This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ
Σχολή Επιστημών Υγείας
Τμήμα Μοριακής Βιολογίας & Γενετικής
Μελέτη σηματοδότησης στη
Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία
1. Αιματολογική Κλινική και Μονάδα Μεταμόσχευσης Αιμοποιητικών Κυττάρων,
ΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου», Θεσσαλονίκη, Ελλάδα
2. Ινστιτούτο Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών (ΙΝΕΒ), Εθνικό Κέντρο Έρευνας και
Τεχνολογικής Ανάπτυξης (ΕΚΕΤΑ), Θεσσαλονίκη, Ελλάδα
ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΕΣ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΕΣ ΣΤΗ ΧΛΛ ............................................................................. 33
ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΑ ΥΠΟΣΥΝΟΛΑ #1 ΚΑΙ #4 ......................................................................................... 33
ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΜΕΣΩ BCR ΣΤΗ ΧΛΛ ........................................................................................ 34
3
TLRS ΣΤΗ ΧΛΛ ............................................................................................................................................ 35
ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ................................................................................................................. 37
Μετά την αναγνώριση ενός μικροβιακού παθογόνου, οι TLR ενεργοποιούν
ενδοκυττάρια σηματοδοτικά μονοπάτια που επάγουν την παραγωγή κυτταροκινών,
ιντερφερονών τύπου Ι και χημειοκινών. Επιπλέον, η σηματοδότηση μέσω TLR οδηγεί
στην υπερέκφραση συνδιεγερτικών μορίων των δενδριτικών κυττάρων που δρουν
ως αντιγονοπαρουσιαστικά. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται ωρίμανση των
δενδριτικών κυττάρων και είναι απαραίτητη για την επαγωγή ανοσοαποκρίσεων της
προσαρμοστικής ανοσίας, γεγονός που υποδεικνύει την σημασία των TLR ως
μεσολαβητές ανάμεσα στη έμφυτη και την προσαρμοστική ανοσία. Ένας σημαντικός
ρόλος τους είναι η ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού που οδηγεί στην
παραγωγή κυτταροκινών, π.χ. του παράγοντα νέκρωσης όγκων α (Tumor Necrosis
Factor α, TNFα) και των ιντερλευκινών IL-6, IL-1β και IL-12. Επίσης σημαντικά είναι
και τα εναλλακτικά μονοπάτια των TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 και TLR9 που επάγουν
αντιικές ανοσοαποκρίσεις μέσω της παραγωγής ιντερφερόνης τύπου Ι (IFN)(4).
20
ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ TLR
Μετά την ενεργοποίηση τους, οι TLR διμερίζονται και υφίστανται τις διαμορφωτικές
αλλαγές που είναι απαραίτητες για την ενεργοποίηση των αμέσως επόμενων μορίων
του σηματοδοτικού μονοπατιού, δηλαδή τις πρωτεΐνες που ονομάζονται
προσαρμογείς(6). Σε αυτές περιλαμβάνονται οι:
MyD88 (Myeloid differentiation primary response protein 88)
Mal (MyD88-adapter like) ή TIRAP (TIR domain containing adapter)
TRIF (TIR domain-containing adapter inducing Interferon-β ή TICAM-1 (TIR-
containing adapter molecule-1)
TRAM (TRIF-related adapter molecule) ή TICAM-2 (TIR-containing adapter
molecule-2)
SARM (Sterile α and HEAT-Armadillo motifs)
Τα σηματοδοτικά μονοπάτια που επάγονται από τους TLR χαρακτηρίζονται ως
MyD88-εξαρτώμενα ή TRIF-εξαρτώμενα, καθώς οι πρωτεΐνες MyD88 και TRIF είναι
οι κύριοι ρυθμιστές της σηματοδότησης. Και στα δύο μονοπάτια επάγεται η
παραγωγή κυτταροκινών και ιντερφερονών τύπου Ι μέσω της ενεργοποίησης
μεταγραφικών παραγόντων και κινασών(20, 22) (Εικόνα 4).
Εικόνα 4: Οι υποδοχείς TLR με τους προσδέτες που τους ενεργοποιούν, τους προσαρμογείς με τους οποίους αλληλεπιδρούν και τα προϊόντα της σηματοδοτικής τους οδού (3)
21
MYD88-ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ
Η πρωτεΐνη MyD88 διαθέτει μια περιοχή θανάτου (Death Domain, DD) στο Ν-τελικό
άκρο της και μια επικράτεια TIR στο C-τελικό άκρο της, μέσω της οποίας
αλληλεπιδρά με όλους τους TLR εκτός του TLR3. Οι TLR1, TLR2, TLR4 και TLR6
χρειάζονται και την πρωτεΐνη TIRAP ως ένα ενδιάμεσο μόριο για σύνδεση τους με την
MyD88, ενώ οι TLR5, TLR7, TLR9 και TLR11 μπορεί να συνδεθούν απευθείας. Όταν
ένας προσδέτης δεσμευτεί σ’ έναν TLR, η MyD88 επιστρατεύει τα μέλη της
οικογένειας κινασών IRAK (IL-1 Receptor-Associated Kinases) μέσω της
αλληλεπίδρασης των περιοχών θανάτου και των δύο μορίων. Μετά την
ενεργοποίησή της, η IRAK-4 φωσφορυλιώνει την IRAK-1, η οποία με τη σειρά της
ενεργοποιεί τον προσαρμογέα TRAF6 (TNF Receptor-Associated Factor 6) και
συνδέεται με αυτόν. Στη συνέχεια, το σύμπλοκο IRAK-1/TRAF6 απομακρύνεται από
τον υποδοχέα και αλληλεπιδρά με την κινάση TAK1 (TGF-β-Activated Kinase 1) και
τις πρωτεΐνες που την δεσμεύουν, TAB1 και TAB2 (TAK1-Binding Proteins). Ενώ η
IRAK-1 παραμένει στη μεμβράνη όπου και αποδομείται, το σύμπλοκο των TRAF6,
TAK1, TAB1 και TAB2 μετακινείται στο κυτταρόπλασμα όπου συνδέεται και με άλλες
πρωτεΐνες, π.χ. Ubc13 και Uev1A. Η ενεργοποίηση της TAK1 επιφέρει ενεργοποίηση
του συμπλόκου ΙΚΚ (IκB Kinase Complex) το οποίο επάγει τη φωσφορυλίωση της
πρωτείνης IκB και την απελευθέρωση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB.
Παράλληλα, η TAK1 ενεργοποιεί τις κινάσες JNK και p38 και ERK μέσω της
φωσφορυλίωσης διαφόρων MAP κινασών, οι οποίες με τη σειρά τους ενεργοποιούν
μεταλλάξεων στα γονίδια των ανοσοσφαιρινών που ακολουθεί την επαφή με το
αντιγόνο και σκοπό έχει ν’ αυξήσει τη συγγένεια της ανοσοσφαιρίνης για το αντιγόνο.
Ο όρος «υπερμεταλλαξιγένεση» οφείλεται στην εξαιρετικά υψηλή συχνότητα
εισαγωγής μεταλλάξεων, η οποία κυμαίνεται από 10-5 έως 10-3/bp/κυτταρική γενιά
και είναι σαφώς μεγαλύτερη από τη συχνότητα εισαγωγής μεταλλάξεων στο
γονιδίωμα ενός φυσιολογικού κυττάρου (10-9-10-11)(35). Όσα Β λεμφοκύτταρα
περάσουν επιτυχώς τη διαδικασία επιλογής που επάγεται από τα δενδριτικά
κύτταρα των λεμφοζιδίων και τα TH κύτταρα, διαφοροποιούνται είτε προς Β
λεμφοκύτταρα μνήμης, είτε προς πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν αντισώματα
(Εικόνα 9).
29
Εικόνα 9: Στάδια ανάπτυξης των Β λεμφοκυττάρων(33)
ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΟΥ Β ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ
Επειδή η κυτταροπλασματική ουρά τους είναι κοντή, οι ανοσοσφαιρίνες δεν έχουν
την ικανότητα να μεταδώσουν ενδοκυττάρια σήματα. Για το λόγο αυτό, η
μεμβρανική Ig συνδέεται με το ετεροδιμερές Igα/Igβ, το οποίο σταθεροποιείται με
δισουλφυδρυλικούς δεσμούς, και έτσι σχηματίζεται ο Β κυτταρικός υποδοχέας (B-
cell receptor, BCR). Οι κυτταροπλασματικές ουρές των Igα και Igβ περιέχουν μοτίβα
ενεργοποίησης των ανοσοϋποδοχέων βασισμένα στην τυροσίνη (Immunoreceptor
Tyrosine-Based Activation Motifs, ITAMs), τα οποία απαιτούν τη συνάθροιση δύο ή
περισσότερων ανοσοσφαιρινών για να ενεργοποιηθούν και ν’ αρχίσουν τη
σηματοδότηση μέσω του BCR. Αρχικό συμβάν της σηματοδότησης είναι η
φωσφωρυλίωση των ITAM από τις πρωτεϊνικές κινάσες τυροσίνης της οικογένειας
Src (Lyn, Syk) και η δημιουργία ενός λειτουργικού συμπλέγματος του υποδοχέα με
ικανότητα σηματοδότησης. Σε μια οδό η Syk ενεργοποιεί την PLCγ μέσω
φωσφορυλίωσης της τυροσίνης, η οποία στη συνέχεια υδρολύει το PIP2 παράγοντας
τα δεύτερα μηνύματα DAG και IP3. Η IP3 ελευθερώνει ιόντα Ca2+ και επάγει διάφορα
σηματοδοτικά μονοπάτια. Η DAG, μαζί με ιόντα Ca2+ που έχουν ελευθερωθεί από τη
δράση της IP3, ενεργοποιεί την PKC η οποία, με τη σειρά της, ενεργοποιεί πρόσθετες
οδούς σηματοδότησης. Το σύμπλοκο του υποδοχέα παράγει επίσης μηνύματα που
30
ενεργοποιούν το σηματοδοτικό μονοπάτι Ras, το οποίο ενεργοποιεί με διαδοχικές
φωσφορυλιώσεις τις κινάσες ERK και JNK και, παράλληλα με τα άλλα μονοπάτια,
οδηγεί στην ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων NF-κB, AP-1 και NFAT(1,
19, 36) (Εικόνα 10).
Εικόνα 10: Τα σηματοδοτικά μονοπάτια που επάγονται από την ενεργοποίηση του BCR(19)
ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ TLR ΣΤΑ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ
Διάφορα είδη Β λεμφοκυττάρων εκφράζουν διαφορετικά επίπεδα υποδοχέων TLR.
Τα ανώριμα Β λεμφοκύτταρα εκφράζουν χαμηλά επίπεδα των TLR, ενώ τα
ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα και τα Β λεμφοκύτταρα μνήμης εκφράζουν υψηλά
επίπεδα των TLR1, TLR6, TLR7, TLR9 και TLR10 και χαμηλά επίπεδα του TLR2. Η
έκφραση των TLR αυξάνει μετά από ενεργοποίηση του BCR ή του CD40, ιδίως στην
31
περίπτωση των TLR9 και TLR10. Στα πλασματοκύτταρα εκφράζονται πολλοί TLR,
συμπεριλαμβανομένων των TLR3 και TLR4, και παρατηρείται αύξηση της ποσότητας
των εκκρινόμενων αντισωμάτων μετά από ενεργοποίηση των TLR. Η συνδιέγερση
των TLR με τον BCR δρα ως ένα τρίτο σήμα που προάγει την ενεργοποίηση, τον
πολλαπλασιασμό και την τελική διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων και μπορεί
επίσης να υποβοηθά τις διαδικασίες της μεταστροφής ισοτύπου, της σωματικής
υπερμεταλλαξιγένεσης και την ανάπτυξη ή συντήρηση των βλαστικών κέντρων(37, 38).
Επίσης, σύμφωνα με ορισμένες ενδείξεις, οι TLR εμπλέκονται στην αρνητική επιλογή
των Β λεμφοκυττάρων, καθώς έχει παρατηρηθεί αυξημένος αριθμός αυτοδραστικών
ανώριμων Β λεμφοκυττάρων σε άτομα με έλλειψη των πρωτεϊνών MyD88 ή IRAK4
που συμμετέχουν στα σηματοδοτικά μονοπάτια των TLR(39, 40).
ΧΡΟΝΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ
ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ
Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) είναι η πιο κοινή μορφή λευχαιμίας στο
Δυτικό ημισφαίριο, αφού αποτελεί το 30% του συνόλου των λευχαιμιών.
Εκδηλώνεται σχεδόν αποκλειστικά σε ενήλικες άνω των 50 ετών και προσβάλει τους
άντρες σε διπλάσια συχνότητα σε σχέση με τις γυναίκες(41). Η ΧΛΛ είναι κακοήθες
νεόπλασμα των Β λεμφοκυττάρων και χαρακτηρίζεται από προοδευτική
συσσώρευση μονοκλωνικών CD5+ Β-λεμφοκυττάρων στους λεμφικούς ιστούς, το
μυελό των οστών και το αίμα(42, 43).
Παρότι δεν έχει ακόμα διασαφηνιστεί ποιό/ά είναι τα κύτταρα προέλευσης της ΧΛΛ,
είναι πλέον κοινώς αποδεκτό πως τα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ έχουν εμπειρία
αντιγόνου καθώς παρουσιάζουν κοινό ανοσοφαινότυπο και προφίλ γονιδιακής
έκφρασης με τα ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα(44-46). Πρόσφατες έρευνες δείχνουν
ότι τα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ αλληλεπιδρούν με το μικροπεριβάλλον λαμβάνοντας
σήματα επιβίωσης μέσω πολλαπλών υποδοχέων, από τους οποίους ο Β κυτταρικός
υποδοχέας διαδραματίζει τον πιο σημαντικό ρόλο, και πως η αλληλεπίδραση αυτή
καθορίζει την εξέλιξη της νόσου(47, 48). Ωστόσο, ο ακριβής αντίκτυπος της αντιγονικής
διέγερσης στη ΧΛΛ, το είδος των αντιγόνων καθώς και οι παράγοντες του
μικροπεριβάλλοντος που μπορεί να οδηγήσουν σε ανάπτυξη και επέκταση του
λευχαιμικού κλώνου δεν έχουν αποσαφηνιστεί.
32
STATUS ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ IGHV
Οι ασθενείς με ΧΛΛ διαχωρίζονται σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με το ποσοστό των
σωματικών μεταλλάξεων στα γονίδια των ανοσοσφαιρινών. Οι αλληλουχίες των
γονιδίων IGHV που έχουν ομολογία μικρότερη από 98% με το αντίστοιχο μη
αναδιατεταγμένο γονίδιο χαρακτηρίζονται ως μεταλλαγμένες (Μ-ΧΛΛ). Αντίστροφα,
αλληλουχίες με ομολογία μεγαλύτερη από 98% σε σχέση με το αντίστοιχο μη
αναδιατεταγμένο γονίδιο ορίζονται ως αμετάλλακτες (Α-ΧΛΛ). Το status
μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς
προγνωστικούς δείκτες, καθώς οι περιπτώσεις της Α-ΧΛΛ εμφανίζουν πιο επιθετική
μορφή της νόσου ενώ οι περιπτώσεις της Μ-ΧΛΛ έχουν πιο ήπια κλινική πορεία(49-51).
ΠΡΟΦΙΛ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ
Τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης της Α-ΧΛΛ και Μ-ΧΛΛ είναι ομοιόμορφα, με τα
κύτταρα να χαρακτηρίζονται από υψηλή έκφραση των δεικτών ενεργοποίησης
CD23, CD25, CD69 και CD71, και χαμηλή έκφραση των CD22, Fcγ υποδοχέα IIb,
CD79b και IgD. Ακόμα, όλα τα κύτταρα εκφράζουν CD27, το οποίο είναι
χαρακτηριστικό των Β λεμφοκυττάρων μνήμης(52-54). Υπάρχουν όμως και ορισμένες
διαφορές στην έκφραση κάποιων γονιδίων, όπως στην περίπτωση των μορίων CD38
και ZAP-70 τα οποία εμπλέκονται στη σηματοδότηση μέσω του BCR και
χρησιμοποιούνται ως προγνωστικοί δείκτες(55, 56).
Το CD38 είναι μεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που συναντάται σε πολλά είδη λευκών
αιμοσφαιρίων, μεταξύ των οποίων και τα Β λεμφοκύτταρα. Ο ρόλος του είναι η
ενίσχυση της σηματοδότησης μέσω του BCR και η παροχή σημάτων που ρυθμίζουν
την απόπτωση και τα επίπεδα του κυτταροπλασματικού ασβεστίου. Στη ΧΛΛ, μέσω
του σηματοδοτικού μονοπατιού της ZAP-70 και της ERK 1/2, το CD38 προάγει
σήματα επιβίωσης και πολλαπλασιασμού(57). Η ZAP-70 είναι κυτταροπλασματική
πρωτεΐνη που παρέχει σήματα ενεργοποίησης στα Τ ή Β λεμφοκύτταρα. Στη ΧΛΛ,
κύτταρα θετικά για ZAP-70 έχουν μεγάλη πιθανότητα να εκφράζουν μόρια
προσκόλλησης και υποδοχείς χημειοκινών που προωθούν τη μετανάστευση των
κυττάρων προς μια βαθμίδωση χημειοκινών με αποτέλεσμα την αναστολή του
μηχανισμού της απόπτωσης(58). Στην Α-ΧΛΛ παρατηρείται υψηλή έκφραση των CD38
και ZAP-70, αντίθετα από την Μ-ΧΛΛ(59).
33
ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΕΣ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΕΣ ΣΤΗ ΧΛΛ
Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στην ΧΛΛ διαφέρει πολύ από το αντίστοιχο των
φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων και μοναδικά χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη
υποσυνόλων ασθενών με σχεδόν ταυτόσημους BCR (στερεότυποι BCR). Οι ασθενείς
που ανήκουν σε ένα στερεότυπο υποσύνολο έχουν ακριβώς ή σχεδόν ίδιες
αλληλουχίες των βαριών και ελαφριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών, μεταξύ
άλλων και πολύ όμοιες υπερμεταβλητές περιοχές CDR3(60-64). Η στερεοτυπία είναι
συχνό φαινόμενο στη ΧΛΛ καθώς 30% των ασθενών φέρουν στερεότυπους BCR(65,
66). Η συχνότητα αυτή είναι αξιοσημείωτη, καθώς αν αναλογιστεί κανείς τους
μηχανισμούς δημιουργίας ποικιλότητας των ανοσοσφαιρινών, η πιθανότητα δύο
διαφορετικά Β λεμφοκύτταρα να εκφράζουν στερεότυπους υποδοχείς είναι πολύ
χαμηλή (10-12). Η έκφραση των στερεότυπων BCR είναι υψηλότερη στην Α-ΧΛΛ σε
σχέση με τη Μ-ΧΛΛ(63, 64). Η στερεοτυπία του BCR θεωρείται ισχυρή ένδειξη
αναγνώρισης διακριτών αντιγόνων ή δομικά παρόμοιων επιτόπων και πολλά
δεδομένα δείχνουν ότι έχει και κλινική σημασία αφού πλέον συγκεκριμένα
στερεότυπα υποσύνολα σχετίζονται με ιδιαίτερη πρόγνωση(67). Το πιο
χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι οι ασθενείς που ανήκουν στο στερεότυπο
υποσύνολο #2 οι οποίοι αν και φέρουν μεταλλαγμένα γονίδια IGHV έχουν κακή
πρόγνωση(67).
ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΑ ΥΠΟΣΥΝΟΛΑ #1 ΚΑΙ #4
Οι περιπτώσεις ΧΛΛ που εκφράζουν αμετάλλακτους IGHV1/5/7-IGKV1(D)-39 BCRs
ανήκουν στο στερεότυπο υποσύνολο #1 (ΣΥ #1), ενώ περιπτώσεις που εκφράζουν
μεταλλαγμένους IGHV4-34/IGKV2-30 BCRs ισοτύπου IgG ανήκουν στο στερεότυπο
υποσύνολο #4 (ΣΥ #4). Τα δύο αυτά στερεότυπα υποσύνολα έχουν τη μεγαλύτερη
συχνότητα στη Α-ΧΧΛ και Μ-ΧΛΛ, αντιστοίχως. Το ΣΥ#1 αποτελεί το 2,5-3% ενώ το
ΣΥ #4 το 1% της ΧΛΛ(64, 65, 68). Οι ασθενείς που ανήκουν στο ΣΥ #1 έχουν υψηλά
επίπεδα CD38, CD49d και ZAP-70, παρουσιάζουν διάφορα δυσμενή χαρακτηριστικά,
όπως υψηλή τάση ανάπτυξης αυτοάνοσης θρομβοπενίας, και έχουν πολύ κακή
πρόγνωση, η οποία επιδεινώνεται από την υψηλή συχνότητα ανεπιθύμητων
χρωμοσωμικών ανωμαλιών που έχουν παρατηρηθεί σε αυτό το υποσύνολο.
Αντίθετα, οι ασθενείς που ανήκουν στο ΣΥ #4 δεν εκφράζουν CD38 και ZAP-70, έχουν
λίγες γενετικές βλάβες και ακολουθούν πολύ ήπια κλινική πορεία, ακόμα και σε
34
σύγκριση με άλλες περιπτώσεις Μ-ΧΛΛ(67). Λόγω αυτών των χαρακτηριστικών, το ΣΥ
#1 και το ΣΥ #4 θεωρούνται πρότυπα κακής και καλής πρόγνωσης αντίστοιχα.
ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΜΕΣΩ BCR ΣΤΗ ΧΛΛ
Οι αποκρίσεις των Β λεμφοκυττάρων της ΧΛΛ μετά από διέγερση του BCR διαφέρουν
ανάμεσα σε διαφορετικές περιπτώσεις. Σε όλες τις περιπτώσεις ΧΛΛ, τα επίπεδα της
επιφανειακής IgM (sIgM) είναι μειωμένα και παρατηρείται μειωμένη απόκριση μετά
από διέγερση του BCR σε σχέση με τα φυσιολογικά Β λεμφοκύτταρα (69-71).
Περιπτώσεις με αμετάλλακτα γονίδια IGHV και/ή υψηλό ποσοστό κυττάρων θετικών
για ZAP-70 ή/και CD38 αποκρίνονται πιο συχνά στη δέσμευση της sIgM. Στην Μ-ΧΛΛ,
φαίνεται πως τα Β λεμφοκύτταρα δεν ανταποκρίνονται στη διέγερση μέσω του BCR,
τουλάχιστον όταν χρησιμοποιείται το αντί-IgM ως αντιγόνο(72, 73). Μια συστηματική
μελέτη προσπάθησε να συσχετίσει την ενεργοποίηση των κινασών καθοδικά του
BCR με το status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV. Βρέθηκε πως οι Akt και ERK ήταν
φωσφορυλιωμένες στο σύνολο των περιπτώσεων της Α-ΧΛΛ και στο 75% των
περιπτώσεων της Μ-ΧΛΛ, γεγονός που υποδηλώνει ότι το μονοπάτι είναι ως ένα
βαθμό ενεργό στις περισσότερες περιπτώσεις ΧΛΛ. Ωστόσο, στην πλειονότητα των
περιπτώσεων παρατηρήθηκε περιορισμένη ενεργοποίηση των μονοπατιών της JNK
και του NF-κB. Αυτό το μοριακό πρότυπο ατελούς ανοσοαπόκρισης μετά από
διέγερση του BCR είναι παρόμοιο με το αντίστοιχο ανεργικών Β λεμφοκυττάρων στα
ποντίκια(74-78). Επιπλέον, σύμφωνα με πρόσφατη μελέτη, σε μια υποομάδα ασθενών
η αδυναμία σηματοδότησης μέσω του BCR χαρακτηρίζεται από φωσφορυλίωση της
κινάσης ERK1/2, ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-ATc1 και
ανενεργό Akt. Στις περιπτώσεις αυτές, η χρήση αναστολέων της ERK1/2 και του NF-
ATc1 κατέστησε τα κύτταρα ικανά να ανταποκριθούν στη διέγερση με αντί-IgM και
τελικά οδήγησε σε απόπτωση, δημιουργώντας νέες θεραπευτικές προοπτικές. Όπως
έχει αναφερθεί και σε άλλες μελέτες, η στόχευση μορίων που βρίσκονται σε
προχωρημένα στάδια του σηματοδοτικού μονοπατιού του BCR προσφέρει το
πλεονέκτημα της άμεσης διαμόρφωσης των μηχανισμών επιβίωσης και
πολλαπλασιασμού των κυττάρων, σε αντίθεση με τη στόχευση μορίων που
βρίσκονται στα πρώτα στάδια του μονοπατιού τα οποία μπορεί να επηρεάζονται και
από ερεθίσματα μέσω άλλων υποδοχέων(75, 79, 80).
35
TLRS ΣΤΗ ΧΛΛ
Τα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ εκφράζουν συχνά BCRs που προσδένονται με
αυτοαντιγόνα αλλά και κοινά παθογόνα, όπως συστατικά του βακτηριακού
τοιχώματος. Οι TLR που αναγνωρίζουν αυτού του είδους τα μοριακά μοτίβα
εκφράζονται στα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ και έχουν προφίλ έκφρασης παρόμοιο με
το αντίστοιχο των Β λεμφοκυττάρων με εμπειρία αντιγόνου(79, 81-84). Έχουν
παρατηρηθεί υψηλά επίπεδα mRNA των TLR1, TLR2, TLR6, TLR7, TLR9 και TLR10,
πολύ χαμηλά επίπεδα mRNA των TLR4 και TLR8 και απουσία των TLR3 και TLR5. Οι
TLR που εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα είναι λειτουργικοί στα λευχαιμικά κύτταρα,
όπου επάγουν σήματα είτε πολλαπλασιασμού ή απόπτωσης και αναστέλλουν την
αγγειογένεση των όγκων(82-91). Μέχρι πρόσφατα, η έρευνα στη ΧΛΛ είχε εστιαστεί
στους TLR7 και TLR9, με αντικρουόμενα αποτελέσματα. Κάποιες μελέτες
υποστηρίζουν ότι η διέγερση του με CpG επάγει τον πολλαπλασιασμό των Β
λεμφοκυττάρων και την παραγωγή κυτταροκινών(87, 91), ενώ άλλες αναφέρουν πως η
διέγερση με CpG οδήγησε τα κύτταρα σε απόπτωση(90). Επιπλέον, φαίνεται πως η
απόκριση στη διέγερση του TLR9 ποικίλλει ανάμεσα σε διαφορετικές ομάδες
ασθενών(82, 84, 91), αν και φαίνεται πως επάγει επιλεκτικά απόπτωση στην Μ-ΧΛΛ(82,
92). Η διέγερση μέσω του TLR7 βρέθηκε να έχει γενικά αντι-αποπτωτική δράση(93)
αλλά τελευταία δεδομένα δείχνουν ότι στη Μ-ΧΛΛ μπορεί να επάγει απόπτωση(82).
Επίσης, ο TLR7 έχει την ικανότητα να επάγει την έκφραση συνδιεγερτικών μορίων,
με μεγάλη ωστόσο ετερογένεια(94, 95). Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι διαφορετικά
στερεότυπα υποσύνολα εμφανίζουν διαφορετικά προφίλ έκφρασης και
λειτουργικότητας των TLR(81, 82). Για παράδειγμα, η διέγερση μέσω των TLR1/2,
TLR2/6 και TLR9 σε ασθενείς των ΣΥ #1 και #4, οδήγησε σε σημαντική αύξηση της
έκφρασης του CD86 στο ΣΥ #4, ενώ δεν είχε κάποιο αποτέλεσμα στο ΣΥ #1. Αντίθετα,
η διέγερση μέσω του TLR7 αύξησε την έκφραση του CD25 στο ΣΥ #1 περισσότερο
απ’ ό,τι στο ΣΥ #4(82).
36
ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
37
ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
ΟΜΑΔΑ ΜΕΛΕΤΗΣ
Η ομάδα μελέτης περιλάμβανε 28 ασθενείς με Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία
που παρακολουθούνται στην Αιματολογική Κλινική του ΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου». Οι
14 έφεραν μεταλλαγμένα γονίδια IGHV και οι άλλοι 14 αμετάλλακτα. Οι 4 από αυτούς
ανήκαν στο στερεότυπο υποσύνολο #4 (IGHV4-34/IGKV2-30) και εξέφραζαν
μεταλλαγμένους BCR IgG ισομορφής. Επίσης, άλλοι 4 ασθενείς ανήκαν στο
στερεότυπο υποσύνολο #1 (IGHV1/5/7-IGKV1(D)-39) και εξέφραζαν
αμετάλλακτους BCR IgM ισομορφής.
ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ CD19+ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΔΕΙΓΜΑ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΧΡΟΝΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ
Η απομόνωση των CD19+ κυττάρων πραγματοποιήθηκε με χρήση της τεχνολογίας
RosetteSep κατά την οποία πραγματοποιείται αρνητική επιλογή των επιθυμητών
κυττάρων (Πίνακας 2) με την πρόσδεση μονοκλωνικών αντισωμάτων σε αυτά. Η
μέθοδος οδηγεί στο σχηματισμό ροζετών των ανεπιθύμητων κυττάρων με τα ερυθρά
αιμοσφαίρια και επακόλουθη καθίζηση τους όταν φυγοκεντρηθούν παρουσία
φικόλης (Εικόνα 11).
Πίνακας 2: Αντισώματα για τους δείκτες των ανεπιθύμητων κυττάρων.
Δείκτες Κυτταρικός τύπος έκφρασης
CD2 Τ λεμφοκύτταρα, ΝΚ κύτταρα, Θυμοκύτταρα
CD3 Τ λεμφοκύτταρα, Θυμοκύτταρα
CD16 ΝΚ κύτταρα, Ουδετερόφιλα, Μακροφάγα
CD36 Μονοπύρηνα, Αιμοπετάλια
CD56 ΝΚ κύτταρα
CD66b Κοκκιοκύτταρα
38
Εικόνα 11: Αρνητική επιλογή των CD19+ κυττάρων με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. (Τροποποιημένο από: http://www.stemcell.com/en/Products/All-Products/RosetteSep-Human-B-Cell-Enrichment-Cocktail.aspx)
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Προσθήκη 50 μl μονοκλωνικών αντισωμάτων RosetteSep ανά ml ολικού
Fetal Bovine Serum (FBS) (PBS-FBS 2%) στο ολικό αίμα και ανάδευση
4. Επιστοίβαση σε ίσο όγκο φικόλης
5. Φυγοκέντρηση στις 2.000 στροφές για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου
6. Συλλογή της στιβάδας που περιέχει τα εμπλουτισμένα κύτταρα σε καινούργιο
falcon
7. Προσθήκη PBS-FBS 2% μέχρι τελικό όγκο 12 ml
8. Φυγοκέντρηση στις 2.000 στροφές για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου
9. Αφαίρεση υπερκειμένου
39
10. Προσθήκη 10 ml PBS/FBS 2%
11. Επανάληψη της διαδικασίας φυγοκέντρησης και αφαίρεσης υπερκειμένου
άλλες δύο φορές
12. Επαναιώρηση των κυττάρων σε ποσότητα PBS-FBS 2% ανάλογη με την
ποσότητα του ιζήματος
13. Χρώση μικρής ποσότητας των κυττάρων με τη χρωστική Trypan Blue
14. Μεταφορά των κυττάρων σε καταμετρική πλάκα Νeubauer
15. Μέτρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο
ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΠΟΣΟΣΤΟΥ ΤΩΝ CD19+ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ
Η μέτρηση του ποσοστού των CD19+ κυττάρων πραγματοποιήθηκε με
κυτταρομετρία ροής (FACS) σε αναλυτή BD FACS CANTO και τα αποτελέσματα
αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού BD FACS DIVA.
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Προσθήκη 10 μl μίγματος μονοκλωνικών αντισωμάτων CD3-FITC και CD19-
PE σε 100 μl ολικού αίματος
2. Ανακίνηση και επώαση των δειγμάτων για 10 λεπτά σε θερμοκρασία
δωματίου
3. Προσθήκη 2 ml διαλύματος χλωριούχου αμμωνίου (NH4CL) για λύση των
ερυθροκυτττάρων
4. Ανακίνηση και επώαση των δειγμάτων για 10 λεπτά σε θερμοκρασία
δωματίου
5. Φυγοκέντρηση στις 2.000 στροφές για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου
6. Απόρριψη του υπερκειμένου
7. Προσθήκη 1 ml DPBS 1X σε κάθε δείγμα
8. Μέτρηση του ποσοστού των CD19+ κυττάρων στον αναλυτή
Η διαδικασία επαναλήφθηκε και μετά την αρνητική επιλογή των CD19+ κυττάρων
και για χρήση στην πειραματική διαδικασία επιλέχθηκαν τα δείγματα που τα
περιείχαν σε ποσοστό μεγαλύτερο από 95% (Εικόνα 12).
40
Εικόνα 12: Ανάλυση του ποσοστού των CD19+ κυττάρων πριν (Α) και μετά (Β) τη διαδικασία της αρνητικής επιλογής.
ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ
Η διέγερση των υποδοχέων TLR και BCR των CD19+ κυττάρων πραγματοποιήθηκε
με τη χρήση προσδετών κατάλληλων για τους υποδοχείς που επιθυμούμε να
μελετήσουμε (Πίνακας 3). Οι υγρές καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε ατμόσφαιρα με
περιεκτικότητα 5% CO2 στους 37 oC για συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα.
Πίνακας 3: Προσδέτες που χρησιμοποιήθηκαν για τη διέγερση των υποδοχέων TLR και BCR.
Υποδοχείς Προσδέτες Όγκοι
TLR1/2 Pam3CSK4 1 μg/ml
TLR7 Imiquimod - R837 0,1 μg/ml
TLR9 CpG ODN 2,5 μg/ml
BCR αντί-IgM 20 μg/ml
BCR (ΣΥ #4) αντί-IgG 20 μg/ml
41
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Επαναδιάλυση των κυττάρων σε θρεπτικό υλικό RPMI Complete (RPMI 1640
με περιεκτικότητα 10% fetal calf serum, 2 mmol/l l-glutamine και 15 μg/ml
gentamicin) με τελική συγκέντρωση 3x106 κύτταρων ανά ml θρεπτικού
υλικού
2. Μεταφορά 1 ml δείγματος στο αντίστοιχο πηγαδάκι πλάκας 24 πηγαδιών
3. Προσθήκη του κατάλληλου προσδέτη ή συνδυασμού προσδετών σε κάθε
πηγαδάκι με τη διάταξη της Εικόνας 13
4. Τοποθέτηση σε κλίβανο περιεκτικότητας 5% CO2 στους 37 οC και επώαση
των αντίστοιχων πλακών για 15 και 50 λεπτά
Εικόνα 13: Διάταξη της καλλιέργειας ανά χρονικό στιγμιότυπο, όπου CTL είναι το αδιέγερτο control, IgM το αντί-IgM, IgG το αντί-IgG, C το CpG ODN, Im το Imiquimod-R837 και PAM το Pam3CSK4.
42
ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ
Στο τέλος της επώασης πραγματοποιήθηκε συλλογή των κυττάρων.
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Συλλογή της κυτταροκαλλιέργειας του κάθε πηγαδιού σε ξεχωριστό
eppendorf
2. Φυγοκέντρηση στις 5.000 στροφές για 5 λεπτά στους 4 οC
3. Αφαίρεση υπερκειμένου
4. Προσθήκη 1 ml DPBS 1X
5. Επανάληψη της διαδικασίας φυγοκέντρησης, αφαίρεσης υπερκειμένου και
προσθήκης DPBS
6. Επανάληψη της φυγοκέντρησης και αφαίρεση υπερκειμένου
7. Αποθήκευση στους -20 οC
ΛΗΨΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΟΛΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Προετοιμασία του διαλύματος λύσης των κυττάρων (Lysis Buffer) του οποίου
η σύσταση αναφέρεται στον Πίνακα 4
2. Προσθήκη αναστολέων πρωτεασών (PMSF, Leupeptin, Na3VO4) και
φωσφατάσης (NaF), των οποίων οι συγκεντρώσεις φαίνονται στον Πίνακα 5
3. Επαναδιάλυση του ιζήματος σε κατάλληλο όγκο του Lysis Buffer που περιέχει
τους αναστολείς (20 μl Lysis Buffer ανά 2x106 κύτταρα)
4. Επώαση στον πάγο για 15 λεπτά
5. Φυγοκέντρηση στις 14.000 στροφές για 15 λεπτά στους 4 οC
6. Μεταφορά του υπερκειμένου σε παγωμένα eppendorfs
7. Αποθήκευση στους -20 οC ή στους -80 οC για μεγάλο χρονικό διάστημα
43
Πίνακας 4: Σύσταση του Lysis Buffer.
Αντιδραστήρια Όγκοι
Glycerol 5 ml
NaCl (5 M) 1 ml
Tris (1 M pH=7.4) 1 ml
10% SDS 500 μl
1% Triton X-100 500 μl
EDTA (0,5 M pH=8) 100 μl
sodium deoxycholate 0,25 gr
dH20 έως τελικό όγκο 50 ml
Πίνακας 5: Συγκέντρωση των αναστολέων στο Lysis Buffer.
Αναστολείς Όγκοι
NaF 1 mM
PMSF 0,421 mM
Leupeptin 5 ng /300 μl
Na3VO4 1 mM
ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ
Για επιτυχή σύγκριση των πρωτεϊνικών σημάτων που θα προκύψουν από την
ανοσοανίχνευση Western είναι απαραίτητο να πραγματοποιηθεί ανάλυση ίσων
ποσοτήτων πρωτεϊνών. Αυτό επιτυγχάνεται με τη μέθοδο ποσοτικοποίησης
πρωτεϊνών Bradford που χρησιμοποιεί τη χρωστική Coomassie (Coomassie Plus
Bradford Assay kit, Pierce Biotechnology, Rockford, USA). Η ποσοτικοποίηση
βασίζεται στην ιδιότητα της Coomassie να προσδένεται στις πρωτεΐνες σε
περιβάλλον όξινου pH, αλλάζοντας το χρώμα του διαλύματος από κόκκινο σε μπλε
44
όταν ολοκληρωθεί η πρόσδεση (Εικόνα 14). Η ποσότητα του συμπλόκου πρωτεΐνης-
χρωστικής στο διάλυμα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης, επομένως
με τη μέτρηση της απορρόφησης του συμπλόκου στα 595 nm και τη βοήθεια μιας
πρότυπης καμπύλης (Πίνακας 6), μπορεί να προσδιοριστεί η συγκέντρωση των
πρωτεϊνών ενός άγνωστου δείγματος.
Εικόνα 14: Απεικόνιση των αυξανόμενων συγκεντρώσεων πρωτεΐνης (από αριστερά προς τα δεξιά) οι οποίες αποδίδονται με εντονότερο μπλε χρώμα, σύμφωνα με τη μέθοδο Bradford(Πηγή: www.eiroforum.org/media/photo_galleries/embl/index.html)
Πίνακας 6: Πρόγραμμα αραίωσης για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης. Η επιλογή της αλβουμίνης (BSA) ως την χρησιμοποιούμενη πρωτεΐνη οφείλεται στο γεγονός ότι οι σφαιρικές πρωτεΐνες δεσμεύουν τη χρωστική καλύτερα.
Φιαλίδιο Όγκος διαλύματος
αραίωσης Όγκος BSA
Τελική συγκέντρωση BSA
1 0 μl 300 μl από stock 2000 μg/ml
2 125 μl 375 μl από stock 1500 μg/ml
3 325 μl 325 μl από stock 1000 μg/ml
4 175 μl 175 μl από φιαλίδιο 2 750 μg/ml
5 325 μl 325 μl από φιαλίδιο 3 500 μg/ml
6 325 μl 325 μl από φιαλίδιο 5 250 μg/ml
7 325 μl 325 μl από φιαλίδιο 6 125 μg/ml
8 400 μl 100 μl από φιαλίδιο 7 25 μg/ml
9 400 μl 0 μl 0 μg/ml (control)
45
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Μεταφορά 50 μl από κάθε δείγμα στους κατάλληλους δοκιμαστικούς
σωλήνες
2. Προσθήκη 1,5 ml Coomassie Plus Reagent και καλή ανάμιξη
3. Επώαση για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου
4. Μέτρηση του BSA και δημιουργία πρότυπης καμπύλης
5. Μέτρηση της απορρόφησης όλων των δειγμάτων
6. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης σε κάθε δείγμα με βάση την
πρότυπη καμπύλη
ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ WESTERN
Η ανοσοανίχνευση Western (Western Blot) είναι αναλυτική μέθοδος μεταφοράς
πρωτεϊνών σε μεμβράνη με στόχο την ανίχνευση και ταυτοποίηση τους. Αρχικά, οι
μετουσιωμένες πρωτεΐνες ηλεκτροφορούνται σε πηκτή πολυακρυλαμίδης (10%
NuPAGE Bis-Tris gel, Ιnvitrogen, Paisley, UK) και έτσι διαχωρίζονται με βάση το
μοριακό βάρος. Στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF (Ιnvitrogen, Paisley,
UK) όπου ακινητοποιούνται, και επωάζονται με αντισώματα τα οποία είναι ειδικά για
μια πρωτεΐνη-στόχο και συνδέονται μόνο με αυτή.
ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Προετοιμασία δειγμάτων σύμφωνα με τον Πίνακα 7
2. Τοποθέτηση των δειγμάτων για 10 λεπτά στους 70 οC
3. Μεταφορά των δειγμάτων στον πάγο
46
Πίνακας 7: Σύσταση των δειγμάτων προς φόρτωση στη πηκτή.
Αντιδραστήρια Όγκοι
Πρωτεΐνη 15 μg (9,5 μl)
NuPAGE LDS Sample Buffer 4 μl
NuPAGE Reducing 1,5 μl
Τελικός Όγκος 15 μl
SDS-ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Αραίωση του Running Buffer 20X (Ιnvitrogen, Paisley, UK) σε τελική
συγκέντρωση 1X με αποσταγμένο νερό
2. Τοποθέτηση της πηκτής πολυακρυλαμίδης στη συσκευή Invitrogen XCell
SureLock
3. Γέμισμα του εσωτερικού θαλάμου της συσκευής με περίπου 200 ml Running
Buffer και 500 μl Antioxidant (Ιnvitrogen, Paisley, UK)
4. Γέμισμα του εξωτερικού θαλάμου της συσκευής με 600 ml Running Buffer
5. Φόρτωμα των δειγμάτων στην πηκτή πολυακρυλαμίδης
6. Ρύθμιση της συσκευής ηλεκτροφόρησης για 1 ώρα στα 180 Volt
ΗΛΕΚΤΡΟΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΜΕΜΒΡΑΝΗ PVDF (TRANSFER)
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Προετοιμασία του διαλύματος μεταφοράς (Transfer Buffer) σύμφωνα με τον
Πίνακα 8
2. Εμποτισμός της μεμβράνης PVDF σε μεθανόλη για 5 λεπτά
3. Εμποτισμός σφουγγαριών, χαρτιών Whatman, μεμβράνης PVDF και της
πηκτής πολυακρυλαμίδης σε Transfer Buffer
4. Διάταξη των παραπάνω όπως φαίνεται στην Εικόνα 15
47
5. Γέμισμα του εσωτερικού θαλάμου της συσκευής με Transfer Buffer
6. Ρύθμιση της συσκευής ηλεκτροφόρησης για 1 ώρα και 38 λεπτά στα 40 Volt
7. Μετά το πέρας της διαδικασίας πλύσιμο της μεμβράνης με PBS Tween (PBS-
T) 0,001% 3 φορές επί 5 λεπτά
Πίνακας 8: Σύσταση του Transfer Buffer.
Αντιδραστήρια Όγκοι
Μεθανόλη 100 ml
NuPAGE Transfer Buffer 20x (Invitrogen) 50 ml
NuPAGE Antioxidant (Invitrogen) 1 ml
dH2O Έως τελικό όγκο 1000 ml
Τελικός όγκος 1000 ml
Εικόνα 15: Διάταξη του Transfer. (Τροποποιημένο από: http://tools.invitrogen.com/ content/sfs/manuals/blotmod_pro.pdf)
ΧΡΩΣΗ ΜΕ PONCEAU S
Για να επιβεβαιωθεί αν η μεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή στη μεμβράνη
ήταν επιτυχής, πραγματοποιείται χρώση της μεμβράνης με τη χρωστική Ponceau S
(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany) που προσδίδει στις πρωτεϊνικές ζώνες
κόκκινο χρώμα (Εικόνα 16).
48
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Προσθήκη χρωστικής Ponceau S στη μεμβράνη και επώαση για 5 λεπτά σε
θερμοκρασία δωματίου
2. Πλύσιμο της μεμβράνης με dH2O έως ότου φύγει η περίσσεια χρωστικής
3. Παρατήρηση των ζωνών που σχηματίστηκαν
4. Πλύσιμο της μεμβράνης με dH2O επί 5 λεπτά
5. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 2 φορές επί 5 λεπτά
Εικόνα 16: Χρώση μεμβράνης με Ponceau S. Όσο πιο έντονο το χρώμα, τόσο μεγαλύτερη η ποσότητα της πρωτεΐνης.
ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Επώαση της μεμβράνης με 2,5% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη διαλυμένο
σε PBS-T για 1 ώρα (με σκοπό τη δέσμευση των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης
των αντισωμάτων και μείωση του «θορύβου» στις εικόνες)
2. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 3 φορές επί 5 λεπτά
3. Επώαση της μεμβράνης με πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα διαλυμένο
είτε σε γάλα είτε σε BSA (οι συγκεντρώσεις των αντισωμάτων που
49
χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον Πίνακα 9) για 2 ώρες σε θερμοκρασία
δωματίου ή overnight στους 4 οC
4. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 3 φορές επί 5 λεπτά
5. Επώαση της μεμβράνης με δευτερογενές μονοκλωνικό αντίσωμα IgG
(συνδεδεμένο με ραφανική υπεροξειδάση) (1:10.000 σε γάλα 2,5%) για 2
ώρες σε θερμοκρασία δωματίου
6. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 3 φορές επί 5 λεπτά
7. Επώαση της μεμβράνης με κατάλληλο υπόστρωμα που πραγματοποιεί
αντίδραση χημειοφωταύγειας (Super signal west pico chemiluminescent
substrate, Pierce Biotechnology, Rockford, USA)
8. Καλό στέγνωμα της μεμβράνης και τοποθέτησή της στο μηχάνημα
GeneGnome της Syngene για λήψη εικόνας
Πίνακας 9: Οι συγκεντρώσεις των μονοκλωνικών αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν.
Μονοκλωνικά Αντισώματα
Συγκεντρώσεις
p-ERK 1:500 σε BSA 0,1%
β-actin HRP 1:50.000 σε γάλα 2,5%
STRIPPING
Σε περίπτωση που το μοριακό βάρος δυο πρωτεϊνών είναι παρόμοιο ή ταυτόσημο και
υπάρχει περίπτωση οι ζώνες να μην είναι ξεκάθαρες, πρέπει να απομακρυνθεί το
πρώτο μονοκλωνικό. Για το σκοπό αυτό επωάζουμε τη μεμβράνη με Stripping Buffer
(Pierce Biotechnology, Rockford, USA).
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 3 φορές επί 5 λεπτά
2. Επώαση με Stripping Buffer για 10-40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ή
στους 37 οC (ανάλογα με το πόσο ισχυρά συνδεδεμένο είναι το πρωτογενές
μονοκλωνικό αντίσωμα που πρέπει να απομακρυνθεί)
3. Πλύσιμο της μεμβράνης με PBS-T 3 φορές επί 5 λεπτά
50
4. Blocking με γάλα 2,5% για 10-40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου
5. Επώαση της μεμβράνης με πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα
ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΣΗΜΑΤΩΝ
Για την ποσοτικοποίηση της πρωτεϊνικής έκφρασης των δειγμάτων που
αναλύθηκαν, πραγματοποιείται επώαση της ίδιας μεμβράνης με αντίσωμα για β-
ακτίνη, δομική πρωτεΐνη που θεωρείται ότι εκφράζεται ισόποσα σε όλα τα κύτταρα
ανεξάρτητα από τις συνθήκες. Τα σήματα της εξεταζόμενης πρωτεΐνης και της β-
ακτίνης μετρώνται με το πρόγραμμα Image J (http://lukemiller.org/index.php/
2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-image-j/). Για κάθε δείγμα
υπολογίζεται ο λόγος έντασης της εξεταζόμενης πρωτεΐνης προς την ένταση της β-
ακτίνης.
51
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
52
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
ΟΜΑΔΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΗΣ ΧΛΛ ΕΜΦΑΝΙΖΟΥΝ ΕΝΕΡΓΟ MAPK ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΤΟΥ BCR ΚΑΙ ΤΩΝ TLR1/2, TLR7 ΚΑΙ TLR9
Για να προσδιορίσουμε την επίδραση της διέγερσης του BCR και των TLR1/2/7/9
αλλά και της συνδιέγερσης τους στα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ διερευνήσαμε τη
φωσφορυλίωση (ενεργοποίηση) των MAP κινασών ERK1/2 (p-ERK1/2) καθοδικά
του σηματοδοτικού μονοπατιού το οποίο ενεργοποιείται τόσο από τον BCR όσο και
από τους TLRs. Η ενεργοποίηση της σηματοδοτικής οδού εξετάστηκε σε 28 ασθενείς
με ΧΛΛ, από τους οποίους 14 έφεραν αμετάλλακτα γονίδια IGHV (Α-ΧΛΛ) ενώ οι
υπόλοιποι 14 έφεραν μεταλλαγμένα γονίδια IGHV (Μ-ΧΛΛ). Οι 4/14 ασθενείς της Α-
ΧΛΛ ανήκαν στο ΣΥ #1, ενώ οι 4/14 ασθενείς της Α-ΧΛΛ ανήκαν στο ΣΥ #4. Όλοι οι
λευχαιμικοί κλώνοι εξέφραζαν ανοσοσφαιρίνες ισοτύπου IgM εκτός από τους
κλώνους των ασθενών του ΣΥ #4 που εξέφραζαν IgG.
Η διέγερση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε υγρή καλλιέργεια με χρήση ειδικών
προσδετών για όλους τους υποδοχείς. Συγκεκριμένα, ο BCR διεγέρθηκε με αντί-
ανθρώπινα αντισώματα IgM ή IgG, κατά περίπτωση, και οι TLR1/2, TLR7 και TLR9
με τους προσδέτες Pam3CSK4, Imiquimod και CpG ODN, αντιστοίχως. Σε όλους τους
ασθενείς πραγματοποιήθηκε καλλιέργεια μέσω των TLR9 και TLR7 αφού οι
υποδοχείς αυτοί είναι από τους καλύτερα μελετημένους στη ΧΛΛ, ωστόσο τα
αποτελέσματα των διεγέρσεών τους είναι ετερογενή και χρήζουν περαιτέρω
μελέτης(87, 90, 91, 93-95).
Για τους ασθενείς που ανήκαν στα στερεότυπα υποσύνολα #1 και #4 στην
καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε και ο προσδέτης του TLR1/2, καθώς σε προηγούμενη
μελέτη προέκυψε ότι η απόκριση στη διέγερση του ετεροδιμερούς είχε αρκετές
διαφορές ανάμεσα στα δύο υποσύνολα(82). Επιπλέον, σε όλους τους ασθενείς
πραγματοποιήθηκε διέγερση μέσω του BCR, καθώς και συνδιέγερσή του με τους TLR,
με σκοπό να μελετηθεί ο ρόλος των TLR στη σηματοδότηση μέσω του BCR. Ως
αρνητικός μάρτυρας (control) χρησιμοποιήθηκαν αδιέγερτα κύτταρα της κάθε
περίπτωσης, καλλιεργημένα υπό τις ίδιες συνθήκες.
53
Η έκφραση της p-ERK μετρήθηκε με ανοσοανίχνευση Western με τη χρήση ειδικών
αντισωμάτων στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών. Τα αποτελέσματα
εκφράστηκαν ως λόγος της έντασης της ζώνης της πρωτεΐνης-στόχου σε σχέση με
την ένταση της ζώνης της β-ακτίνης. Θεωρήσαμε ότι υπήρχε αύξηση της p-ERK εάν η
διαφορά με το αντίστοιχο αδιέγερτο control ήταν μεγαλύτερη από |1,2|x.
Α-ΧΛΛ
ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL
Στα αδιέγερτα κύτταρα των ασθενών με αμετάλλακτα γονίδια IGHV, η ERK ήταν
φωσφορυλιωμένη στο σύνολο των περιπτώσεων, με πτώση των επιπέδων της p-ERK
να παρατηρείται στα 50 λεπτά (fold=0,7).
Εικόνα 17: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη στην Α-ΧΛΛ για τα αδιέγερτα κύτταρα στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών
ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR7 ΚΑΙ TLR9
Η διέγερση μέσω του BCR για 15 λεπτά δεν οδήγησε σε κάποια διαφορά στα επίπεδα
έκφρασης της p-ERK αλλά στη παρατεταμένη έκθεση των κυττάρων σε αντί-IgM για
50 λεπτά παρατηρήθηκε αύξησή τους (fold=1,6). Τα διεγερμένα κύτταρα μέσω TLR9
παρουσίασαν υψηλά επίπεδα p-ERK σε σχέση με τα αδιέγερτα (fold=2,1), ενώ η
διέγερση μέσω του TLR7 αύξησε ελάχιστα την φωσφορυλίωση της ERK (fold=1,3).
54
ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR
Οι συνδιεγέρσεις των κυττάρων με αντί-IgM + Im και με αντί-IgM + CpG οδήγησαν σε
μικρή αύξηση των επιπέδων της p-ERK σε σχέση με το αδιέγερτο (fold=1,4 και 1,5),
παρατηρήθηκε όμως μείωση των επιπέδων της p-ERK σε σύγκριση με τη διέγερση
των μονών διεγέρσεων του BCR και των TLR (fold=0,5-0,9).
Εικόνα 18: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη στην Α-ΧΛΛ στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών
Εικόνα 19: Αποτελέσματα ανοσοανίχνευσης Western για p-ERK και β-ακτίνη στο χρονικό στιγμιότυπο των 50 λεπτών σε μια αντιπροσωπευτική περίπτωση της Α-ΧΛΛ
55
ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #1
ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL
Στα αδιέγερτα κύτταρα του στερεότυπου υποσυνόλου #1 παρατηρήθηκε
φωσφορυλίωση της ERK και στα δύο χρονικά στιγμιότυπα, με τα επίπεδα της p-ERK
να μειώνονται στα 50 λεπτά (fold=0,4).
Εικόνα 20: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη για τα αδιέγερτα κύτταρα, στο ΣΥ #1 στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών
ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR1/2, TLR7 ΚΑΙ TLR9
Η έκθεση των κυττάρων σε αντί-IgM οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της p-ERK
(fold=1,6) στο χρονικό στιγμιότυπο των 50 λεπτών, ενώ στα 15 λεπτά δεν
παρατηρήθηκε διαφορά σε σχέση με το αδιέγερτο control. Σε όλες τις διεγέρσεις
μέσω των TLR ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα p-ERK, με μεγαλύτερη διαφορά σε
σχέση με τα αδιέγερτα κύτταρα να εμφανίζει η διέγερση μέσω των TLR1/2
(fold=2,4).
ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR
Όλες οι συνδιεγέρσεις οδήγησαν σε αύξηση των επιπέδων έκφρασης της p-ERK σε
σύγκριση με το αδιέγερτο control, αλλά παρατηρήθηκε είτε μείωση ή καμία διαφορά
στα επίπεδα της p-ERK σε σύγκριση με όλες μεμονωμένες διεγέρσεις (fold=0,6-1).
56
Εικόνα 21: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη στο ΣΥ #1 στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών
Εικόνα 22: Αποτελέσματα ανοσοανίχνευσης Western για p-ERK και β-ακτίνη στο χρονικό στιγμιότυπο των 50 λεπτών σε μια αντιπροσωπευτική περίπτωση του ΣΥ #1
Μ-ΧΛΛ
ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL
Στα αδιέγερτα κύτταρα των ασθενών με μεταλλαγμένα γονίδια IGHV η ERK ήταν
φωσφορυλιωμένη και στα δύο χρονικά στιγμιότυπα, με τα επίπεδα έκφρασής της να
μειώνονται σημαντικά στα 50 λεπτά (fold=0,3).
57
Εικόνα 23: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη για τα αδιέγερτα κύτταρα στη Μ-ΧΛΛ στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών
ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR7 ΚΑΙ TLR9
Μετά από έκθεση στο αντίσωμα αντί-IgM για 15 λεπτά, τα επίπεδα έκφρασης της p-
ERK αυξήθηκαν (fold=1,4), ενώ μετά από έκθεση για 50 λεπτά παρατηρήθηκε μείωσή
τους σε σχέση με τα αδιέγερτα κύτταρα (fold=0,8). Οι διεγέρσεις μέσω των TLR7 και
TLR9 δεν είχαν κάποιο αντίκτυπο στη φωσφορυλίωση της ERK (fold=1,1 και 1,2).
ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR
Μετά από έκθεση σε αντί-IgM + Im και αντί-IgM + CpG ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα
της p-ERK συγκριτικά με το αδιέγερτο control (fold=1,8 και 2,8) και τις μεμονωμένες
διεγέρσεις του BCR (fold=1,6 και 1,7). Η συνδιέγερση του BCR με τον TLR9 αύξησε
τα επίπεδα της p-ERK (fold=1,7) σε σχέση με την μονή διέγερση με CpG, ενώ η
συνδιέγερση του BCR με τον TLR7 δεν εμφάνισε διαφορές στην έκφραση της p-ERK
σε σχέση με την μονή διέγερση με Im (fold=1).
58
Εικόνα 24: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη για τη Μ-ΧΛΛ στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών
Εικόνα 25: Αποτελέσματα ανοσοανίχνευσης Western για p-ERK και β-ακτίνη στο χρονικό στιγμιότυπο των 50 λεπτών σε μια αντιπροσωπευτική περίπτωση της Μ-ΧΛΛ
ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #4
ΑΔΙΕΓΕΡΤΟ CONTROL
Στα αδιέγερτα κύτταρα των ασθενών που ανήκουν στο στερεότυπο υποσύνολο 4
ανιχνεύθηκε p-ERK και στα δύο χρονικά στιγμιότυπα, με τα επίπεδα έκφρασής της
να είναι υψηλότερα στα 15 λεπτά (fold=3,2).
59
Εικόνα 26: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη για τα αδιέγερτα κύτταρα στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών
ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕΣΩ BCR, TLR1/2, TLR7 ΚΑΙ TLR9
Η διέγερση μέσω του BCR οδήγησε σε ετερογενείς αποκρίσεις, με τα επίπεδα της p-
ERK να μειώνονται στα 15 λεπτά (fold=0,8) αλλά να αυξάνονται αρκετά στα 50 λεπτά
(fold=2,1). Μετά από έκθεση στους προσδέτες Im, CpG και PAM, τα επίπεδα
έκφρασης της p-ERK αυξάνονται, με την διέγερση μέσω του TLR1/2 να εμφανίζει τη
μεγαλύτερη διαφορά σε σχέση με το control (fold=2,5).
ΣΥΝΔΙΕΓΕΡΣΗ BCR ΚΑΙ TLR
Οι συνδιεγέρσεις του BCR με τους TLR1/2, TLR7, και TLR9 αύξησαν τη
φωσφορυλίωση της ERK συγκριτικά με τα αδιέγερτα κύτταρα (fold=1,2-2,2), άλλα
στην πλειοψηφία των περιπτώσεων μείωσαν τα επίπεδα της p-ERK σε σχέση με τις
μεμονωμένες διεγέρσεις των υποδοχέων (fold=0,2-1). Μόνο η συνδιέγερση του BCR
με τον TLR7 αύξησε την έκφραση της p-ERK σε σχέση με την μονή διέγερση με Im
(fold=3,6).
60
Εικόνα 27: Το γράφημα αντιπροσωπεύει τις διάμεσες τιμές και το εύρος της p-ERK σε αναλογία προς την β-ακτίνη στο ΣΥ #4 για στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών
Εικόνα 28: Αποτελέσματα ανοσοανίχνευσης Western για p-ERK και β-ακτίνη στο χρονικό στιγμιότυπο των 50 λεπτών σε μια αντιπροσωπευτική περίπτωση του ΣΥ #4
61
ΣΥΖΗΤΗΣΗ
62
ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι τα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ παρουσιάζουν
εμπειρία αντιγόνου και αλληλεπιδρούν με το μικροπεριβάλλον μέσω των υποδοχέων
τους, με βασικότερο τον BCR, ο οποίος διεγείρεται τόσο από αυτοαντιγόνα όσο και
από εξωγενή αντιγόνα(46, 96).
Η διάκριση των ασθενών με ΧΛΛ που γίνεται με βάση την κατάσταση μεταλλάξεων
των γονίδιων IGHV (Α-ΧΛΛ και Μ-ΧΛΛ) έχει τόσο κλινική όσο και λειτουργική
σημασία. Μολονότι και οι δύο ομάδες γενικά παρουσιάζουν μειωμένη απόκριση στη
διέγερση μέσω του BCR(69-71), υπάρχουν ορισμένες διαφορές. Συγκεκριμένα, στην Α-
ΧΛΛ παρατηρείται πολυαντιδραστικότητα και ενεργός σηματοδότηση μέσω του
BCR, ενώ στην Μ-ΧΛΛ η μεταβίβαση σημάτων μέσω του υποδοχέα είναι μειωμένη(72,
73, 97). Φαίνεται πως η ικανότητα σηματοδότησης μέσω του BCR έχει κλινική σημασία,
καθότι η Μ-ΧΛΛ σχετίζεται με ήπια κλινική πορεία, ενώ η Α-ΧΛΛ με επιθετική πορεία.
Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της ΧΛΛ είναι η κατάταξη των ασθενών σε υποσύνολα
με βάση την έκφραση στερεότυπων BCR. Οι ασθενείς που ανήκουν σε ένα ορισμένο
στερεότυπο υποσύνολο χαρακτηρίζονται από ταυτόσημους BCR και ιδιαίτερη
κλινική πορεία που συχνά είναι ανεξάρτητη από το status μεταλλάξεων των γονιδίων
IGHV(67). Σχεδόν το 30% των περιπτώσεων της ΧΛΛ ανήκει σε κάποιο στερεότυπο
υποσύνολο(64), καθιστώντας τις μελέτες σχετικά με τη στερεοτυπία σημαντικές πηγές
πληροφοριών για την ανάπτυξη και εξέλιξη της νόσου.
Δύο από τα πιο σημαντικά στερεότυπα υποσύνολα είναι το #1 που εκφράζει
αμετάλλακτους IGHV1/5/7-IGKV1(D)-39 BCRs και το #4 που εκφράζει
μεταλλαγμένους IGHV4-34/IGKV2-30 BCRs ισοτύπου IgG. Τα δύο αυτά στερεότυπα
υποσύνολα θεωρούνται πρότυπα κακής και καλής πρόγνωσης, αντιστοίχως(67).
Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα κύτταρα της ΧΛΛ μέσω των BCR τους
αναγνωρίζουν κοινά παθογόνα, τα οποία αναγνωρίζονται επίσης και από τους
υποδοχείς TLR(81-84). Οι TLR συνδέουν την έμφυτη με τη προσαρμοστική ανοσία,
καθώς η ενεργοποίηση τους αποτελεί το τρίτο σήμα για την ενεργοποίηση των
ανώριμων Β λεμφοκυττάρων επικουρικά στην ειδική σύνδεση του αντιγόνου με τον
BCR (πρώτο σήμα) και την αλληλεπίδραση του με τα Τ λεμφοκύτταρα (δεύτερο
σήμα). Οι TLR φαίνεται να λειτουργούν καθοδικά του BCR, καθώς η ενεργοποίηση
του BCR οδηγεί σε ραγδαία επαγωγή ορισμένων TLR. Γνωρίζουμε ότι η διέγερση του
63
BCR των TLR ενεργοποιεί διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία
συναντώνται στο επίπεδο των MAP κινασών και του NF-κB, αλλά ακόμη ο
αντίκτυπος της συνδιέγερσης αυτής των υποδοχέων αυτών στα Β λεμφοκύτταρα δεν
έχει μελετηθεί εκτενώς.
Οι TLR εκφράζονται στα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ, με προφίλ έκφρασης παρόμοιο
με το αντίστοιχο των Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Επιπλέον, είναι λειτουργικοί καθώς
επάγουν την έκφραση συνδιεγερτικών μορίων και, κατά περίπτωση,
πολλαπλασιασμό ή απόπτωση. Έχουν παρατηρηθεί διαφορετικά πρότυπα έκφρασης
των TLR ανάλογα με την κατάσταση μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV ενός ασθενούς
ή με βάση το στερεότυπο υποσύνολο στο οποίο ανήκει, αλλά τα αποτελέσματα
διαφορετικών μελετών παρουσιάζουν μεγάλη ετερογένεια(81-83, 86-95).
Στην παρούσα μελέτη προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε πιθανές διαφορές στην
ενδοκυττάρια σηματοδότηση μετά από διέγερση του BCR, επιλεγμένων TLR καθώς
και συνδιέγερσή τους σε καλά χαρακτηρισμένες ομάδες ασθενών. Συγκεκριμένα,
μελετήσαμε τα αποτελέσματα της διέγερσης του BCR και των TLR1/2, TLR7 και
TLR9 καθώς και την επίδραση διπλών σημάτων (μέσω BCR και TLR) σε σχέση με τα
σήματα που προέρχονται από έναν μόνο υποδοχέα. Εξετάσαμε την ενεργοποίηση της
σηματοδοτικής οδού των MAP κινασών σε 28 περιπτώσεις ασθενών με ΧΛΛ: 14 Μ-
ΧΛΛ από τους οποίους οι 4 ανήκουν στο ΣΥ #4 και 14 Α-ΧΛΛ από τους οποίους οι 4
ανήκουν στο ΣΥ #1. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία αντί-IgM, Im,
CpG και PAM μεμονωμένα, αλλά και μετά από διπλή διέγερση με αντί-IgM + Im, αντί-
IgM + CpG ή αντί-IgM + PAM. Στα χρονικά στιγμιότυπα των 15 και 50 λεπτών
αναλύθηκε η ενεργοποίηση της κινάσης ERK μέσω ανοσοανίχνευσης Western.
Α-ΧΛΛ ΕΝΑΝΤΙ Μ-ΧΛΛ
Σύμφωνα με μια πρόσφατη μελέτη, η ERK είναι συνεχώς φωσφορυλιωμένη σε
περιπτώσεις στις οποίες δεν υπάρχει ανταπόκριση μετά από διέγερση του BCR, ιδίως
στην Μ-ΧΛΛ. Οι περιπτώσεις αυτές χαρακτηρίζονται επιπλέον από συνεχή
ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-ATc1 και ανενεργό Akt(79),
χαρακτηριστικά που συσχετίζονται με την ανεργία Β λεμφοκυττάρων στα
ποντίκια(77). Έτσι ενισχύεται η άποψη ότι τα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ που φέρουν
αυτά τα χαρακτηριστικά έχουν καταστεί ανεργικά μετά από παρατεταμένη έκθεση
64
σε αυτό-αντιγόνα. Στην παρούσα μελέτη δεν επιβεβαιώθηκε το συγκεκριμένο
αποτέλεσμα, αφού παρατηρήθηκε υψηλότερη έκφραση φωσφορυλιωμένης ERK στα
αδιέγερτα κύτταρα της Α-ΧΛΛ.
Μετά από διέγερση μέσω του BCR με αντί-IgM επί 15 λεπτά παρατηρήθηκε αυξημένη
φωσφορυλίωση της ERK στη Μ-ΧΛΛ, ενώ στην παρατεταμένη έκθεση των 50 λεπτών
δεν παρατηρήθηκε διέγερση. Αντίθετα αποτελέσματα παρουσίασε η Α-ΧΛΛ, όπου τα
επίπεδα της p-ERK δε διέφεραν ιδιαίτερα από το control στα 15 λεπτά, άλλα
αυξάνονταν στα 50 λεπτά. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα κύτταρα της Μ-
ΧΛΛ έχουν γρηγορότερη απόκριση μετά από διέγερση μέσω του BCR, άλλα το σήμα
είναι παροδικό, ενώ στα κύτταρα της Α-ΧΛΛ το σήμα έχει μεγαλύτερη διάρκεια.
Η διέγερση μέσω των TLR7 και TLR9 στα 50 λεπτά, οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων
της p-ΕΡΚ στην Α-ΧΛΛ ενώ στη Μ-ΧΛΛ δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά σε σχέση
με τα αδιέγερτα κύτταρα. Επομένως, διέγερση που πραγματοποιείται μόνο μέσω
αυτών των υποδοχέων έχει θετικό αποτέλεσμα μόνο στην Α-ΧΛΛ.
Στη Μ-ΧΛΛ η συνδιέγερση του BCR/TLR7 και BCR/TLR9 κατάφερε να αυξήσει την
έκφραση της p-ERK σε σχέση με το αδιέγερτο control, κατά το αναμενόμενο. Επίσης,
μετά τη διπλή διέγερση τα επίπεδα της p-ΕΡΚ αυξήθηκαν περισσότερο σε σχέση με
τις μεμονωμένες διεγέρσεις μέσω των BCR, TLR7 και TLR9, με μεγαλύτερο αντίκτυπο
να έχει η συνδιέγερση του BCR με τον TLR9. Στην Α-ΧΛΛ τα επίπεδα της p-ERK
αυξήθηκαν μόνο σε σχέση με τα αδιέγερτα κύτταρα και δεν παρουσίασαν διαφορά ή
παρουσίασαν μείωση σε σχέση με της μονές διεγέρσεις. Συνεπώς, φαίνεται πως στην
Μ-ΧΛΛ για να ενεργοποιηθεί η ERK απαιτείται συνδιέγερση του BCR με τους TLR, ενώ
στην Α-ΧΛΛ οι μεμονωμένες διεγέρσεις έχουν καλύτερα αποτελέσματα.
ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΑ ΥΠΟΣΥΝΟΛΑ #1 ΕΝΑΝΤΙ #4
Μετά από διέγερση μέσω του BCR επί 15 λεπτά παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων
της p-ERK σε σχέση με το αδιέγερτο control στο ΣΥ #4 και καμία διαφορά στο ΣΥ #1,
ενώ μετά την παρατεταμένη διέγερση των 50 λεπτών αυξήθηκε η φωσφορυλίωση
της ERK και στα δύο υποσύνολα. Αυτό δείχνει πως η απόκριση των κυττάρων στη
διέγερση του BCR είναι αργή αλλά το σήμα έχει μεγαλύτερη διάρκεια. Στο ΣΥ #4, η
μεγάλη διαφορά στα επίπεδα της p-ERK ανάμεσα στα 15 και 50 λεπτά πιθανόν
οφείλεται στο γεγονός ότι υπό κανονικές συνθήκες τα κύτταρα είναι ανεργικά και
65
επομένως χρειάζεται κάποιος χρόνος ώστε να αποκατασταθεί η δυνατότητα
σηματοδότησης μέσω του BCR.
Τα δύο υποσύνολα είχαν παρόμοιες αποκρίσεις και στη διέγερση μέσω των TLR1/2,
TLR7 και TLR9 με PAM, Im και CpG, αντιστοίχως, η οποία οδήγησε σε αύξηση των
επιπέδων της p-ERK στο στιγμιότυπο των 50 λεπτών σε όλες τις περιπτώσεις. Και
στα δύο υποσύνολα, μεγαλύτερη αύξηση επέφερε η διέγερση μέσω των TLR1/2.
Μετά από τις διπλές διεγέρσεις του BCR με τους TLR παρατηρήθηκε αύξηση της
φωσφορυλίωσης της ERK σε σχέση με το αδιέγερτο control και στα δύο υποσύνολα,
αλλά μείωση σε σχέση με τις μεμονωμένες διεγέρσεις των υποδοχέων. Γενικότερα,
στα ΣΥ #1 και #4 φαίνεται πως οι διεγέρσεις μέσω ενός μόνο υποδοχέα αυξάνουν την
έκφραση της p-ERK περισσότερο σε σχέση με τις διπλές διεγέρσεις.
ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #1 ΕΝΑΝΤΙ Α-ΧΛΛ
Η διέγερση του BCR με αντί-IgM είχε το ίδιο αποτέλεσμα τόσο στην Α-ΧΛΛ όσο και
στο ΣΥ #1, με τη φωσφορυλίωση της ERK να μην παρουσιάζει διαφορά από τα
αδιέγερτα κύτταρα στα 15 λεπτά, αλλά να αυξάνεται στα 50 λεπτά.
Η διέγερση μέσω των TLR7 και TLR9 αύξησε τα επίπεδα της p-ERK τόσο στην Α-ΧΛΛ
όσο και στο ΣΥ #1, με τη διέγερση μέσω του TLR9 να επιφέρει τη μεγαλύτερη αύξηση
και στις δύο περιπτώσεις. Ομοιότητες ανάμεσα στις δύο ομάδες παρατηρήθηκαν και
στις συνδιεγέρσεις του BCR με τους TLR7 και TLR9, καθώς τόσο στην Α-ΧΛΛ και στο
ΣΥ #1 η p-ERK αυξήθηκε μόνο συγκριτικά με το αδιέγερτο control, αλλά ήταν
μειωμένη ή σταθερή σε σχέση με όλες τις μονές διεγέρσεις των υποδοχέων. Συνεπώς,
τουλάχιστον στη συγκεκριμένη μελέτη, όλοι οι ασθενείς που φέρουν αμετάλλακτα
γονίδια, είτε ανήκουν στο ΣΥ #1 είτε στο γενικό σύνολο της Α-ΧΛΛ, ανταποκρίνονται
καλύτερα στις διεγέρσεις μέσω ενός μεμονωμένου υποδοχέα, με τη μεγαλύτερη
αύξηση στα επίπεδα της p-ERK να παρατηρείται μετά από διέγερση μέσω του TLR9.
ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΟ ΥΠΟΣΥΝΟΛΟ #4 ΕΝΑΝΤΙ Μ-ΧΛΛ
Συγκρίνοντας τη φωσφορυλίωση της ERK μετά από διέγερση μέσω του BCR σε σχέση
με το αδιέγερτο control στην περίπτωση της Μ-ΧΛΛ παρατηρήθηκε αύξηση στα 15
66
λεπτά και μείωση στα 50 λεπτά, ενώ στο ΣΥ #4 ακριβώς το αντίθετο, γεγονός που
δείχνει ότι οι ασθενείς που ανήκουν στη Μ-ΧΛΛ δε φέρουν όλοι ανεργικούς BCR.
Οι διεγέρσεις των TLR7 και TLR9 οδήγησαν σε αύξηση της p-ERK μόνο στο ΣΥ #4,
ενώ στην Μ-ΧΛΛ δεν είχαν κάποιο αντίκτυπο. Στη Μ-ΧΛΛ, μετά τις διπλές διεγέρσεις
του BCR και των TLR7 και TLR9 αυξήθηκε η φωσφορυλίωση της ERK σε σχέση με τα
αδιέγερτα κύτταρα ή τις μεμονωμένες διεγέρσεις. Αντίθετα, στο ΣΥ #4 η p-ERK ήταν
μειωμένη ή σταθερή σε σχέση με τις μονές διεγέρσεις των υποδοχέων και αύξηση της
παρατηρήθηκε μόνο σε σχέση με το control. Το συμπέρασμα που προκύπτει από
αυτές τις παρατηρήσεις είναι ότι η p-ERK έχει διαφορετικά προφίλ λειτουργικότητας
στους μεταλλαγμένους ασθενείς του ΣΥ #4 έναντι των ασθενών της γενικότερης
κατηγορίας της Μ-ΧΛΛ.
67
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
68
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1 Kindt, T.J., et al., Kuby immunology. 6th ed. 2007, New York: W.H. Freeman. xxii,
574, I-27 p.
2 Medzhitov, R. and C.A. Janeway, Jr., Innate immunity: the virtues of a nonclonal
system of recognition. Cell, 1997. 91(3): p. 295-8.
3 Kawai, T. and S. Akira, TLR signaling. Semin Immunol, 2007. 19(1): p. 24-32.
4 Kawai, T. and S. Akira, TLR signaling. Cell Death Differ, 2006. 13(5): p. 816-25.
5 Kawai, T. and S. Akira, Pathogen recognition with Toll-like receptors. Curr Opin
Immunol, 2005. 17(4): p. 338-44.
6 Akira, S. and K. Takeda, Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol, 2004. 4(7):
p. 499-511.
7 Bauer, S., G. Hartmann, and S. Akira, Toll-like receptors (TLRs) and innate
immunity. Handbook of experimental pharmacology. 2008, Berlin: Springer. xi,
240 p.
8 Owen, J.A., et al., Kuby immunology. 7th ed. 2013, New York: W.H. Freeman. xxvii,
692, 109 p.
9 McGettrick, A.F. and L.A. O'Neill, Toll-like receptors: key activators of leucocytes and
regulator of haematopoiesis. Br J Haematol, 2007. 139(2): p. 185-93.
10 Takeuchi, O. and S. Akira, Toll-like receptors; their physiological role and signal
transduction system. Int Immunopharmacol, 2001. 1(4): p. 625-35.
11 Lund, J.M., et al., Recognition of single-stranded RNA viruses by Toll-like receptor 7.
Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(15): p. 5598-603.
12 Nagai, Y., et al., Essential role of MD-2 in LPS responsiveness and TLR4 distribution.
Nat Immunol, 2002. 3(7): p. 667-72.
13 Takeuchi, O., et al., Cutting edge: preferentially the R-stereoisomer of the