The Effects of Elevated Outcome of H1N1 Influenza A Virus ...

The Effects of Elevated Testosterone on the Outcome of 

ma2009 H1N1 Influenza A Virus infection in Old Male Mice 

by 

Ornob Alam 

A thesis submitted to Johns Hopkins University in conformity with the 

requirements for the degree of Master of Science 

Baltimore, Maryland 

April, 2015 

ii

ABSTRACT 

  Testosterone (T) has anti‐inflammatory properties, and has been shown to play a 

role in the pathogenesis of infectious and autoimmune diseases. Disease pathology from 

influenza A virus  (IAV)  infection  is caused by an excessive pro‐inflammatory  response, 

and severe disease  is especially common among elderly men, who have  lower T  levels. 

We tested the hypothesis that T will protect against IAV pathogenesis in young adult (8‐

10 weeks) and old (17‐18 months) male mice. To study the effects of T  in young adult 

male mice, the mice were gonadectomized, treated with T or placebo capsules, infected 

with a sub‐lethal dose of H1N1, and monitored for morbidity and mortality. In old male 

mice,  serum T  is naturally  low,  therefore  gonadectomies are not  required before  the 

subsequent  steps.  In  addition,  we  attempted  to  elevate  testosterone  levels 

endogenously  in  old  male  mice  through  steroidogenic  drugs  called  TSPO  ligands. 

However,  two  different  drugs  tested  did  not  significantly  raise  serum  testosterone 

levels.  T‐treated  young  adult males  experienced  lower morbidity,  and  had  lower  IgG 

antibody titers compared to placebo‐treated young adult males. In old males, while the 

same dose of T was not protective against morbidity from IAV infection, treatment with 

a  higher  dose  of  T  resulted  in  improved  recovery  from  influenza  disease.  Protection 

from morbidity  by  testosterone  treatment  is  not  reflected  in  the  expression  of  Ki67, 

which is a marker for proliferation, in the lungs at 21 days after infection. This suggests 

that either the improved recovery from disease is not associated with improved repair, 

or day 21, which  is after peak disease and viral  clearance,  is  too  late a  time point  to 

iii

detect any difference. We hypothesize that old males require a higher dose of T in order 

to mitigate the chronic pro‐inflammatory state brought about by aging. 

iv

ACKNOWLEDGEMENTS 

I  am  delighted  to  take  this  opportunity  to  thank my  thesis  advisor, Dr.  Sabra 

Klein, for all the support and guidance during my time in her laboratory. I would like to 

thank Landon vom Steeg and Olivia Hall for their great patience  in teaching me almost 

everything  I  know  about working with mice,  data  analysis,  and many  other  things.  I 

would  like  to  thank Dr.  Jackye Peretz  for her help and advice with various  techniques 

and questions. I am grateful to all the members of the Klein and Pekosz laboratories for 

their great  input on my presentations and  research, and  for helping  to create a work 

environment that I have really enjoyed. I would  like to thank my secondary reader, Dr. 

Barry  Zirkin,  for  all  the  discussions  and  help  regarding my  research  and writing,  and 

members of his group, Dr. Haolin Chen,  Janet Folmer, and  June Liu  for  the numerous 

occasions  on  which  they  have  helped  me  plan  out  my  research,  and  learn  new 

techniques.  Lastly,  I would  like  to  thank my  father, mother,  sister,  and  friends  for all 

their love and support throughout my life.  

v

TABLE OF CONTENTS 

Title  Pg.

Introduction  1‐11 

Influenza Pathogenesis   1 

Aging, the Immune System, and the Outcome of Infectious Diseases   3 

Testosterone, the Immune System and Aging   6 

Models for Studying the Effects of Testosterone in Old Male Mice   9 

Methods   

12‐16 

Animals  12 

Virus Infection and Quantification  12 

TSPO Ligand Administration  13 

Testosterone Administration  13 

Sample Collection  14 

Immunohistochemistry and Staining  14 

Anti‐influenza total IgG ELISA  15 

Statistical Analyses  16 

Results   

17‐25 

Administration of testosterone results in reduced morbidity and antibody titers in young male mice following infection with influenza A virus  

17 

Administration of the TSPO Ligands Ro5‐4864 and PK11195 does not increase testosterone concentrations in old male mice  

17 

Administration of low dose testosterone does not alter the outcome of infection with ma2009 H1N1 in old male mice  

18 

vi

Administration of high dose testosterone improves the outcome of infection with ma2009 H1N1 in old male mice  

19 

Protection from influenza pathogenesis is not associated with increased proliferation in the lungs at 21 days post infection  

20 

Discussion  

29‐36 

Conclusions  29 

Future Directions  33 

Public Health Significance   35 

Bibliography  

37‐43 

Curriculum Vita  44‐46 

vii

LIST OF FIGURES 

Results  

Figure 1: Effects of testosterone (T) on the outcome of ma2009 H1N1 influenza infection in young male mice (2 mo) 

21 

Figure 2: Effects of Ro5‐4864 and PK11195 on body mass, and serum and testicular testosterone (T)  in old male mice 

22 

Figure 3: Effects of  low dose testosterone (low T) on the outcome of ma2009 H1N1 influenza infection in old male mice (17 mo)

24 

Figure 4: Effects of high dose testosterone (high T) on the outcome of ma2009 H1N1 influenza infection in old male mice (17 mo)

26 

Figure 5: Effects of testosterone treatment on Ki67 expression 21 days post infection with ma2009 H1N1 influenza in young and old male mice 

27 

1

INTRODUCTION 

Influenza Pathogenesis 

Influenza viruses are an enveloped viruses of the Orthomyxoviridae family with a 

segmented, (‐) ssRNA genome (Baigent & McCauley, 2003). Influenza A, B, and C are the 

three types of Orthomyxoviridae currently known to infect humans, with influenza A and 

B being the most associated with severe disease (Baigent & McCauley, 2003). Influenza 

disease is characterized by varying severity of febrile and respiratory symptoms (Lagace‐

Wiens et al., 2010). While illness from seasonal strains generally lasts one to two weeks, 

influenza can also result in hospitalizations and death. The virus is transmitted through 

respiratory  droplets  and  primarily  infects  epithelial  cells  of  the  respiratory  tract.  The 

disease  is considered a worldwide public health problem because of  the ability of  the 

virus  to change every year,  its  rapid  transmission between humans, and  the  resulting 

pandemic potential (Lagace‐Wiens et al., 2010). 

RNA  genomes  are  especially  susceptible  to mutations  due  to  the  absence  of 

proofreading mechanisms during replication, as opposed to the proofreading and repair 

mechanisms  found  in  DNA  viruses  (Lauring  et  al.,  2013).  This  allows  RNA  viruses  to 

evade  immune systems and anti‐viral drugs by  increasing  the  likelihood of a mutation 

that  confers  resistance.  Single  nucleotide mutations  that  enable  influenza  viruses  to 

escape  host  immunity  are  referred  to  as  antigenic  drift  (Bouvier &  Palese,  2008).  In 

addition,  the  segmented  nature  of  the  influenza  virus  genome  allows  reassortment 

between different  strains of each viral  species  (Bouvier & Palese, 2008). For  instance, 

2

two  influenza  A  strains,  after  coinfecting  a  host  cell,  can  exchange  segments;  the 

resulting recombinant strain can have altered replication rates, thereby contributing to 

altered virulence (Pappas et al., 2008). This is known as antigenic shift. Influenza viruses 

infect  birds,  pigs,  and  other  animals  alongside  humans,  and  therefore  segments 

previously not seen in humans can arise through reassortment and human contact with 

animals, and have unpredictable effects (Bouvier & Palese, 2008).  

These mechanisms  for  genetic  variation make  influenza  seasonal  outbreaks  a 

logistical  challenge  as  new  vaccines  need  to  be  developed  every  year  (Kidd,  2014). 

Despite these efforts, seasonal influenza strains are still a significant cause of morbidity 

as well as mortality,  having been associated with an average of 23,640 deaths per year 

in  the  US  between  1976  and  2007  (CDC,  2010).  There  have  also  historically  been 

multiple pandemics of  influenza as a  result of new strains of  the virus  that arose  that 

were easily transmissible, and that the human population had no preexisting  immunity 

to. The 1918 influenza pandemic killed an estimated 50 million people around the world 

(Taubenberger et al., 2012). 

Populations  that  experience  the  greatest  disease  severity  are  children,  the 

elderly,  pregnant  women,  and  obese  individuals  which  are  all,  to  some  degree, 

immunocompromised populations  (Mauskopf et al., 2013).   Sex differences  in disease 

outcome  have  also  been  observed.  Women  of  reproductive  age  (16‐49)  are  more 

susceptible to severe disease from influenza infection, whereas among older individuals 

(65+) men experience more severe disease (Klein, 2012). Influenza disease pathology is 

primarily  caused  by  a  dysregulated  inflammatory  response  (Damjanovic  et  al.,  2012). 

3

These differences in disease pathology are therefore thought to be a result of different 

inflammatory  environments  possibly mediated  by  hormonal  differences  between  the 

groups of individuals as well as across the life course (Klein, 2012). 

Aging, the Immune System, and the Outcome of Infectious Diseases 

Immunosenescence  refers  to  the progressive  functional decline of  the  immune 

system with age  (Castelo‐Branco & Soveral, 2014).  It  is also associated with a chronic 

low‐grade pro‐inflammatory state, which is thought to be a result of increased oxidative 

stress in aging cells and elevated levels of certain pro‐inflammatory cytokines (Cannizzo 

et al., 2011). Both the innate and adaptive arms of the immune system are affected.  

Within  the  innate  immune  system,  a  few  noteworthy  changes  are:  1) 

plasmacytoid DCs  (pDCs) undergo a decrease  in  the number of  IFN‐α producing  cells, 

even though total numbers remain similar to younger age groups (Jing et al., 2009); 2) 

monocyte‐derived  DCs  from  aged  subjects  have  increased  reactivity  to  self‐antigens 

such  as  DNA,  which  is  thought  to  contribute  to  chronic  inflammation  during  aging 

(Agrawal  et  al.,  2009);  3) monocytes  undergo  changes  in  the  numbers  of  different 

subpopulations, and also show a cumulative decline  in the secretion of  IL‐6 and TNF‐α 

(Nyugen  et  al.  2010);  and  4)  neutrophils  exhibit  reduced  phagocytic  ability  and 

decreased bacteriocidal activity in the elderly (Wenisch et al., 2000). 

Data on  the  adaptive  immune  system  from  animal models  as well  as humans 

show that aging is associated with reduced clonal diversity of naïve CD4+ T cells (Naylor 

4

et  al.,  2005),  increased  frequency  of  central memory,  reduced  frequency  of  effector 

memory  CD4+  T  cells  (Kang  et  al.,  2004),  reduced    clonal  diversity  of  CD8+  T  cells 

(Messaoudi  et  al.,  2004),  and  increased  frequency  of  effector memory  and  effector 

CD8+ cells  (Hong et al., 2004). Decrease  in  IL‐2 production during aging contributes to 

decreased  proliferation  of  all  thymic‐derived  T  cells  (Effros  &  Walford,  1983).  The 

decreased  ability  to  proliferate  and  preserve  T  cell  receptor  (TCR)  diversity  likely 

contributes to the reduced  immune‐surveillance that results  in  increased susceptibility 

to  infectious  diseases  among  aged  individuals.  CD4+  and  CD8+  T  cells  from  aged 

individuals  generally  do  not  express  the  co‐stimulatory  molecule  CD28,  and  this  is 

thought to confer the cells with resistance to apoptosis (Vallejo et al., 2000). Loss of IL‐2 

also  results  in  increased  IFN‐γ  production  from  CD28null  cells,  which  potentially 

contributes  to  chronic  inflammation  during  aging  (Kared  et  al.,  2014).  Loss  of  IL‐2  in 

conjunction with an increase in IL‐1β results in an increase in the number of T helper 17 

cells  (Th17)  cells  (Lim  et  al.,  2014).  This  results  in  an  increase  in  the  basal 

Th17/Regulatory T (Treg) cell ratio (Schmitt et al., 2013), even though the basal levels of 

Treg cells do not vary significantly with age (Hwang et al., 2009). Dysregulation of Th17 

responses possibly favors inflammation and contributes to age‐associated autoimmune 

diseases.  In  contrast,  the  Th17/Treg  cell  ratio  decreases  with  age  after  stimulation, 

suggesting an increase in the production of suppressive cells after infection (Schmitt et 

al.,  2013).  Increased  activity  of  Treg  cells  could  prevent  rejection  of  tumor  cells  and 

contribute to cancer (Fessler et al., 2013). 

5

Aging  is also associated with changes  in B cell function. Elderly  individuals have 

been shown to have decreased clonal diversity of B cells compared to young individuals 

(Gibson  et  al.,  2009).  In  a  study  conducted  with  an  inactivated  seasonal  influenza 

vaccine, antigen‐specific plasmablasts, as well as the number of antibodies produced by 

each  cell, were  shown  to  be  reduced  in  elderly  individuals  (70‐  to  100‐  years  old)  in 

response  to  vaccination  as  compared  to  younger  individuals  (18‐  to  30‐  years  old) 

(Sasaki  et  al.,  2011).  However,  antibodies  induced  by  the  vaccine  in  the  elderly 

individuals were shown to react with greater avidity and affinity to the 2009 pandemic 

H1N1 virus than those in the young individuals. In a study conducted with an activated 

split 2009 pandemic H1N1 vaccine, antibody  levels and avidity were both shown to be 

higher  in elderly  individuals (66‐ to 83‐ years old) than  in young  individuals (18‐ to 65‐ 

years old), possibly as a result of preexisting immunity to a related H1N1 strain in elderly 

populations  (Khurana  et  al.,  2012).    Receipt  of  seasonal  influenza  vaccine  by 

intramuscular  injection  results  in  significantly  higher  antibody  titers  in  elderly  (>65 

years‐old)  females  than  in elderly males  (Engler et al., 2008).  In addition, elderly  (>65 

years‐old) males have a higher  incidence of severe disease from  influenza after having 

received  the  seasonal  influenza  vaccine  (Wang  et  al.,  2002).  Therefore,  while  there 

appears  to be evidence  for  the general decline of B cell  function with age, some data 

also  suggest  that  the qualitative antibody  response  is  improved  in elderly  individuals, 

and the functional changes vary by gender. 

A mouse study on the  lungs during aging showed that pulmonary macrophages 

exist in a highly activated state in older mice (18 months) compared to younger mice (3 

6

months)  (Canan et al., 2014). The older mice were also shown  to have elevated basal 

levels  of  the  pro‐inflammatory  cytokines  IFN‐γ,  TNF‐α,  and  IL‐12  in  the  lungs.  This 

possibly  contributes  to  the  chronic  inflammatory  state  associated  with  aging.  In 

response to Mycobacterium tuberculosis infection, pulmonary macrophages in the older 

mice exhibited greater uptake of bacteria, but  lower activation by  IFN‐γ  (Canan et al., 

2014).  Another  study  showed  that  older  mice  (16‐18  months  old)  showed  greater 

morbidity  from a sub‐lethal dose of  influenza A virus  than younger mice  (2‐3 months) 

(Yin  et  al.,  2014).  The  study  showed  that  this was  at  least  partially  caused  by more 

damage to alveolar Type I and Type II cells, and delayed epithelial repair. This supports 

the existence of a chronic pro‐inflammatory environment in the lungs in aged mice. 

Aging is therefore characterized by a weakened response to infections as a result 

of a decline in function in the innate and adaptive arms of the immune system, as well 

as a chronic  low‐grade pro‐inflammatory state possibly brought about by changes in the 

Th17/Treg  balance,  and  increased basal  levels of  various pro‐inflammatory  cytokines. 

Testosterone, the Immune System, and Aging 

Testosterone  is  a  steroid  hormone  that  has  been  shown  to  have  anti‐

inflammatory  properties.  It  has  been  shown  to  be  protective  in  a mouse model  of 

rheumatoid arthritis, which  is an autoimmune disease, through the downregulation of 

autoantibodies (Keith et al., 2013). Testosterone also decreased IFN‐γ  production from 

natural killer T (NKT) cells in a mouse model of amebic liver abscess, which is caused by 

7

infection  with  Entamoeba  histolytica  (Lotter  et  al.,  2013).  In  a  study  of  influenza, 

gonadectomized male mice showed reduced survival when  infected with a  lethal dose 

of  the virus, without  showing any change  in viral  titers  relative  to  infected gonadally‐

intact mice,  suggesting  that  testosterone has  a protective effect on disease outcome 

through modulating the immune response against the virus (Robinson et al., 2011). High 

testosterone  in men  is  associated with  lower antibody  titers  in  response  to  influenza 

vaccination (Furman et al., 2014). 

Testosterone can act directly on androgen receptors present  in CD4+ T cells to 

increase the production of the anti‐inflammatory cytokine IL‐10 (Liva et al., 2001). It also 

suppresses  the generation of  reactive oxygen  species and  IL‐8  in human granulocytes 

and monocytes (Boje et al., 2012). Reactive oxygen species are involved in the induction 

of an inflammatory response, and IL‐8 is a chemokine that directs neutrophils and other 

granulocytes to the site of damage or infection. 

  Preliminary research from our lab has shown that testosterone has a protective 

effect  on  the  disease  pathology  caused  by  Influenza  A  virus  infection  in male mice. 

Administration of exogenous testosterone to gonadectomized young male mice resulted 

in  less weight  loss, which  is a measure of disease pathology,  in  response  to  influenza 

infection compared to gonadectomized mice treated with placebo only. Clinical scoring 

of observable symptoms of disease also showed a protective effect of testosterone on 

observable morbidity  from  influenza  infection.  Influenza  disease  is mainly  caused  by 

immune‐mediated pathology  in response to the virus (Damjanovic et al., 2012), so the 

8

anti‐inflammatory  properties  of  testosterone  are  thought  to  be  responsible  for  its 

protective effects against influenza disease pathology. 

  Testosterone  in males decreases with age  in both humans (Maggio et al., 2005) 

and  rodents  (Coquelin  &  Desjardins,  1982).  Old  male  mice  infected  with  influenza 

exhibit lower survival rates than young male mice, which we hypothesize to suggest that 

testosterone may have a protective effect against influenza disease in young mice. Low 

testosterone  in old males may  lead to  immune dysregulation as a result of the  loss of 

the  anti‐inflammatory  effects  of  testosterone  seen  in  younger males.  The  hormone 

leptin also may play a role in the increased inflammation seen in old males. It is required 

for  the  proliferation  of  activated  CD+  T  cells,  which  are  important  mediators  of 

inflammation  upon  infection  (Saucillo  et  al.,  2014).  Leptin  has  been  shown  to  be 

elevated  in populations with  low testosterone such as women, older men,  (Furman et 

al., 2014),  and men  treated with  cetrorelix, which  reversibly  reduced  testosterone  to 

castrate levels (Büchter et al., 1999).  

We hypothesize that the chronic pro‐inflammatory state associated with aging in 

men  is  therefore possibly partially  linked  to  a decrease  in  testosterone  levels.  This  is 

supported by data showing the interaction of testosterone with the immune system and 

the outcome of  infectious diseases  (Liva et al., 2001; Keith et al., 2013).  For diseases 

such  as  influenza,  that  are  primarily  caused  a  dysregulated  inflammatory  response 

(Damjanovic  et  al.,  2012),  decreased  testosterone may  result  in more  severe  disease 

9

pathology  in  the  elderly,  despite  the  general  decline  of  immune  function  with  age 

(Castelo‐Branco & Soveral, 2014). 

Models for Studying the Effects of Testosterone in Old Male Mice 

  The mouse model that we use for studying the effects of testosterone requires 

the  subcutaneous  implantation  of  silastic  capsules  containing  crystalline  testosterone 

propionate (TP) between the scapulae of the mice, which results in the slow release of 

testosterone  into  the  bloodstream  (Hetzler  et  al.,  2008).  The  length  of  the  capsule 

determines the rate of release of testosterone. Previous research in our lab has utilized 

this model to show the protective effects of testosterone against influenza disease from 

infection with maPR8  influenza  in castrated young male mice  (introduce  in results).  In 

old  male  mice,  studies  have  been  conducted  using  exogenous  administration  of 

testosterone in non‐castrated mice to observe the effects of testosterone on androgen 

receptor expression, anti‐anxiety behavior, and cognitive performance (Hill et al., 2004; 

Frye et al., 2008). This  is made possible because old male mice have  low endogenous 

testosterone  levels  (Coquelin  &  Desjardins,  1982).  Implanting  testosterone  capsules 

without castrating the mice could also more accurately model the effects of exogenous 

testosterone administration in older, hypogonadal men. An alternative way of studying 

the  effects  of  testosterone  involves  the  use  of  TSPO  (Translocator  Protein)  ligands, 

which activate the steroidogenic pathway to upregulate endogenous testosterone. 

10

Steroidogenesis  is  the process by which cholesterol  is converted  to biologically 

active steroid hormones (Stocco & Clark, 1996). The primary sites of steroidogenesis are 

testicular  Leydig  cells  in  males,  and  ovarian  granulosa  and  theca  cells  in  females. 

Testosterone  synthesis  in  Leydig  cells  begins,  like  in  all  steroidogenic  cells, with  the 

import  of  cholesterol  from  the  outer mitochondrial membrane  (OMM)  to  the  inner 

mitochondrial membrane  (IMM)  (Zirkin & Chen, 2000). This  is mediated by  the OMM 

proteins Steroidogenic Acute Regulatory Protein (StAR) and Translocator Protein (TSPO), 

and  is  the  rate‐limiting  step  for  steroidogenesis.  Cholesterol  is  metabolized  by  the 

enzyme  P450  side‐chain  cleavage  enzyme  (CYP11A1)  to  pregnenolone  in  the 

mitochondria  (Zirkin  &  Chen,  2000).  Pregnenolone  is  converted  to  progesterone  by 

mitochondrial or microsomal 3β‐hydroxysteroid dehydrogenases (HSD3B). Progesterone 

in  smooth  endoplasmic  reticulum  is  converted  to  androstenedione  by  17α‐

hydroxylase/C17–20‐lyase  (CYP17A1).  Androstenedione  is  metabolized  by  HSD3B  to 

testosterone  (Zirkin  &  Chen,  2000).  Less  direct  routes with  additional  intermediates 

exist for testosterone synthesis in Leydig cells. 

TSPO,  previously  known  as  the  peripheral  benzodiazepine  receptor  (PBR),  is 

found on the OMM of mitochondria in steroidogenic tissue, organs such as lungs, liver, 

and kidneys, and  in  the  central nervous  system  (Austin et al., 2013).  In  steroidogenic 

tissue,  TSPO  releases  cholesterol  into  the  IMM. While  the  exact mechanism  is  not 

completely understood,  ligand‐induced stabilization of TSPO  is thought to result  in the 

release  of  cholesterol  (Scarf &  Kassiou,  2011).  Exogenous  administration  of  synthetic 

ligands  (FGIN‐1‐27  and Ro5‐4864)  that bind  to  TSPO have been  shown  to upregulate 

11

testosterone synthesis  in primary Leydig cells  isolated from Brown Norway rats (Chung 

et  al.,  2013).  FGIN‐1‐27  was  also  shown  to  increase  circulating  testosterone 

concentrations when administered to both young and old Brown Norway rats. This has 

important  clinical  implications  for  hypogonadal men because direct  administration of 

testosterone  can  result  in  infertility  in  men  (Crosnoe  et  al.,  2013).  Testosterone 

negatively  regulates  itself  by  acting  on  LH‐producing  gonatroph  cells  in  the  anterior 

pituitary gland. High levels of testosterone in the serum from exogenous administration 

shuts  down  LH  synthesis  in  the  gonatroph  cells.  Without  stimulation  from  LH, 

testosterone  synthesis  stops  in  Leydig  cells  in  the  testes,  and  this  can  result  in  the 

production  of  non‐viable  sperm  cells  (Crosnoe  et  al.,  2013).  TSPO  ligands  therefore 

constitute a promising potential therapy for hypogonadism, as the testosterone is then 

produced endogenously by the Leydig cells. Alongside its effects on testosterone, TSPO 

ligands have been shown to have anti‐inflammatory effects in non‐reproductive tissues 

(Zhao et al., 2011). If TSPO ligands significantly increase testosterone production in the 

testes of old male mice,  it could possibly serve as an effective model  for studying  the 

effects of  testosterone on  the  immune  response  to  influenza, while also  studying  the 

therapeutic potential of TSPO ligands. 

Using either exogenous or endogenous models for elevating testosterone in old 

male mice, we sought to test the hypothesis that elevation of circulating testosterone 

concentrations  in  old,  hypogonadal  males  may  reduce  the  detrimental  effects  of 

influenza  infection by decreasing pulmonary pathology, and promoting  survival of old 

male mice following infection.  

12

METHODS 

Animals 

Young  (8‐10 weeks of age) and old  (17‐18 months of age) male C57BL/6 mice 

were  obtained  from Charles River  and  the NIA  respectively,  and  housed  up  to  5  per 

microisolator  cage  under  standard  BSL‐2  housing  condition with  food  and water  ad 

libitum. Young male mice were surgically gonadectomized. All animal procedures were 

approved  by  the  Johns  Hopkins  University  Animal  Care  and  Use  Committee  (ACUC) 

under  animal  protocol  M012H270  and  performed  in  compliance  with  the  National 

Research  Council’s  guide  to  Care  and  Use  of  Laboratory  Animals.  Experiments were 

conducted as a series of replicates and animal numbers varied and are provided  in the 

legends. 

Virus Infection and Quantification 

Mouse‐adapted  influenza A  virus, A/California/4/09/H1N1  (ma2009;H1N1) was 

generated, and kindly provided by Dr. Daniel Perez at University of Maryland, College 

Park  (Ye  et  al.,  2010).  Mice  were  anesthetized  by  intramuscular  injection  of 

ketamine/xylazine  cocktail,  then  intranasally  inoculated  with  30l  of  Dulbecco’s 

Modified  Eagle Media  (DMEM)  for  the mock‐infection,  or ma2009  diluted  in  DMEM 

(TCID50=2)  (Lorenzo  et  al.,  2011).  For  virus  quantification,  log10  dilutions  of  lung 

homogenates were  plated  onto  a monolayer  of Madin‐Darby  Canine  Kidney  (MDCK) 

13

cells in replicates of 6 for five days. Cells were stained with naphthol blue black (Sigma 

Aldrich) and scored for cytopathic effects (CPE). The 50% tissue culture  infectious dose 

(TCID50) was calculated according to the Reed‐Muench method (Reed & Muench, 1938), 

and was used to back titer all inoculums. 

TSPO Ligand Administration 

Mice  were  intraperitoneally  injected  daily,  with  one  of  two  compounds:  PK 

11195:  1‐(2‐chloro‐phenyl)‐N‐methyl‐N‐(l‐methylpropyl)‐1‐isoquinoline  carboxamide 

(Sigma),  or  Ro5‐4864:  7‐chloro‐5‐(4‐chlorophenyl)‐1,3‐dihydro‐1‐methyl‐2H‐1,4‐

benzodiazepin‐2‐one (Sigma). Each experimental group was injected with either 3 mg/kg 

or  0.3 mg/kg  of  either  PK  11195  or  Ro5‐4864    dissolved  in  10%  dimethylsulphoxide 

(DMSO) and 90% PBS with Ca+ and Mg+. The control group was injected with the vehicle 

solution alone. 

Testosterone Administration 

Testosterone  (T)  was  administered  by  subcutaneously  implanting  a  silastic 

capsule (0.040  inch  inner diameter  id, 0.085  inch outer diameter, 12.5 mm and 20 mm 

length for 7.5 mm T capsules and 15 mm T capsules respectively) between the scapulae, 

containing  100%  crystalline  testosterone  propionate  (Sigma)  as  previously  described 

(Hetzler et al., 2008). The  capsules were enclosed by 2.5 mm of medical adhesive on 

both ends, and equilibrated  in sterile physiological saline. The 7.5 mm T capsules have 

been shown to produce serum testosterone levels approximating the higher end of the 

14

physiological range  in young male C57BL/6 mice for at  least 28 days post  implantation 

(unpublished  data).  Animals  in  the  untreated  group were  similarly  anesthetized  and 

received implants of blank capsules.  

Sample Collection 

Body mass was  recorded daily  for 14 days  in  the  ligand pilot  study,  and body 

mass, and body  temperature were recorded daily  for 21 days and clinical scores were 

recorded at various time points  in the  influenza morbidity studies. Clinical scores were 

adapted  from  the  SHIRPA  primary  screen,  and morbidity  from  influenza  in  the mice 

were assigned a total of scores of 0 or 1 for hyperapnea, piloerection, hunched, and  no 

escape, and 5 for death. In the ligand pilot study, serum was collected on days 3 and 7, 

and  stored at  ‐80C until  they were  thawed  for  serum  testosterone measurement by 

radioimmunoassay  as previously described.  The mice were  euthanized on day  7,  and 

seminal  vesicles  and  testes  were  collected  to  weigh,  and  to  weigh  and  measure 

testicular  testosterone,  respectively.  In  the  morbidity  studies,  mock  and  influenza‐

infected males were  euthanized  at  one  of  several  days  post‐infection  (dpi),  at which 

time,  serum was  collected  to measure  antibody  titers,  and whole  lungs were  either 

snap‐frozen and stored at ‐80C to measure viral titers, or inflated with Z‐fix to observe 

inflammation by immunohistochemistry as described below.  

Immunohistochemistry and Staining 

Lungs were inflated, fixed in Z‐fix, embedded in paraffin, cut into 5 μm sections, 

15

and mounted on glass slides. Slides were deparafinized with xylene and rehydrated  in 

graded ethanol. Heat‐induced antigen  retrieval with citrate buffer was performed and 

slides were blocked with 10% normal goat serum prior to overnight incubation with the 

primary  antibody  in  a  humidified  chamber.  The  slides  were  then  treated  with  3% 

hydrogen peroxide  to block endogenous peroxidase activity. Detection of  the primary 

antibody  signal  was  done  using  the  EXPOSE  rabbit  specific  HRP/DAB  detection  kit 

(abcam). Primary antibodies  included:  rabbit anti‐Ki67  (Abcam), anti‐IAV NA antibody. 

Images were taken using a Nikon Eclipse E800 and analyzed using ImageJ (NIH).  

Anti‐influenza total IgG ELISA 

ELISA plates (96 well, company here) were coated overnight at 4°C with 100 ng 

of  purified ma2009 H1N1,  after which  plates were washed  and  blocked  for  1  h with 

blocking  solution  (10%  dry  skim milk  powder  in  PBS).  Plates were washed,  duplicate 

diluted serum samples were added in a 2‐fold series starting at 1:1000, and plates were 

incubated  at  37°C  for  1  h.  Anti‐mouse  IgG  secondary  antibody  (1:5000;  Peroxidase 

AffiniPure Goat Anti‐mouse IgG; Jackson Immunoresearch Laboratories) was added and 

plates  were  incubated  for  1  h  at  37°C.  Reactions  were  developed  with  3,3’,5,5’ 

tetramethylbenzidine  (TMB)  and  stopped  using  1N HCL.  Plates were  read  at  450  nm 

absorbance  on  a  plate  reader.  To  determine  the  antibody  titer,  a  cutoff  value  was 

determined  by multiplying  the  average  ELISA  values  of  serum  from  naïve  animals  at 

each dilution by 3. The sample ELISA titer was the highest serum dilution of that sample 

series  with  a  value  above  the  cutoff.  A  sample  was  considered  positive  only  if  the 

16

average OD was 3 times higher than the corresponding dilution value of naïve serum. 

Statistical Analyses 

Morbidity data were analyzed with a multivariate analysis of variance (MANOVA) 

with one within‐subjects variable (days) and one between‐subjects variable (treatment) 

and  significant  interactions were  further  analyzed  using planned  comparisons.  Serum 

proteins, organ weights, virus titers, and IHC data were analyzed using one‐way ANOVA 

or  t  tests,  significant  interactions were  further  analyzed  using  the  Tukey method  for 

pairwise  multiple  comparisons.  Mean  differences  were  considered  statistically 

significant if p<0.05.  

17

RESULTS 

Administration of testosterone results in reduced morbidity and antibody 

titers in young male mice following infection with influenza A virus 

Young male  C57BL/6 mice were  gonadectomized  and  implanted with  placebo 

capsules  or  7.5  mm  testosterone  propionate  capsules,  which  elevate  serum 

testosterone to the upper limit of the physiological range observed in intact young male 

mice (Fig. 1A). Following  infection with   ma2009 H1N1  influenza A virus, testosterone‐

treated mice showed reduced percentage  loss of body mass (Fig. 1B), and had a  lower 

clinical  disease  score  of  observable  symptoms  (Fig.  1C)  compared  to  placebo‐treated 

mice. Antibody titers in serum samples collected at day 21 post infection were lower for 

the  testosterone‐treated mice compared  to  the placebo‐treated mice  (Fig. 1D). These 

data suggest that treatment with testosterone affects the outcome of influenza, at least 

in young male mice. 

Administration  of  the  TSPO  Ligands  Ro5‐4864  and  PK11195  does  not 

increase testosterone concentrations in old male mice 

Testosterone  concentrations  decline  with  age,  even  in  mice  (Coquelin  & 

Desjardins, 1982). To  test  the hypothesis  that endogenous  testosterone  levels  can be 

increased in old male mice, old male C57BL/6 mice were treated with high (3 mg/kg) or 

low (0.3 mg/kg) doses of Ro5‐4864 or PK11195, or vehicle. The mice were weighed daily 

for the seven day duration of the treatment to determine if TSPO ligands cause notable 

18

toxicity.  Treatment with  TSPO  ligand  did  not  change  body mass  relative  to  vehicle‐

treated males  (Fig.  2A). Mice  treated with  the  low  dose  (0.3 mg/kg)  of  either  TSPO 

ligand (Ro5‐4864 and PK11195) showed an  increase  in seminal vesicle mass relative to 

those treated with the high doses (3 mg/kg) of TSPO  ligands or vehicle for 7 days (Fig. 

2B).  Despite  the  observed  changes  in  seminal  vesicle  mass,  which  is  androgen‐

dependent, there was no significant increase in serum testosterone concentrations after 

treatment with either low or high doses of either TSPO ligand after either 3 or 7 days of 

treatment  (Fig.  2C,D).  Similarly,  testicular  production  of  testosterone  was  not 

significantly elevated by treatment with TSPO ligands (Fig. 2E). These data suggest that 

TSPO  ligands, at  least at the tested doses, are not sufficient to elevate testosterone  in 

old male mice. 

Administration of  low dose  testosterone does not alter  the outcome of 

infection with ma2009 H1N1 in old male mice 

To test the hypothesis that exogenous elevation of testosterone in old males will 

improve influenza pathogenesis, old male C57BL/6 mice were left intact and implanted 

with placebo  capsules or 7.5 mm  (low dose)  testosterone propionate  capsules, which 

elevate  serum  testosterone  to  the upper  limit of  the physiological  range observed  in 

intact  young male mice  (Fig.  3A).  Following  infection with ma2009  H1N1,  low  dose 

testosterone‐treated mice showed no change in percentage loss of body mass (Fig. 3B) 

or survival (Fig. 3C) compared to placebo‐treated mice. The average day of death after 

19

infection  was  slightly  later  for  the  testosterone‐treated  (15±3.00)  compared  with 

placebo‐treated (11.7±1.20) mice. Antibody titers in serum samples collected at day 28 

post  infection were similarly  low between the  low dose testosterone‐treated mice and 

the placebo‐treated mice (Fig. 3D). These data suggest that old male mice may be  less 

responsive to testosterone treatment than their young male counterparts, at least with 

regard to influenza virus infection. 

Administration  of  high  dose  testosterone  improves  the  outcome  of 

infection with ma2009 H1N1 in old male mice 

To test the hypothesis that old male mice require higher doses of testosterone to 

alter  the outcome of  influenza  infection, old male C57BL/6 mice were  left  intact and 

implanted  with  placebo  capsules  or  15  mm  (high  dose)  testosterone  propionate 

capsules. Serum testosterone concentrations were not significantly increased at 21 days 

after  infection  (28 days after  implantation)  (Fig. 4A). Following  infection with ma2009 

H1N1  influenza  A  virus,  high  dose  testosterone‐treated  mice  showed  reduced 

percentage  loss  of  body  mass  (Fig.  4B),  but  similar  survival  (Fig.  4C)  compared  to 

placebo‐treated mice. The average day of death after infection was slightly later for the 

testosterone‐treated  (13.8±2.03)  compared  with  placebo‐treated  mice  (12±0.68). 

Antibody titers  in serum samples collected at day 21 post  infection were similarly  low 

between  the high dose  testosterone‐treated mice  and  the placebo‐treated mice  (Fig. 

20

4D). These data suggest that testosterone treatment can improve outcome measures of 

influenza virus infection. 

Protection  from  influenza pathogenesis  is not associated with  increased 

proliferation in the lungs at 21 days post infection 

Testosterone  (T)  treatment  in young male mice  (with 7.5 mm T capsules), and 

old male mice (with 15 mm T capsules) was protective against morbidity from influenza 

virus  infection.  To  test  the  hypothesis  that  this  was  due  to  increased  repair  in  the 

testosterone‐treated mice, we measured the expression of Ki67, which  is a marker for 

cellular proliferation,  in  the  lungs  at 21 days  after  infection. There was no  significant 

difference in Ki67 expression between placebo‐treated and testosterone‐treated young 

male mice, and between placebo‐treated and high dose testosterone‐treated old male 

mice  (Fig.  5B).  These  data  suggest  that  there  is  either  no  effect  of  testosterone  on 

repair, or the effect can be better detected at an earlier time point. 

21

Figure  1:  Effects  of  testosterone  (T)  on  the  outcome  of  ma2009  H1N1  influenza 

infection in young male mice (2 mo). Young male mice were gonadectomized (gdx) and 

implanted with 7.5 mm T (n=15) or placebo (n=14) capsules. Serum T was measured by 

RIA (A), body mass was measured daily (B), and clinical scores were measured on days 0, 

3, 5, 7, 9, 11, 14, and 18 post  infection (C). Antibody titers were analyzed 21 days post 

infection by ELISA  (D). Data  shown are  the mean ± SEM. Asterisks  (*) denote p<0.05. 

Red lines in panel A represent physiological serum T range in young male mice. 

Figure 1

22

A. B.

D. C.

E.

Figure 2

23

Figure 2: Effects of Ro5‐4864 and PK11195 on body mass, and  serum and  testicular 

testosterone (T)  in old male mice. Old male mice received either Ro5‐4864 or PK11195 

[low (L): 0.3 mg/kg body mass; high (H): 3 mg/kg body mass] or placebo by ip injection 

for 7 days  (n=5  in each group). Body mass was measured daily over the course of the 

seven  day  study  (A).  Seminal  vesicle mass  was measured  after  7  days,  and  data  is 

presented as a percentage of total body mass of each mouse (B). Serum T at days 3 (C) 

and 7 (D), and testicular T (D) were measured by RIA. Data shown are the mean ± SEM. 

*P < 0.05. Red lines in panel C and D represent physiological serum testosterone range 

in young male mice. 

24

Figure 3: Effects of    low dose testosterone  (low T) on the outcome of ma2009 H1N1 

influenza infection in old male mice (17 mo). Old male mice were implanted with low T 

(n=10) or placebo  capsules  (n=9).  Serum T was measured by RIA  (A), body mass was 

measured  daily  (B),  and  survival  was  assessed  using  the  Kaplan‐Meier  method  (C). 

Antibody titers were analyzed 28 days post  infection by ELISA (D). Data shown are the 

Figure 3

25

mean ± SEM. Asterisks  (*) denote p<0.05. Red  lines  in panel A represent physiological 

serum T range in young male mice. 

26

Figure 4: Effects of high dose testosterone (high T) on the outcome of ma2009 H1N1 

influenza infection in old male mice (17 mo). Old male mice were implanted with high T 

or placebo capsules (n=17 in each group). Serum T was measured by RIA (A), body mass 

was measured daily (B), and survival was assessed using the Kaplan‐Meier method (C). 

Antibody titers were analyzed at 21 days post infection by ELISA (D). Data shown are the 

mean ± SEM. Asterisks  (*) denote p<0.05. Red  lines  in panel A represent physiological 

serum T range in young male mice. 

Figure 4

27

Placebo T‐Treated

Young

Old

Figure 5

A.

B.

28

Figure 5: Effects of testosterone treatment on ki67 expression 21 days post  infection 

with ma2009 H1N1  influenza  in  young  and old male mice. Paraffin‐embedded  lungs 

were deparafinized and stained with anti‐Ki67 antibody and DAB substrate (brown) and 

counterstained with hematoxylin (purple). Representative images are provided for lungs 

from  young  and  old  placebo  and  testosterone‐treated male mice  (A).  Percentage  of 

Ki67+  nuclei  was  calculated  in  lungs  tissue  from  young  and  old  placebo  and 

testosterone‐treated male mice   (n=3  in each group) (B). Arrows  indicate Ki67 positive 

staining. 

29

DISCUSSION 

Conclusions 

Age‐related    changes  in  immune  function  result  in more  severe  disease  from 

influenza  infection  in  the  elderly  (Parzych  et  al.,  2013).  Because  influenza  disease 

pathology  is primarily mediated by a dysregulated  inflammatory response (Damjanovic 

et al., 2012), this is possibly influenced by the chronic pro‐inflammatory state associated 

with aging, which results  in higher basal  levels of pro‐inflammatory cytokines and may 

contribute  to more  severe disease  in  the elderly  (Cannizzo et al., 2011). Compared  to 

elderly females,   as well as young males, elderly males are more susceptible to severe 

disease (Serfling et al., 1967). Testosterone has been shown to have anti‐inflammatory 

properties  in  various models  (Keith  et  al.,  2013;  Lotter  et  al.,  2013),  and  decreasing 

levels  of  testosterone with  age  in men  (Maggio  et  al.,  2005)  could  contribute  to  the 

increased  severity  of  disease  in  elderly  men.  Therefore,  we  hypothesized  that 

testosterone administration would be protective against influenza disease in our mouse 

model of influenza by modulating the inflammatory response to infection.  

We  assessed  the  effects  of  testosterone  in  young male mice  to  confirm  that 

testosterone  affects  influenza  pathogenesis. Administration  of  testosterone  (7.5 mm) 

and  restoration  of  serum  testosterone  to  the  upper  end  of  physiological  levels was 

protective  against morbidity  from  infection  with ma2009  H1N1  influenza  A  virus  in 

gonadectomized  young male mice.  These  results  are  consistent  with  reports  in  the 

30

literature of the anti‐inflammatory properties of testosterone (Keith et al., 2013; Lotter 

et  al.,  2013),  as well  as  previous  research  from  the  lab  using maPR8 H1N1  influenza 

virus, which showed that gonadectomized young male mice showed lower survival than 

intact  young male mice  in  response  to  a  lethal  dose  of    virus without  observing  any 

differences in viral titers (Robinson et al., 2011). Antibody titers were significantly lower 

in  the  serum  collected  at  day  21  from  the  testosterone‐treated mice, which  further 

points towards an immunosuppressive role for testosterone. This replicates findings in a 

study  conducted  with  human  populations  that  showed  that  men  with  higher 

testosterone  levels  produce  a  lower  antibody  response  in  response  to  a  trivalent 

inactivated  influenza vaccine compared to men with  lower testosterone (Furman et al. 

2014). 

Old male mice have  lower  testosterone  levels as compared with younger male 

mice  (Coquelin  &  Desjardins,  1982).  In  order  to  determine  whether  testosterone  is 

protective  in old male mice, we  first  looked at a means of  raising  testosterone  levels 

endogenously, as that could be an alternative to directly administering testosterone to 

elderly males.  TSPO  ligands  have  been  shown  to  raise  testosterone  to  physiological 

levels  in old male rats by stimulating steroidogenesis  in the testes (Chung et al., 2013). 

We  hypothesized  that  the  same  would  be  true  in  old  male  mice.  However, 

administration  of  two  different  TSPO  ligands,  Ro5‐4864  and  PK11195,  in  high  or  low 

doses did not significantly raise either testicular or serum testosterone levels in old male 

C57BL/6 mice. While the trending association between low dose TSPO ligand and higher 

serum testosterone may reach statistical significance with a  larger sample, none of the 

31

groups showed testosterone elevated to within the physiological range of testosterone 

observed  in  healthy  young mice.  However,  the mice  treated with  low  doses  of  the 

ligands showed a significant  increase  in seminal vesicle mass, providing some evidence 

that these TSPO ligands have a greater physiological effect at low than high doses. The 

dose  response  of  the  drug  does  not  appear  to  be  linear,  therefore  it  is  difficult  to 

determine whether a higher or  lower dose of TSPO  ligand would  increase testosterone 

to a greater extent. A possible reason for TSPO ligands raising testosterone levels in rats 

but  not  in mice may  be  differences  in  binding with  the  TSPO  protein. We  therefore 

decided that TSPO ligand would not serve as an effective model to study the effects of 

testosterone on influenza pathogenesis in old male C57BL/6 mice. For that, we reverted 

to our model of testosterone replacement using capsules as in young male mice. 

Aging results in an overall decline in immune function (Castelo‐Branco & Soveral, 

2014), as well as an increase in the basal levels of pro‐inflammatory cytokines (Cannizzo 

et  al., 2011). Whether  age‐related  changes  in  immune  function  could be  reversed by 

treatment with testosterone was tested. In contrast to the data from young male mice 

showing  that  lower  testosterone  is associated with higher antibody  titers, older male 

mice  produced  lower  antibody  titers  than  younger male mice,  regardless  of whether 

they  were  treated  with  testosterone.  This  suggests  that  vaccines  would  not  be  as 

effective in elderly individuals, and this is consistent with studies conducted on influenza 

vaccine efficacy in humans (Sasaki et al., 2011). Decreased antibody responses resulting 

from both aging and testosterone administration in young male mice indicate the need 

for tailoring vaccinations to specific population subsets to ensure sufficient protection. 

32

Administration of  low dose  testosterone, despite elevating serum  testosterone 

to  the upper end of physiological  levels  seen  in young male mice, was not protective 

against morbidity or survival from  infection with ma2009 H1N1  influenza A virus  in old 

male mice.  This  is  possibly  a  result  of  the  chronic  pro‐inflammatory  state  associated 

with aging  (Cannizzo et al., 2011), which may not be  counteracted  sufficiently by  the 

same dose of  testosterone  that was protective  in young male mice.  It  is also possible 

that aging results in a decrease in androgen receptor expression, which would limit the 

effects of testosterone. Administration of high dose testosterone was protective against 

morbidity but not  survival  from  infection with ma2009 H1N1  influenza A  virus  in old 

male C57BL/6 mice. However, testosterone levels in the high dose testosterone‐treated 

mice  had  been  depleted  to  levels  comparable  to  placebo‐treated mice  28  days  after 

implantation (21 days post infection). We hypothesize that this is because testosterone 

in the high dose capsules diffused out at a faster rate as a result of an increased surface 

area compared to that of the low dose capsules. The protection against morbidity from 

influenza pathogenesis  in  the high dose  testosterone‐treated  group despite  the  early 

depletion of  the hormone  in  the  serum  suggests  that  testosterone may be having an 

early  effect  on  the  immune  response  to  the  virus,  and  resulting  in  downstream 

protective  effects.  This  is  consistent  with  a  study  showing  that  testosterone 

downregulates  the  expression  of  toll‐like  receptor  4  (TLR‐4)  in macrophages  in mice; 

TLR‐4 is a key trigger for inflammation and innate immunity. Both doses of testosterone 

resulted  in a trend of delay  in the average day of death, again suggesting a protective 

effect. 

33

None of the treatment groups of old male mice fully recovered to baseline body 

mass after  infection, which  is consistent with evidence in the  literature suggesting that 

aging results in decreased recovery from influenza infection (Yin et al., 2014). However, 

high dose testosterone resulted in significantly improved recovery, which suggests that 

testosterone  is  one  of  several  factors  that  can  influence  the  outcome  of  influenza 

disease  in  old male mice,  and  that  the  higher  dose  of  testosterone  is  sufficient  in 

counteracting some of  the excessive  inflammation  that  is associated with  the disease. 

Testosterone has been shown to accelerate repair  in other models of  injury (Hetzler et 

al.,  2008). We  therefore  hypothesized  that  decreased morbidity  from  influenza  virus 

infection  in testosterone‐treated young male mice and high dose testosterone‐treated 

old  male  mice  might  partially  be  influenced  by  increased  repair  in  the  lungs  after 

infection. However, our data  from 21 days after  infection does not suggest that  is the 

case.  It may possibly be more useful  to  look at ki67 at earlier  time points during and 

before peak of disease according to the morbidity curves,  in order to more accurately 

assess a role  for repair  in the protective effect of testosterone against morbidity  from 

influenza virus infection. 

Future Directions 

The  lower dose of testosterone, despite  increasing serum testosterone  levels  in 

old male mice  to  the upper  levels of  the physiological  range of  testosterone  seen  in 

young male mice, did not have  the same protective effect against morbidity as  in  the 

34

young male mice. To  test whether  this  is because of a decrease  in androgen  receptor 

(AR) expression with age, we will measure AR expression  in young and old male mice 

with and without testosterone treatment. 

The  depletion  of  testosterone  at  21  days  post  infection  is  a  limitation  to  the 

interpretation  of  this  data  as  maintaining  a  constant  environment  of  elevated 

testosterone is important to our hypothesis. To have a more concrete understanding of 

what part of the response to influenza virus infection is being affected by testosterone, 

we will determine the time after implantation of the high dose testosterone capsules at 

which serum testosterone peaks and how long it takes to be depleted after that. We will 

collect serum at various time point post infection, and measure testosterone. 

We  hypothesized  that  the  protection  from  influenza  pathogenesis  in 

testosterone‐treated  young male mice  and  high  dose  testosterone‐treated  old male 

mice  is possibly a  repair of accelerated  repair  in  the  lungs,   as  testosterone has been 

shown to upregulate repair  in other models of  injury  (Hetzler et al., 2008). At 21 days 

after  infection, we do not see a difference  in expression of Ki67, which  is a marker for 

proliferation,  between  lungs  from  placebo‐treated  and  testosterone‐treated  mice 

among  both  young  and  old  age  groups.  As  day  21  is  after  peak  infection  and  viral 

clearance (Robinson et al., 2011), it is possible that it is too late to detect a difference at 

this point. We will  therefore measure Ki67 expression  in  lungs at days 7 and 14 post 

infection to detect a possible difference in epithelial repair at earlier time points during 

the infection.  

35

Public Health Significance 

Influenza  is  a  global  public  health  burden.  Seasonal  influenza  is  a  significant 

cause of mortality every year (Lagace‐Wiens et al., 2010). Owing to the mutation‐prone 

nature of  its RNA genome  (Lauring et al., 2013), new vaccines need  to be  researched 

and manufactured every year to combat the spread of the virus in the population. While 

seasonal  strains  are  not  always  severe,  influenza  can  result  in  hospitalizations  and 

death,  especially  in  at‐risk  populations,  including  the  elderly  (Mauskopf  et  al.,  2013). 

Elderly men,  in particular, tend to be more susceptible to severe disease compared to 

elderly women and young men (Serfling et al., 1967). This, combined with the fact that 

elderly men produce lower antibody titers than elderly women in response to influenza 

vaccination makes influenza a serious threat for elderly men (Sasaki et al., 2011).  

Low  testosterone  and  its  accompanying  effects  are  also  a  significant  burden 

among elderly men  (Maggio et  al., 2005).  It  is possibly  associated with  the  increased 

severity  of  influenza  in  elderly men,  as  testosterone  has  been  shown  to  have  anti‐

inflammatory  properties  (Lotter  et  al.,  2013),  and  severe  pathology  from  influenza  is 

known to be caused by an excessive inflammatory response to infection (Damjanovic et 

al.,  2012). We  therefore  hypothesized  that  testosterone  administration may  provide 

some protection for elderly men against influenza pathogenesis. 

  We utilized  old male mice with low testosterone as our model for elderly men in 

the  population.  Our  results  suggest  that  testosterone  could  be  useful  in  decreasing 

morbidity from influenza, but further research is required to elucidate the mechanisms 

36

of this protection, and to determine any possible side effects of immunomodulation by 

testosterone. 

37

BIBLIOGRAPHY 

Agrawal A, Tay J, Ton S, Agrawal S, Gupta S. Increased reactivity of dendritic cells from aged subjects to self‐antigen, the human DNA. J Immunol. 2009 Jan 15;182(2):1138‐45.  Austin CJ, Kahlert J, Kassiou M, Rendina LM. The translocator protein (TSPO): a novel target for cancer chemotherapy. Int J Biochem Cell Biol. 2013 Jul;45(7):1212‐6. doi: 10.1016/j.biocel.2013.03.004. Epub 2013 Mar 18.  Baigent SJ, McCauley JW. Influenza type A in humans, mammals and birds: determinants of virus virulence, host‐range and interspecies transmission. Bioessays. 2003 Jul;25(7):657‐71.  Barron AM, Garcia‐Segura LM, Caruso D, Jayaraman A, Lee JW, Melcangi RC, Pike CJ. Ligand for translocator protein reverses pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 2013 May 15;33(20):8891‐7. doi: 10.1523/JNEUROSCI.1350‐13.2013.  Boje A, Moesby L, Timm M, Hansen EW. Immunomodulatory effects of testosterone evaluated in all‐trans retinoic acid differentiated HL‐60 cells, granulocytes, and monocytes. Int Immunopharmacol. 2012 Apr;12(4):573‐9. doi: 10.1016/j.intimp.2012.02.008. Epub 2012 Feb 24.  

Bouvier NM, Palese P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 2008 Sep 12;26 Suppl  

4:D49‐53. 

Büchter D, Behre HM, Kliesch S, Chirazi A, Nieschlag E, Assmann G, von Eckardstein A. 

Effects of testosterone suppression in young men by the gonadotropin releasing 

hormone antagonist cetrorelix on plasma lipids, lipolytic enzymes, lipid transfer 

proteins, insulin, and leptin. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 1999;107(8):522‐9.  Canan CH, Gokhale NS, Carruthers B, Lafuse WP, Schlesinger LS, Torrelles JB, Turner J. Characterization of lung inflammation and its impact on macrophage function in aging. J Leukoc Biol. 2014 Sep;96(3):473‐80. doi: 10.1189/jlb.4A0214‐093RR. Epub 2014 Jun 16.  Cannizzo ES, Clement CC, Sahu R, Follo C, Santambrogio L. Oxidative stress, inflamm‐aging and immunosenescence. J Proteomics. 2011 Oct 19;74(11):2313‐23. doi: 10.1016/j.jprot.2011.06.005. Epub 2011 Jun 21.  Castelo‐Branco C, Soveral I. The immune system and aging: a review. Gynecol Endocrinol. 2014 Jan;30(1):16‐22. doi: 10.3109/09513590.2013.852531. Epub 2013 Nov 12. 

38

 CDC. Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza: United States, 1976—2007. 2010.  Chung JY, Chen H, Midzak A, Burnett AL, Papadopoulos V, Zirkin BR. Drug ligand‐induced activation of translocator protein (TSPO) stimulates steroid production by aged brown Norway rat Leydig cells. Endocrinology. 2013 Jun;154(6):2156‐65. doi: 10.1210/en.2012‐2226. Epub 2013 Mar 22.  Coquelin A, Desjardins C. Luteinizing hormone and testosterone secretion in young and old male mice. Am J Physiol. 1982 Sep;243(3):E257‐63.  Crosnoe LE, Grober E, Ohl D, Kim ED. Exogenous testosterone: a preventable cause of male infertility. Translational Androl & Urol. 2013 June; 2(2).  Damjanovic D, Small CL, Jeyanathan M, McCormick S, Xing Z. Immunopathology in influenza virus infection: uncoupling the friend from foe. Clin Immunol. 2012 Jul;144(1):57‐69. doi: 10.1016/j.clim.2012.05.005. Epub 2012 May 15.  Daugherty DJ, Selvaraj V, Chechneva OV, Liu XB, Pleasure DE, Deng W. A TSPO ligand is protective in a mouse model of multiple sclerosis. EMBO Mol Med. 2013 Jun;5(6):891‐903. doi: 10.1002/emmm.201202124. Epub 2013 May 17.  Effros RB, Walford RL. The immune response of aged mice to influenza: diminished T‐cell proliferation, interleukin 2 production and cytotoxicity. Cell Immunol. 1983 Oct 15;81(2):298‐305. 

Engler RJ, Nelson MR, Klote MM, VanRaden MJ, Huang CY, Cox NJ, Klimov A, Keitel 

WA, Nichol KL, Carr WW, Treanor JJ;Walter Reed Health Care System Influenza 

Vaccine Consortium. Half‐ vs full‐dose trivalent inactivated influenza vaccine (2004‐

2005): age, dose, and sex effects on immune responses. Arch Intern Med. 2008 Dec 

8;168(22):2405‐14. doi: 10.1001/archinternmed.2008.513.  Fessler J, Ficjan A, Duftner C, Dejaco C. The impact of aging on regulatory T‐cells. Front Immunol. 2013 Aug 6;4:231. doi: 10.3389/fimmu.2013.00231. eCollection 2013.  Frye CA, Edinger K, Sumida K. Androgen administration to aged male mice increases anti‐anxiety behavior and enhances cognitive performance. Neuropsychopharmacology. 2008 Apr;33(5):1049‐61. Epub 2007 Jul 11. 

Furman D, Hejblum BP, Simon N, Jojic V, Dekker CL, Thiébaut R, Tibshirani RJ, Davis MM. Systems analysis of sex differences reveals an immunosuppressive role for testosterone 

39

in the response to influenza vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Jan 14;111(2):869‐74. doi: 10.1073/pnas.1321060111. Epub 2013 Dec 23.  Gibson KL, Wu YC, Barnett Y, Duggan O, Vaughan R, Kondeatis E, Nilsson BO, Wikby A, Kipling D, Dunn‐Walters DK. B‐cell diversity decreases in old age and is correlated with poor health status. Aging Cell. 2009 Feb;8(1):18‐25. doi: 10.1111/j.1474‐9726.2008.00443.x. Epub 2008 Nov 5. 

 Hatori A, Yui J, Yamasaki T, Xie L, Kumata K, Fujinaga M, Yoshida Y, Ogawa M, Nengaki N, Kawamura K, Fukumura T, Zhang MR. PET imaging of lung inflammation with [18F]FEDAC, a radioligand for translocator protein (18 kDa). PLoS One. 2012;7(9):e45065. doi: 10.1371/journal.pone.0045065. Epub 2012 Sep 12.  Hill CM, Anway MD, Zirkin BR, Brown TR. Intratesticular androgen levels, androgen receptor localization, and androgen receptor expression in adult rat Sertoli cells. Biol Reprod. 2004 Oct;71(4):1348‐58. Epub 2004 Jun 23.  Hong MS, Dan JM, Choi JY, Kang I. Age‐associated changes in the frequency of naïve, memory and effector CD8+ T cells. Mech Ageing Dev. 2004 Sep;125(9):615‐8.  Hetzler LE, Sharma N, Tanzer L, Wurster RD, Leonetti J, Marzo SJ, Jones KJ, Foecking EM. Accelerating functional recovery after rat facial nerve injury: Effects of gonadal steroids and electrical stimulation. Otolaryngol Head Neck Surg. 2008 Jul;139(1):62‐7. doi: 10.1016/j.otohns.2008.02.006.  Hwang KA, Kim HR, Kang I. Aging and human CD4(+) regulatory T cells. Mech Ageing Dev. 2009 Aug;130(8):509‐17. doi: 10.1016/j.mad.2009.06.003. Epub 2009 Jun 18.  Jing Y, Shaheen E, Drake RR, Chen N, Gravenstein S, Deng Y. Aging is associated with a numerical and functional decline in plasmacytoid dendritic cells, whereas myeloid dendritic cells are relatively unaltered in human peripheral blood. Hum Immunol. 2009 Oct;70(10):777‐84. doi: 10.1016/j.humimm.2009.07.005. Epub 2009 Jul 23.  Kang I, Hong MS, Nolasco H, Park SH, Dan JM, Choi JY, Craft J. Age‐associated change in the frequency of memory CD4+ T cells impairs long term CD4+ T cell responses to influenza vaccine. J Immunol. 2004 Jul 1;173(1):673‐81.  Kared H, Camous X, Larbi A. T cells and their cytokines in persistent stimulation of the immune system. Curr Opin Immunol. 2014 Aug;29:79‐85. doi: 10.1016/j.coi.2014.05.003. Epub 2014 May 29.  Keith RC, Sokolove J, Edelman BL, Lahey L, Redente EF, Holers VM, Sakaguchi S, 

40

Robinson WH, Riches DW. Testosterone is protective in the sexually dimorphic development of arthritis and lung disease in SKG mice. Arthritis Rheum. 2013 Jun;65(6):1487‐93. doi: 10.1002/art.37943.  

Khurana S, Verma N, Talaat KR, Karron RA, Golding H. Immune response following 

H1N1pdm09 vaccination: differences in antibody repertoire and avidity in young adults 

and elderly populations stratified by age and gender. J Infect Dis. 2012 Feb 

15;205(4):610‐20. doi: 10.1093/infdis/jir791. Epub 2011 Dec 29.  Kidd M. Influenza viruses: update on epidemiology, clinical features, treatment and vaccination. Curr Opin Pulm Med. 2014 May;20(3):242‐6. doi: 10.1097/MCP.0000000000000049.  Klein SL. Sex differences in prophylaxis and therapeutic treatments for viral diseases. Handb Exp Pharmacol. 2012;(214):499‐522. doi: 10.1007/978‐3‐642‐30726‐3_22.  Lagacé‐Wiens PR, Rubinstein E, Gumel A. Influenza epidemiology‐‐past, present, and future. Crit Care Med. 2010 Apr;38(4 Suppl):e1‐9. doi: 10.1097/CCM.0b013e3181cbaf34.  Lauring AS, Frydman J, Andino R. The role of mutational robustness in RNA virus evolution. Nat Rev Microbiol. 2013 May;11(5):327‐36. doi: 10.1038/nrmicro3003. Epub 2013 Mar 25.  Lim MA, Lee J, Park JS, Jhun JY, Moon YM, Cho ML, Kim HY. Increased Th17 differentiation in aged mice is significantly associated with high IL‐1β level and low IL‐2 expression. Exp Gerontol. 2014 Jan;49:55‐62. doi: 10.1016/j.exger.2013.10.006. Epub 2013 Oct 17.  Liva SM, Voskuhl RR. Testosterone acts directly on CD4+ T lymphocytes to increase IL‐10 production. J Immunol. 2001 Aug 15;167(4):2060‐7.  Lotter H, Helk E, Bernin H, Jacobs T, Prehn C, Adamski J, González‐Roldán N, Holst O, Tannich E. Testosterone increases susceptibility to amebic liver abscess in mice and mediates inhibition of IFNγ secretion in natural killer T cells. PLoS One. 2013;8(2):e55694. doi: 10.1371/journal.pone.0055694. Epub 2013 Feb 12.  Maggio M, Basaria S, Ceda GP, Ble A, Ling SM, Bandinelli S, Valenti G, Ferrucci L. The relationship between testosterone and molecular markers of inflammation in older men. J Endocrinol Invest. 2005;28(11 Suppl Proceedings):116‐9.  Mauskopf J, Klesse M, Lee S, Herrera‐Taracena G. The burden of influenza complications in different high‐risk groups: a targeted literature review. J Med Econ. 2013;16(2):264‐

41

77. doi: 10.3111/13696998.2012.752376. Epub 2012 Dec 4.  Messaoudi I, Lemaoult J, Guevara‐Patino JA, Metzner BM, Nikolich‐Zugich J. Age‐related CD8 T cell clonal expansions constrict CD8 T cell repertoire and have the potential to impair immune defense. J Exp Med. 2004 Nov 15;200(10):1347‐58.  Naylor K, Li G, Vallejo AN, Lee WW, Koetz K, Bryl E, Witkowski J, Fulbright J, Weyand CM, Goronzy JJ. The influence of age on T cell generation and TCR diversity. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):7446‐52.  Nyugen J, Agrawal S, Gollapudi S, Gupta S. Impaired functions of peripheral blood monocyte subpopulations in aged humans. J Clin Immunol. 2010 Nov;30(6):806‐13. doi: 10.1007/s10875‐010‐9448‐8. Epub 2010 Aug 12.  Pappas C, Aguilar PV, Basler CF, Solórzano A, Zeng H, Perrone LA, Palese P, García‐Sastre A, Katz JM, Tumpey TM. Single gene reassortants identify a critical role for PB1, HA, and NA in the high virulence of the 1918 pandemic influenza virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 26;105(8):3064‐9. doi: 10.1073/pnas.0711815105. Epub 2008 Feb 19.  Parzych EM, DiMenna LJ, Latimer BP, Small JC, Kannan S, Manson B, Lasaro MO, Wherry EJ, Ertl HC. Influenza virus specific CD8⁺ T cells exacerbate infection following high dose influenza challenge of aged mice. Biomed Res Int. 2013;2013:876314. doi: 10.1155/2013/876314. Epub 2013 Sep 26.  Rettew JA, Huet‐Hudson YM, Marriott I. Testosterone reduces macrophage expression in the mouse of toll‐like receptor 4, a trigger for inflammation and innate immunity. Biol Reprod. 2008 Mar;78(3):432‐7. Epub 2007 Nov 14.  Robinson DP, Lorenzo ME, Jian W, Klein SL. Elevated 17β‐estradiol protects females from influenza A virus pathogenesis by suppressing inflammatory responses. PLoS Pathog. 2011 Jul;7(7):e1002149. doi: 10.1371/journal.ppat.1002149. Epub 2011 Jul 28. 

Robinson DP, Huber SA, Moussawi M, Roberts B, Teuscher C, Watkins R, Arnold AP, Klein 

SL. Sex chromosome complement contributes to sex differences in coxsackievirus B3 but 

notinfluenza A virus pathogenesis. Biol Sex Differ. 2011 Aug 1;2:8. doi: 10.1186/2042‐

6410‐2‐8. 

Sakai M, Ferraz‐de‐Paula V, Pinheiro ML, Ribeiro A, Quinteiro‐Filho WM, Rone MB, 

Martinez‐Arguelles DB, Dagli ML, Papadopoulos V, Palermo‐Neto J. Translocator protein 

(18 kDa) mediates the pro‐growth effects of diazepam on Ehrlich tumor cells in vivo. Eur 

J Pharmacol. 2010 Jan 25;626(2‐3):131‐8. doi: 10.1016/j.ejphar.2009.09.036. Epub 2009 

42

Sep 24. 

Sasaki S, Sullivan M, Narvaez CF, Holmes TH, Furman D, Zheng NY, Nishtala M, 

Wrammert J, Smith K, James JA, Dekker CL, Davis MM, Wilson PC, Greenberg HB, He XS. 

Limited efficacy of inactivated influenza vaccine in elderly individuals is associated with 

decreased production of vaccine‐specific antibodies. J Clin Invest. 2011 

Aug;121(8):3109‐19. doi: 10.1172/JCI57834. Epub 2011 Jul 25. 

Saucillo DC, Gerriets VA, Sheng J, Rathmell JC, Maciver NJ. Leptin metabolically licenses 

T cells for activation to link nutrition and immunity. J Immunol. 2014 Jan 1;192(1):136‐

44. doi: 10.4049/jimmunol.1301158. Epub 2013 Nov 22.  Scarf AM, Kassiou M. The translocator protein. J Nucl Med. 2011 May;52(5):677‐80. doi: 10.2967/jnumed.110.086629. Epub 2011 Apr 15.  Schmitt V, Rink L, Uciechowski P. The Th17/Treg balance is disturbed during aging. Exp Gerontol. 2013 Dec;48(12):1379‐86. doi: 10.1016/j.exger.2013.09.003. Epub 2013 Sep 20.  Serfling RE, Sherman IL, Houseworth WJ. Excess pneumonia‐influenza mortality by age and sex in three major influenza A2 epidemics, United States, 1957‐58, 1960 and 1963. Am J Epidemiol. 1967 Sep;86(2):433‐41.  Stocco DM, Clark BJ. Regulation of the acute production of steroids in steroidogenic cells. Endocr Rev. 1996 Jun;17(3):221‐44.  Taubenberger JK, Baltimore D, Doherty PC, Markel H, Morens DM, Webster RG, Wilson IA. Reconstruction of the 1918 influenza virus: unexpected rewards from the past. MBio. 2012 Sep 11;3(5). pii: e00201‐12. doi: 10.1128/mBio.00201‐12. Print 2012.  Vallejo AN, Schirmer M, Weyand CM, Goronzy JJ. Clonality and longevity of CD4+CD28null T cells are associated with defects in apoptotic pathways. J Immunol. 2000 Dec 1;165(11):6301‐7.  

Wang CS, Wang ST, Chou P. Efficacy and cost‐effectiveness of influenza vaccination of 

the elderly in a densely populated and unvaccinated community. Vaccine. 2002 Jun 

7;20(19‐20):2494‐9. 

Wenisch C, Patruta S, Daxböck F, Krause R, Hörl W. Effect of age on human neutrophil 

43

function. J Leukoc Biol. 2000 Jan;67(1):40‐5. 

Yin L, Zheng D, Limmon GV, Leung N, Xu S, Rajapakse JC, Yu H, Chow V, Chen J. 

Aging exacerbates damage and delays repair of alveolar epithelia following influenza  

viral pneumonia. Respir Res. 2014 Sep 30;15(1):116. [Epub ahead of print]  Zhao YY, Yu JZ, Li QY, Ma CG, Lu CZ, Xiao BG. TSPO‐specific ligand vinpocetine exerts a neuroprotective effect by suppressing microglial inflammation. Neuron Glia Biol. 2011 May;7(2‐4):187‐97. doi: 10.1017/S1740925X12000129. Epub 2012 Jul 6.  Zirkin BR, Chen H. Regulation of Leydig cell steroidogenic function during aging. Biol Reprod. 2000 Oct;63(4):977‐81.  

44

Ornob Alam  

Home:                 1024 North Broadway St.       Baltimore, Maryland, 21205 E: [email protected] P: (850) (570)‐0594  Work:   Department of Molecular Microbiology and Immunology 615 North Wolfe St.  Baltimore, Maryland, 21205 E: [email protected] P: (410) 614‐7794  Born: 9th February, 1991, Dhaka, Bangladesh  Nationality: USA  Education: B.Sc.  in Biological Science  from Florida State University, Tallahassee, FL  (August 2009‐May 2013), GPA 3.70/4.00.  Sc.M. Candidate in Molecular Microbiology & Immunology at Johns Hopkins Bloomberg School  of  Public  Health,  Baltimore,  MD  (September  2013‐present),  GPA  3.62/4.00. Thesis  Title:  The  Effects  of  Elevated  Testosterone  on  the Outcome  of ma2009 H1N1 Influenza A Virus Infection in Old Male Mice. Thesis Advisor: Dr. Sabra Klein. Anticipated to graduate in May 2014  Professional Experience:  Undergraduate  Research.  Dr.  David  Gilbert’s  laboratory  at  Florida  State  University (January  2012‐May  2013).  Principal  responsibilities  included  BAC  and  plasmid purification, molecular cloning, and genetic recombineering  Sc.M.  Research.  Dr.  Sabra  Klein’s  laboratory  at  Johns  Hopkins  Bloomberg  School  of Public  Health  (September  2014‐present).  Principal  responsibilities  include  conducting animal  studies,  including  infection,  dissection  and  tissue  collection  as well  as  assays including  virus  titration,  ELISAs,  virus  neutralization,  radioimmunoassays,  and immunohistochemistry   

45

Volunteer Experience:  UMAR Boxing. Tutored, and organized volunteering trips for children in an after‐school program (January 2014‐May 2014)  Art With  a Heart. Co‐instructed a  summer art  class  for middle‐school  children across five schools in Baltimore (June 2014‐August 2014)  Presentations:  2012  Undergraduate  Research  and  Creative  Activities  Awards  Symposium.  “Is  Late Replication Necessary for G9a‐Mediated Methylation to Occur?”  Awards:  2012 Undergraduate Research and Creative Activities Award  Skills:  Laboratory  Techniques:  BAC  and  plasmid  purification;  molecular  cloning;  genetic recombineering;  DNA  and  RNA  extractions;  animal  studies,  including  infection, dissection,  tissue  collection,  and  behavioral  phenotyping;  virus  titration;  ELISAs;  virus neutralization; radioimmunoassays; immunohistochemistry  Statistical Analyses: Systat, SigmaPlot, Prism, Stata  Languages Spoken: Bengali, Hindi, English  References: Sabra L. Klein, PhD Associate Professor Department of Molecular Microbiology and Immunology Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health 615 N. Wolfe Street Baltimore, Maryland 21205 P: (410)955‐8898 E: [email protected]  Andrew Pekosz, PhD Associate Professor  Department of Molecular Microbiology and Immunology Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health 615 N. Wolfe Street 

46

Baltimore, Maryland 21205 P: (410) 502‐9306 E: [email protected]  David Gilbert, PhD J. Herbert Taylor Distinguished Professor of Molecular Biology Department of Biological Science Florida State University 319 Stadium Drive Tallahassee, Florida 32306 P: (850) 645‐7583 E: [email protected]