés en una solución

Materiales y métodos: Inmunoprecipitación

Anticuerpos unidos a sustrato

sólido*

Gránulos se añaden a la mezcla de proteínas

Proteínas blanco capturadas por

los gránulos

*Gránulos microscópicos superparamagnéticos o gránulos microscópicos de agarosa (no magnético).

Método directo

Materiales y métodos: Inmunoprecipitación

Anticuerpos en la mezcla de

proteínas

Se unen a su objetivo

Perlas recubiertas de

proteína A/G se unen a la mezcla

Método indirecto

Materiales y métodos: Inmunoprecipitación

Extractos glomerulares se incubaron toda la noche con las muestras de suero.

Se les añadió Matriz de afinidad IgG4 para purificación y aislamiento de dicha Ig

Se recogieron los inmunoprecipitados

Examinar la presencia de la proteína THSD7A usando los anticuerpos anti-THSD7A

Materiales y métodos: Espectrometría de masasBandas

visibles del WB.

Corte

Digestión con tripsina

Péptidos digeridos identificados con espectrometría de

masas

• Permite elucidar

estructura y propiedades químicas

de una molécula.

Materiales y métodos: análisis histológico

• Inmunofluorescencia: visualizar la distribución de una proteína o antígeno específico en células o secciones de tejido.

• Inmunohistoquímica: revela la existencia de distintas proteínas en las muestras de tejidos, permiten conocer el origen y la función de diferentes células.

RESULTADOS

Se estudiaron muestras de Pacientes con NMI y muestras control para analizar total de proteínas en extractos glomerulares humanos

Positivos para anticuerpos

PLA2R1

Reaccionaron con PLA2R1 nativo y

recombinante

Negativos para anticuerpos

PLA2R1

Reaccionaron para una proteína

de 250 KD

Muestras control o con otras

enfermedades glomerulares

No presentaron ninguna

reacción similar

RESULTADOS

• En pacientes negativos para anticuerpos PLA2R1 se encontró un antígeno de 250 KD presente en el glomérulo humano.

• Se encontró que es una proteína N-glicosilada y que se expresa exclusivamente en la membrana celular, lo que ayuda a concluir que es diferente al PLA2R1.

RESULTADOS

RESULTADOS

Se usaron dos estrategias para

identificar el antígeno

Hidrolisis parcial de proteínas

Electroforesis y western blot

Se encontraron 3 bandas : 250, 225 y

200 KD

Se generó una lista de posibles antígenos

Por:CaracterísticasLocalización

Expresión en riñón humano

RESULTADOS

• Tras todos los estudios realizados se detectó que la proteína que se estaba buscando era la THSD7A

• También se vio que tanto la forma nativa como la recombinante de la proteína mostraban la misma masa tras la glicosilacion lo que se puede interpretar como una pequeña diferencia en modificaciones post transcripcionales.

• Todas las muestras presentaron inmunoprecipitación

RESULTADOS

RESULTADOS

Para determinar la Ig predominante, se usaron

anticuerpos contra IgG1 hasta IgG4

La predominante es la IgG4

RESULTADOS

THSD7A nativo y recombinante desaparecieron tras el proceso de reducción lo que sugiere que los anticuerpos atacan en epitopos específicos

RESULTADOS3 pacientes analizados

en western blot y proteína en orina.

1. Proteínas altas al diagnóstico.

2. Bajaron con inhibición farmacológica

3. 4 meses después subió nuevamente con aumento de anticuerpos.

4. Cambio de tratamiento.

5. Baja proteínas y anticuerpos.

1. Proteinuria severa

2. Tratamiento con corticotropina

3. Baja anticuerpos y proteinuria

1. No recibió inmunosupresores

2. Alta proteinuria constante

RESULTADOS

RESULTADOS

Las biopsias renales se analizaron con inmunofluorescencias, se encontró que:• THSD7A se relaciona con colágeno tipo IV y la

fibronectina.• Se ubica principalmente en podocitos.

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOSInmunohistoquimicos

PLA2R1 se expresa menos que THSD7A

RESULTADOS

Alto contenido granular de THSD7A y PLA2R1 normal

RESULTADOS

Normal para THSD7A pero elevado para PLA2R1

RESULTADOS

Pacientes con NMI secundario, normal para ambos valores

RESULTADOS

Exclusividad de anticuerpos

RESULTADOS

Al comparar características clínicas, no se encontraron relevancias en • Edad• Proteinuria• Albumina sérica• creatinina• Inmunosupresión

Si se encontraron cambios significativos en el género, encontrando ms mujeres en el grupo positivo para THSD7A

(65% )

Discussion

Names What did they say? Agree Disagree

Debiec H, Svobodova B, et al.

“Staining of the biopsy specimen for the presence of the antigen (THSD7A or PLA2R1) may identify a small additional percentage of patients whose serum was sampled after immunologic remission had occurred.”

x

Ju W, Greene SC, et al.

“This finding is consistent with recent data showing that THSD7A is more highly expressed in podocytes than in glomerular endothelial and mesangial cells.”

x

Discussion

Names What did they say? Agree Disagree

East L, Isacke CM “THSD7A was initially characterized as an endothelial protein that is expressed in the placental vasculature. ”

x

Hoxha E, Debiec H, et al.

“Furthermore, renal-biopsy samples from patients who were positive for anti-THSD7A antibodies had increased staining for the antigen within immune deposits, a phenomenon also seen in patients who are positive for anti-PLA2R1 antibodies”

x

Personal conclussions

• I think is very important to know a new antigen for the IMN, because it is a way to create effective treatments for these people. This discovery is very interesting because the authors are motivating us to investigate. Now is clear that PLA2R1 and THSD7A are implicated in IMN, but now the objective is to search which are the others antigens implicated in this disease and why the antibodies are expressing in some people but not in others.

Personal conclussions

• Been able to investigate this kind of diseases that don't have a known reason is a really good thing, because lots of them can have a better treatment if only the scientist and doctors could understand what is really happening, because some of this are not well treat not because lack of possibilities but because lack of knowledge.

Mapa conceptual

Por: Cristina Benjumea Zuluaga

Por: Natalia Zapata López