PROYECTO FIN DE MASTERMASTER OFICIAL EN NEUROCIENCIASUNIVERSIDAD
DE SALAMANCA
TRABAJO REALIZADO EN EL DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA Y BIOLOGA
MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA, BAJO LA DIRECCIN DE LOS
DOCTORES JUAN PEDRO BOLAOS HERNNDEZ Y NGELES ALMEIDA PARRA.
FORMACIN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO POR INTERFERENCIA EN LA
EXPRESIN DE LA GLUTAMATOCISTENA LIGASA
PATRICIA RODRGUEZ RODRGUEZ 2009
FORMACIN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO POR INTERFERENCIA EN LA
EXPRESIN DE LA GLUTAMATO- CISTENA LIGASA
NDICE1. INTRODUCCIN.Pgina 2
- Mitocondria y estrs oxidativo. Pgina 2 - Glutatin (GSH):
Funcin biolgica y sntesis.... Pgina 4
2. HIPTESIS Y OBJETIVO...
Pgina 6
3. MATERIAL Y METODOS- Especie ensayada, condiciones del
animalario y control de la edad gestacional - Cultivo primario de
neuronas.. - Tratamiento con MitoSOXTM. - Transferencia de
Western.
Pgina 7
Pgina 7 Pgina 7
- Transfecciones. Pgina 9Pgina 10 Pgina 10
- Citometra de flujo... Pgina 11 - Anlisis estadstico de los
resultados... Pgina 12
4. RESULTADOS Y DISCUSIN..- Disminucin de la expresin de la GCL
mediante SiRNA.
Pgina 12
- Cultivo primario de neuronas corticales de rata. Pgina 12Pgina
13
- Citometra de flujo... Pgina 15 - Microscopa... Pgina 16
5. CONCLUSIONES
Pgina 17
6. REFERENCIAS
Pgina 18
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FORMACIN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO POR INTERFERENCIA EN LA
EXPRESIN DE LA GLUTAMATO- CISTENA LIGASA
1. INTRODUCCINLas enfermedades neurodegenerativas son un grupo
de patologas
caracterizadas por la prdida progresiva de neuronas en reas
concretas del cerebro. Entre ellas cabe destacar la Enfermedad de
Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, Esclerosis Lateral Amiotrfica y
Enfermedad de Huntington.
Las enfermedades de Alzheimer y de Parkinson son las dos
enfermedades neurodegenerativas mas prevalentes. La enfermedad de
Alzheimer se caracteriza por una degeneracin cognitiva progresiva.
Se observan placas seniles compuestas de pptido beta amiloide y
ovillos neurofibrilares constituidos principalmente por protena tau
hiperfosforilada. Existe una variante familiar que aparece a edades
tempranas, aunque esto solo supone un 5-10% de los casos.(Brundin
et al. 2008) (Linazasoro 2008)
La Enfermedad de Parkinson se caracteriza por la prdida de
neuronas en la substantia nigra, y la aparicin de inclusiones
intraneuronales denominadas cuerpos de Lewy, que son inclusiones
citoplasmticas con alfa sinuclena y ubiquitina. A nivel clnico se
caracteriza por una serie de defectos motores, como temblor,
rigidez y bradicinesia, adems de otra serie de sntomas no motores.
Al igual que ocurre con la enfermedad de Alzheimer existen formas
familiares en las que estn implicadas al menos 10 loci genticos
distintos: PARK1-PARK10 (Olzmann et al. 2004).
- MITOCONDRIA Y ESTRS OXIDATIVOCada vez existen mas evidencias
que relacionan los defectos en la funcin mitocondrial y el estrs
oxidativo con la patognesis de las enfermedades neurodegenerativas.
Se sabe que la mitocondria contribuye al envejecimiento mediante la
acumulacin de mutaciones en el DNA mitocondrial y la produccin de
especies reactivas de oxgeno (ROS).
La generacin de especies reactivas de oxgeno a partir del
oxigeno molecular es un proceso fisiolgico que tiene lugar en las
clulas de todos los organismos aerbicos. Entre las principales
especies reactivas de oxigeno se encuentran el anin superxido
(O2.-) y el perxido de hidrogeno (H2O2) que se presentan en las
clulas en concentraciones basales del orden de nanomolar y
micromolar, respectivamente
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(Dawson y Dawson 1996). En general, y en el sistema nervioso
central (SNC) en particular, el anin superxido se forma in vivo
como consecuencia de la reduccin incompleta del oxigeno en la
cadena de transporte de electrones mitocondrial, aunque tambin
puede generarse por la accin de enzimas como la xantina oxidasa. Su
reaccin con la enzima superxido dismutasa (SOD) da lugar a la
generacin de H2O2, una sustancia poco reactiva pero con capacidad
oxidante. El H2O2 puede generarse adems por la accin de otras
enzimas como la monoamina oxidasa (catabolismo de la dopamina). El
O2- puede reaccionar en presencia de hierro dando lugar a la
formacin de radicales hidroxilo (.OH) mediante la reaccin de
Fenton. Asimismo, el H2O2 y el O2- pueden reaccionar entre s, en
presencia de cationes metlicos, mediante la reaccin de Haber-Weiss,
generando igualmente radicales hidroxilo, que son especies
altamente reactivas y oxidantes (Halliwell 1992; Peuchen et al.
1997). (Ver Esquema 1)Cadena de transporte electrnico mitocondrial
Xantina Oxidasa
O2.Reaccin de Haber- Weiss.
NO ONOO-
O2 + OH- +
.
OHO2
SOD
OH- + OH
.
Reaccin de Fenton Fe 3+ Fe 2+
H2O2Monoamino Oxidasa
Esquema 1: Generacin de especies reactivas de oxgeno.
Cuando se incrementa la produccin de sustancias oxidantes, o
bien se produce una deficiencia en los mecanismos antioxidantes
intracelulares, las especies reactivas de oxigeno resultan dainas
para la clula. Esta situacin de desequilibrio en la homeostasis
redox intracelular, es decir, entre oxidantes y antioxidantes, es
lo que se conoce como estrs oxidativo. Los daos celulares
producidos por estas sustancias son de naturaleza variada y afectan
a la estructura del DNA, de los lpidos de membrana y de muchas
protenas. En el sistema nervioso central, se ha descrito la
implicacin de las especies reactivas de oxigeno en los efectos
txicos y
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neurodegenerativos que tienen lugar en patologas como la
isquemia cerebral o las enfermedades de Parkinson y Alzheimer
(Halliwell 1992; Moro et al. 2005).
- GLUTATIN (GSH): FUNCIN BIOLGICA Y SNTESIS.El tripptido
glutatin (-L glutamil-L-cisteinlglicina) se encuentra ampliamente
distribuido en las clulas de animales, plantas y microorganismos.
Es el compuesto tilico presente en mayor concentracin en todas las
clulas (Meister 1988). Participa en distintas funciones como la
detoxificacin de xenobiticos, el mantenimiento de los grupos
sulfhidrilo de las protenas en su estado reducido, es cofactor de
varias enzimas y constituye la forma de almacenamiento y transporte
de la cistena en la clula, pero su funcin ms importante es la de
antioxidante intracelular, desempeando un papel crucial en la
defensa celular frente al estrs oxidativo y nitrosativo.
En su accin antioxidante, el glutatin puede combinarse de forma
no enzimtica con distintos radicales libres como superxido,
hidroxilo y xido ntrico, o actuar como donador de electrones en la
reduccin de perxidos, en una reaccin catalizada por la glutatin
peroxidasa. En ambos casos, el producto final es el glutatin
oxidado o disulfuro de glutatin (GSSG) (Dringen 2000). El perxido
de hidrgeno, el oxido ntrico y el peroxinitrito reaccionan con el
GSH mayoritariamente (>90%) mediante este mecanismo (Radi et al.
1991). El GSSG as formado es el sustrato de la flavoenzima glutatin
reductasa que transfiere electrones del NADPH al GSSG, regenerando
de esta forma el GSH. El estado redox celular viene determinado por
la relacin entre molculas oxidadas y reducidas en la clula. En
condiciones normales, el GSH representa el 98% del glutatin total
intracelular. Al ser el glutatin el antioxidante mayoritario,
incluso la oxidacin de una pequea cantidad de GSH a GSSG, puede
producir importantes cambios en el estado redox celular.
Otros compuestos como los xenobiticos, se unen al glutatin por
accin de las glutatin- S- transferasas formando aductos de glutatin
que se excretan al espacio extracelular (Meister 1988). En el
sistema nervioso central, este mecanismo de detoxificacin est
presente en astrocitos, pero no en neuronas (Johnson et al. 1993).
El GSH y sus aductos se liberan al medio extracelular, donde son
metabolizados a travs de reacciones enzimticas catalizadas por la
-glutamltranspeptidasa y la dipeptidasa, regenerndose de este modo
la glicina y la cistena. Este ltimo es el aminocido precursor
limitante de la sntesis de GSH (Sagara et al. 1993). En
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situaciones de estrs oxidativo se produce adems la eliminacin al
exterior celular de parte del GSSG formado (Meister 1988).
La concentracin intracelular de GSH es un factor determinante de
la vulnerabilidad neuronal al anin peroxinitrito (ONOO-) (Radi et
al. 1991; Bolanos et al. 1995) (Bolanos et al. 1996) (Almeida et
al. 1998; Clementi et al. 1998). De hecho, la concentracin
intracelular de GSH disminuye dramticamente cuando las neuronas se
exponen a ONOO- endgeno o exgeno (Bolanos et al. 1995) (Bolanos et
al. 1996; Almeida et al. 1998; Almeida et al. 2001). Es ms, el
ONOO- nicamente provoca el dao mitocondrial y la subsiguiente
muerte celular en los astrocitos cuando en stos se disminuyen
drsticamente las concentraciones intracelulares de glutatin (Barker
et al. 1996). En este sentido, es importante resaltar que los
astrocitos disponen de una alta concentracin intracelular de
antioxidantes, como el glutatin (Raps et al. 1989) (Sagara et al.
1993; Bolanos et al. 1995) y vitamina E (Makar et al. 1994), que no
poseen las neuronas, diferencia que puede explicar, al menos en
parte, la resistencia de los astrocitos frente a la citotoxicidad
del ONOO-.
Por otro lado, la activacin del ciclo de las pentosas fosfato
por H2O2 (BenYoseph et al. 1996) o peroxinitrito (Garcia-Nogales et
al. 2003) incrementa la disponibilidad de NADPH, necesario para la
regeneracin de GSH a partir de GSSG.
El glutatin se sintetiza de novo en el citosol celular en dos
reacciones ATPdependientes consecutivas, catalizadas por la
glutamato-cistena ligasa (GCL, EC 6.3.2.2) y la glutatin sintetasa
(GSHS, EC 6.3.2.3) (Ver esquema 2). La primera es limitante y se
inhibe por retroalimentacin por producto final (GSH) (Dringen
2000). En sta, el L-glutamato y L-cistena forman
L--glutamil-L-cistena (-GC). En la segunda reaccin, la -GC se une a
la L-glicina generando GSH.
La GCL es una protena heterodimrica, compuesta por una subunidad
cataltica (GCLCat, PM ~ 73000 Da) y una subunidad moduladora
(GCLMod, PM ~30000 Da). sta modula la afinidad de la cataltica por
los sustratos y los inhibidores, reduciendo as la Km de la GCLCat
por el glutamato, e incrementando la Ki para el GSH. Ambas
subunidades han sido clonadas y secuenciadas (Yan yMeister 1990;
Huang et al. 1993), de forma que estn codificadas por diferentes
genes con diferentes localizaciones cromosomales. La expresin de
ambas subunidades est poco
coordinada, posiblemente por estar situadas en cromosomas
diferentes, de forma que el control de la transcripcin de ambas
subunidades es independiente y diferente
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FORMACIN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO POR INTERFERENCIA EN LA
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segn los tejidos (Dahl yMulcahy 2001). Ambas subunidades estn
unidas mediante un puente disulfuro (Seelig et al. 1984; Chang
yChang 1994) (Misra yGriffith 1998) aunque a juzgar por la
resistencia frente a tioles, es evidente la presencia de fuerzas no
covalentes como decisivas en la estabilidad del dmero (Chang yChang
1994).
L- Glu
GCL- GC
GSHSGSHATP ADP + Pi
L- Cys
ATP
ADP + Pi
L- Gly
Esquema 2: Sntesis de glutatin (GSH)
2. HIPTESIS Y OBJETIVODado que la GCL es la enzima limitante en
la biosntesis de novo del GSH, su regulacin es de especial
importancia en la defensa celular frente al estrs oxidativo y/o
nitrosativo. Por lo tanto, conocer las vas de sealizacin en las que
est involucrado el glutation podra ayudar a dilucidar los
mecanismos moleculares implicados en la muerte neuronal que se
asocia a las enfermedades
neurodegenerativas.
Actualmente, la nica herramienta conocida para estudiar la
funcin del glutatin es el compuesto denominado
L-butionina-sulfoximina (L-BSO), un anlogo del L-glutamato que
inhibe competitivamente la GCLcat. Sin embargo, L-BSO presenta el
inconveniente de su inespecificidad, ya que tambin inhibe la
glutation sintetasa, e imposibilidad de su uso in vivo, dado que no
atraviesa la barrera hematoenceflica. Por este motivo, en el
presente trabajo nos planteamos disear e implementar una
herramienta molecular, a ser posible ms especfica, que nos
permitiera interferir en la biosntesis de glutation en cultivos
primarios de neuronas. Con los resultados previsibles pretendemos
establecer una herramienta til para el estudio de los mecanismos
moleculares implicados en la neurodegeneracin asociada a ciertas
enfermedades neurodegenerativas, tales como la Enfermedad de
Parkinson.
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FORMACIN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO POR INTERFERENCIA EN LA
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3. MATERIAL Y MTODOS- ESPECIE ENSAYADA, CONDICIONES DEL
ANIMALARIO Y CONTROL DE LA EDAD GESTACIONAL
Para la realizacin de todos los cultivos se emplearon ratas
albinas de raza Wistar, criadas y suministradas por el Servicio de
Experimentacin Animal de la Universidad de Salamanca. Los animales
se criaron en jaulas manteniendo un ritmo de luz-oscuridad de 12
horas, con fase de oscuridad entre las 20:00 y las 8:00 horas del
da siguiente. La humedad oscil entre el 45 % y el 65 % y la
temperatura entre los 20 C y los 25 C. Los animales se alimentaron
ad libitum con una dieta slida estndar (17 % de protenas, 3 % de
lpidos, 58,7 % de glcidos, 4,3 % de celulosa, 5 % de minerales y 12
% de humedad) y tuvieron en todo momento acceso libre al agua de
bebida.
La edad gestacional de la rata se control limitndose a una noche
el tiempo de cohabitacin de las ratas vrgenes con los machos. A las
9:00 horas de la maana siguiente se separaron aquellas que
presentaban espermatozoides en el frotis vaginal, acompaados de
clulas epiteliales de la vagina caractersticas del da frtil del
estro. Bajo estas condiciones, el periodo de gestacin de la rata se
asume que es de 21,7 das.
Todos los tratamientos con animales cumplen con la normativa
vigente de la comisin europea del 18.06.2007 (2007/526/CE) y la
legislacin espaola (RD 1201/2005) sobre las lneas directrices
relativas al alojamiento y cuidado de los animales utilizados para
experimentacin y otros fines cientficos, y los protocolos fueron
aprobados por el Comit tico para la Experimentacin Animal y Humana
del Instituto de Neurociencias de Castilla y Len (INCyL).
- CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS
Para la realizacin del cultivo primario de neuronas se emplearon
fetos de rata de 16 das de gestacin (Almeida et al. 1998). Las
ratas gestantes fueron anestesiadas con ter etlico y sacrificadas
mediante dislocacin cervical.
Posteriormente se extrajeron los fetos mediante una
histerectoma. Los fetos se
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trasladaron en una placa petri a una cabina de flujo laminar
(TC48, Gelaire Flow Laboratories, McLean, Virginia, EEUU) para
garantizar las condiciones de esterilidad del cultivo. Con la ayuda
de tijeras, pinzas y papel impregnado en etanol al 70 %, se retir
el crneo y se extrajeron ambos hemisferios cerebrales.
El tejido as obtenido se deposit sobre una placa Petri de
poliestireno que contena la solucin de disgregacin (NaCl 116 mM,
KCl 5,4 mM, NaH2PO4 1,01 mM, MgSO4 1,5mM, NaHCO3 26 mM, glucosa 4
mM, rojo fenol 10 mg/mL, albmina 0,3 % p/v y DNAsa tipo I 20 g/mL a
pH 7,2) y, empleando un bistur, se disgreg parcialmente y se dej
decantar en un tubo de 50 mL (BD, Falcon, Bedford, Massachussets,
EEUU) durante 4 minutos. El sedimento obtenido se resuspendi en la
solucin de tripsinizacin (solucin de disgregacin suplementada con
tripsina al 0,025 %, p/v) y se incub a 37 C durante 15 minutos, en
un bao agitando suavemente cada 2-3 minutos para facilitar la
tripsinizacin. Transcurrido este tiempo, la digestin se detuvo
aadiendo suero fetal de ternera (FCS; Roche Diagnostics,
Heidelberg, Alemania) a una concentracin final del 10 % v/v y el
tejido se centrifug a 500 x g durante 5 minutos (Beckman
Instruments, Palo Alto, California, EEUU).
El sedimento resultante se resuspendi en 12 mL de la solucin de
disgregacin y, para conseguir su disociacin, se hizo pasar 9 veces
a travs de una pipeta Pasteur previamente siliconada y con la punta
redondeada. Tras dejar reposar la solucin celular durante 4
minutos, se recogi cuidadosamente el sobrenadante conteniendo las
clulas disociadas en un tubo de 50 mL. Este proceso se realiz otra
vez resuspendiendo el sedimento en 9 mL de la solucin de
disgregacin para incrementar la eficiencia. Los sobrenadantes
obtenidos se combinaron y las clulas disociadas se centrifugaron de
nuevo a 500 x g durante 5 minutos. El sedimento celular se
resuspendi primero en 1 mL de DMEM (Dulbeccos Modified Eagle
Medium; Sigma-Aldrich Chemical Co., Barcelona, Espaa) y, a
continuacin, en 20 mL de DMEM, y una pequea alcuota de esta
suspensin celular (10 L) se diluy cuatro veces y se mezcl con un
volumen igual de azul de tripano (Sigma-Aldrich) al 0,4 % para el
recuento celular, empleando para ello una cmara cuentaglbulos de
Neubauer (Zeiss, Oberkochen, Alemania) y un microscopio de
contraste de fases, modelo CK30 (Olympus, Japn).
Una vez determinado el nmero de clulas, la suspensin se diluy en
el medio de cultivo (DMEM suplementado con FCS al 10 %) y se
sembraron a una densidad de de 250.000 clulas/cm2 en placas de
cultivo (Nunc; Roskilde, Dinamarca) previamente
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recubiertas con poli-D-lisina (10 g/mL; Sigma-Aldrich). Las
placas se colocaron en un incubador termostatizado a 37 C (Thermo
Forma 310, Thermo-Fisher Scientific, Ohio, EEUU) con una atmsfera
saturada de vapor de agua, compuesta por un 95 % de aire y un 5 %
de CO2.
A los dos das de cultivo, el medio se cambi por DMEM
suplementado con suero de caballo (Sigma-Aldrich) al 5 % v/v,
glucosa 20 mM (Sigma-Aldrich). Al cuarto da de cultivo se aadi
arabinsido de citosina 10 M (Sigma-Aldrich) para impedir la
proliferacin de clulas no neuronales. Las clulas se utilizaron a
los 6-7 das de cultivo. Bajo estas condiciones, los cultivos de
neuronas mostraron una pureza aproximada del 97-99 %, determinada
mediante inmunorreaccin con el marcador neuronal Map-2 (Almeida et
al. 2005).
Todos los medios de cultivo se suplementaron con penicilina (100
U/mL), estreptomicina (100 g/mL) y anfotericina B (0,25 g/mL)
suministrados por SigmaAldrich.
- TRANSFECCIONESLas transfecciones celulares se realizaron con
el reactivo catinico
Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Madrid), siguiendo las
instrucciones detalladas por el fabricante. Para reducir la
expresin de GCL decidimos emplear la tecnologa del RNA de
interferencia. Basndonos en criterios de diseo racional de siRNA
(Reynolds et al. 2004), seleccionamos la secuencia mostrada en la
Tabla 1, que est dirigida contra la subunidad cataltica de la GCL.
Como control empleamos un siRNA dirigido contra la luciferasa, por
emplearse de forma rutinaria en nuestro laboratorio (Tabla 1). La
concentracin final de siRNA empleada fue de 100 nM. Los dplex
siRNAs se adquirieron comercialmente (Dharmacon, Lafayette,
Colorado, EEUU).
SiRNA GCL SiRNA Luciferasa
5-GAAGGAGGCTACTTCTATA-3 5-CTGACGCGGAATACTTCGA-3
Tabla 1: Secuencias del SiRNA empleado para disminuir la
expresin de la GCL y como control (SiRNA Luciferasa).
Por otro lado, estas mismas secuencias se utilizaron tambin en
forma de RNA en horquilla de pequeo tamao o small hairpin RNA
(shRNA) mediante el empleo del
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FORMACIN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO POR INTERFERENCIA EN LA
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vector de expresin pSuper-neo/GFP (Oligoengine, Seattle,
Washington, EEUU). La eleccin de este sistema nos permiti
identificar las clulas eficientemente transfectadas por seleccin
del marcador (GFP) mediante citometra de flujo. Como es sabido, la
estructura en horquilla del shRNA se reconoce por la enzima Dicer,
que la digiere en los RNA pequeos de interferencia (siRNA)
funcionales. As, tanto por el mtodo del siRNA como del shRNA, la
separacin de las hebras del siRNA permite la unin de una de ellas a
la secuencia complementaria del RNA mensajero. Como consecuencia se
produce la degradacin del mRNA por el complejo RISC, que conduce a
una disminucin de la abundancia de la protena.
- TRATAMIENTO CON MITOSOXMitoSOXTM Red es un reactivo derivado
de hidroxietidina (HE) que permite detectar de manera selectiva la
produccin de anin superxido en clulas vivas mediante citometra de
flujo y microscopia confocal. La oxidacin del anin superxido
produce la liberacin de un producto fluorescente que se excita a
una longitud de onda de 480 nm, con un mximo de emisin de 567 nm.
MitoSOXTM Red se dirige especficamente hacia la mitocondria, donde
se une al DNA mitocondrial y muestra fluorescencia en funcin del
grado de oxidacin. Para el tratamiento con MitoSOXTM Red se lavaron
las clulas una vez con el medio Hanks (glucosa 5.5 mM, Ca2+, Mg2+,
pH=7.4) a 37 C. Posteriormente se realiz una incubacin con
MitoSOXTM Red durante 30 minutos en un incubador termostatizado a
37C. Luego se realizaron lavados nuevamente con Hanks y se
tripsiniz con EDTA al 10%. Las muestras as obtenidas se pusieron en
tubos de citmetro, centrifugando durante 5 minutos a 500g. El
sobrenadante obtenido en la centrifugacin se desech y se realizo un
nuevo lavado con 500 L de Hanks, volviendo a centrifugar 5 minutos
a 500g. Finalmente, el pellet obtenido se resuspendi en un volumen
final de 500 L de Hanks fro y se analiz por citometra de flujo.
- TRANSFERENCIA DE WESTERNPara obtener los extractos proteicos
totales, las clulas se lavaron con PBS y se lisaron en tampn de
lisis, compuesto por RIPA (SDS al 1 %, EDTA 0,5 M, Triton Tx-100 al
1 % v/v, NaCl 150 mM, Na2HPO4 10 mM a pH 7,0) al que se le aaden
inhibidores de proteasas y fosfatasas (aprotinina 50 g/mL,
leupeptina 50 g/mL,
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inhibidor de tripsina (soybean) 50 g/mL, TLCK 100 M, NaF 50 mM,
ortovanadato sdico 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 100
M, N-p-tosil-L-fenilamina
clorometil cetona (TPCK) 100 M, fenantrolina 1 mM y pepstatina A
50 g/mL). Los extractos se hirvieron durante 5 minutos, se
centrifugaron a 13.000 x g durante 10 minutos y se recogi el
sobrenadante. La concentracin de protenas se determin mediante el
sistema BCA (Pierce, Rockwell, Illinois, EEUU).
Las protenas (50 g aprox.) de los extractos obtenidos se
separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (solucin
de acrilamida/bisacrilamida 29/1; BioRad Labortories S.A.,
Alcobendas, Madrid) al 8 %, con un marcador de peso molecular de
protenas (BenchmarkTM, Invitrogen, Carlsbad, California, EEUU),
utilizando un sistema de electroforesis vertical (MiniProtean-3,
BioRad Laboratories, California, EEUU). Posteriormente, las
protenas se transfirieron electroforticamente a membranas de
nitrocelulosa (Hybond, Amersham Biosciences) que, tras la
transferencia, se bloquearon con leche al 5 % p/v en TTBS (Tris 20
mM, NaCl 500 mM, Tween 20 al 0,1 % v/v a pH 7,5), durante 1 hora.
Las membranas se incubaron en la solucin de anticuerpos (TTBS
suplementado con BSA al 2 % p/v) que contena el anticuerpo para la
GCL (1/500, Abcam, Cambridge, UK) a 4 C durante toda la noche. Tras
lavar 3 veces con TTBS, las membranas se incubaron en TTBS con BSA
al 2 % en presencia del anticuerpo secundario adecuado; conjugado
con la peroxidasa de rbano a 25 C durante 45 minutos.
Finalmente,
las
membranas
se
incubaron
con
el
reactivo
de
quimioluminiscencia SuperSignalTM West Dura (Pierce) y se
expusieron a una pelcula Kodak XAR-5 (Sigma-Aldrich).
- CITOMETRA DE FLUJOEl anlisis se realiz utilizando un citmetro
de flujo FACScalibur (BD, Bioscences) y los programas CellQuestTM
PRO y Paint-A-GateTM
PRO (BD
Bioscences). Se seleccionaron nicamente las clulas que
presentaran fluorescencia verde, posteriormente cuantificando la
fluorescencia roja debida al MitoSOXTM Red para determinar el
incremento de estrs oxidativo en las clulas transfectadas con el
RNA para la GCL frente a los controles, transfectados con RNA para
la Luciferasa.
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- ANLISIS ESTADSTICO DE LOS RESULTADOSTodos los valores se
expresaron como medias S.E.M. (error estndar de la media). La
significatividad se determin mediante anlisis de la varianza,
seguido del test de la menor diferencia significativa de rango
mltiple (para comparaciones mltiples) o el test de la t de Student
(para comparaciones entre dos nicos grupos de valores). En todos
los casos, un valor de p