UNIVERSITATEA DE MEDICINA ȘI FARMACIE CRAIOVA ȘCOALA DOCTORALĂ TEZĂ DE DOCTORAT CORELAȚII IMUNOHISTOCHIMICE ȘI MOLECULARE LA NIVELUL MICROVASCULARIZAȚIEI VENOASE ÎN MELANOMUL CUTANAT PRIMAR REZUMAT CONDUCĂTOR DOCTORAT: PROF.UNIV.DR. FRANCISC MIXICH Student doctorand: GABRIELA AVRAM Craiova 2013
17
Embed
TEZĂ DE DOCTORAT imunohistochimice si...tumorii în faze verticală de creștere. 4. 2.1. Metoda de cuantificare a venuleor MECA-79 pozitve Imunohistochimia a fost efectuată pe microsecțiuni,
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSITATEA DE MEDICINA ȘI FARMACIE CRAIOVA
ȘCOALA DOCTORALĂ
TEZĂ DE DOCTORAT CORELAȚII IMUNOHISTOCHIMICE ȘI MOLECULARE LA
NIVELUL MICROVASCULARIZAȚIEI VENOASE ÎN
MELANOMUL CUTANAT PRIMAR REZUMAT
CONDUCĂTOR DOCTORAT:
PROF.UNIV.DR. FRANCISC MIXICH
Student doctorand:
GABRIELA AVRAM
Craiova 2013
2
CUPRINS
I. Stadiul actual al cunoaşterii 3
II. Contribuții personale 4
Obiective 4
Material şi metodă 4
Metoda de cuantificare a venuleor MECA-79 pozitve 6
Reacția de polimerizare în lanț ( PCR) 8
Analiza statistică 8
Rezultate 8
Discuții 10
Concluzii 12
Bibliografie selectivă 15
Cuvinte cheie: melanom, high endothelial venules, MECA-79, regresie,
chemokine, CCL19, CCL21, CCR7
3
I.Stadiul actual al cunoaşterii
Melanomul malign reprezintă o neoplazie a cărui incidență este într-o continuă
creștere, fiind responsabil de 75% din decesele cauzate de neoplaziile cutanate. Deși în
stadiile incipiente, aceasta este de obicei curabil prin rezecție chirurgicală, ratele de
mortalitate prin melanom metastatic sunt încă mari datorită absenței unui tratament
eficient pentru acestă malignitate.[1,2]
O serie de interacțiuni complexe și căi de semnalizare între celulele tumorale și
celulele sistemul imun sunt implicate în procesul de diseminare al melanomului în
ganglionii limfatici.[3,4]
În timpul răspunsului imun în condiții normale, traficulul limfocitelor din sânge
la nivelul ganglionilor limfatici are loc prin venulele mici, denumite venule cu endoteliu
înalt (High Endothelial Venules).[5, 6] HEV sunt venule postcapilare, specializate care
din punct de vedere morfologic și funcțional sunt distincte de venulele obișnuite, acestea
pot fi găsite în zonele paracorticale și interfoliculare ale ganglionilor limfatici.[7]
În melanomul malign, prezența infiltratului limfocitar tumoral (tumour infiltrating
lymphocytes,TIL) este asociată cu un efect anti-tumoral și implicit participă la procesul
de regresie a acestui neoplasm. TIL este direct corelat cu un răspuns imun eficace
împotriva celulelor tumorale, constituind un factor de prognostic pentru supraviețuire.[8]
Martinet și colab.[9] au raportat, pentru prima dată, prezența HEV în tumorile
umane solide, inclusiv în cadrul melanomului cutanat, unde acestea facilitează infiltrarea
limfocitelor la nivel tumoral. Martinet și colab.[10], au demonstrat că densitate mare a
venulelor cu endoteliu înalt a fost corelată cu supraexpresia chemokinelor CCL19 și
CCL21. De asemenea, au constatat că există o puternică legatură între densitatea
intratumorală a venulelor cu endoteliu înalt și procesul de regresie tumorală.
Prezența HEV a fost observată și în cadrul melanomului metastatic, asocierea
acestora cu acumularea de limfocite în structuri nodulare purtând denumirea de organe
limfoide terțiare (tertiary lymphoid organs, TLO).[11] TLO au similitudini morfologice,
4
celulare și vasculare semnificative cu organele limfoide secundare, în special cu
ganglionii limfatici.[12]
Anumite chemokine, CCL19 și CCL21, sunt exprimate constitutiv de celulele
stromale, celule dendritice și de către celulele tumorale din melanom.[13,14] CCL19 și
CCL21 sunt transferate la nivelul celulelor endoteliale unde interacționeză cu receptorul
său specific CCR7, direcționând astfel migrarea limfocitelor la ganglionii limfatici via
HEV.[15,16] În plus, expresia CCR7 în celule tumorale din melanom a fost corelată cu
migrarea celulelor tumorale și dezvoltarea metastazelor în ganglionii limfatici.[17,18]
II.CONTRIBUȚII PERSONALE
CAPITOLUL 4. OBIECTIVE. MATERIAL ȘI METODĂ
4.1 Obiectivele lucrării Studiul propune o evaluare completă şi amănunţită a melanomului cutanat primar,
cu ajutorul metodelor clasice de investigare (clinice și paraclinice), precum şi a unor
tehnici moderne cum sunt imunohistochimia şi reacția de polimerizare în lanț
(polymerase chain reaction, PCR).
În acest studiu au fost evaluate mai multe probe de melanom malign cutanat în diferite
etape ale progresiei tumorale urmărindu-se identificarea unor caracteristici histologice
în vederea folosiri acestora ca posibili markeri de evaluare a prognosticului. Cercetarea în
această direcţie este de mare actualitate şi obţinerea rezultatelor propuse poate contribui
la creşterea gradului de cunoaștere a mecanismelor ce intervin în răspunsul antitumoral și
respectiv în procesul de regresie.
Principalele obiective specifice ale studiului includ:
» Evaluarea caracteristicilor histologice tumorale în diferite faze de progresie
tumorală;
» Extinderea cunoștintelor legate de mecanismele ce intervin în procesul de
regresie al melanomului malign cutanat;
» Identificarea venulelor cu endoteliu înalt și legatura acestora cu diferite
caracteristici tumorale dar și cu răspunsul antitumoral.
5
Utilizând tehnica de imunohistochimie ne-am propus să cuantificam și să
caracterizăm profilul vaselor cu endoteliu înalt (HEV) în diferite tipuri de melanom
(melanoma primar, melanom cu metastaze în tranzit și metastaze viscerale). Metoda are
la bază utilizarea anticorpului monoclonal MECA-79 urmată de evaluarea microscopică a
pozitivității vaselor. De asemenea ne-am propus să evaluăm prin tenhica PCR expresia
genică a chemokinelor CCL19, CCL21 dar și a receptorului lor CCR7 în vederea corelării
gradului de expresie cu densitatea venulelor cu endoteliu înalt.
În cercetarea actuală ne-am propus de a spori cunoașterea mecanismelor
moleculare și imunologice implicate în fenomenului de regresie în corelație cu
prezența/absența vaselor cu endoteliu înalt.
4.2. Material și metodă
În acest studiu retrospectiv, am analizat 85 de probe tumorale obținute de la
pacienți diagnosticați cu melanom cutanat. Probele au fost colectate într-o perioadă de 10
ani (2002-2011), la Departamentul de Patologie, al Spitalului Clinic Universitar
Valencia, Spania.
Probele au fost puse la dispoziția noastră cu binevoința Prof. Univ. Dr. CARLOS
MONTEAGUDO în cadrul proiectului POSDRU/107/1.5/S/82705. Cazurile au fost
selectate din specimene consecutive de melanom, primite la Departamentul de Patologie
cu singura condiție ca specimenele tumorale să fie primite proaspete și nefixate. Probele
de melanom primar și metastatic, au fost manual secționate pentru a obține secțiuni
tumorale cu mai mult de 90% conținut de țesut tumoral.
Din fiecare probă s-a prelevat:
» Un fragment tumoral a fost luat pentru realizarea extracție ARN-ului. În cazul
melanoamelor primare s-a prelevat prima secțiune, imediat adiacent zonei cu grosimea
tumorală cea mai mare. Probele tumorale proaspete au fost imediat congelate în azot
lichid și păstrate la o temperatură de -80 ° Celsius.
» Cea de-a doua secțiune în parafină după tehnica de includere standard.
Lotul de studiu a cuprins cazuri de melanoam primar, metastaze în tranzit și
metastaze la distanță.
6
Probele de melanom cutanat ce prezentau metastaze ganglionare nu au fost incluse în
studiu, deoarece vasele cu endoteliu înalt reprezintă o componentă normală a
ganglionilor limfatici.
Caracteristicile clinico-patologice evaluate ale pacienților incluși în studiu sunt:
vârsta, sex, localizare, tipul histologic, ulcerația, nivelul Clark, grosime Breslow, faza de
creștere, regresia, mitoze, nevi asociați în amtecedente și gradul de infiltrare limfocitară.
Regresia tumorală a fost evaluată în conformitate cu College of American
Pathologists (CAP) 2012 respectiv: Ӕnlocuirea celulelor tumorale cu infiltrate inflamator
limfocitar, precum și prezența de fibroză la nivelul dermului, melanofagocitoză și
telangiectazii”.
Infiltratul inflamator limfocitar a fost evaluat, de asemenea, conform College of
American Pathologists (CAP) și a fost împărțit în 3 categorii:
» absent→ limfocitele nu sunt prezente la nivel tumoral sau sunt prezente, dar nu
infiltreză tumora;
» non-dens→infiltratul limfocitar apare numai focal dar nu și de-a lungul întregii
baze în faza de verticală creștere;
» dens→ infiltratul inflamator limfocitar se găseste difuz pe întreaga bază a
tumorii în faze verticală de creștere.
4. 2.1. Metoda de cuantificare a venuleor MECA-79 pozitve
Imunohistochimia a fost efectuată pe microsecțiuni, folosind probe de țesut fixate
în formol și în parafină. Tehnica a fost realizată cu ajutorul sistemului de detectare