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( 19 ) United States ( 12 ) Patent Application Publication ( 10 ) Pub . No . : US 2018 / 0051060 A1
JO ( 43 ) Pub . Date : Feb . 22 , 2018
( 54 ) CELL - PERMEABLE ( ICP ) - SOCS3 RECOMBINANT PROTEIN AND USES THEREOF
( 60 ) Provisional application No . 62 / 042 , 493 , filed on Aug . 27 , 2014 .
( 71 ) Applicant : CELLIVERY THERAPEUTICS , INC . , Seoul ( KR )
( 72 ) Inventor : Daewoong JO , Brentwood , TN ( US )
( 73 ) Assignee : CELLIVERY THERAPEUTICS , INC . , Seoul ( KR )
Publication Classification ( 51 ) Int . CI .
CO7K 14 / 47 ( 2006 . 01 ) CO7K 7 / 08 ( 2006 . 01 ) A61K 38 / 00 ( 2006 . 01 )
( 52 ) U . S . CI . CPC . . . . . . . . . . . . CO7K 14 / 4703 ( 2013 . 01 ) ; C07K 7 / 08
( 2013 . 01 ) ; COZK 2319 / 00 ( 2013 . 01 ) ; CO7K 2319 / 21 ( 2013 . 01 ) ; A6IK 38 / 00 ( 2013 . 01 )
( 57 ) ABSTRACT The present invention relates to providing improved cell permeable ( iCP ) - SOCS3 recombinant protein and uses thereof . Preferably , the iCP - SOCS3 recombinant protein may be used as protein - based anti - angiogenic agent by utilizing the platform technology for macromolecule intra cellular transduction .
( 21 ) Appl . No . : 15 / 631 , 982
( 22 ) Filed : Jun . 23 , 2017
Related U . S . Application Data ( 63 ) Continuation - in - part of application No . 14 / 838 , 295 ,
filed on Aug . 27 , 2015 .
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( Figure 1 ]
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US 2018 / 0051060 A1
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Page 54
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Relative Fold ( Geo Meas : MTO85 )
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Patent Application Publication
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Feb . 22 , 2018 Sheet 53 of 105
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 54 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 11c ) 3 . mientras q engligining nangyari naam van m i n menina waamini wewe mwenyewe warunking w omen with a view
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 55 of 105 US 2018 / 0051060 A1
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 56 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 136 ]
Delivery Potential ( Geo Mean )
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( Figure 13c )
Delivery Potential ( Geo Mean ) 5
0 2 3 4 5 Number of Leucine
( Figure 13d )
Delivery Potential ( Geo Mean )
Number of Valine
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 58 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 14a )
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( Figure 14b )
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 59 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 14c )
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( Figure 14d )
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US 2018 / 0051060 A1 Feb . 22 , 2018 Sheet 60 of 105 Patent Application Publication
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 61 of 105 US 2018 / 0051060 A1
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( Figure 161
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 63 of 105 US 2018 / 0051060 A1
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 64 of 105 US 2018 / 0051060 A1
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 65 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 22 )
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( Figure 251
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 68 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 28a ]
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 69 of 105 US 2018 / 0051060 A1
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 73 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 32 )
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 74 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 34 )
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 75 of 105 US 2018 / 0051060 A1
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Annexio V
? ? ?? , # 53 ?? : 38 ?? S35 ? 438 ?
( Figure 37
AG? S32
titutyHiHiHiHTTP
Vehicle ? : 1538 STOR ??
2?
s8 } S? MacS2?
??
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 76 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 38 )
Solubility Permeability
Rank ???? Rank aMTD Yield ( mg / L )
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
481 77 121 26tttttttttttttttttt2227tttttttttttttttttttt 364 58 623 177
292929292929292 WWWWWWWWWWWWWWWWWWWWW WYYYYYYYYYYYYYYYYY
81 * * * * *
324 / 662
281 * * * * * * * * * OWN S LLLLLLLLLLLL2hritttttttttttttt . 3333333333333333333 162
365 54 www wwwwwwwwwww 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - - 1 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 111131 - II - III
563 481 2
47 LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL 232424242424242424242424242 897 622144
* * * * * * * * * * *
46 10 * * * * * * * 324
Biological Activity Apoptosis ( TUNEL Assay )
133 Rank T ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
. . . . . . . . . . . . . . . . * * * * * * * *
aMTD 904 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
www w wwwwwwwwwwwwwwww
Rank aMTD
165 324 563281 Apoptosis ( Annexin V )
1 1 2 3 4 165 281 563 904
Wound Healing 1 1 2 3 4
165 904 281324
5 324
T !
Rank aMTD
TOR .
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 5 563 * * * * * * * *
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
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( Figure 39a ) I aMTD165 D socs3 SOCS SDB - - - - - - - ICP - SOCS3
( M46S3B )
( Figure 39b )
( M $ 38 )
Solubility
Yield ( mg / l ) 20
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 78 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 401
Vehicle * FITC only
meteo FITC - Non - CP - SOCS3 red FITC - ICP - SOCS3 ( HM165 $ 3B ) * * * FITC - CP - SOCS3 ( M 85 S3B )
ime nt was SAABIKAASAASAAS A ASAW A SASA SAMAA Mittwowa SINABIKI * * * * *
*
* *
mas * * * * * * * *
HM 65S3B
Counts A *
* * * *
fa M 6S3B S
* *
* * * * * *
* * *
even the most * * * * * in die het tweede 304 10 % 10 % 10 %
Fluorescence escenc
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W
69 % 58 % %
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( Figure 42 )
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ICP SOCS3 MM : 56 $ 38 MAGAS3B
inimal minimo m etaisai
Vehicle interne er en stemningen in minute einem andere de meest generating contention to the intern e u pareiging panjang yang ingin menguntunin n inyo ang init magandang tananyang panjan g jarang dan peranan
( Figure 43 )
O His - tag a MTD165 socs3 SDB *
2 ICP - SOCS3 ( HM46S3B )
ICP - SOCS3 M ICP - SOCS3 ( HM165S3B ( V28L ) )
V28L
LD I N
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( Figure 441 ICP - SOCS3
HM 6553B HM 6S3B ( V28L )
wwwwwwwwww * * * * * wimwi * *
Bundan tashout the contention Solubility * ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????
management autour la bandera * * * *
Yield ( mg / L ) 11 . 6 10 . 23 * * * *
( Figure 45 )
waterpartiet D Vehicle FITC
meanino FITC - Non - CP - SOCS3 FITC - ICP - SOCS3
te rendere la loro parte sortie de la tempor incide
FITC FITC - Non - CP - SOCS3 FITC - ICP - SOCS3 ( V28L ) ntes
Karsinkin ICP . SOCS3 ICP - socs3
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* * * * * * * * * * * * * * *
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100 101 102 103 104 105 106 107 102 103 104 105
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US 2018 / 0051060 A1 Feb . 22 , 2018 Sheet 81 of 105 Patent Application Publication
[ Figure 46 *
14 ? *
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Ilii ????????????????????????????????????????? ??????????? ??????????????????????? all fatility ( %
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*
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*
Nafs Vehicle 483E HB * S3E SL
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Figure 47
# sar s3 Vehics .
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* * * S3 ? ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????
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28 3
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* * * ?? ?? ?? ???? ?? ???? ?? ??? ? . ???? ???? ? ?? ?? ?? ?? ?? ? ?? ??? ????? ?? ???
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( Figure 48a )
CP SOCS3 w w w . * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
Vehicle Non - CP SOCS3 HU , S3 MMS36 ( V2 & L
( Figure 48b )
CP SOCS3 MMS36MM S3B ( V28L Vehicle Non - CP - SOCS :
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 83 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 49a )
- MTD185 aMTD165 ( 12 afa ) sos : 508 ( 99 aya )
SOCS3 ( 225 ala )
V2 & L 853M , 853M 8 . MD D V V28DBS3M5S SUBS3M55
( Figure 49b )
yutt
BS3M ( V28L ) BS3M165
( Figure 49c )
( V28L ) BS3M 68 wwwwwwwwwww BS3M6 PTG
# M $
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( Figure 501
Treatment ( uM ) - FN - Y -
- *
HS3B HM 6S3B 1 5 10 1 5 10 * * * * *
P - STAT3
B - actin
( Figure 51a )
EDTA .
* W
parte di
Counts * * * * wwwwwwwwwwwwww wwwwwwwwwwwwwww 0 60 % 10 % 10 % SK 33
wwwwwwwwwwwwwwww 06 08 10 *
Wattitilitatii ittihittiittiliitilitatii ittihittiittiliitilitatii ittihittiittiliitilitatii ittihittiitattiilitatii ittihittiittiliitilitati
Fluorescence
( Figure 516 )
Proteinase K
Counts * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
* * *
Fluorescence
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 85 of 105 US 2018 / 0051060 A1
ID Ie ( Figure 52a )
Taxol X ???????????? ????????????????
2 . FITCHH $ 38 3 . FITCHM838 8
???????????????????????????????????????????????????????????
Counts posaryo pa P
ress * * * ay w Within the . 3 OLX SOKOLO Fluorescence
( Figure 52b )
- UDAWDUY Antimycin * SH 15 2 MITC # 838 3 . FITCH . 838
9999999999999999999999999 ATP ti oscooteot stic
60 % 0 040 MOL Counts - - - - - - -
* 00000000000000000000 DIY * * * *
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??????? ??????? * * * xiririririririri
Fluorescence
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Figure 53
3 ?????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????????????
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538 3 , FITC - N ???? ??? ??? ????????????????? ?????? ??
?? ??????? ???? ?? ?????? ?????? ???????? ???? Arts ???? ??? ?? ??
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?????????? ?????????????? ???? ?????? ???? ???? ??
??????????? ??? ??? ???? ?? * ???????? ???? ?????????
? ? ? ? ????? ???????? ????????????? ???????? ???? ?? ? ?? |
Fluorescence
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( Figure 541
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*
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0 14 : 43 : 42 : 14 14 . 44
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| ???? ???XX ? : ?? , ???? : E - ???? , ???? Anythmartmentantion the ??? ????????? ??????? ?? ????? ?
* * - * - * - * - * - * - *
* * * * * *
A . Lund ,
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Figure 55 )
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8 Hear TOM
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 88 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 56 )
Vehicle Non - CP - SOCS CP SOCS3 Vehicle Non - GP SOCS3 CP - SOCS3
* * * * *
FIYA FITC
Nomarski Nomarski
Vehicle Non - CP - SOCS3 CP SOCS3 Vehicle Non - P $ 0053 CH SOCS3 INST
www memesi 76 XLARI FITO . * 3
Nomarski Nomarski
( Figure 57 )
- - - - - - - - - - - - - -
- - - -
Rel . Cell Viability ( % ) -
- - - - -
Vehicle HS3B HM785S3B
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 89 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 58 ) TOTT he
Rel . Migrated Cells ( % )
. 888 wwwwwwwwwwwww 11 . . . . . . .
. .
. .
.
Vehicle HS3B HM 6S3B
( Figure 59 ) Vehicle HS3B HMESIS
( OOZX )
24h
( X100 )
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * they
*
* * *
* * * * * *
Rel . Branch Paints 195 * * * * *
Rel . Tuke Length ( % ) modo a noite ventana nu am mai internacionamento
WAY * * *
. * * * . . * * * .
* * * * * w
Y27 . * *
* * *
* * *
*
Vehicle MMS38 Vehicle HSBB Treatment
. . " 2 . MS3B Treatment
HR je SDB 0 . 01
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( Figure 60 )
HUVECS HS3B HM166S3B Vehicle
BFGEL wwwwwwwwwwwwwwwww w wwwwwwwwwwwww
D - 73TOR mimimpimimmierumimini mimi mim ni miongoni mengin e en stor interneto sve tried
MTOR
P - Akt - - - - - - - ??
8 - actin
( Figure 61 ) WM 6S3B iniciaisiamina HS3B
2ug inicia L ' i ' ' Diluent 0 . 5 pg 2 20
. . . permitinimumimininosiminimine Dilien * * * 2 ) HS3B ( 2 , 9 ) HX185S3B ( 0 . 5 pg , 10 ) WiseS3E ( 7 yeni n = 12 ) 1S3B ( 2 xg , 1 - 10 )
Neovasculized Egge ( 94 ) * * * * * * * * * * * * * * * * * *
NHILLINOINNILLTILANNI . . .
.
Diluent 2pg HS38
2 0 . 5 . 193 . . . $ BHS3B
wisi
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( Figure 62 )
PANC - 1 Conditioned Media USING Conditioned Media 4838 HMS38 Vehicle AM38 Vehicle
??????? ? Relativa in vadad Cells ( 4 ) Ili Relative lavaded Cells ( % ) II . Landelen Son -
-
Vehicle HGB HREFS38 Protein : 10 2M Vešticle HS3B HR - 538
( Figure 63 ]
DMEM HMS3B
30000
o becco wooowwe 20000 Diameter ( pixels ) % of Diameter ( % ) $ 0 $ tion w w
10000 wageni ni watu wasio
O gewer nline Vehicle HS3B MacsS3B Vehicla HS3B HMS3B
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 92 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Hgure 4
CSS 22
. .
…
…
3
… … … … com . autore .
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s gegeggs … … … … … ? …
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Vehicle ?38 ; & RS3 yrheir S38 3 x8538 egggggggggggg } 43 . .
??? . .
Length of Sprouts . . . . . . . .
S3A A? Mommunion - … …
| ??ice 38 ??S3 Vehicle HS3B HM189S3B
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( Figure 65 )
Vehicle
ago No . 114 No 130 | No : 133 HS3B
No 118 WAWALA HM05S3B
Versicle 087MG + DMEM HS3B : U67NG + DMEMNON - CP - SOCS3 6 ug ) HMC530 : U87MC + DMEWICP SOCS3 ( 6 pat
( Figure 66 )
Hep3B , Day 42 vehicle RSS HR 4 , 538 SOCS3 - Hop3B . 2 - 11 - 01
avertail VEGF mapemain lain dalam haniminimiminiminimiminiminiminin wwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwww i min e minimipigia mambo ( WW ) aun?on Jouni
V ( 30 mgikg ) # Velicke = 6 ) mon HS38 ( 126 ) - HMS3B ( n = 51
7644 erwartenariat P - ERK
S
? 2000 worden de l ' imprimiminimin
Start } } : br snake
O * * * * casino gaminamas namasis namasiningen B - actin 0 5 35 40 10 15 20 25 30 Treatment ( day )
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 94 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 671
HepG2 Day 42
Vehicle HS3B HM19538 SOCS3 - HepG2 - T1 - 01 wysingsminio SES KIMONOR MAM A D MDL K meminimajo Mama ini memanjatininiais
VEGF y
" : " " ' . ' . ' . ' . ' . . MYNTTTTT 11LLLL
W ( 30 mg / kg ) Velicten HS3B B ) MMS38 ( n = 8 ) PERK URE ) SUMOK BUIL r ar to attend to be contactati la
. 888 montant within this man passing
?K 1 mmmmmmmmmmmmmmmmmm HIF - * - *
Start * 50 . 05 T : Tumor miplaniston
Bhiwani wanatoa supaya meningsuren Q 5 10 20 25 30 35 40 45
Treatment days B - actin . : : : : : : : : : : : :
( Figure 68 )
PANO1 Day $ 2
Vehicle HS38 HPSES3B SOCS - PANC1 - TI - 01 wwwwwwwww
VEGE wowowo Final Istus ) auron JOU
V ( 30 mg kg inne the Vehicle ( n = 1
* KS3B ( n = 6 ) HMS $ 33553 PERK
. . . . . . . . . . . . . . . . . frit mipanasamnici owote Stop Wwwwwwwwww ERK Start o poos i Biplantation
: te Angiopoeting 1 D e 35 40 10 15 20 25 30
Treatmt { d } B - actin
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 95 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 691
087MG Day 42 Vehicle HS3B HMS3B
SOC83 - 087MG - 11 - 02 7 - - , , »
meminta www . moto rstoelen weiteren www 99A
: . Litominen www wiwit * *
hewwwwwwwww
V 149 mpkg Vehicle ( s ) H838 ( = 6 )
* HM S3B ( n = 6 ) 76 %
* *
D - ERK { FLAUT SUDA BOLU for more Stop
* * * *
minimninin sinni www inimesinin * * * *
ERK wwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwy wwwyway 10 . 05
: Tumar lisplantation Angiopoietin 11 35 40 45 ananananananananananana
www * * * * p 0 5 10 15 20 30
Trsahaanit [ day ? hereinananana n ananana
B - actin
( Figure 70 )
AGH LAPST
w
Kinrarairy www . t
Peptide w27 STYLE Peptide v28 TYD
OL VOLTK
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
???? ???V ' ' ' ' ' ????????
potentiai cete me
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 Sheet 96 of 105 US 2018 / 0051060 A1
( Figure 71 )
Cargo Basic CAP Primors ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
Amino add Nucleotide 5 primers Sequence Sequence TATGGCCGCA GGAATTCCATATGTATGGCCGC
YORKERROR AAAAACGCC AAAAAACGCCGCCAGCGCCGC 6CCAGCGCO CGCOTCACCCACAGCAAOITTC
SEQIO NO : 5323 CCCCCCCC ( SEQ IO NO : 836 ) ( SEQID NO : 833 )
RA
SOCS3 @ GOTICOTATOY AGGGTTTCCGAA CGCGTCGACTTAA Polyn RRRRRRRRR GTCGTCGTCG CGTCCICCTCGTCCTCGTGTCA
CCCACAGCAA GTTTCCCGcco SEQIO NO : 534 TCGTCGT cc { SEQO NO : 837 ) ( SEQ ID NO
( SEQD NO : 833 ) 8383 wereweweweweeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee
( Figure 72a )
D Mis - ta Wamto © TAY Pok SOCS3 sos Full Name Abbreviation
MiG - S0053 - SDR
Mis - 3827 . 80053 - 808 HRU : 338
Mis - FAY - SOCS3SDH H7538
MisEYR SOCS2 - 308 HRS3B
( Figure 726 )
HS3B HM6538 HTS3B
Yield ( mg / t ) Solubility . ? ? ? ? ?
?? ???? ??? ???? ????? ?? ???? Snowwwwww wi pu
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Patent Application Publication Feb . 22 , 2018 _ Sheet 97 of 105 _ US 2018 / 0051060 Al
{ Fire 73a
Hydrophobic CPP HM $ 38
????? , Fc - 4
1 . F }? - SBE * * ? *
* * * *
*
* Counts * * * *
*
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*
* * * * * * * * * * 1 gta si & *
*
Furt???ce
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Cationic CPPS HTSB
* * * *
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ELLELFLE . .
Feb . 22 , 2018 Sheet 98 of 105 US 2018 / 0051060 A1
wwwwwwwwwwwwwwwww
Monomoreservernardeneserversarancorrecoverserverserversonias
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( Figure 75a )
US 2018 / 0051060 A1 Feb . 22 , 2018 Sheet 99 of 105 Patent Application Publication