-
Thérapie génique ex vivo de la dystrophie musculaire de Duchenne
à l’aide de cellules souches pluripotentes
induites
Mémoire
Chantale Maltais
Maîtrise en Biologie cellulaire et moléculaire Maître ès
sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Chantale Maltais, 2014
-
III
Résumé
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie
héréditaire due à l'absence de
dystrophine. Parmi les thérapies possibles, la greffe autologue
de myoblastes dérivés de cellules
souches pluripotentes induites (hiPSCs) provenant du patient
dystrophique, préalablement corrigés
génétiquement, est envisageable. Lors de la première partie de
ma recherche, j'ai transplanté des
hiPSCs de patient DMD différenciés en myoblastes chez la souris
Rag/mdx. Ces cellules avaient été
corrigées génétiquement à l'aide d'un vecteur lentiviral codant
pour la micro-dystrophine, une
dystrophine tronquée, mais toujours fonctionnelle. Mes résultats
ont démontré l'expression de cette
micro-dystrophine dans certaines fibres hybrides. Cependant, le
protocole de différenciation des
hiPSCs en myoblastes doit être amélioré. La deuxième partie de
mon projet consistait donc à induire
la myogenèse à l’aide de protéines recombinantes. Pour cela, des
facteurs de transcription
régulateurs de la myogenèse, fusionnés à un peptide de
pénétration cellulaire, ont été produits et
purifiés d’un système bactérien. Leur pénétration dans des
cellules mésenchymateuses a été
observée in vitro et leurs effets sur les cellules sont en cours
d’étude. Lorsque ces approches
thérapeutiques seront mises au point, elles pourraient être
appliquées cliniquement pour traiter des
patients dystrophiques.
-
V
Abstract
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a hereditary myopathy due
to the absence of dystrophin.
Among the possible therapies, there is the autologous
transplantation of genetically corrected
myoblasts derived from human induced pluripotent stem cells
(hiPSCs) of a dystrophic patient. In the
first part of my research project, I have transplanted myoblasts
differentiated from iPSCs of a DMD
patient in the Rag/mdx mouse. These cells had been previously
genetically corrected with a lentiviral
vector coding for micro-dystrophin, a functional truncated
version of dystrophin. The results
demonstrated the expression of this micro-dystrophin in some of
the hybrid fibers. However, in order
to increase the graft success, the protocol of differentiation
of hiPSCs in myoblasts must be
improved. The second part of my project was the induction of
myogenesis from hiPSCs using
recombinant proteins. To accomplish this, myogenic transcription
factors fused with a cell penetrating
peptide were produced and purified from the bacterial system.
Their capacity to enter into
mesenchymal-like cells in vitro was observed and their effects
on the cells are currently under study.
Once optimized, these therapeutic approaches could be clinically
applied to treat dystrophic patients.
-
VII
Table des matières
Résumé
..............................................................................................................................................
III Abstract
...............................................................................................................................................
V Table des matières
............................................................................................................................
VII Liste des figures
..................................................................................................................................
IX Liste des tableaux
...............................................................................................................................
XI Liste des abréviations
.......................................................................................................................
XIII Remerciements
................................................................................................................................
XVII Chapitre 1 :
Introduction.......................................................................................................................
1
1.1 Tissu musculaire squelettique
..............................................................................................
1 1.1.1 Myogenèse
......................................................................................................................
1 1.1.2 Muscle squelettique adulte
..............................................................................................
4
1.1.2.1 Anatomie et physiologie
...........................................................................................
4 1.1.2.2 Réparation des tissus musculaires
..........................................................................
8
1.2 La dystrophie musculaire de Duchenne
.............................................................................
10 1.2.1 Historique
.......................................................................................................................
10 1.2.2 Description de la maladie
...............................................................................................
10 1.2.3 Gène de la dystrophine et mutations
.............................................................................
12 1.2.4 Dystrophine
....................................................................................................................
13
1.2.4.1 Isoformes
...............................................................................................................
13 1.2.4.2 Dp427 musculaire
..................................................................................................
14
1.2.5 Le complexe de glycoprotéines associé à la dystrophine
.............................................. 15 1.3 Soins et
traitements de la DMD
.........................................................................................
17
1.3.1 Diagnostique
..................................................................................................................
17 1.3.2 Traitements et thérapies
................................................................................................
18
1.3.2.1 Traitements pharmacologiques
..............................................................................
18 1.3.2.2 Thérapie génique
...................................................................................................
20 1.3.2.3 Thérapie
cellulaire..................................................................................................
22
1.4 Modèles animaux
...............................................................................................................
25 1.4.1 Modèles murins
.............................................................................................................
25 1.4.2 Modèles canins
..............................................................................................................
26 1.4.3 Modèle félin
...................................................................................................................
26
1.5 Cellules souches humaines
...............................................................................................
27 1.5.1 Cellules souches embryonnaires
...................................................................................
27
1.5.1.1 Historique et législation
..........................................................................................
27 1.5.1.2 Isolation et culture
..................................................................................................
28 1.5.1.3 Caractéristiques et mécanisme de pluripotence
.................................................... 30
1.5.2 Cellules souches pluripotentes induites
.........................................................................
32 1.5.3 Myogenèse
dirigée.........................................................................................................
33
Chapitre 2. La thérapie génique ex vivo à l’aide d’hiPSCs DMD et
d’un vecteur lentiviral codant pour la micro-dystrophine
..........................................................................................................................
35
2.1
Objectif...............................................................................................................................
35 2.2 Matériels et
Méthodes........................................................................................................
37
2.2.1 Production des vecteurs viraux
......................................................................................
37
-
VIII
2.2.1.1 Vecteur lentiviral codant pour la micro-dystrophine
(Le.MCK-µDysV5) ................. 37 2.2.1.2 Vecteur adénoviral
codant pour MyoD (Ad.CAG-MyoD)
........................................ 38
2.2.2 Culture cellulaire
............................................................................................................
38 2.2.2.1 Les myoblastes humains normaux
.........................................................................
39 2.2.2.2 La lignée d’hiPSCs dystrophiques
..........................................................................
40 2.2.2.3 Différenciation en cellules mésenchymateuses
...................................................... 40 2.2.2.4
Correction génique à l’aide du vecteur Le.MCK-µDysV5
....................................... 41 2.2.2.5 Différenciation
en myoblastes à l’aide du vecteur Ad.CAG-MyoD
.......................... 41
2.2.3 Détection de l’expression de la micro-dystrophine-V5 in
vitro ........................................ 41 2.2.4 Greffe des
cellules dans les muscles de souris Rag/mdx
.............................................. 43 2.2.5 Analyses
immunohistologiques
......................................................................................
44
2.3 Résultats
............................................................................................................................
45 2.3.1 Détection de l’expression de µDysV5 in vitro
.................................................................
45 2.3.2 Immunomarquages
........................................................................................................
45 2.3.3 Évaluation du nombre des fibres positives aux
immunomarquages ............................... 47
2.4 Discussion
..........................................................................................................................
49 Chapitre 3. Induction de la myogenèse à l’aide de facteurs de
transcription...................................... 53
3.1 Objectif
...............................................................................................................................
53 3.2 Matériels et méthodes
........................................................................................................
55
3.2.1 Construction des vecteurs d’expression
.........................................................................
55 3.2.2 Production des protéines recombinantes
.......................................................................
60
3.2.2.1 Transformation des bactéries thermo-compétentes
............................................... 60 3.2.2.2 Culture
des bactéries transformées
.......................................................................
61 3.2.2.3 Induction de la production des protéines recombinantes
....................................... 61 3.2.2.4 Détection des
protéines par immunobuvardage de type Western
.......................... 62 3.2.2.5 Lyse des cellules
bactériennes
..............................................................................
62 3.2.2.6 Purification des protéines recombinantes
.............................................................. 62
3.2.2.7 Dessalage et renaturation des protéines recombinantes
....................................... 63
3.2.3 Essais in vitro de 6xHis-Tat-MyoD
..............................................................................
64 3.2.3.1 Culture des cellules mésenchymateuses
............................................................... 64
3.2.3.2 Transduction des protéines recombinantes dans les cellules
mésenchymateuses 64 3.2.3.3 Détection des protéines
.........................................................................................
64
3.3 Résultats
............................................................................................................................
67 3.3.1 Construction des vecteurs d’expression
.........................................................................
67 3.3.2 Production et purification des protéines recombinantes
................................................. 67 3.3.3
Détection des protéines recombinantes dans les cellules transduites
.......................... 70
3.4 Discussion
..........................................................................................................................
71 Chapitre 4 : Conclusion
......................................................................................................................
73 Bibliographie
......................................................................................................................................
75
-
IX
Liste des figures
Figure 1. Facteurs impliqués lors de la myogenèse embryonnaire.
..................................................... 2 Figure 2.
Développement du muscle squelettique adulte.
...................................................................
3 Figure 3. Anatomie du muscle squelettique d’un point de vue
macroscopique et microscopique. ....... 6 Figure 4. Liaison des
myofibrilles au sarcolemme via les costamères.
................................................ 7 Figure 5.
Facteurs impliqués lors de la réparation musculaire.
............................................................ 9
Figure 6. Manœuvre de Gower
..........................................................................................................
11 Figure 7. Isoformes de la dystrophine.
...............................................................................................
14 Figure 8. Dystrophine et le complexe de glycoprotéines associé.
..................................................... 17 Figure 9.
Versions de la dystrophine.
................................................................................................
20 Figure 10. Étapes d'une greffe de myoblastes allogéniques.
............................................................. 23
Figure 11. Isolation des cellules souches embryonnaires et mise en
culture. .................................... 29 Figure 12. Vecteur
Le.MCK-µDysV5.
................................................................................................
37 Figure 13. Différents types cellulaires greffés.
...................................................................................
39 Figure 14. Immunomarquages des cryosections consécutives de
muscles greffés à l'aide de myoblastes humains normaux.
..........................................................................................................
45 Figure 15. Immunomarquages des cryosections consécutives de
muscles greffés à l'aide de MSCs corrigées génétiquement à l’aide
du vecteur Le.MCK-µDysV5 et différenciées en myoblastes. ....... 46
Figure 16. Immunomarquages des cryosections consécutives de muscles
greffés à l'aide de MSCs corrigées génétiquement à l’aide du
vecteur Le.MCK-µDysV5, mais non différenciées en myoblastes.
...........................................................................................................................................................
47 Figure 17. Succès de greffe évalué par le compte de fibres
positives aux immunomarquages. ........ 48 Figure 18.
Représentation schématique du plasmide pET-16b.
........................................................ 56 Figure
19. Mécanisme de l'induction à l'IPTG.
...................................................................................
57 Figure 20. Immunobuvardage de type Western de l'induction de la
production des protéines recombinantes.
..................................................................................................................................
67 Figure 21. SDS-PAGE de la purification de 6x[His]-Tat-MyoD.
......................................................... 68 Figure
22. SDS-PAGE de la purification de 6x[His]-Tat-Pax3.
........................................................... 69
Figure 23. SDS-PAGE de la purification de 6x[His]-Tat-Pax7.
........................................................... 69
Figure 24. Immunobuvardage de type Western pour la détection de la
protéine 6x[His]-Tat-MyoD intracellulaire.
.....................................................................................................................................
70
-
XI
Liste des tableaux
Tableau 1. Séquences des amorces utilisées.
...................................................................................
58 Tableau 2. Paramètres pour l'amplification par PCR des gènes
MyoD, Pax3 et Pax7. ..................... 59 Tableau 3.
Températures de production des protéines recombinantes dans les
bactéries E. coli BL21 (DE3).
................................................................................................................................................
61
-
XIII
Liste des abréviations
2′OMe = 2′-O-méthyl-phosphorothioate ADN = acide
déoxyribonucléique ADNc = ADN complémentaire ARN = acide
ribonucléique ARNm = ARN messager ATP = adénosine triphosphate BCA
= acide bicinchonique bFGF = basic fibroblast growth factor BMP 4 =
bone morphogenetic protein 4 CAG = cytomegalovirus early
enhancer/chicken β-actin CH= calponin homology CKCS-MD = cavalier
King Charles spaniels muscular dystrophy cm = centimètre CPP =
cell-penetrating peptide DAPI = 4',6'-diamidino-2-phénylindole DGC
= complexe de glycoprotéines associé à la dystrophine DMD =
Dystrophie Musculaire de Duchenne DMEM = Dulbecco's modified Eagle
medium DTT = dithiothreitol ESCs = cellules souches embryonnaires
Eya 1/2 = eyes-absent homologs 1 et 2 FBS = sérum de veau foetal
FGF = fibroblast growth factor g = force relative de centrifugation
GRMD = Golden Retriever Muscular Dystrophy HBSS = Hank’s balanced
salts solution hESCs = ESCs humaines HFMD = hypertrophy feline
muscular dystrophy HGF = hepatocyte growth factor HRP = Horseradish
peroxydase hiPSCs= iPSCs humaines IGF = insulin growth factor IgG =
immunoglobuline G IL-6 = interleukine-6 IPTG =
isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside iPSCs = cellules souches
induites à la pluripotence kb = kilobase kDa = kiloDalton LB =
Luria-Bertani LIF = leukemia inhibitory factor M = molaire MAST205
= microtubule associated serine/threonine kinase 205 Kd Mb =
mégabase MCK = muscle creatine kinase
-
XIV
Mdx = muscular dystrophy X-linked MEF = mouse embryonic
fibroblasts mg = miligramme mm = milimètre ml = mililitre mM =
milimolaire MI = multiplicité d’infection MRFs = facteurs
régulateurs de la myogénèse MSCs = cellules mésenchymateuses Myf5 =
facteur myogénique 5 MyHC = myosin heavy chain MyoD = facteur de
différenciation myogénique MyoG = myogénine NaCl = chlorure de
sodium NAPDH = nicotinamide adénine dinucléotide phosphate nNos =
neural nitric oxide synthase ONA = oligonucléotide antisens Pax 3/7
= paired box transcription factors 3 et 7 pb = paire de bases PBS =
phosphate buffer solution PCR = réaction en chaîne par polymérase
PDGF = platelet-derived growth factor PMO = morpholino
phosphorodiamidate oligonucléotide PMSF =
phenylmethylsulfonylfluoride P/S = pénicilline et streptomycine rpm
= rotations par minute SDS = sodium dodécyl sulfate SDS-PAGE =
sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Shh =
Sonic hedgehog Six1/4 = sine oculis–related homeobox 1 et 4
SSEA-3/4 = antigènes de surface spécifiques au stade embryonnaire 3
et 4 TA = Tibialis anterior Tat = trans-acting activator of
transcription
TGF- = transforming growth factor beta TNF = tumor necrosis
factor Tris-HCl = Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride
µDys = micro-dystrophine µDysV5 = micro-dystrophine avec un tag V5
µl = microlitre µg = microgramme µm = micrometre V = Volts VAA =
virus adéno-associé
-
XV
Ces travaux ont été effectués dans l’espoir de
contribuer au développement d’un traitement
curatif contre la dystrophie musculaire de
Duchenne.
-
XVII
Remerciements
En premier lieu, je tiens à remercier le Dr. Jacques P. Tremblay
de m’avoir accueillie dans son
laboratoire. Il a su me transmettre ses connaissances et sa
passion pour la recherche, et m’a permis
d’évoluer dans un environnement innovateur. J’ai eu la chance de
travailler sur de multiples projets et
ainsi d’apprendre une grande variété de techniques.
De plus, je suis reconnaissante envers tous les membres de
l’équipe de recherche pour m’avoir
conseillée et pour tous les bons moments passés au laboratoire.
Un merci spécial à Joël Rousseau
et Catherine Gérard qui ont su répondre à mes innombrables
questions, surtout au début de ma
maîtrise, et me soutenir lorsque j’étais dans le creux de la
vague.
J’aimerais aussi remercier particulièrement Carl Lebel, qui m’a
montré les premiers pas en thérapie
génique, et William-Édouard Gravel, qui est toujours de bonne
humeur et prêt à aider.
Finalement, je tiens à remercier ma famille et mes amis,
spécialement ma mère et mon beau-père.
Sans leurs encouragements, leur soutien et leur amour, je ne
serais pas la moitié de la personne que
je suis aujourd’hui.
-
1
Chapitre 1 : Introduction
Ce mémoire porte sur le développement d’une thérapie de la
dystrophie musculaire de Duchenne
(DMD) basée sur l’utilisation de cellules souches pluripotentes
induites humaines (hiPSCs). Des
thèmes seront d'abord introduits, comme le tissu musculaire
squelettique, la DMD et ses traitements
et thérapies, les modèles animaux existants et les cellules
souches en médecine régénérative. Par la
suite, deux parties de mon projet de recherche seront décrites,
d’une part la thérapie génique ex vivo
de la DMD à l'aide d'hiPSCs et d'un vecteur lentiviral codant
pour la micro-dystrophine, et d’autre part
l’induction de la myogenèse à l’aide de facteurs de
transcription.
1.1. Tissu musculaire squelettique
Les tissus musculaires squelettiques ont pour fonction
principale de permettre le mouvement
volontaire, le maintien de la posture et la production de
chaleur. Ils représentent près de 40 % du
corps humain et leur formation débute lors de
l’embryogenèse.
1.1.1. Myogenèse
Lors de l’embryogenèse, des gradients de morphogènes, comme
l'acide rétinoïque, le fibroblast
growth factor (FGF) et Wnt, ainsi que des changements dans
l’expression des gènes, vont provoquer
la formation des somites à partir du mésoderme para-axial.
Lorsque les cellules quittent la partie
caudale, un gradient d’acide rétinoïque permet leur polarisation
pour former le dermomyotome dorsal
et le sclérotome ventral. Des signaux venant des tissus
avoisinants, tels que Wnts, Sonic Hedgehog
(Shh) et Noggin, activent l’expression des facteurs de
régulation myogéniques (MRFs) primaires,
alors que le bone morphogenetic protein 4 (BMP4) inhibe
l’engagement des cellules dans la voie
myogénique, tel que démontré par la Figure 1 [1, 2].
-
2
Figure 1. Facteurs impliqués lors de la myogenèse embryonnaire.
Les muscles squelettiques proviennent du dermomyotome, lui-même
dérivé du compartiment dorsal du somite. Image adaptée de Gilbert,
2013 [2].
Le compartiment dorsal du somite deviendra le dermomyotome, dont
les muscles squelettiques (sauf
ceux de la tête) sont dérivés. Les protéines sine oculis–related
homeobox 1 et 4 (Six1 et Six4) lient
les eyes-absent homologs 1 et 2 (Eya1 et Eya2) et les
transloquent au noyau. Ainsi, ils agiront
comme cofacteurs pour activer les gènes cibles de Six1/4,
c'est-à-dire paired box transcription
factor 3 (Pax3), facteur de différenciation myogénique (MyoD),
Mrf4, et myogénine (MyoG). Les
cellules du dermomyotome sont marquées par l’expression des
paired box transcription factors 3
et 7 (Pax3 et Pax7) et par une faible expression du facteur
myogénique 5 (Myf5). Pax3 est requis
pour la migration des précurseurs myogéniques des somites et
active l’expression précoce et
transitoire de Myf5 et MyoD [3]. Pax7 sera nécessaire pour la
spécification en cellules satellites [4].
Une partie du dermomyotome va donc se développer pour former le
myotome. À ce stade, les
cellules sont dites engagées dans la voie musculaire,
puisqu’elles expriment MyoD et Myf5, deux
marqueurs de la spécification terminale des cellules
musculaires. Les cellules qui les expriment se
nomment des myoblastes [5]. Les myoblastes vont proliférer pour
finalement se retirer du cycle
cellulaire. Par la suite, ils expriment des MRFs tardifs, comme
la MyoG et Mrf4. Les cellules
deviennent alors des myocytes, qui vont s’aligner, puis
fusionner pour former les fibres musculaires,
-
3
c’est-à-dire les cellules musculaires adultes qui expriment des
protéines spécifiques au muscle,
comme la myosin heavy chain (MyHC) et muscle creatin kinase
(MCK) (Figure 2) [6].
Figure 2. Développement du muscle squelettique adulte. Plusieurs
facteurs de transcription régulent la myogenèse. Six1/4 et Pax3/7
sont des régulateurs de la spécification initiale, alors que Myf5
et MyoD engagent les cellules dans la voie myogénique. La fusion
des myocytes en myotubes est assurée par l'expression des gènes de
la différenciation terminale, soit MyoG et Mrf4. Figure adaptée de
Bentzinger et al., 2012 [6].
Toutefois, une partie des précurseurs myogéniques ne se
différencie pas de cette manière. En effet,
les cellules satellites exprimant Pax7 restent amarrées au
pourtour des fibres nouvellement formées
-
4
et ont un rôle clé dans la régénération musculaire. Leur
implication dans ce processus de réparation
sera expliquée en détail à la section 1.1.2.2.
1.1.2. Muscle squelettique adulte
1.1.2.1. Anatomie et physiologie
Les cellules du muscle squelettiques sont appelées fibres
musculaires. Elles sont multinucléées et
possèdent une forme cylindrique d'un diamètre variant de 10 à
100 micromètres (µm) et dont la
longueur peut atteindre jusqu'à 30 centimètres (cm) chez
l'humain. Elles sont formées par la fusion
de myoblastes, des cellules précurseurs mononucléées [7].
Les fibres possèdent un sarcoplasme qui contient plusieurs
organites, dont de multiples
mitochondries, le réticulum sarcoplasmique ainsi que de nombreux
noyaux cellulaires, qui sont
retrouvés en périphérie de la fibre, sous la membrane plasmique.
Cette dernière est appelée le
sarcolemme et fait face à la lame basale, une matrice de tissu
conjonctif, principalement constituée
de fibronectine pour permettre la migration de cellules
mononucléées lors de la réparation
musculaire. Cette lame basale est située sous la lame
réticulaire, et font tous deux partie de
l’endomysium. Diverses cellules s’y retrouvent, comme des
fibroblastes et des macrophages. De
plus, les cellules satellites, qui sont les cellules souches
musculaires adultes, sont situées dans la
lame basale [8].
Les fibres musculaires sont formées de myofibrilles, les
éléments contractiles du muscle. Il s'agit
d'organites complexes faits de groupes de filaments d'actine et
de myosine. Ces filaments sont
organisés en sarcomère, l'unité fonctionnelle du muscle, et
portent des stries qui sont alignées avec
celles des myofibrilles voisines. C'est l'alternance régulière
des bandes A et I qui donne l'apparence
striée du muscle [7, 8].
Le regroupement de plusieurs fibres musculaires entourées de
leur endomysium est un faisceau
musculaire, lui-même étant recouvert de tissu conjonctif dense
régulier appelé le périmysium. Ce
dernier comprend de multiples vaisseaux sanguins nécessaires
pour l'irrigation du muscle. Plusieurs
faisceaux regroupés ensemble sont recouverts par l'épimysium,
une couche de tissu conjonctif dense
irrégulier. Elle est impliquée dans la transmission de la force
mécanique et l’élasticité du muscle, en
-
5
plus de servir de réservoir de facteurs de croissance et d’eau
pour le développement et la
régénération musculaire (Figure 3) [8, 10].
-
6
Figure 3. Anatomie du muscle squelettique d’un point de vue
macroscopique et microscopique. Les muscles squelettiques sont
faits de myofibrilles composées de sarcomères contenant des
filaments d'actine et de myosine. Les myofibrilles sont regroupées
en fibres musculaires. Chaque fibre est entourée d'endomysium. Un
ensemble de fibres est entouré du périmysium et s'appelle un
faisceau. Plusieurs faisceaux sont enveloppés par l’épimysium.
Image tirée de Tortora et al., 1994 [8].
-
7
La contraction musculaire est provoquée par le glissement des
filaments d'actine le long des
filaments de myosine, un processus qui est dépendant de
l’adénosine triphosphate (ATP) et du
calcium. La régulation du transport des ions calcium est assurée
par le réticulum sarcoplasmique, qui
entoure chaque myofibrille. Les myofibrilles périphériques sont
connectées à la membrane plasmique
via les costamères, c’est-à-dire des complexes protéiques situés
sous la membrane dont le rôle est
de permettre la transmission des forces contractiles d’une fibre
à l’autre. Les costamères sont des
régions enrichies en plusieurs protéines, dont deux complexes
importants, soit les complexes
dystrophine-glycoprotéines et intégrine-vinculine-taline (Figure
4). Ces derniers empêchent donc les
micro-ruptures de la membrane en synchronisant les contractions
des fibres musculaires [7].
Figure 4. Liaison des myofibrilles au sarcolemme via les
costamères. Les costamères sont riches en protéines. On y retrouve
une concentration de complexes dystrophine-glycoprotéines et
intégrine-vinculine-taline. Image adaptée de Ervasti, 2003 [9].
-
8
1.1.2.2. Réparation des tissus musculaires
Les fibres musculaires entrent dans un processus de réparation
en réponse à des bris qui peuvent
être causés par des stress mécanique, ischémique, thermique ou
pharmacologique. La réparation
musculaire s'effectue en deux phases, soit la phase dégénérative
et la phase régénérative.
La phase dégénérative est caractérisée par une nécrose. Elle
survient immédiatement après la
rupture du sarcolemme de la fibre, ce qui provoque une entrée de
calcium intracellulaire, et la
destruction d'organites, comme les mitochondries, les ribosomes
et les myofibrilles. Cette rupture
provoque aussi une sortie des protéines musculaires vers le
système sanguin, telles la créatine
kinase et la troponine, ainsi que des molécules biologiquement
actives.
La phase régénérative est divisée en trois étapes : la réaction
inflammatoire, l’activation et
différenciation des cellules satellites, et finalement la
maturation des nouvelles fibres et le
remodelage des fibres régénérées. Tout d’abord, une réaction
inflammatoire est enclenchée, au
cours de laquelle des macrophages et neutrophiles sont attirés
aux sites endommagés pour
phagocyter les débris cellulaires [11]. Ces cellules ainsi que
la matrice extracellulaire sécrètent des
facteurs de croissance qui activent les cellules satellites,
comme le FGF, le transforming growth
factor beta (TGF-), l'insulin growth factor (IGF), l'hepatocyte
growth factor (HGF), le tumor necrosis
factor (TNF), l'interleukine-6 (IL-6) et le leukemia inhibitory
factor (LIF) (Figure 5). Les cellules
satellites sont normalement quiescentes et ont un faible taux de
synthèse de macromolécules et une
activité métabolique minimale. Elles se protègent bien des
dommages, via des facteurs et des
enzymes qu’elles produisent, en plus d’utiliser la glycolyse
anaérobique, dans le but de limiter
l’accumulation d’oxygène réactif. Elles ont la capacité de se
régénérer elles-mêmes et de se
différencier [12, 13]. Elles produisent des molécules qui
régulent les cascades de signalisation pour
leur entrée dans le cycle cellulaire. Si nécessaire, elles
peuvent être rapidement activées puisqu’elles
possèdent des récepteurs et des enzymes pour répondre aux
molécules de signalisation lors d’un
bris de fibres musculaires. De plus, les cellules satellites
transcrivent les facteurs myogéniques, mais
ceux-ci sont inactifs grâce à des corépresseurs ou des
mécanismes post-transcriptionnels. Ces
facteurs peuvent donc être rapidement libérés lors de
l’activation des cellules satellites [14]. Ainsi,
suite à leur activation, le niveau d'expression de Pax7 diminue
alors que celui de MyoD et Myf5
augmente dans les cellules satellites. Leur division asymétrique
et la différenciation des cellules qui
-
9
en découle résultent en des myoblastes qui vont fusionner aux
fibres endommagées, ou former de
nouvelles fibres [7]. Une petite portion des cellules ne se
différencie pas et retourne à un état de
quiescence pour préserver le pool de cellules satellites [15].
Les fibres régénérées et nouvellement
formées sont petites et centro-nucléées. Leur croissance et
maturation, ainsi que la migration des
noyaux vers la périphérie des fibres, correspond à la troisième
phase de la régénération, et dépend
de plusieurs facteurs, comme la nature du bris ainsi que le
rétablissement des jonctions
neuromusculaires et des vaisseaux sanguins [11].
Figure 5. Facteurs impliqués lors de la réparation musculaire.
Lors d'un bris musculaire, des facteurs sont sécrétés par la
matrice extracellulaire et les cellules inflammatoires, activant
ainsi les cellules satellites qui se mettent alors à exprimer MyoD
et Myf5. Ces dernières vont donc proliférer et se différencier, et
ainsi exprimer les gènes tardifs, soit MRF4 et et MyoG, avant de
fusionner avec la fibre endommagée. Figure adaptée de Chargé et
al., 2004 [5].
-
10
1.2. La dystrophie musculaire de Duchenne
1.2.1. Historique
La dystrophie musculaire de Duchenne, ou DMD, est une myopathie
qui a été décrite pour la
première fois en 1852 par Edward Meryon. Toutefois, c'est au
physiologiste français Guillaume
Benjamin Amand Duchenne à qui on doit de considérables
caractérisations cliniques en 1861, alors
qu'il croyait que la maladie était d'origine cérébrale.
Toutefois, en 1868, il s'est aperçu que la maladie
était plutôt d’origine musculaire. Il la nomma alors « paralysie
musculaire pseudo-hypertrophique ou
paralysie myo-sclérosique », mais elle est maintenant largement
connue sous le nom de dystrophie
musculaire de Duchenne. Il fut le premier à proposer des
critères diagnostiques bien précis et il
inventa l'appareil à biopsie, qui a été largement utile pour
décrire les processus microscopiques de la
maladie [16].
1.2.2. Description de la maladie
La DMD est une myopathie héréditaire récessive liée au
chromosome X, ayant une incidence d'un
cas sur 3 500 naissances mâles. Il s'agit de la forme de
dystrophie la plus sévère, étant létale. Elle
est caractérisée par une perte progressive de force musculaire
dès l'âge de 2 ou 3 ans. Durant ce
stade de l'enfance, les symptômes sont plutôt rares, mais des
signes cliniques, comme l'élévation du
taux de créatine kinase sérique et la nécrose des tissus
musculaires, sont des preuves du début de
la dégénérescence musculaire. Vers l'âge de 4 ans, il est
possible d'observer une démarche
anormale, une pseudo-hypertrophie des mollets, ainsi qu'une
difficulté à monter les escaliers. On
note l'apparition des signes de Gower vers l'âge de 5 à 7 ans
(Figure 6). Il s'agit d'une manœuvre
effectuée par l'enfant pour se relever du sol. Les muscles de
ses jambes et de ses hanches étant
devenus trop faibles pour cette tâche, il doit se servir de tout
son corps pour se relever [16].
-
11
Figure 6. Manœuvre de Gower La faiblesse musculaire des patients
DMD les force à utiliser tous les muscles de leur corps pour se
relever du sol. Cette méthode est appelée Manœuvre de Gower
[17].
Vers l'âge de 12 ans, les patients se retrouvent confinés dans
un fauteuil roulant puisque les muscles
de leurs membres ont perdu trop de force pour les soutenir. La
majorité des patients développent
alors une scoliose. Des difficultés respiratoires surviennent
peu après, les forçant à recourir à un
système de respiration assistée. L'espérance de vie des patients
varie entre 20 et 30 ans et les
principales causes de décès sont l'insuffisance respiratoire ou
cardiaque [18].
La plupart des femmes porteuses sont asymptomatiques
puisqu'elles possèdent deux copies du
chromosome X. Celles qui sont toutefois affectées ont des
symptômes se rapprochant beaucoup
plus de ceux de la dystrophie musculaire de Becker que ceux de
la DMD [19].
-
12
De plus, les patients atteints ont un taux sérique de créatine
kinase très élevé dès la naissance, en
raison des dommages continuels que subissent leurs tissus
musculaires. En effet, les muscles des
patients sont très fragiles puisqu'une protéine très importante,
la dystrophine, est absente. Au fil du
temps, le tissu musculaire est remplacé par du tissu adipeux et
conjonctif, jusqu'à ce qu'il y ait perte
de fonction musculaire [20].
1.2.3. Gène de la dystrophine et mutations
Le gène de la dystrophine responsable de la maladie a été
découvert par Kunkel et al. en 1985 [21].
Il est situé sur le bras court du chromosome X au locus Xp21.2.
Cette découverte est attribuable à
l'étude de quelques patientes atteintes de la DMD ayant une
translocation autosomale du
chromosome X, et une inactivation de l’autre chromosome X [22,
23].
Le gène possède environ 2.4 mégabases (Mb) d'acides
désoxyribonucléiques (ADN), ce qui en fait
un des plus grands gènes connu chez l’humain, représentant à lui
seul près de 1 % du
chromosome X. Il code pour un acide ribonucléique messager
(ARNm) de 14 kilobases (kb) de 79
exons, ayant des introns inhabituellement longs. Ainsi,
seulement 0,6 % du gène représente la partie
codante.
Dans 70 % des cas, les patients ont des réarrangements de larges
sections d'ADN, soit une délétion
ou duplication d’un ou plusieurs exons. Ces mutations sont
retrouvées généralement près de deux
sites en particulier : près de l’extrémité 5’ du gène et vers le
centre, là où il y a de très longs introns
(plus de 100 kb). Dans 30 % des cas, il s’agit de mutations
ponctuelles ou de micro-délétions
impliquant un petit nombre de nucléotides. Chez le tiers des
patients DMD, les mutations sont
spontanées et n’ont pas d'antécédent familial [16].
La gravité des symptômes de la DMD n’a pas de lien avec la
longueur de la mutation. Généralement,
les mutations produisent une erreur de cadre de lecture lors de
la traduction de l’ARNm. Le ribosome
rencontrera un codon stop prématuré et la protéine ne sera pas
produite.
Dans les cas où la mutation dans le gène de la dystrophine ne
causerait pas de codon stop
prématuré, une protéine tronquée est produite. Ces patients sont
atteints de la dystrophie musculaire
de Becker. La sévérité des symptômes des patients Becker dépend
de l’ampleur de la délétion et du
-
13
site de la mutation. Si c'est dans un endroit de liaisons
(domaine N-terminal ou riche en cystéines), la
dystrophine ne pourra plus se lier à son complexe glycoprotéique
associé (DGC) ou à l’actine, et un
phénotype de DMD est obtenu [24]. Toutefois, si la protéine
garde une certaine fonctionnalité, le
phénotype de la maladie sera atténué. La dystrophie de Becker se
caractérise donc par des
symptômes beaucoup moins sévères que ceux de la DMD et la
progression de la maladie est plus
lente [16, 24].
1.2.4. Dystrophine
1.2.4.1. Isoformes
Il existe plusieurs isoformes de la dystrophine (Figure 7). La
transcription du gène de la dystrophine
pleine longueur (Dp427) est sous le contrôle de trois promoteurs
principaux indépendants, selon le
tissu :
1) Cerveau (B);
2) Muscle (M);
3) Purkinje (P).
Il existe aussi quatre isoformes courtes, régulées par quatre
promoteurs internes qui sont eux aussi
tissus spécifiques :
1) Rétinienne (R) = Dp260;
2) Cerveau 3 (B3) = Dp140;
3) Cellules de Schwann (S) = Dp116;
4) Général (G) = Dp71.
-
14
Figure 7. Isoformes de la dystrophine. Il existe sept isoformes
de la dystrophine, soit trois longues et quatre courtes. Leur
transcription dépend des tissus. Figure adaptée de Blake et al.,
2002 [25].
Les fonctions des isoformes sont toujours mal connues, mais
l'absence de l'isoforme neurale
expliquerait potentiellement le retard mental parfois observé
chez le tiers des patients DMD [16, 25].
1.2.4.2. Dp427 musculaire
L’isoforme musculaire de la dystrophine (Dp427(M)) a un poids
moléculaire de 427 kiloDaltons (kDa),
et est constituée de 3685 acides aminés [16, 26]. Sa séquence
est hautement conservée chez
l’homme et la souris, et est riche en hélice-alpha, impliquant
un rôle structurel. Elle est présente dans
tous les tissus musculaires (squelettiques, cardiaques et
lisses) à environ 0.002 % des protéines
totales [27].
La dystrophine est composée de quatre domaines principaux. Son
extrémité N-terminale contient
une paire de modules CH, pour calponin homology, et sert de
domaine de liaison à l'actine. Le
deuxième domaine est composé de 24 répétitions en tandem de
style triple hélice et quatre
domaines charnières, ce qui lui confère sa flexibilité. Ce
domaine a une certaine homologie avec les
multiples répétitions de la spectrine. Le troisième domaine
contient un module WW qui se lie à la
bêta-dystroglycane, une protéine du complexe associé à la
dystrophine. Ce module est suivi par une
séquence riche en cystéines, permettant une liaison
calcium-dépendante de la calmoduline. Le
quatrième domaine, le C-terminal, ne présente pas d'homologie
avec aucun gène connu et est
spécifique à la dystrophine. Il s’agit d’un domaine superhélice
alpha qui permet la liaison à la
dystrobrévine [16, 28].
-
15
La dystrophine est située sur la surface cytoplasmique du
sarcolemme et sert d’ancre pour le
cytosquelette à la matrice extracellulaire via le DGC [29]. Elle
assure ainsi l’intégrité du sarcolemme
et la transduction de la force le long de la fibre lors des
contractions musculaires. Elle empêcherait
ainsi les micro-ruptures et les fuites d’ions. Chez le patient
DMD, la nécrose cellulaire progressive
serait due à des protéases calcium-dépendantes. La dystrophine
étant absente, les micro-ruptures
du sarcolemme créeraient des fuites d’ions qui augmenteraient la
nécrose [26]. La dystrophine
possède aussi un rôle important lors de l’échafaudage du DGC,
mais les mécanismes moléculaires
impliqués sont incertains.
L’absence de la dystrophine provoque l’instabilité du sarcolemme
des fibres musculaires. Les
contractions musculaires des patients dystrophiques provoquent
donc des ruptures membranaires
entrainant une succession de cycles de dégénérescence et
régénérescence des myofibrilles. Ces
cycles continus épuisent le réservoir de cellules satellites qui
deviennent sénescentes à force de se
diviser continuellement. Ceci entraîne la dégénération
musculaire progressive caractéristique de la
maladie.
1.2.5. Le complexe de glycoprotéines associé à la
dystrophine
Le complexe de glycoprotéines associé à la dystrophine (DGC)
compte plusieurs éléments, dont la
distribution varie selon la localisation ou le tissu : la
laminine-2, les dystroglycans (α et β), les
sarcoglycans (α, β, δ, ε, γ et δ ), la sarcospan, la
dystrobrévine, les syntrophines (α1, β1, β2, γ1
et γ2), la neural nitric oxyde synthase (nNos), la microtubule
associated serine/threonine kinase 205
Kd (MAST205), la syncoiline, et la calvéoline-3. Chez les
vertébrés, au niveau musculaire, son rôle
est de maintenir la structure du sarcolemme et des jonctions
neuromusculaires en liant le
cytosquelette à la matrice extracellulaire [30]. De plus, il
serait aussi impliqué dans la transmission
synaptique et le regroupement de récepteurs de l’acétylcholine
aux jonctions neuromusculaires. Il
possède aussi un rôle lors de la signalisation, puisqu'il
interagit avec des molécules de signalisation,
comme nNos, les ions calcium, la calmoduline, la protéine kinase
A, Grb2, Ras,
phosphoinositide 3-kinases et bien d’autres [31]. Les rôles
possibles du DGC dans les autres tissus
ne seront pas discutés dans ce mémoire.
-
16
Parmi les éléments du DGC, des mutations dans les gènes codant
pour les sarcoglycans,
dystroglycans, dystrobrévines, la laminine et la calvéoline-3
sont connues pour être létales ou
causant des myopathies. En particulier, nNos est importante pour
la production d'oxyde nitrique, qui
augmente la circulation sanguine localement selon les besoins
lors d’un exercice physique. Chez les
patients dystrophiques, nNos est délocalisé du sarcolemme et se
retrouve au cytosol, mais conserve
son activité enzymatique. Ainsi, il augmenterait la constriction
des vaisseaux sanguins, ce qui
causerait un stress ischémique [32], en plus d’augmenter
l’activité de la nicotinamide adénine
dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase, l’inflammation et la
dégradation de protéines, ainsi que de
diminuer l’activation des cellules satellites [33]. En raison de
cela, les muscles des patients
dystrophiques seraient plus fragiles, subiraient un plus grand
stress oxydatif et ischémique, et
auraient une plus faible capacité régénérative.
-
17
Figure 8. Dystrophine et le complexe de glycoprotéines associé.
La dystrophine relie le cytosquelette d’actine par son extrémité
N-terminale à la matrice extracellulaire via le complexe de
glycoprotéines associé à la dystrophine (DGC). Image adaptée de
Davies et al., 2006 [34].
1.3. Soins et traitements de la DMD
1.3.1. Diagnostique
Les premiers symptômes de la maladie sont visibles vers l’âge de
3 ans. Une prise de sang pour
l’analyse du taux de créatine kinase sérique permettra de
déterminer l’importance des bris
musculaires. Le diagnostic de DMD sera ensuite confirmé par des
analyses génétiques.
Un diagnostic prénatal est effectué par amniocentèse lorsqu'il y
a présence de cas familiaux, mais
aucun test de dépistage n'est effectué d'emblée chez tous les
nouveau-nés.
-
18
1.3.2. Traitements et thérapies
Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour la DMD.
Cependant, des traitements ou soins
permettant de ralentir ou d’atténuer certains symptômes de la
maladie sont disponibles, telles la
physiothérapie, l'utilisation d'orthèses et la chirurgie pour
réparer les scolioses dues à
l'affaiblissement des muscles dorsaux. Rendu aux stades tardifs
de la maladie, il est nécessaire
d'avoir recours à la ventilation artificielle. Toutefois,
plusieurs stratégies thérapeutiques sont
envisageables et peuvent être classifiées comme suit :
pharmacologique, génique et cellulaire [18].
1.3.2.1. Traitements pharmacologiques
Les traitements pharmacologiques de base ont généralement pour
but de diminuer l’inflammation ou
d’augmenter la prolifération des cellules musculaires. C’est le
cas des corticostéroides, comme la
Prednisone et le Déflazacort, qui peuvent ralentir la perte de
fonction musculaire de 6 à 24 mois [35].
Une avenue thérapeutique possible consiste à surexprimer
l’utrophine, un gène orthologue à la
dystrophine, pouvant compenser fonctionnellement le manque de
cette dernière. Chez une personne
normale, l’utrophine est située aux jonctions neuromusculaires
et myotendineuses. Par contre, chez
le patient dystrophique et lors du développement embryonnaire,
elle se localise au sarcolemme. Il a
été démontré par Tinsley et al. qu’une version tronquée de
l’utrophine pouvait réduire le phénotype
DMD tout en restaurant la localisation d’une partie du DGC [36].
Toutefois, Li et al. ont établi que
même la version pleine longueur de l’utrophine ne permet pas de
recruter nNos au sarcolemme des
fibres musculaires [37]. Ces études indiquent que la
surexpression d'utrophine chez les patients
DMD pourrait améliorer le phénotype de la maladie, mais ceux-ci
souffriraient toujours d'une
myopathie, puisque l’absence de nNos au sacrolemme cause un
stress ischémique, comme
mentionné précédemment [26, 37]. Une petite molécule qui
s’annonçait prometteuse, la BMN195,
aurait dû pouvoir augmenter le niveau d’utrophine, comme
démontré dans les essais pré-cliniques.
Cependant, les essais cliniques de phase I n’ont pas montré
d’élévation de l’utrophine [38]. De son
côté, la SMT C1100 aurait augmenté de deux fois le taux
d’utrophine chez des patients DMD et une
étude clinique de phase II est en cours.
Il existe aussi des approches visant à restaurer l’expression de
la dystrophine. C’est le cas des
molécules permettant d’ignorer un codon stop prématuré, telles
la gentamicine et l’ataluren. La
-
19
gentamicine a obtenu des résultats variables lors des essais
cliniques, allant de 0 à 15 %
d’expression de dystrophine chez les patients. Aurino et al. ont
démontré que l’ataluren,
anciennement connu sous le nom de PTC124, avait des effets
similaires à la gentamicine, sans les
conséquences adverses. Lors de l’essai clinique de phase IIa, 61
% des patients ont démontré une
augmentation d’expression de dystrophine [39, 40]. Cette
molécule est présentement en essai
clinique de phase III.
L'analyse des gènes de patients atteints de la dystrophie
musculaire de Becker ont permis de
conclure qu'une version tronquée de la protéine pouvait lui
conférer une certaine fonctionnalité [41].
La technique du saut d'exon est basée sur cette connaissance. En
effet, des oligonucléotides
antisens (ONA) sont synthétisés de façon à être chimiquement
protégés contre la dégradation
enzymatique et être complémentaires à une séquence particulière.
Ainsi, l'ONA se lie sur la
séquence cible de l'ARN pré-messager, empêchant l'épissage d'un
ou plusieurs exons. La protéine
produite est tronquée, mais fonctionnelle. Les premiers essais
cliniques faits avec deux types d’ONA,
le 2′-O-méthyl-phosphorothioate (2′OMe) et le morpholino
phosphorodiamidate oligonucléotide
(PMO), ont donné des résultats variables, allant jusqu’à 55 % de
fibres positives pour la dystrophine
chez un patient [42]. L’essai clinique de phase III utilisant la
technique du saut d'exon vient d'être
arrêté subitement. En effet, l'étude clinique du Drisapersen
faite par GlaxoSmithKline et Prosensa
s'annonçait prometteuse, mais l'analyse des tests de marche de 6
minutes faite après 48 semaines
de traitement ne démontre aucune amélioration significative
entre les patients traités avec l'ONA et
ceux ayant reçu le placebo [43].
D’autres méthodes sont basées sur la correction du gène ou de
son expression, soit par l’utilisation
de méganucléases, de zinc finger nucléases ou de systèmes de
transposons [35]. Le principe est
que le cadre de lecture peut être réparé en induisant des
micro-délétions ou micro-insertions dans le
gène de la dystrophine. Chapdelaine et al. ont démontré que les
méganucléases pouvaient cibler
une séquence spécifique, induire une micro-délétion et restaurer
le cadre de lecture du gène in vitro
et in vivo [44].
Il serait aussi possible de bloquer la myostatine, un membre de
la famille TGF-β, qui normalement
limite la masse musculaire. Les méthodes pouvant bloquer cette
signalisation sont variées, allant de
l’utilisation d’une molécule inhibitrice ou la destruction de
son ARNm, jusqu’à la mutation du gène lui-
même. Les résultats obtenus chez la souris laissent présager que
ce traitement, combiné à un autre,
-
20
comme le saut d’exon, pourrait être bénéfique dans le cas d’une
thérapie de la DMD. Des essais
cliniques sont en cours [45].
1.3.2.2. Thérapie génique
La thérapie génique consiste à introduire une copie
fonctionnelle du gène de la dystrophine dans les
fibres musculaires du patient. La très grande taille de la
dystrophine est un facteur limitant lors du
développement de thérapies. Le groupe de Chamberlain a donc créé
des versions tronquées, mais
toujours fonctionnelles, de la dystrophine afin de diminuer la
taille de la séquence codante. Il a été
démontré que ces versions, malgré des délétions de plus de 50 %
de la séquence codante,
possédaient toujours une fonctionnalité ressemblant à celle de
la dystrophine pleine longueur [46].
En effet, les micro- et mini-dystrophines créées se localisent
au sarcolemme et permettent
l’échafaudage du DGC, à l’exception de nNOs. En effet, pour un
échafaudage adéquat de nNos, les
exons 42 à 45 de la dystrophine, codant pour les domaines
homologues à la spectrine 16 et 17, sont
requis [47]. Les versions tronquées ont l’avantage d’être plus
faciles à insérer dans les cellules de
par leur plus petite taille (Figure 9).
Figure 9. Versions de la dystrophine. L’ADNc de la dystrophine
pleine longueur fait près de 11 kb. La mini-dystrophine a subi une
délétion allant de la deuxième charnière à la répétition de type
spectrine 18 (ΔC2-R18) et a une taille d'environ 6 kb. La
micro-dystrophine a une délétion allant de la deuxième charnière à
la répétition de type spectrine 21 (ΔC2-R21), et le c-terminal est
manquant.
-
21
La complication de la thérapie génique réside en la livraison
difficile du gène d’intérêt, puisque les
tissus musculaires sont les plus abondants du corps humain et
composés de fibres qui ne se divisent
pas, elles-mêmes entourées d'épaisses couches de tissus
conjonctifs. Les principaux vecteurs
utilisés sont les plasmides et les vecteurs viraux [48]. Les
plasmides peuvent être injectés
directement, administrés par pression hydrodynamique ou par
électroporation. Toutefois, puisqu'une
longue expression du transgène est désirée, il est préférable
d'avoir recours à une méthode résultant
en l'intégration du transgène dans le génome du patient. Pour
ces raisons, les vecteurs viraux non
intégratifs, comme les vecteurs adénoviraux ou dérivés de virus
adéno-associés (VAA) sont à
écarter. Les vecteurs lentiviraux sont ceux de prédilections, dû
à leur capacité de transduire des
cellules en division ou non, d'intégrer le génome de l’hôte
ainsi que par la longue expression du
transgène. De plus, il leur est possible de contenir les micro-
et mini-dystrophines.
Le transfert de gènes utilisant les vecteurs viraux a causé un
grand enthousiasme au début des
années 1990, mais a connu plusieurs embardées depuis. En effet,
quelques patients participants à
des essais cliniques ont connu des fins tragiques suite aux
traitements à l'aide de ces vecteurs. C'est
le cas notamment de Jesse Gelsinger, en 1999, décédé 98 heures
après avoir reçu une injection
d'un vecteur adénoviral de type 5 qui a engendré une sévère
réponse immunitaire [49, 50]. En 2002,
un essai clinique utilisait un vecteur rétroviral afin de
traiter le déficit immunitaire combiné sévère lié à
l’X. Malgré que cela était considéré très peu probable chez
l’humain, une mutagenèse d’insertion
s’est produite, résultant en un patient souffrant de leucémie
lymphocytaire aiguë, ce qui lui a été
fatal [51]. En 2007, un autre patient, cette fois traité pour
l'arthrite, est décédé suite au traitement à
l'aide d’un VAA [52]. Ces décès démontrent les limitations des
études faites chez l'animal afin de
prédire les réactions humaines, la toxicité potentielle des
vecteurs viraux non-réplicatifs, ainsi que la
variabilité de la réponse d'un patient à l'autre.
Un certain succès pour le traitement de la DMD dans les modèles
animaux à l’aide de vecteurs
viraux a été obtenu. Toutefois, les équipes de recherche se sont
heurtées à divers problèmes,
comme la toxicité, le rejet immunitaire ou la courte durée
d’expression du transgène. Un essai
clinique de phase I vient d’ailleurs d’être complété, utilisant
un VAA codant pour la mini-dystrophine.
Toutefois, cet essai n'a pas permis d'obtenir une expression
significative de dystrophine et une
réaction immunitaire contre la dystrophine a été observée chez 4
des 6 patients [53].
-
22
1.3.2.3. Thérapie cellulaire
De son côté, la thérapie cellulaire consiste à greffer des
cellules exprimant une dystrophine
fonctionnelle, dans les muscles des patients dystrophiques. Ces
cellules peuvent provenir d’un
donneur sain (greffe allogénique) ou de cellules souches ou
progénitrices, venant du patient lui-
même (greffe autologue), corrigées préalablement ex vivo. La
Figure 10 démontre le principe de la
thérapie cellulaire, où les cellules saines ou corrigées
génétiquement sont micro-injectées de façon
intramusculaire afin de fusionner avec les cellules de l’hôte,
et ainsi former des fibres hybrides. Le
noyau de la cellule normale permet l’expression de la
dystrophine sur quelques centaines de microns
de la fibre hybride [54, 55].
-
23
Figure 10. Étapes d'une greffe de myoblastes allogéniques. (1)
Une biopsie de tissus musculaire d'un donneur sain est effectuée
pour obtenir des fibres musculaires (2) qui seront digérées de
façon enzymatique (3). Ces cellules, une fois mises en culture in
vitro, prolifèrent et deviennent des myoblastes (4). Les myoblastes
ainsi obtenus sont par la suite injectés à haute densité dans les
muscles d'un patient dystrophique (5). En (6), un marquage à la
bêta-galactosidase d'un muscle de singe greffé avec des myoblastes
exprimant LacZ a été effectué. Image adaptée de Tremblay et al.
[56].
-
24
Des essais cliniques utilisant la greffe de myoblastes ont été
réalisés et ont eu des résultats
variables. Les premiers essais cliniques utilisant cette méthode
comportaient l'utilisation de la
cyclosporine A comme traitement immunosuppresseur. Toutefois, il
a été démontré que la dose
utilisée était trop faible pour empêcher une réaction
immunitaire [57]. Il a aussi été démontré par
Huard et al. que des myoblastes allogéniques greffés à une
souris immunosupprimée seulement
avec la cyclosporine A ou un sérum anti-lymphocyte causaient une
réaction immunitaire résultant en
un rejet de la greffe [58]. Depuis, le tacrolimus est devenu le
traitement de prédilection et les résultats
de greffe se sont améliorés. Notre laboratoire a d’ailleurs
réussi un essai clinique de Phase I chez
neuf patients au cours duquel une greffe de myoblastes provenant
d'un donneur sain
immunocompatible a été effectuée. Jusqu'à 26 % des fibres
musculaires de la zone traitée
exprimaient la dystrophine [59].
Il existe toutefois plusieurs facteurs limitant la thérapie
cellulaire, comme la mort rapide des cellules
greffées, le faible taux de migration à travers le muscle de
l‘hôte et le rejet immunitaire [35]. Notre
laboratoire travaille activement à améliorer ces différents
aspects. Suite à leur transplantation, les
myoblastes ne migrent que vers les fibres musculaires qui sont
en régénération, parce qu’ils sont
attirés par des facteurs chémo-attractants. Ainsi, les
myoblastes transplantés auront tendance à
fusionner près des sites d'injection avec les fibres qui ont été
endommagées par l’injection. Certains
critères ont d’ailleurs été établis afin d'augmenter le succès
des greffes, soit des injections à haute
densité de cellules, bien distribuées dans tout le muscle, avec
des trajectoires d'injection près les
unes des autres, de façon homogène sur la longueur de chaque
trajectoire [60]. De plus, des études
démontrent que la co-injection de facteurs de croissance, comme
l'IGF et le bFGF, peut favoriser la
migration des myoblastes [61]. Il a été montré que près du tiers
des myoblastes mourraient moins de
24 heures suivant la greffe. Les mécanismes exacts de ce
processus sont inconnus, mais une
réaction inflammatoire pourrait y jouer un rôle [62]. De plus,
les myoblastes provenant d'un donneur
sain expriment des antigènes qui causeront une réaction
immunitaire chez le patient. Sans traitement
immunosuppresseur, la greffe sera rejetée [56].
Mendell et al. ont démontré, lors d’une étude clinique, que des
patients dystrophiques traités à l’aide
d’un VAA codant pour une mini-dystrophine pouvaient développer
des anticorps contre un épitope de
la mini-dystrophine. De plus, ils ont découvert que certains
patients dystrophiques possédaient déjà
des anticorps contre la dystrophine, et ce, même avant
traitement visant à rétablir son expression.
-
25
Des lymphocytes T auto-réactifs spécifiques à la dystrophine ont
aussi été observés chez un patient
dystrophique ayant été traité à la gentamycine pour augmenter la
lecture des codons stops
prématurés (résultats non-publiés) [63]. Ces résultats mettent
l’emphase sur la nécessité de prendre
en compte la potentielle réaction immunitaire du patient contre
la dystrophine, et ce, peu importe la
manière dont elle est réintégrée chez le patient [64].
Il n'en demeure pas moins que le principal obstacle à ce type de
thérapie est la quantité considérable
de cellules requises pour traiter un muscle complet. Ainsi, le
traitement de tous les muscles
squelettiques d'un patient n'est pas envisageable à ce
moment.
1.4. Modèles animaux
Quelques modèles animaux sont disponibles pour expérimentation :
murin, canin, et félin. Chaque
modèle présente des avantages et des inconvénients. Les modèles
les plus couramment utilisés
seront vus en détail.
1.4.1. Modèles murins
Il existe quelques modèles murins pour la DMD, notamment la
souris mdx, pour X-linked muscular
dystrophy, les mdx2cv, mdx3cv, mdx4cv et mdx5cv, ainsi que la
mdx52 [65]. La souris mdx est un
modèle spontané découvert en 1984 et qui possède une mutation
non-sens à l’exon 23, résultant en
une absence de dystrophine. Il s’agit du modèle animal le plus
couramment utilisé. Cette souris a un
phénotype ressemblant à celui de la DMD chez l’humain, mais en
moins sévère. En effet, on note
l’infiltration de neutrophiles et de macrophages, ainsi que des
cycles de nécrose et de régénération,
amenant éventuellement une dégénérescence musculaire
progressive, mais insuffisante pour
provoquer le même phénotype que chez l'humain dystrophique. Les
capacités contractiles des
muscles de ces souris sont altérées, leur force est diminuée et
une augmentation plasmatique de la
créatine kinase est notable [65].
Les lignées mdx2cv, mdx3cv, mdx4cv et mdx5cv ont été créées par
mutagenèse chimique dans le
but d’induire des mutations ponctuelles dans le gène de la
dystrophine. Ces quatre lignées de souris
possèdent des mutations à des endroits différents dans le gène.
Ceci provoque une absence de
dystrophine musculaire complète (Dp427), sauf dans le cas de la
mdx3cv, où une dystrophine
-
26
musculaire mutante est produite (Dp415), mais n’est pas
fonctionnelle. Ces lignées présentent aussi
des variations de niveau d’expression des isoformes musculaire,
nerveuse et hépatique [65, 66].
La souche mdx52 a été créée par recombinaison homologue, en
désactivant le gène DMD à l’exon
52, causant une absence de dystrophine. Elle présente le même
phénotype que la souris mdx
régulière, sauf qu’elle n’exprime pas l’isoforme rétinienne
(Dp260), ce qui amène quelques
anormalités à ce niveau [65].
1.4.2. Modèles canins
Des mutations dans le gène de la DMD ont été identifiées chez le
Golden Retriever (GRMD),
Rottweiler, le German Short-Hair Pointer, et le Cavalier King
Charles Spaniels (CKCS-MD) [65]. La
dystrophie musculaire du Golden Retriever a été la plus
caractérisée. L’absence de la dystrophine
est causée par un codon stop prématuré dû à une mutation
ponctuelle au site d’épissage de
l’intron 6, ce qui cause le saut de l’exon 7. Le phénotype
observé chez le modèle GRMD est
semblable à celui de l’humain DMD, présentant une perte de force
musculaire progressive ainsi
qu’une atteinte cardio-respiratoire. Toutefois, ce modèle n’est
pas optimal puisque la mutation se
trouve dans un site non fréquemment muté chez l’humain [67].
Le modèle CKCS-MD possède un phénotype dystrophique sévère,
comme le GRMD, mais il a une
mutation dans un site d’épissage de l’exon 50, résultant en sa
délétion. Ceci présente un avantage
du point de vue thérapeutique, puisque la majorité des mutations
du gène humain de la DMD sont
entre les exons 45 à 55. Le CKCS-MD représente donc le modèle
idéal pour tester les méthodes
thérapeutiques comme le saut d’exon, les zinc finger nucléases
et les transposons [68].
1.4.3. Modèle félin
L’HFMD, ou Hypertrophy Feline Muscular Dystrophy, n’exprime pas
la dystrophine. Toutefois, son
phénotype est particulier : hypertrophie de certains muscles
(langue, cou, épaules), salivation
excessive, problème de marche causant des sautillements de
lapin, cardiomyopathie,
hépatosplénomégalie et insuffisance rénale. De larges délétions
sont présentes dans le gène de la
DMD au niveau des promoteurs musculaire et Purkinje. En raison
de la faible similarité des
phénotypes entre l’HFMD et l’humain DMD, ce modèle n’est que
très rarement utilisé [69].
-
27
1.5. Cellules souches humaines
Les cellules souches humaines possèdent des caractéristiques
particulières qui les rendent très
intéressantes aux yeux de la médecine régénérative. Elles ont la
capacité de s'auto-renouveler
indéfiniment in vitro, en plus de pouvoir se différencier en
cellules plus spécialisées, pouvant ainsi
réparer ou remplacer les cellules endommagées par une maladie,
une lésion ou le vieillissement.
1.5.1. Cellules souches embryonnaires
Les cellules souches embryonnaires humaines (hESCs) sont dites
totipotentes, puisqu’elles ont la
capacité de se différencier dans les trois feuillets
embryonnaires, soit le mésoderme, l’endoderme et
l’ectoderme. De plus, elles possèdent la capacité
d’auto-renouvellement. Les lignées d'hESCs déjà
établies peuvent servir pour les études de différenciation
spécifiques et le développement d'avenues
thérapeutiques à l'aide des cellules qui en sont dérivées. Leur
utilisation thérapeutique présente
plusieurs limitations, comme le rejet immunitaire et les
problèmes éthiques.
1.5.1.1. Historique et législation
C'est à partir de l'étude du développement des embryons, dès les
années 1860 en Allemagne, que
s'est fait la déduction que des cellules souches existent.
Toutefois, ce n'est qu'en 1961 que deux
Canadiens, les docteurs James Till et Ernest McCulloch, prouvent
leur existence expérimentalement
et publient leur découverte en définissant les caractéristiques
précises de ces cellules. Ces
chercheurs sont considérés comme les pères des cellules souches,
puisque leurs expériences ont
ouvert la voie à la recherche actuelle sur les cellules souches
embryonnaires et adultes. Les
premières ESCs murines ont été extraites d'un blastocyste, en
1981, au Royaume-Uni et aux États-
Unis. Le premier mammifère, une brebis, fut cloné en Écosse en
1996 [70]. C'est en 1998 que la
première lignée d'hESCs a été établie aux États-Unis par Thomson
et al., à partir d'un embryon
préimplantatoire [71].
Puisque l'obtention d'une lignée de hESCs nécessite la
destruction d'un embryon, divers
mouvements de protestation ont vu le jour, pour des raisons
éthiques [72]. Ainsi, au Canada, le
Comité de Surveillance des Cellules Souches a été créé en 2001
afin de vérifier que les demandes
de subventions de recherche touchant les hESCs respectent les
valeurs et l’éthique canadiennes.
-
28
Depuis 2005, les études faites sur des embryons humains sont
soumises à la loi sur la reproduction
assistée (Bill C6), principalement dans le but d'empêcher toute
forme de rémunération que les
femmes pourraient en tirer, ainsi que les manipulations
génétiques, le clonage, les hybrides, les
chimères ou toutes lubies scientifiques [73].
1.5.1.2. Isolation et culture
L'isolation de hESCs se fait normalement à partir d'un embryon
surnuméraire qui provient d'une
clinique de fertilisation. Celui-ci est alors fertilisé pour
obtenir un zygote qui sera mis en culture pour
permettre sa division cellulaire. Après 5 jours, les divisions
cellulaires ont formé une sphère d'environ
200 cellules, appelée le blastocyste. Dans cet agrégat se
retrouve la masse cellulaire interne, formée
d'environ 35 cellules pluripotentes. Cette masse est extraite
manuellement avant d'être remise en
culture pour obtenir une lignée de hESCs (Figure 11) [72].
-
29
Figure 11. Isolation des cellules souches embryonnaires et mise
en culture. Un ovule surnuméraire est fécondé in vitro et le zygote
se divise (1). Vers le jour 5, le zygote devient le blastocyste
(2), dont la masse interne est isolée (3), puis mise en culture sur
une couche nourricière de fibroblastes murins irradiés (4). Les
cellules sont dissociées (5) et remises sur une nouvelle couche
nourricière (6) pour finalement former une lignée de cellules
souches embryonnaires (7). Image adaptée de National Institutes of
Health [74].
-
30
Les techniques de culture des hESCs ont beaucoup évolué au fil
des années. En premier lieu, des
fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), mitotiquement
inactivés avec des rayons gamma ou la
mitomycine-C, étaient requis pour la culture à l'aide d'un
milieu riche en sérum. Le rôle des MEF est
de favoriser l'adhésion des hESCs au pétri et de sécréter des
protéines importantes pour le maintien
de l'état de pluripotence et l'auto-renouvèlement [72, 75].
Cependant, recourir à des cellules murines
amène le risque de xéno-contamination puisqu'elles sont
reconnues comme potentiellement
porteuses de divers pathogènes pouvant infecter l'humain, ce qui
pourrait compromettre leur
utilisation clinique ultérieure. Pour cette raison, des systèmes
basés sur des cellules nourricières
humaines ont été développés, notamment avec des fibroblastes
humains adultes et fœtaux [76].
Toutefois, il a été remarqué que les cellules nourricières
venant de souris n'expriment pas les mêmes
taux de certains facteurs de croissance que celles provenant de
l’humain, par exemple l'activine A et
FGF-2. De plus, les différentes lignées de cellules nourricières
humaines variaient entre elles [75].
Malgré les bénéfices apportés par les cellules nourricières
humaines, il n'en reste pas moins qu'elles
impliquent l'utilisation d'un milieu dont la composition est
variable.
C'est ainsi que se sont développées différentes matrices, comme
la laminine, la fibronectine ou le
Matrigel, pouvant remplacer les cellules nourricières.
Toutefois, un milieu supplémenté par une
combinaison de différents facteurs de croissance (bFGF, TGF-β,
Nodal, activine A, LIF, Noggin, et
platelet-derived growth factor (PDGF)) est requis afin de
compenser le manque causé par l'absence
de cellules nourricières [77]. Parmi ces facteurs, la présence
de bFGF est indispensable. Il s'est donc
développé, en 2007, un milieu chimiquement défini, appelé le
mTeSR [78]. L’utilisation du Matrigel,
combinée au mTeSR, est maintenant la norme pour la culture
d'hESCs. Leur avantage réside en la
standardisation des techniques de culture ainsi que la réduction
des variabilités du milieu et par la
diminution de la charge de travail. En effet, l'utilisation de
cellules nourricières était laborieuse,
demandant d’être préparées la veille de la mise en culture des
ESCs.
1.5.1.3. Caractéristiques et mécanisme de pluripotence
Les caractéristiques nécessaires à l'utilisation des hESCs en
médecine régénérative correspondent à
leur stade indifférencié. Une lignée d'hESCs doit être dérivée
d'un embryon, capable d'être proliférée
et de maintenir un état indifférencié pour une longue période de
temps, en gardant un caryotype
normal. Généralement, ces cellules conservent un caryotype
normal sur une période de temps assez
-
31
étendue in vitro, mais il peut arriver que des conditions de
stress rendent instables les chromosomes
12 et 17 [79, 80]. Il est donc important d’évaluer le caryotype
fréquemment puisque ces cellules
peuvent continuer d'exprimer des marqueurs de pluripotence tout
en étant aneuploïdes [81]. La
pluripotence est la capacité de développer les cellules des
trois feuillets embryonnaires, c'est-à-dire
l'endoderme, l'ectoderme, et le mésoderme. Elle peut être
vérifiée par la formation de tératomes chez
la souris immunodéficiente ayant reçu une greffe de ces
cellules. Les tératomes sont un amas de
cellules des trois feuillets embryonnaires. De plus, l'enzyme
télomérase est fortement exprimée chez
les hESCs. Celle-ci permet de répliquer l'extrémité des
chromosomes, empêchant ainsi leur
rétrécissement lors des divisions cellulaires [72].
Lorsque les hESCs sont mises en culture, elles poussent en
colonies compactes ayant un contour
rond et bien défini, et les cellules qui les forment possèdent
un ratio noyau/cytoplasme élevé. Elles
expriment différents marqueurs typiques de l'état embryonnaire,
tels les antigènes de surface
spécifiques au stade embryonnaire 3 et 4 (SSEA-3, SSEA-4), ainsi
que TRA-1-60 et TRA-1-81. Elles
sont aussi caractérisées par une forte expression d'alcaline
phosphatase, une hydrolase de
phosphate, ainsi que par des facteurs de transcription, comme
Oct-4, Sox2, Nanog, Foxd3 et
Rex1 [81].
Le mécanisme de pluripotence est un processus hautement régulé
qui requiert l'implication de
plusieurs gènes pour maintenir l'état indifférencié. Trois
facteurs sont considérés comme les
éléments clés régulateurs de la pluripotence, c'est-à-dire Oct4,
Nanog et Sox2. Ces trois régulateurs
partagent plusieurs gènes cibles et contrôlent la transcription
de plusieurs gènes importants dans le
processus de pluripotence, et ce, par des voies de
signalisations distinctes ou non. Oct4 et Nanog
sont abondamment exprimés dans les cellules pluripotentes et y
sont spécifiques. L'absence de Oct4
entraîne la différenciation des hESCs en trophoblastes, alors
que sa surexpression dirige les cellules
vers la voie endodermique primitive et mésodermique [82]. Nanog
inhibe la différenciation en cellules
endodermiques primitives, alors que sa surexpression n'a pas de
conséquences connues [83]. Sox2,
pour sa part, est exprimé chez les cellules pluripotentes, les
cellules germinales, ainsi que les
précurseurs neuronaux. Son absence provoque une différenciation
spontanée des hESCs. Sox2 et
Oct4 peuvent former un complexe pour lier des régions
amplificatrices afin de réguler l'expression de
certains gènes impliqués dans le maintien de l'état
indifférencié, dont eux-mêmes et Nanog [84, 85].
-
32
1.5.2. Cellules souches pluripotentes induites
Les caractéristiques des hESCs font en sorte qu'elles pourraient
représenter un atout pour la
médecine régénérative. Toutefois, leur provenance soulève des
problèmes éthiques. De plus, il s'agit
de cellules allogéniques, et leur utilisation clinique
requerrait une immunosuppression du receveur.
En 2006, Yamanaka et al. ont découvert les quatre facteurs de
transcription nécessaires à la
production de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs)
murines, c’est-à-dire Oct4, Klf4, Sox2
et c-Myc. Les cellules transduites à l'aide de rétrovirus codant
pour ces quatre facteurs possèdent les
caractéristiques des ESCs, c'est-à-dire la capacité
d'auto-renouvellement et de différenciation dans
les trois feuillets embryonnaires [86, 87]. En 2007, deux
équipes de chercheurs ont réussi à dériver
des iPSCs à partir de cellules somatiques humaines. Tout
d'abord, le Dr. Yamanaka et son équipe
ont poursuivi leur lancée en utilisant cette fois des lentivirus
codant pour les quatre facteurs humains
afin de transformer des fibroblastes en cellules souches
humaines induites à la pluripotence
(hiPSCs) [88]. L'autre équipe, celle du Dr. Thomson, a utilisé
quatre lentivirus codant pour Oct4,
Sox2, Nanog et Lin28. Malgré que les facteurs utilisés soient
différents, les résultats obtenus étaient
très similaires et permettaient l'obtention de cellules
semblables aux hESCs [89]. Depuis, les
recherches se poursuivent afin d'éliminer l'oncogène c-Myc ainsi
que l'oncogène et suppresseur de
tumeur Klf4, et éliminer l'utilisation de vecteurs viraux
intégratifs, voir même remplacer ce type de
vecteur totalement, par des plasmides, des protéines ou d'autres
systèmes. Toutefois, l'élimination
de c-Myc réduit l'efficacité de reprogrammation, déjà faible
avec les quatre facteurs originaux. De
plus, il faut déjà compter deux mois pour parvenir à une
reprogrammation complète [89]. Des
équipes travaillent donc à augmenter l'efficacité de
reprogrammation à l'aide d'autres facteurs ou de
petites molécules chimiques permettant de modifier la structure
de la chromatine ou de moduler
certaines voies de signalisation [90, 91]. Certaines recherches
se concentrent sur des micro-ARN
pour remplacer les facteurs ou améliorer l'efficacité de
programmation [92]. La technique la plus
courante de nos jours comprend l'utilisation du virus à ARN
Sendaï, non intégratif, et efficace [93].
Plusieurs lignées d’hiPSCs ont été produites afin de modéliser
diverses maladies pour en permettre
l’étude. De plus, les hiPSCs représentent une avenue
thérapeutique particulièrement intéressante
puisqu’il est possible de créer des lignées de cellules
spécifiques au patient, réduisant ainsi les
risques de réactions immunitaires lors d’une greffe autologue.
Il est donc nécessaire d’obtenir une
-
33
large quantité de cellules tissu-spécifiques, non
tumorigéniques, capable de s’intégrer et de
fonctionner chez l’hôte suite à une transplantation [94].
1.5.3. Myogenèse dirigée
Pour être utiles dans la médecine régénérative, les cellules
souches doivent être différenciées
spécifiquement au moment désiré. Les trois méthodes les plus
couramment utilisées sont la
formation de corps embryoïdes, l'utilisation d'un cocktail de
facteurs de croissance spécifiques ainsi
que la surexpression ou l’inhibition de gènes.
Plusieurs équipes ont tenté de mettre au point un protocole de
différenciation myogénique efficace,
permettant d'obtenir des myoblastes à partir d'hiPSCs, qui
possèderaient les mêmes capacités de
prolifération et de fusion que les myoblastes provenant d'une
culture primaire [95, 96]. Toutefois, ces
techniques, parfois complexes, ont connu des taux de succès
variables in vitro, ou étaient peu
reproductibles. Les cellules dérivées de ces protocoles
ressemblent à des myoblastes, mais l'analyse
de l'expression des gènes et l'observation de leurs capacités
myogéniques révèlent qu'elles ne sont
pas tout à fait de vrais myoblastes.
Darabi et al. ont démontré que l’expression inductible de Pax7
dans des iPSCs murines lors de la
formation de corps embryoïdes résulte en des cellules pouvant
être purifiées par l’expression du
récepteur alpha du PDGF, un marqueur du mésoderme para-axial. La
transplantation des cellules
myogéniques précurseurs ainsi obtenues chez la souris
dystrophique a résulté en un succès de
greffe élevé et une augmentation de la contractilité des muscles
[97].
Récemment, le groupe de Tanaka et al. a montré que l'expression
inductible de MyoD dans des
hiPSCs spécifiait les cellules dans la voie myogénique avec une
efficacité de 70-90 %. L'analyse de
l'expression des gènes des myoblastes résultants démontre une
grande ressemblance avec des
myoblastes humains venant d'une culture primaire. Toutefois,
l'expression de Myf5 est manquante
dans ces cellules, impliquant que le protocole utilisé emprunte
une voie de différenciation différente
que celle retrouvée in vivo [95].
Notre groupe a aussi établi un protocole de différenciation
d'hiPSCs en myoblastes à l'aide d'un
milieu myogénique et celui-ci sera abordé en détail au chapitre
2. De plus, la différenciation
-
34
myogénique à l'aide de facteurs de croissance recombinants est
en cours d'étude. Cette technique
sera quant à elle décrite au chapitre 3.
-
35
Chapitre 2. La thérapie génique ex vivo à l’aide d’hiPSCs DMD et
d’un vecteur lentiviral codant pour la micro-dystrophine
2.1. Objectif
La thérapie cellulaire représente une avenue thérapeutique
intéressante, mais plusieurs limitations
demeurent. En effet, le grand nombre de cellules requises pour
traiter tous les muscles d'un patient
représente un obstacle de taille. Pour y pallier, des hiPSCs
dérivées de cellules du patient lui-même
pourraient être utilisées, car elles représentent une source
renouvelable de cellules myogéniques.
Ces cellules doivent cependant être corrigées génétiquement afin
de leur permettre d'exprimer une
dystrophine fonctionnelle dans les muscles du patient greffé.
Une des difficultés réside dans la
correction efficace, puisque la dystrophine est le plus long
gène du corps humain. En principe,
l’ADNc de la dystrophine pourrait être simplement transfecté
dans les hiPSCs. Cependant, l’ADNc de
la dystrophine étant de plus de 11 kb, l’efficacité de
transfection et le taux d’intégration sont très bas.
Sachant que la micro-dystrophine possède une fonctionnalité
semblable à celle de la dystrophine
pleine longueur, et que sa taille réduite (3.6 kb) permet
l'entrée dans un vecteur, l'hypothèse de
travail est la suivante: la correction ex vivo d'hiPSCs
dystrophiques à l'aide d'un vecteur viral codant
pour la micro-dystrophine permettra l'expression d’une
dystrophine fonctionnelle dans les muscles
qui recevront une greffe de ces cellules corrigées. Un vecteur
lentiviral de troisième génération a été
choisi afin de permettre une transduction des cellules en
division ou non, ainsi qu’une longue
expression du transgène due à une intégration dans le génome de
l’hôte, tout en ayant un plus faible
taux de mutagenèse d’insertion [48].
Les hiPSCs DMD sont différenciées en myoblastes suivant le
protocole de différenciation établi par
mon prédécesseur, impliquant un milieu myogénique développé dans
notre laboratoire, ainsi qu’un
vecteur adénoviral codant pour MyoD. Les myoblastes corrigés
ainsi obtenus sont ensuite micro-
injectés dans le Tibialis anterior (TA) de souris Rag/mdx,
c’est-à-dire à la fois immunodéficientes et
dystrophiques. L’expression de la micro-dystrophine est évaluée
un mois plus tard.
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37
2.2. Matériels et Méthodes
2.2.1. Production des vecteurs viraux
2.2.1.1. Vecteur lentiviral codant pour la micro-dystrophine
(Le.MCK-µDysV5)
Un vecteur lentiviral (Le.MCK-µDysV5) codant pour la
micro-dystrophine (µDys) de chien fusionnée
à un tag V5 était sous contrôle du promoteur muscle creatine
kinase (MCK). Le gène de la micro-
dy