TEZ Ă DE DOCTORAT CERCET ĂRI PRIVIND TRASABILITATEA … · fierberea mustului de bere. Spectrul compu şilor prenilflavonoidici care se reg ăsesc Spectrul compu şilor prenilflavonoidici

UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DE STUDII DOCTORALE DOMENIUL BIOTEHNOLOGII

TEZĂ DE DOCTORAT

CERCETĂRI PRIVIND TRASABILITATEA UNOR SUBSTANłE BIOLOGIC ACTIVE ÎN

BIOTEHNOLOGIA BERII

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

Ing. ELENA DIMA (MUDURA)

CONDUCATOR STIINTIFIC PROF.UNIV.DR. CARMEN SOCACIU

2009

I

SCOP ŞI OBIECTIVE

Determinarea unor compuşi biologic activi din clasa substanŃelor

prenilflavonoidice este un pas important în studiul calităŃii hameiului şi berii.

Xantohumolul, izoxantohumolul şi 8-prenilnaringenina sunt compuşi prezenŃi

numai în planta de hamei şi singura cale de expunere a organismului uman la

acŃiunea benefică a acestor compuşi este berea.

Xantohumolul şi izoxantohumolul au fost intens studiaŃi în ultima

perioadă pentru efectul lor anticancerigen demonstrat prin studii in vivo şi pentru

efectele antioxidante, antimicrobiene, antivirale, antimutagene demonstrate prin

numeroase studii in vitro. 8- prenilnaringenina este considerată astăzi cel mai

puternic fitoestrogen cunoscut.

Lucrarea de faŃa are ca scop studiul trasabilitaŃii unor substanŃe biologic

active din clasa prenilflavonoidelor în biotehnologia berii, urmărind îndeosebi

posibilitatea realizării unui tip de bere funcŃionalizate cu acest tip de compuşi care

au capacitate antioxidantă.

Berea este obŃinută din ingrediente naturale, orz, hamei, apă şi drojdie.

Fiecare dintre acestea contribuie la profilul nutriŃional al produsului finit, în

funcŃie de cantitatea folosită şi de tehnologia adoptată.

Hameiul este un ingredient important în biotehnologia berii. El conferă

unicitate acestui produs din perspectiva caracteristicilor senzoriale. In afară de

acestea, hameiul conŃine numeroase principii active, care de-a lungul timpului au

fost utilizate atât în industria alimentară, cât şi în farmacologie.

Conul de hamei care se utilizează în industria berii, conŃine o glandă,

lupulina, în care se acumulează numeroşi metaboliŃi secundari, dintre care cei mai

importanŃi sunt acizii amari şi substanŃele fenolice. Aceşti compuşi sunt

responsabili de valoarea biologică ridicată a produselor obŃinute din hamei. In

aceste condiŃii, valorificarea principiilor active din hamei constituie o oportunitate

pentru dezvoltarea unor sortimente de bere cu proprietăŃi funcŃionale, care să se

adreseze unei categorii speciale de consumatori.

II

Pentru realizarea cercetărilor au fost selecŃionate patru soiuri reprezentative

de hamei, Magnum şi Brewers Gold ca şi soiuri amare, Hüller Bitterer şi Perle ca

şi soiuri aromate, cultivate în arelalele pedo-climatice de mare favoritate din zona

Sighişoarei, fermele Saschiz şi Seleş. Probele de hamei recoltate au fost folosite ca

şi materie primă pentru obŃinerea berii în staŃia pilot a UniversitaŃii de ŞtiinŃe

Agricole şi Medicină Veterinară din Cluj-Napoca.

Pentru realizarea unei beri funcŃionale, alături de măsurile tehnologice

necesare pentru conservarea şi developarea principiilor active din hamei, se impun

o serie de proceduri analitice de investigare a calităŃii şi cantităŃii acestor compuşi

în hamei, pe fluxul tehnologic şi în bere.

Principalele obiective ale studiului de faŃă sunt:

1. Identificarea şi cuantificarea răşinilor amare din patru soiuri de hamei

cultivate în România.

2. Identificarea şi cuantificarea unor substanŃelor prenilflavonoidice

specifice hameiului în patru soiuri cultivate în România.

3. Optimizarea procesului biotehnologic pentru obŃinerea unei beri

funcŃionale cu o concentraŃie ridicată de substanŃe prenilflavonoidice.

4. Trasabilitatea substanŃelor prenilflavonoidice în relaŃie cu capacitatea

antioxidantă a berii funcŃionale realizate.

Teza este structurată în următoarele părŃi:

PARTEA INTÂI: STUDIU DE LITERATUR Ă, cuprinde trei capitole:

Capitolul.1 SubstanŃe bioactive din bere, descrie în zece subcapitole,

principalele clase de compuşi chimici care contribuie la profilul nutriŃional

bioactiv al berii.

Capitolul.2 Hameiul (Humulus lupulus L.).Caracterizare, compoziŃie

chimică şi compuşi bioactivi, descrie în 2 subcapitole unitare principalele

noŃiuni de biologie a plantei de hamei, respectiv sistematica şi soiurile, precum

principalele clase de compuşi biologic activi din compoziŃia chimică a

conurilor de hamei.

Capitolul.3 Metodologii moderne de analiză a compuşilor bioactivi din

hamei şi bere, cuprinde patru subcapitole în care sunt prezentate metodele de

III

identificare şi cuantificarea a principalilor compuşi bioactivi din hamei şi bere,

respectiv a răşinile amare, substanŃele prenilflavonoidice, compuşilor fenolici

şi substanŃelelor amare din bere.

PARTEA A DOUA: CERCET ĂRI PROPRII, cuprinde trei capitole:

Capitolul.4 Analiza substanŃelor amare din soiurile de hamei Magnum,

Brewers Gold, Huller Bitterer şi Perle, cultivate în România, cuprinde trei

subcapitole referitoare la prezentarea probelor de hamei luate în lucru, a

metodelor se separare, identificare şi dozare a răşinilor amare specifice şi

nespecifice din conurile şi peleŃii de hamei, rezultate şi discuŃii.

Capitolul.5 Analiza unor substanŃe prenilflavonoidice din soiurile de

hamei Magnum, Brewers Gold, Huller Bitterer şi Perle, cultivate în

România, cuprinde două subcapitole referitoare la identificarea şi

cuantificarea unor compuşi prenilflavonoidici specifici hameiului, respectiv a

xantohumolului, izoxantohumolului şi 8-prenilnaringeninei, prin cromatografie

lichidă de înaltă performanŃă cuplată cu spectrometria de masă (HPLC-

MS/MS), rezultate şi discuŃii.

Capitolul.6 Trasabilitatea substanŃelor prenilflavonoidice în biotehnologia

de obŃinere a unei beri funcŃionale în staŃia pilot a USAMV Cluj-Napoca,

cuprinde două subcapitole referitoare la materiile prime utilizate, tehnologia

adoptată pentru realizarea studiului, metodele analitice de investigaŃie,

rezultate şi discuŃii.

Partea de cercetări proprii se încheie cu un capitol de Concluzii şi bibliografia

aferentă studiilor efectuate.

Analizele aferente studiului au fost realizate în colaborare cu colectivele

Laboratorului de Incercări pentru Controlul şi SiguranŃa Alimentelor şi

Laboratorului Centrului de Cercetări Produse Vegetale din cadrul UniversităŃii de

ŞtiinŃe Agricole şi Medicină Veterinară din Cluj-Napoca, precum şi Centrului de

Cercetare Biofarmaceutică şi Farmacocinetică a Medicamentului din cadrul

UniversităŃii de Medicină şi Farmecie Iuliu HaŃeganu din Cluj-Napoca.

IV

Elementele de originalitate ale acestei teze constau în:

• Primul studiu din România de identificare şi caracterizare cantitativă

a unor compuşilor prenilflavonoidici din hameiul românesc;

• Dezvoltarea şi validarea unei metode de identificare şi cuantificare a

xantohumolului, izoxantohumolului şi 8-prenilnaringeninei din hamei şi bere;

• Dezvoltarea şi validarea unei metode de identificare şi cuantificare a

acizilor amari din hamei;

• ObŃinere a unei beri funcŃionale cu o concentraŃie ridicată de

prenilflavonoide.

V

CERCETĂRI PROPRII

In ultimii ani consumatorul de alimente şi băuturi este din ce în ce mai bine

informat despre rolul dietei alimentare în menŃinerea sănătaŃii, în protejarea

organismului faŃă de factorii de poluare sau pentru compensarea unor deficienŃe în

funcŃionarea organismului. In acest context dezvoltarea unor alimente funcŃionale

cu proprietăŃi bioactive a devenit o necesitate. SubstanŃele polifenolice din

materiile prime vegetale sunt considerate ca având un rol antioxidant important în

prevenirea bolilor degenerative (Socaciu, 2008). Un interes deosebit este acordat

hameiului şi substanŃelor prenilflavonoidice din hamei, dintre care xantohumolul,

izoxantohumolul şi 8-prenilnaringenina sunt cei mai importanŃi. Xantohumulul şi

izoxantohumolul sunt consideraŃi antioxidanŃi naturali cu " un larg spectru de

acŃiune", pentru prevenirea şi tratamentul cancerului, în special a cancerului de

prostată şi a cancerului de sân, pentru tratamentul şi prevenirea arterosclerozei. 8 –

prenilnaringenina este considerat cel mai puternic fitoestrogen cunoscut până

astăzi. Singura sursă nutritională pentru aceşti componenŃi din dieta umană este

berea. ObŃinerea unei beri funcŃionale cu o concentraŃie ridicată de

prenilflavonoide poate să aducă importante beneficii consumatorului, atunci când

este consumată cu moderaŃie.

Compuşii prenilflavonoidici din bere provin în totalitate din hameiul utilizat la

fierberea mustului de bere. Spectrul compuşilor prenilflavonoidici care se regăsesc

în mustul de bere depinde de calitatea şi cantitatea de hamei utilizat şi de

parametrii procesului de fierbere a mustului de bere cu hamei. Prin fermentaŃia

alcoolică a mustului şi condiŃionarea berii, concentraŃia de substanŃe

prenilflavonoidice se reduce în special datorită adsorbŃiei acestor compuşi pe

suprafaŃa drojdiei de bere. Cantitatea finală depinde aşadar de caracteristicile

materiilor prime utilizate, de tehnologia de extracŃie utilizată şi de capabilitatea

instalaŃie de lucru.

VI

I. ANALIZA SUBSTANłELOR AMARE DIN SOIURILE

MAGNUM, BREWERS GOLD, HÜLLER BITTERER ŞI PERLE

CULTIVATE ÎN ROMÂNIA

I.1 MATERIALE ŞI METODE

I.1.1 Probele de hamei

Studiul compoziŃiei chimice a răşinilor amare şi substanŃelor

prenilflavonoidice a fost realizat pentru patru soiuri de hamei, Magnum, Brewers

Gold, Hüller Bitterer şi Perle, cultivate în areale pedoclimatice ale podişului

Transilaviei, în fermele Saschiz şi Seleuş din judeŃul Mureş. Hameiul cultivat în

România este folosit în exclusivitate pentru obŃinerea berii. Floarea de hamei

(conul) este recoltată, uscată pentru conservarea principiilor active, macinată şi

trasformată în granule prin presare, denumite peleŃi. PeleŃii de hamei reprezintă

materia primă pentru biotehnologia berii.

Tabelul 1

Descrierea probelor de hamei

Nr Soiul Tipul Codul Sursa

floare PR-F

uscat PR-U

1.

Perle

peleŃi PR-P

floare HB-F

uscat HB-U

2.

Huller Bitterer

peleŃi HB-P

Ferma Seleuş

floare BG-F

uscat BG-U

3.

Brewers Gold

peleŃi BG-P

floare MG-F

uscat MG-U

4.

Magnum

peleŃi MG-P

Ferma Saschiz

Pentru studiul trasabilităŃii substanŃelor biologic active, pe fluxul tehnologic

de obŃinere a hameiului peleŃi, au fost prelevate probe de hamei floare aflat la

maturitatea tehnologică, probe de hamei uscat în uscătoarele fermelor Saschiz şi

VII

Seleuş, precum şi peleŃi tip 90 obŃinuŃi în instalaŃia de peletizare a hameiului, de la

ferma Seleuş. In tabelul 1 este prezentată o descriere detaliată a tipului de probe

recoltate, a locului recoltării, precum şi codificarea probelor în vederea realizării

studiului de trasabilitate. Probele de hamei floare prelevate au fost uscate 48 de ore

în laboratorul LICSA din USAMV Cluj-Napoca la temperatura mediului ambiant,

în vederea reducerii umidităŃii şi congelate împreună cu probele de hamei uscat şi

hamei peleŃi la – 20oC, până în momentul analizei.

I.1.2. METODE ANALITICE

Cele mai importante substanŃe din conuri sunt fără îndoială cele care

imprimă amăreală berii. „SubstanŃele amare" din hamei reprezintă o denumire

originală a răşinilor de hamei şi, această terminologie se foloseşte pentru

desemnarea unor compuşi chimici care nu se definesc ca răşini dar poŃi fi izolaŃi

din acestea din urmă. Comitetul de Nomenclatură al Hameiului recomandă

clasificarea raşinilor din hamei astfel:

• Grupa A: fracŃiunea nespecifică şi

• Grupa B: compuşi specifici şi amestecuri de compuşi specifici.

I.2.1. Analiza fracŃiunii nespecifice

Răşinile din hamei, sau fracŃiunea solubilă în eter etilic sau metanol, se pot

separa pe baza solubilităŃii diferite în eter de petrol, în alte fracŃiuni, amestecuri de

compuşi.care însă, nu pot fi individualizate numai prin extracŃie, de aceea sunt

cunoscute sub denumirea de fracŃiuni nespecifice. Din acestea, pot fi separate: RT-

răşinile totale, RM-răşinile moi totale, RD-răşinile dure, fracŃiunea β şi acizii α,

determinaŃi ca şi valoare conductometrică a hameiului. Metodele analitice utilizate

sunt proceduri recunoscute international, cuprinse în Analytica EBC (Manualul

analitic al ConvenŃiei Europene a Berarilor) (tabelul 2).

VIII

Tabelul 2

Metode utilizate pentru analiza fracŃiunii nespecifice (grupa A)

Scopul metodei Metoda aplicată Parametrii

Determinarea valorii conductometrice a hameiului

Titrare conductometrică a extractului metanolic (Analytica 7.5)

Acizi alfa LCV, %

Determinarea răşinilor totale

ExtracŃie în metanol şi eterdietilic (Analytica 7.5)

Răşini totale RT, %

Determinarea răşinilor moi

ExtracŃie în metanol şi dietil eter, urmată de fracŃionarea în hexan (Analytica 7.5)

Răşini moi RM, % Răşini dure RD=RT-RM FracŃiunea beta=RM-LCV

Umiditatea hameiului Termogravimetric (Analytica 7.2)

SubstanŃa uscată= 100-u, %

I.2.1. Analiza fracŃiunii specifice

Analiza fracŃiunii specifice a probelor de hamei supuse analizei a fost

realizată prin cromatografie de lichide de înaltă performanŃă în fază inversă RP

HPLC, după metoda Analytica EBC 7.8., modificată pentru condiŃiile de lucru din

laboratorul LICSA – USAMV Cluj-Napoca. Prin această metodă au fost

identificaŃi şi cuantificaŃi α- acizii, β- acizii şi izo-α-acizii. Metoda a fost

dezvoltată şi validată pentru analiza acizilor amari din hamei.

Metoda de validare şi procedura de analiză a probelor biologice s-a realizat în

conformitate cu ghidurile de validare RENAR şi Procedurile de Incercare ale

Laboratorului LICSA din cadrul USAMV Cluj-Napoca.

Tabelul 3

Metoda utilizată pentru analiza fracŃiunii specifice (grupa B) Metoda: Cromatografie HPLC(metoda 7.8 Analytică EBC

modificată) Standarde ICE-2 pentru α şi β acizi amari

ICS-I2 pentru izo-α-acizi amari Instrument HPLC Shimadzu Coloana Nucleosil 5C18, 5µm Faza mobilă Metanol: acid fosforic:apă=750:240:10 v/v/v

Program de eluŃie Gradient de concentraŃie Debit 1 ml/min Volum injectare 10 µl Temperatura coloanei 35oC DetecŃia UV la 270 nm pentru izo-α-acizi şi

314 nm pentru α şi β acizi amari

IX

I.2 REZULTATE ŞI DISCUłII

I.2.1 Rezultate şi discuŃii privind analiza frac Ńiunii nespecifice din hamei

Rezultatele analizei fracŃiunii nespecifice din fiecare soi de hamei luat în

studiu, pe fluxul tehnologic de obŃinere a hameiului peleŃi sunt prezentatate în

figura 1.

SOIUL PERLE

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Floare Uscat Peleti

etape tehnologice

con

cen

trat

ia,

%

Totale LCV Moi Dure Beta

SOIUL MAGNUM

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Floare Uscat Peleti

etape tehnologiceco

nce

ntr

atia

, %


SOIUL BREWERS GOLD

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Floare Uscat Peleti

etape tehnologice

con

cen

trat

ia,

%


SOIUL HULLER BITTERER

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Floare Uscat Peleti

etape tehnologice

con

cen

trat

ia,

%


Fig. 1 EvoluŃia răşinilor totale, valorii conductometrice, răşinilor moi, răşinilor dure şi

fractiunii β pentru soiurile de hamei Magnum, Brewers Gold, Hüller Bitterer şi Perle în

trei etape tehnologice: hamei floare, hamei uscat şi hamei peleŃi.

Valorile obŃinute sunt în concordanŃă cu datele raportate în literatura de

specialitate, pentru fiecare soi analizat. Astfel pentru soiul Magnum (floare)

cultivat în Germania, valorile medii ale conŃinutului de răşini totale sunt între 27-

32% şi răşini dure 2-3% ; pentru soiul Brewers Gold (floare) cultivat în Germania,

răşini totale 20,9%, răşini dure 2,2%, răşini moi 18,7% şi fracŃiunea β 9,5%;

X

pentru soiul Perle (floare), cultivat în Germania, răşini totale 21,9%, răşini dure

2,1%, răşini moi 19,8% şi fracŃiunea β 10,5% (Krofta, 2003).

VariaŃia fracŃiunilor de răşini pe fluxul tehnologic de obŃinere a hameiului

peleŃi din hamei floare, în funcŃie de soiul analizat şi etapele tehnologice de

obŃinere a hameiului peleŃi a fost analizată statistic prin metoda two-way ANOVA.

Pentru răşini totale s-a estimat că din varianŃa totală 98,7% de datorează

soiului (***) şi 1,14% (**) prelucrării hameiului, deci concentaŃia de răşini totale

este influenŃată în mică masură de prelucrarea hameiului.

Pentru răşinile moi din varianŃa totală 44,02% se datorează soiului (**) şi

50,38% (***) prelucrării hameiului. Aşadar se constată că prin procesul de

prelucrare are loc o scădere a concentraŃiei de răşini moi pentru fiecare soi în parte

şi pe fiecare etapă de prelucrare, variaŃia concentraŃiei între etapele de prelucrare

având ponderea mai mare în explicarea varianŃei. Prin oxidare raşinile moi se

transformă în răşini dure. Analiza răşinilor dure confirmă faptul că există o

variaŃie a cantităŃii pe fluxul tehnologic, şi că această variaŃie se datorează

prelucrării în proporŃie de 70,99% (**) şi doar 18,61 % (ns) din această variaŃie

este determinată de soi. In consecinŃă prin prelucrarea hameiului, alături de

răşinile dure native, se formează şi o clasă de răşini de oxidare, care reduc calitatea

hameiului. Această variaŃie este un indicator al capabilităŃii fluxului de prelucrare.

Cea mai importantă fracŃiune din răşinile nespecifice este fracŃiunea

denumită valoarea conductometrică a hameiului (LCV), care în general este

asociată cu valoarea concentraŃiei de α-acizi din hamei. Valoarea LCV este

fracŃiunea precipitabilă cu acetatul de plumb din extractul metanolic. In această

fracŃiune, în hameiul floare cea mai mare pondere o au acizii α. Valoarea

conductometrică este foarte importantă deoarece în funcŃie de această valoare se

stabileşte preŃul hameiului. VariaŃia valorii conductometrice pe fluxul tehnologic

depinde de soi în proporŃie de 56,24%(***), dar şi de condiŃiile de prelucrare în

proporŃie de 39,39%(***).

FracŃiunea β cuantifică variaŃia valorii conductometrice din totalul valorii

răşinilor moi. Este un parametru care variază în timpul prelucrării cu 66,17%(**)

şi nu este influenŃat de soi (ns).

XI

Pe parcursul prelucrării hameiului, compoziŃia răşinilor amare şi raportul

între acestea se modifică datorită faptului că aceste răşini sunt foarte sensibile şi se

oxidează uşor în prezenŃa aerului şi chiar la temperatura mediului ambiant. Pentru

conservarea acestor principii active trebuie evitată expunerea hameiului la

temperaturi ridicate în timpul procesului de uscare iar depozitarea intermediară

între etapele fluxului să se facă în condiŃii de refrigerare. Din păcate aceste

considerente nu sunt îndeplinite la fluxul analizat şi în consecinŃă se observă

modificări însemnate ale răşinilor amare din hamei prin prelucrarea din hamei în

floare.

I.2.2 Rezultate şi discuŃii privind analiza frac Ńiunii specifice din hamei

I.2.1.1. Identificarea acizilor amari

Pentru analiza profilului acizilor amari α, β şi izo-α din fracŃiunea specifică

a hameiului, extractul metanolic al fiecărei probe de hamei a fost separat prin RP-

HPLC, ce a avut ca fază mobilă un ameste de metanol:apă:acid fosforic, la un

debit de 1 ml/min. Separarea s-a realizat în sistem gradient pentru o eluare

corespunzătoare a tuturor compuşilor prezenŃi în extract. Cromatogramele au fost

înregistrate la 270 nm pentru izo-α-acizi şi 314 nm pentru acizii α şi β.

In probele de hamei ai fost identificaŃi următorii compuşi:

• α-acizi: humulona, cohumulona, adhumulona;

• β-acizi: lupulona, colupulona, adlupulona;

• izo-α-acizi: izohumulona, izocohumulona, izoadhumulona.

Acizii amari α, β şi izo-α au fost identificaŃi după timpii de retenŃie ai

standardelor corespunzatoare ICE 2 şi ICS-I2. In figura 2 este prezentată

cromatograma HPLC –UV a amestecului de standarde de concentraŃii cunoscute.

Prin interpretarea cromatogramelor au fost obŃinuŃi următorii timpi de retenŃie

pentru compuşii de interes.

XII

Fig.2 Cromatograma HPLC-UV a soluŃiei de calibrare formată din amestecul de

standarde ICE-2 şi ICS –I2

Tabel 4.

Identificarea acizilor amari din amestecul de standarde Compusul identificat Nr.pic Timpul de retenŃie tR

Izocohumulonă 1 8,962 min

Izohumulonă 2 10,388 min

Izoadhumulonă 3 11,154 min

Cohumulonă 4 17,886 min

N+adhumulonă 5 21,727 min

Colupulonă 6 25,098 min

N+adlupulonă 7 27,385 min

I.2.1.2. Cuantificarea acizilor amari

Cromatogramele au fost procesate utilizând programul informatic LC

Solution 1.11.SP1 de la Shimadzu. ConcentraŃiile analiŃilor au fost calculate

automat de programul informatic pe baza datelor analitice, utilizând aria picurilor

XIII

corespunzatoare. Curba de calibrare a fost obŃinută prin filtrarea datelor utilizând

regresia liniară, metoda celor mai mici pătrate, ponderare 1/Y .

I.2.1.3. Caracterizarea profilului şi distribuŃiei acizilor α în probele de hamei

Compuşii identificaŃi s-au regăsit în toate probele de hamei analizate, atât

pentru hameiul floare, uscat sau peleŃi.

In figura 3 sunt prezentate patru cromatograme analizate comparativ pentru

fiecare soi analizat.

Fig.3 Analiză comparativă între cromatogramele probelor de hamei peleŃi pentru soiurile

Magnum, Brewers Gold, Hüller Bitterer şi Perle

XIV

Soiurile de hamei luate în studiu aparŃin unor clase varietale diferite, amare

şi de aromă. Soiurile amare se caracterizează printr-o concentraŃie ridicată de α-

acizi, în timp ce soiurile de aromă, au o concentraŃie medie mai scăzută.

Principalii α acizi identificaŃi şi cuantificaŃi prin analiza HPLC în soiurile

analizate sunt humulona, cohumulona şi adhumulona.

După cum se observă din cromatograma prezentate în figura 3, cei trei

compuşi nu pot fi separaŃi individual prin tehnica cromatografică utilizată. Ei au

fost identificaŃi şi cuantificaŃi sub forma cohumulonă şi n+adhumulonă. In mod

similar şi pentru β-acizi au fost identificaŃi şi cuantificaŃi colupulona şi

n+adlupulona. Suma acizilor identificaŃi şi cuantificaŃi reprezintă cantitatea totală

de α –acizi amari din soiul de hamei analizat.

Total acizi alfa din soiurile de hamei

12,6 8,4 8,7 7,59,3 6,7 8,1 7,26,8 5,6 5,7 5,90

2

4

6

8

10

12

14

MG BG HB PR

soiuri de hamei

Co

nce

ntr

atia

, %

hamei floare hamei uscat hamei peleti

Fig. 4 ConcentraŃia de α-acizi în soiurile de hamei Magnum (MG), Brewers Gold

(BG), Huller Bitterer (HB) şi Perle (PR), în % raportat la substanŃa uscată, pentru probe

de hamei floare, hamei uscat şi hamei peleŃi analizate prin metoda HPLC

Soiul de hamei Magnum este caracterizat la nivel international ca fiind un

soi cu conŃinut ridicat de acizi amari. AsociaŃia Producătorilor de Hamei din

Germania, raportează în 2007 o valoare medie pe ultimii zece ani pentru soiul

Magnum de 12,79%, soiul Brewers Gold de 6,30%, soiul Huller Bitterer de 5,48%

şi pentru soiul Perle de 6,59%. Krofta (2003) raportază pentru soiul Perle cultivat

în Germania valorii ale concentraŃiilor de α-acizi prin analiza HPLC cuprinse între

XV

8,6% şi 10 % şi pentru soiurile cultivate în SUA de 6,4% până la 7,5%. In

concluzie, valorile concentraŃiilor de α-acizi obŃinute pentru soiurile româneşti

luate în analiză se încadrează în caracteristicile normale ale fiecărui soi, diferenŃele

apărute sunt determinate de condiŃiile de cultură specifice fiecărei zone climatice

şi originii botanice a varietăŃii cultivate.

Prin prelucrarea hameiului se observă o scădere considerabilă a

concentraŃie de acizi α în probele de hamei. EvoluŃia acizilor amari depinde de

câŃiva parametrii importanŃi cum sunt prezenŃa sau absenŃa oxigenului, de

umiditatea hameiului, de lumină şi de soi (Foster şi Beck, 1985). Intre procesele

de descompunere naturală a substanŃelor naturale din hamei există diferenŃe

semnificative, în funcŃie de felul acestora: oxidative - în prezenŃa oxigenului, sau

neoxidative – in absenŃa oxigenului. Astfel în prezenŃa oxigenului, acizii amari α

se oxidează şi trec în fracŃiunea răşinilor dure. In absenŃa oxigenului de observă o

diminuarea a concentraŃiei de acizi α, fără modificarea fracŃiunii de răşini moi,

deci are loc un proces de izomerizare.

Analizând statistic evoluŃia acizilor amari pe fluxul tehnologic de fabricaŃie

al peleŃilor de hamei (two way ANOVA) se observă că pierderea se corelează

distinctiv semnificativ (**) cu procesul de fabricaŃie şi numai semnificativ (*) cu

soiul. In consecinŃă, putem spune pentru situaŃia analizată că pierderea de acizi α

este datorată în special condiŃiilor de prelucrare a hameiului.

Humulona (R-izovaleril, tR =21,727 ) este α acidul amar cel mai important

pentru calitatea berii. El conferă gust amar catifelat, plăcut. Humulona a fost

identificată cromatografic împreună cu adhumulona (R-2-metilbutiril), care se află

în concentraŃii relativ reduse faŃă de n-humulonă. Efectele adhumulonei asupra

gustului şi aromei berii nu sunt pe deplin elucidate. In soiul Magnum a fost

cuantificată o cantitate de 10,42 % n+adhumulonă în hameiul floare. Această

cantitate scade prin prelucrare până la valoarea de 5,38% datorită proceselor de

oxidare şi mai puŃin proceselor de izomerizare (cantitatea maximă de izoalfaacizi

identificaŃi în toate soiurile de hamei este de 0,001 %). Acest lucru se observă şi

din evoluŃia fracŃiunii de răşini dure care creşte de la 4,4 % în hameiul floare la 5,2

XVI

% în hameiul peleŃi. In mod similar, se observă o diminuare a concentraŃiei de

cohumulonă în soiul Brewers Gold de la 6% pentru hameiul floare la 3,6% pentru

hameiul peleŃi, în soiul Huller Bitterer de la 6,6% la 4,1% şi pentru soiul Perle de

la 5,4% la 4,5%.

Cohumulona (R-izobutiril, tR=17,886) este un α-acid care imprimă berii o

astringenŃă neplacută. Berarii prefără varietăŃile cu conŃinut scăzut de cohumulona.

Soiurile nobile de hamei au un conŃinut scăzut de cohumulonă. Pentru

caracterizarea soiului se calculează cantitatea procentuală de cohumulonă din

concentraŃia totală de acizi α.

Raportul cohumulona/ Σ α-acizi este un indicator de calitate important în

alegerea hameiului. Pentru soiurile analizate s-au obŃinut următoarele valori ale

raportului cohumulona/ Σ α-acizi (floare-peleŃi): 28,4 – 34,2% pentru soiul

Brewers Gold, 23,6 – 27,3% pentru soiul Huller Bitterer şi 27,2 – 22,3% pentru

soiul Perle, adică valori care nu depăşesc 30% şi care în concordanŃă cu valorile

raportate în literatura de specialitate, cu excepŃia soiului Brewers Gold.

Pentru soiul Magnum acest raport este de 17,1% pentru hameiul floare şi

creşte la 21,2 % pentru hameiul peleŃi. Această creştere se datorează reducerii

concentraŃiei de humulonă, mult mai sensibilă la oxidare, în comparaŃie cu

cohumulona, care este mult mai stabilă. Krofta (2003), raporta pentru soiul

Magnum cultivat în Germania o concentraŃie de 13,7 % α-acizi din care 28,5%

cohumulonă, iar pentru hameiul cultivat în Slovacia, Košir (2006) o concentraŃie

de 9% α-acizi din care 26,74 % cohumulonă. In concluzie, condiŃiile pedo-

climatice din România sunt favorabile cultivării soiului Magnum cu însuşiri

brasicole superioare celor cultivate în alte areale geografice.

I.2.1.4. Caracterizarea profilului şi distribuŃiei acizilor β în probele de hamei

In hameiul analizat au fost identificaŃi şi cuantificaŃi β acizii: colupulonă

(R- izobutiril, tR=27,385) şi lupulonă (R- izovaleril, tR=25,098) identificată

împreună cu adlupulona (R-2metilbutiril) , acizi amari ai căror rol în

biotehnologia berii este destul de controversat. In mod normal acizii β nu

XVII

contribuie la valoarea amară a berii, ca atare. Wöllmer descrie valoarea amară

universală a hameiului ca fiind α + β/9.

Suma componenŃilor individuali reprezintă cantitatea totală de acizi β din

hamei. In figura 26 este prezentată evoluŃia concentraŃiei acizilor β pe fluxul de

fabricaŃie al peleŃilor de hamei.

Total acizi beta din soiurile de hamei

6,7 5,5 5,6 5,35,2 4,2 5,4 4,84,7 4,0 4,2 4,70,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

MG BG HB PR

soiuri de hamei

Co

nce

ntr

atia

, %


Fig.5 ConcentraŃia de β-acizi în soiurile de hamei Magnum (MG), Brewers Gold

(BG), Huller Bitterer (HB) şi Perle (PR), în % m/m raportat la substanŃa uscată, pentru

probe de hamei floare, hamei uscat şi hamei peleŃi analizate prin metoda HPLC



distinctiv semnificativ (**) cu procesul de fabricaŃie şi nesemnificativ (ns) cu

soiul. In consecinŃă, putem spune pentru situaŃia analizată că pierderea de acizi β


In timpul prelucrării hameiului, în timpul fierberii mustului de bere,

fermentaŃiei sau depozitării, acizii β suferă reacŃii de autooxidare cu formare de

hulupone. Huluponele sunt de două ori mai amare decât izo-α-acizii. Formarea de

hulupone în timpul depozitării berii modifică profilul senzorial al berii, aceasta

căpătând o astringenŃă neplăcută. Pentru evitarea acumulării de hulupone în bere

se preferă utilizarea de hamei cu raportul Σ Acizi α / Σ Acizi β cât mai apropiat de

XVIII

1. Unii berari preferă însă şi un hamei cu raportul de 2:1 pentru a asigura o

amăreală constantă în berea îmbuteliată, cunoscând faptul că valoarea izo-α-

acizilor scade în timp. Pentru soiurile luate în analiză raportul Σ Acizi α / Σ Acizi β

(floare-peleŃi) este de 1,87 – 1,46 pentru soiul Magnum, 1,52-1,40 pentru soiul

Brewers Gold, 1,36-1,56 pentru soiul Huller Bitterer şi 1,42-1,25 pentru soiul

Perle. Având în vedere consideraŃiile anunŃate se observă faptul că soiurile

aromate Huller Bitterer şi Perle au un raport al acizilor α/β scăzut care se apropie

de valoarea unitară sau subunitară a soiurilor nobile Saaz, Spalter, Tettnang,

Spalter Select care variază între 0,69 şi 1,1 pentru hameiul floare.



distinctiv semnificativ (**) cu procesul de fabricaŃie şi numai semnificativ (*) cu

soiul. In consecinŃă, putem spune pentru situaŃia analizată că pierderea de acizi α


Raportul colupulonă/Σ β acizi (floare-peleŃi) variază între 38,4 - 43,9 %

pentru soiul Magnum, 56,8-63,5 % pentru soiul Brewers Gold, 44,7 - 45,5 %

pentru soiul Huller Bitterer şi 47,7 - 46,6 pentru soiul Perle. Pentru soiurile

analizate, valoarea maximă este de 47, 7%, cu excepŃia soiului Brewers Gold care

are o compoziŃie diferită de celelalte soiuri de hamei analizate atât pentru raportul

cohumulonă/ Σ α acizi, cât şi pentru colupulonă/ Σ β acizi. Acest soi are un

compoziŃie chimică total diferită faŃă de celelalte soiuri şi care confirmă originea

soiului cultivat în România cu cea a soiului englezesc Brewers Gold. Această

varietate a fost ameliorată de Salmon în 1943 (Nieve, 1991) din hamei american

sălbatic şi a fost primul hamei cu concentraŃie ridicată de α-acizii de 10%. Acest

soi a constituit în continuare materialul biologic pentru obŃinerea altor soiuri cum

sunt Galena, Nugget, Olympic, Northern Brewers. In concluzie, soiul Brewers

Gold este un soi bogat în β acizi, care trebuie utilizat cu atenŃie şi în cupaj cu alte

soiuri pentru obŃinerea unor beri cu amăreală fină, plăcută. Există însă o

oportunitate pentru cultivatori de valorificare în alte scopuri a hameiului cu

concentraŃii ridicate de acizi β, ca şi agenŃi antimicrobieni în industria alimentară

sau farmaceutică.

XIX

II. ANALIZA UNOR SUBSTANłE PRENILFLAVONOIDICE DIN

SOIURILE MAGNUM, BREWERS GOLD, HÜLLER

BITTERER ŞI PERLE CULTIVATE ÎN ROMÂNIA

II.1 MATERIALE ŞI METODE

II.1.1 Probele de hamei

Analiza unor substanŃe prenilflavonoidice a fost realizată pe probe

de hamei din soiul Magnum, Brewers Gold, Hüller Bitterer şi Perle . Descrierea

detaliată a modului de prelevare şi conservare a probelor a fost prezentată detaliat

în capitolul I.1.1. Cele mai importante prenilflavonoide sunt: xantohumolul (X),

izoxantohumolul (IX), 8- prenilnaringenina( 8-PN). Compuşii prenilflavonoidici

sunt cele mai active substanŃe biochimice din compoziŃia hameiului.

II.1.2. METODE ANALITICE

Pentru identificarea şi cuantificarea xantohumulului, izoxantohumolului şi

8-prenilnaringeninei din hamei şi bere, a fost dezvoltată şi validată o metodă

analitică proprie, prin separarea compuşilor cu ajutorul tehnicii HPLC iar

identificarea şi cuantificarea compuşilor s-a realizat prin spectrometrie de masă.

Metoda permite analiza directă a berii şi a extractului metanolic de hamei.

Metoda de validare şi procedura de analiză a probelor biologice s-a realizat

în conformitate cu ghidurile de validare pentru metodele analitice ale FDA (Food

and Drug Administration, SUA); EMEA (European Agency for the Evaluation of

Medicinal Products on Evaluation of Medicines for Human Use) şi Procedurile

Standard de Operare ale Laboratorului de BioechivalenŃă al UMF Iuliu HaŃieganu.

Validarea metodei s-a realizat prin evaluarea parametrilor de performanŃă:

specificitatea, liniaritatea, precizia şi acurateŃea. Metoda dezvoltată este prezentată

în tabelul 5.

Standardele de xantohumol, izoxantohumol şi 8-prenilnaringenină au fost

achiziŃionate de la firma Alexis Biochemicals, San Diego, SUA..

XX

Tabelul 5

Metoda HPLC –MS/MS utilizată pentru analiza prenilflavonoidelor

Metoda: Cromatografie HPLC Standarde XH, IXH, 8-PN Instrument Sistem HPLC (Agilent Technologies) Coloana Zorbax SB-C18 100x3 mm; 3,5 µm Faza mobilă Acetonitril cu 0,1% acid acetic v/v

Program de eluŃie Gradient de concentraŃie Debit 1 ml/min Volum injectare 1 µl Temperatura coloanei 40oC DetecŃia MS/MS Tip ionizare Negativă Sursa de ionizare Electrospray Gaz de coliziune(fragmentare) Heliu

II.2 REZULTATE ŞI DISCUłII

II.2.1 Identificarea xantohumolului, izoxantohumolului şi 8-

prenilnaringeninei

Identificarea şi cuantificarea compuşilor prenilflavonoidici a fost realizată

prin identificarea timpilor de retenŃie ai standardelor de xantohumol,

izoxantohumol şi 8-prenilnaringenină şi prin analiza spectrelor de masă full scan şi

a spectrelor de masă MS/MS reactiv (fragmentare).

Fig. 6 Cromatograma unui amestec de standarde de xantohumol(3),

izoxantohumol(1) şi 8-prenilnaringenina(2)

In figurile 6 şi 7 este prezentată cromatogramele unui amestec de standarde

de xantohumol, izoxantohumol şi 8-prenilnaringenină.

XXI

Xantohumol

Izoxantohumol 8-prenilnaringenină Fig.7 Cromatogramele spectrelor de masă cu ionizare negativă ale xantohumolului (XH),

izoxantohumolului (IXH) şi 8 prenilnaringeninei (8PN) pe baza cărora se face identificarea şi cuantificarea

XXII

Datele cromatografice de identificare a compuşilor prenilflavonoidici analizaŃi sunt prezentate în tabelul 6.

Tabel 6.

Identificarea compuşilor prenilflavonoidici din amestecul de standarde Compusul identificat Nr.pic Timpul de retenŃie

tR

Fragment ionic

din[M-H -]

Izoxantohumol 1 1,6 (232,9 )din 351,3

8-prenilnaringenină 2 2,55 (218) din 339

Xantohumol 3 3,65 (232,9 )din 351,3

II.2.2 Cuantificarea xantohumolului, izoxantohumolului şi 8-

prenilnaringeninei

Metoda de analiză a fost validată prin determinarea specificităŃii, liniaritaŃii,

preciziei şi acurateŃii. Cromatogramele vor fi procesate utilizand programul

informatic QuantAnalysis. ConcentraŃiile analiŃilor vor fi calculate automat de

programul informatic pe baza datelor analitice utilizând aria picurilor

corespunzătoare. Curba de calibrare a fost obŃinută prin filtrarea datelor utilizând

regresia liniară, metoda celor mai mici pătrate, ponderare 1/Y sau 1/Y2.

II.2.3 Caracterizarea profilului şi distribu Ńiei xantohumolului în

probele de hamei

Xantohumolul este principalul compus prenilflavonoidic din compoziŃia

hameiului şi cel mai important din punct de vedere al proprietăŃilor bioactive. Din

punct de vedere chimic, xantohumolul este o calconă prenilată a cărui biosinteză

are loc în glanda de lupulină a conului de hamei, spre deosebire de ceilalŃi

compuşi polifenolici care se găsesc în celelalte părŃi componente ale conului,

respectiv bractee şi rahis. Rezultatele analizelor efectuate pentru determinarea

concentraŃiei de xantohumol în probele de hamei analizate sunt prezentate în

figura 8 .

XXIII

Concentratia de xantohumol din probele de hamei

0,5 0,4 0,2 0,20,3 0,3 0,2 0,10,3 0,3 0,2 0,10

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

MG BG HB PR

soiuri de hamei

con

cen

trat

ia,%


Fig. 8 ConcentraŃia de xantohumol în soiurile de hamei Magnum (MG), Brewers

Gold (BG), Huller Bitterer (HB) şi Perle (PR), în % raportat la substanŃa uscată,

pentru probe de hamei floare, hamei uscat şi hamei peleŃi.

Analizând datele prezentate se constată că cea mai mare concentraŃie de

xantohumol se regăseşte în probele de hamei floare, cu o concentraŃie medie de

0,534 % pentru soiul Magnum, 0,368% pentru soiul Brewers Gold, 0,208% pentru

soiul Huller Bitterer şi 0,176% pentru soiul Perle. Prin prelucrarea hameiului prin

uscare şi peletizare aceste concentraŃii scad semnificativ datorită faptului că

xantohumolul este un compus chimic care izomerizează foarte uşor în prezenŃa

luminii şi temperaturilor ridicate. CondiŃiile de recoltare, depozitare şi regimul de

temperatură al instalaŃiilor de lucru determină în proporŃie de 90% compoziŃia în

compuşi prenilflavonoidici din hamei (Biedl, 2002). Valorile obŃinute pentru

concentaŃia de xantohumol pentru toate soiurile româneşti sunt în concordanŃă cu

valorile raportate în literatură care variază în functie de soi între 0,2 – 1,2 % m/m.

In particular pentru soiul Magnum cultivat în Germania, Krofta (2005) raportează

valori de 0,54%, 0,41% şi 0,63% în anii 2002, 2003 şi 2004 şi pentru soiul Perle

cultivat în Germania 0,46%, 0,32% şi 0, 51%, respectiv cultivat în SUA de 0,42%,

0,45% şi 0, 35%, pentru aceeaşi perioadă. Pentru soiul Brewers Gold şi Huller

Bitterer nu există raportări în literatura de specialitate.

XXIV

Reducerea concentraŃiei de xantohumol în probele de hamei se realizează în

special prin izomerizare în izoxantohumol.

Analizând statistic evoluŃia xantohumolului pe fluxul tehnologic de

fabricaŃie al peleŃilor de hamei (two way ANOVA) se observă că pierderea se

corelează distinctiv semnificativ (**) cu soiul de hamei şi nesemnificativ (ns) cu

prelucrarea hameiului. In consecinŃă, putem spune că reducerea concentraŃiei de

xantohumol se datorează în special unor reacŃii biochimice ce Ńin de natura

compoziŃiei chimice a hameiului.

II.2.3 Caracterizarea profilului şi distribu Ńiei izoxantohumolului în

probele de hamei

PrezenŃa izoxantohumolului în hamei este un fapt care a generat numeroase

controverse în mediul ştiinŃific. AnumiŃi cercetători susŃin ideea că

izoxantohumolul este un artefact şi el se formează numai prin izomerizarea

xantohumolului şi nu este un metabolit secundar al proceselor metabolice care au

loc în conul de hamei. In urma analizelor efectuate şi în hameiul românesc au fost

identificate cantităŃi mici de izoxantohumol cu valori cuprinse între 0,0026-0,0042

% pentru hameiul floare, 0,0023% - 0,056% pentru hameiul uscat şi 0,0021 –

0,0073 pentru hameiul peleŃi. Se observă o uşoară creştere a concentraŃiei de

izoxantohumol pe fluxul tehnologic de obŃinere a peleŃilor de hamei pentru

soiurile Brewers Gold şi Huller Bitterer, datorată reacŃie de izomerizare a

xantohumolului în izoxantohumol, în timpul depozitării şi prelucrării la

temperaturi ridicate. Pentru soiul Perle se observă o conservare a cantităŃii ini Ńiale,

ceea ce poate fi asociat o bună capacitate antioxidantă a acestui soi. Pentru soiul

Magnum se observă o uşoară scădere a concentraŃiei datorată probabil unor

pierderi oxidative.

Dacă se calculează coeficienŃii de corelare Pearson între cantitatea de

xantohumol şi izoxantohumol pentru fiecare soi şi pentru fiecare etapă tehnologică

se obŃin următoarele rezultate care confirmă ipoteza statistică că descreşterea

concentraŃiei de xantohumol se datorează proceselor de izomerizare, cu excepŃia

XXV

soiului Magnum unde nu s-a putut identifica o corelaŃie ( r = -0,01), dar la care

este de remarcat semnul negativ al corelaŃiei. Astfel, pentru soiul Brewers Gold

coeficientul r (Pearson) = -0,93; pentru soiul Hüller Bitterer r= -0,45; pentru soiul

Perle r = -0,39.

Rezultatele obŃinute pentru concentraŃia de izoxantohumol în probele de

hamei sunt comparabile cu cele raportate de Krofta şi al. (2005) pentru hameiul

cultivat în Cehia care are o concentraŃie de izoxantohumol cuprinsă între 0,004%

şi 0,018% pentru hameiul floare.

Concentatia de izoxantohumol din probele de hamei

0,0036 0,0042 0,0031 0,00260,0025 0,0056 0,0023 0,00230,0042 0,0073 0,0033 0,00410,0000

0,0100

MG BG HB PR

soiuri de hamei

con

cen

trat

ia,

%


Fig. 9 ConcentraŃia de izoxantohumol în soiurile de hamei Magnum (MG),

Brewers Gold (BG), Huller Bitterer (HB) şi Perle (PR), în % raportat la substanŃa

uscată, pentru probe de hamei floare, hamei uscat şi hamei peleŃi.

II.2.4 Caracterizarea profilului şi distribu Ńiei 8-prenilnaringeninei în probele

de hamei

Hameiul este considerat o sursă importantă de fitoestrogeni, dintre care cel

mai cel mai important este 8 – prenilnaringenina (Milligan, 1999). 8 –

prenilnaringenina se formează prin izomerizarea dezmetilxantohumolului şi

prezenŃa ei în hamei este considerată de unii autori un artefact. Analizele efectuate

pentru soiurile româneşti arată concentraŃii între 0,0002% - 0,0006% pentru

XXVI

hameiul floare, între 0,00012% - 0,0003% pentru hameiul uscat şi între 0,0001% -

0,0003% pentru hameiul peleŃi, datorate probabil reacŃiilor de izomerizare

declanşate de procesul de prelucrare.

Concentratia de 8-prenilnaringenina din probele de hamei

0,0006 0,0002 0,0003 0,00020,0002 0,0001 0,0003 0,00020,0001 0,0002 0,0002 0,0003

0,0000

0,0010

MG BG HB PR

soiuri de hamei

con

cen

trat

ia,

%


Fig. 10 ConcentraŃia de 8 – prenilnaringenină în soiurile de hamei Magnum (MG),

Brewers Gold (BG), Huller Bitterer (HB) şi Perle (PR), în % m/m raportat la substanŃa

uscată, pentru probe de hamei floare, hamei uscat şi hamei peleŃi.

Aşadar, din analizele prezentate putem spune că soiurile cultivate în

România au o concentraŃie medie de substanŃe prenilflavonoidice între 0,2-0,5%.

Principalul compus prenilflavonoidic identificat este xantohumolul, care reprezintă

peste 99 % din concentraŃia substanŃelor prenilfalvonoidice din probele de hamei

analizate.

XXVII

III. TRASABILITATEA SUBSTAN łELOR PRENILFLAVONOIDICE

ÎN BIOTEHNOLOGIA DE OB łINERE A UNEI BERI

FUNCłIONALE ÎN STA łIA PILOT A USAMV CLUJ-NAPOCA

Scopul acestui studiu este obŃinerea unei beri funcŃionale cu o concentraŃie

ridicată de substanŃe prenilflavonoidice prin proiectarea unui design experimental

şi optimizarea procesului biotehnologic din staŃia pilot a USAMV Cluj-Napoca.

Pentru studiul trasabilităŃii a fost utilizat ca şi indicator coeficientul de recuperare

al compuşilor bioactivi din hamei în bere.

ProprietăŃile funcŃionale ale berii sunt determinate în special de prezenŃa

substanŃelor fenolice. Ei sunt recunoscuŃi ca şi antioxidanŃi naturali care pot

preveni apariŃia bolilor asociate cu stresul oxidativ la nivel celular. Evaluarea

proprietăŃilor funcŃionale pentru berea obŃinută experimental în staŃia pilot

USAMV a fost realizată prin determinarea capacităŃii antioxidante în corelaŃie cu

conŃinutul de substanŃe polifenolice totale pe tot fluxul tehnologic de fabricaŃie.

III .1 MATERIALE ŞI METODE

III.1.1 Materii prime Pentru obŃinerea berii au fost utilizate ca şi materii prime malŃul blond,

malŃul caramel obŃinut în staŃia pilot după o tehnologie proprie, drojdie de bere

Saccaromyces cerevisiae, o suşă de fermentaŃie inferioară şi hamei. Pentru

realizarea experimentelor a fost ales pe baza indicatorului brasicol xantohumol

/acizi α, soiul Brewers Gold.

III.1.2. Protocol experimental pentru obŃinerea unei beri funcŃionale

Studiului trasabilităŃii substanŃelor prenilflavonoidice în vederea obŃinerii

unei beri funcŃionale a fost realizat pe baza unui protocol care cuprinde trei

module de experimente tehnologice, două pentru berea caramel şi unul pentru

berea blondă, realizate în staŃia pilot USAMV Cluj-Napoca. Fiecare modul

XXVIII

cuprinde un set de trei beri experimentale, codificate XAN A....F pentru berile

caramel şi STD 1...3 pentru berea blondă. Berile STD sunt considerate probe

control în desfăşurarea experimentului. Ele au fost realizate utilizând tehnologia

clasică de obŃinere a berii. Berile XAN sunt considerate beri funcŃionale şi au fost

obŃinute printr-o biotehnologie optimizată care conservă substanŃele

prenilflavonoidice extrase din hamei în mustul de bere. Evaluarea rezultatelor s-a

realizat prin analiză comparativă cu un modul martor format dintr-un set de 12

beri reprezentative pentru piaŃa berii din România.

Pentru realizarea protocolului s-au avut în vedere următoarele consideraŃii:

• Pentru toate experimentele a fost utilizat hamei peleŃi din soiul Brewers Gold;

• Hameierea berii a fost realizată cu aceeaşi cantitate de hamei de 100 mg α-

acizi/l must de bere;

• Dozarea hameiului s-a realizat în două etape, la momente diferite de fierbere a

mustului de bere;

• Durata totală de fierbere a mustului a fost de 90 de minute pentru toate

experimentele;

MODULUL I PARAMETRII

Experimente XAN A XAN B XANC ConcentraŃia mustului,oP 12 12 12 Doza de acizi alfa, mg α acizi/l 100 100 100 Doza de xantohumol, mg /l 5,26 5,26 5,26 Doza de izoxantohumol, mg l 0,13 0,13 0,13 Doza de 8-prenilnaringenina, mg /l 0 0 0

CRONOGRAMA DOZARII HAMEIULUI Timp dozare, min

Experiment Doza de hamei 0 45 80 90

I 100% XAN A II

I 50% XAN B II 50%

I 50% XAN C II 50%

MODULUL II PARAMETRII

Experimente XAN D XAN E XAN F ConcentraŃia mustului,oP 10 12 14 Doza de acizi alfa, mg α acizi/l 100 100 100 Doza de xantohumol, mg alfa/l 5,26 5,26 5,26 Doza de izoxantohumol, mg alfa/l 0,13 0,13 0,13 Doza de 8-prenilnaringenina, mg alfa/l 0 0 0

XXIX



I 50% XAN D II 50%

I 50% XAN E II 50%

I 50% XAN F II 50%

MODULUL III PARAMETRII

Experimente STUD 1 STUD 2 STUD 3 ConcentraŃia mustului,oP 14 14 14 Doza de acizi alfa, mg α acizi/l 100 100 100 Doza de xantohumol, mg /l 5,26 5,26 5,26 Doza de izoxantohumol, mg /l 0,13 0,13 0,13 Doza de 8-prenilnaringenina, mg /l 0 0 0



I 50% STD 1 II 50%

I 50% STD 2 II 50%

I 50% STD 3 II 50%

Fig. 11 Protocol experimental pentru obŃinerea unei beri funcŃionale în StaŃia

Pilot USAMV Cluj-Napoca

III.1.3. Optimizarea procesului biotehnologic pentru obŃinerea unei beri

funcŃionale

SubstanŃele prenilflavonoidice sunt solubilizate din hamei în timpul

procesului de fierbere. Gradul de extracŃie depinde de doza aplicată, de

concentraŃia şi compoziŃia mustului, pH-ul mustului şi durata fierberii.

Xantohumolul, cel mai important compus prenilflavonoidic este rapid

izomerizat în timpul procesului de fierbere în izoxantohumol. Din punct de vedere

al obiectivului stabilit, această reacŃie trebuie evitată, astfel încât în must să

rămână o cantitate cât mai mare de xantohumol, care are o activitate biologică de

zece ori mai ridicată decât a izoxantohumolului. Acest lucru nu este uşor de

realizat având în vedere faptul că dozarea hameiului se realizează în primul rând

pentru extracŃia acizilor amari şi uleiurilor volatile, extracŃie care se realizează

XXX

paralel şi în aceleaşi condiŃii cu xantohumolul.

• dozarea hameiului se va realiza în mai multe etape, astfel încât

ultima doză se adaugă cu 10 minute înainte de sfârşitul fierberii şi mustul fiert se

răceşte imediat la 80oC, pentru inhibarea izomerizării xantohumolului.

• concentraŃia şi compoziŃia mustului de bere influenŃează

randamentul de extracŃie şi izomerizare al xantohumolului, între cele două

caracteristici existând un raport invers proporŃional. Pentru evitarea izomerizarii se

vor utiliza musturi concentrate de 14 oP, obŃinute din malŃuri colorate care conŃin

substanŃe inhibitoare ale reacŃiei de izomerizare a xantohumolului.

• scăderea pH-lui mustului în timpul procesului de fierbere inhibă

reacŃia de izomerizare a prenilflavonoidelor; ea este favorizată de utilizarea

malŃului caramel;

Toate celelalte operaŃii tehnologice au fost realizat conform procedurilor standard

de operare din staŃia pilot a USAMV Cluj-Napoca.

III.1.3.4 Analiza unor parametrii de calitate ai malŃului, mustului şi

berii

Analiza unor parametrii de calitate ai malŃului caramel, mustului de bere şi

ai berii, pentru probele recoltate pe parcursul desfăşurării experimentelor, s-a

realizat cu ajutorul metodelor analitice standardizate cuprinse în Analytica EBC

(2006) pentru determinarea concentraŃiei alcoolice, culorii, conŃinut total de

polifenoli, extract primitiv şi valoarea amară.

III.1.3.5 Analiza compuşilor prenilflavonoidici

Analiza compuşilor prenilflavonoidici, din probele de must şi bere s-a

realizat prin cromatografie de lichide de înaltă performanŃă (HPLC) cu

identificarea şi cuantificarea xantohumolului, izoxantohumolului şi 8-

prenilnaringeninei prin spectrometrie de masă MS/MS.

Metoda utilizată este prezentată detaliat în capitolul II. In această metodă,

identificarea şi cuantificarea se realizează în modulul SRM (single reaction

XXXI

monitoring) care asigură o dozare rapidă şi precisă a compusului de interes.

Pentru bere, metoda dezvoltată are avantajul că permite dozarea directă în

sistemul cromatografic a probei, eliminând în acest fel etapele de pregătire care

sunt costisitoare şi necesită timp de pregătire.

III.1.3.6 Analiza capacităŃii antioxidante a materiilor prime, mustului

şi berii

Evaluarea capacităŃii antioxidante a materiilor prime, mustului şi berii este

importantă atât din punct de vedere tehnologic pentru evitarea proceselor oxidative

care modifică profilul senzorial al produsului finit, dar şi din punct de vedere al

funcŃionalităŃii berii în relaŃie cu organismul consumatorului. SubstanŃele

polifenolice din care fac parte şi prenilflavonoidele sunt recunoscute ca şi

substanŃe bioactive care protejează şi promovează sănătatea organismului uman.

Activitatea antioxidantă totală a fost evaluată prin metoda

spectrofotometrică indirectă care utilizează 2,2–difenil–1–picrilhidrazil (DPPH) ca

sistem de generare a radicalului liber DPPH · , printr-o metodă dezvoltată de

laboratorul Centrului de Cercetări Produse Vegetale din cadrul USAMV Cluj-

Napoca. Probele analizate au fost diluate cu soluŃia de DPPH · , iar absorbanŃa

amestecului de reacŃie a fost măsurată după 30 de minute la 515 nm. ReacŃia de

captare a radicalilor liberi care a avut loc determină o modificare a culorii probei

de la albastru la galben şi o descreştere relativă a absorbanŃei. Activitatea

antioxidantă este exprimată ca şi activitate antiradică a probelor.

Pentru determinarea cantitativă s-a realizat o curbă de etalonare,

reprezentată de variaŃia intensităŃii maximului de absorbŃie a DPPH-lui, la 515 nm,

în prezenŃa diferitelor concentraŃii de Trolox (acid 6-hidroxi-2,5,7,8

tetrametilcroman-2-carboxilic, un analog sintetic al vitaminei E) şi curbele

corespunzătoare probelor analizate. Analiza comparativă a probelor s-a realizat

prin:

• calcularea activităŃii antiradicalice (RADPPH) care reprezintă scăderea

relativă a absorbanŃei în probele analizate.

XXXII

100% ×−

=blanc

probablanc

DPPH Abs

AbsAbsRA

• calcularea concentraŃiei de miliechivalenŃi de Trolox/litru, pe baza curbei

de calibrare realizată cu diferite concentraŃii de Trolox ( 3,25 – 200 µmol/l)

III.2. REZULTATE ŞI DISCUłII

III.2.1 . Identificarea şi cuantificarea compuşilor prenilflavonoidici din

must şi bere

Identificarea şi cuantificarea compuşilor prenilflavonoidici a fost realizată

prin identificarea timpilor de retenŃie ai standardelor de xantohumol,

izoxantohumol şi 8-prenilnaringenină şi prin analiza spectrelor de masă full scan şi

a spectrelor de masă MS/MS reactiv (fragmentare). Metoda este descrisă în detaliu

în capitolul II.2.1.

III.2.2 . Analiza trasabilităŃii compuşilor prenilflavonoidici pe fluxul

tehnologic de obŃinere a unei beri funcŃionale

Rezultatele obŃinute în urma monitorizării concentraŃiei de xantohumol,

izoxantohumol şi 8-prenilnaringenină din toate sarjele experimentale, în

principalele etape ale fluxului tehnologic, sunt prezentate în figura 12 (A, B şi C).

Fierberea mustului de bere este etapa cea mai importantă pentru definirea

spectrului de compuşi prenilflavonoidici şi a raportului între cei trei componenŃi.

După cum se observă din figura 12, concentraŃia maximă a compuşilor de interes

se obŃine pentru experimentul F, la care dozarea hameiului, s-a realizat în cea de-a

de-a doua parte a timpului de fierbere şi la o concentraŃie de 14oP a mustului de

bere. Randamentul maxim de recuperare a fost de 33% pentru etapa de fierbere.

Racirea mustului de bere conduce la pierderi importante de compuşi

prenilflavlavonoidici, prin separarea cu trubul de bere, astfel că după această

etapă, coeficientul de recuperare scade la 15%.

In raport cu obiectul propus de reducere a izomerizării xantohumolului în

XXXIII

timpul fierberii se observă că pentru sarjele experimentale XAN, concentraŃia de

xantohumol este superioară concentraŃiei de izoxantohumol, în comparaŃie cu

berile STD la care raportul este invers. Acest obiectiv este important pentru

obŃinerea unei beri funcŃionale, deoarece xantohumolul are o capacitate bioactivă

mult mai ridicată faŃă de izoxantohumol.

Evolutia continutului de xantohumol pe fluxul tehnologic

0

100

200

300

400

500

600

700

XAN A XAN B XANC XAN D XAN E XAN F STD 1 STD 2 STD 3

etapa tehnologica

Co

ntin

ut x

anto

hu

mo

l, n

g/l

MUST RACIT BERE TINARA BERE MATURATA BERE FILTRATA BERE IMBUTELIATA

Evolutia continutului de izoxantohumol pe fluxul tehnologic

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900


etapa tehnologica

Co

nti

nu

t iz

oxa

nto

hu

mo

l, n

g/l


Fig. A Fig. B

Evolutia continutului de 8-prenilnaringenina pe fluxul tehnologic

0

25

50

75

100

125


etapa tehnologica

Contin

ut 8

-pre

niln

arin

gen

ina,

ng/l


Fig. C

Fig.12 EvoluŃia concentraŃiei de xantohumol (fig.A), izoxantohumol(fig.B) şi 8-

prenilnaringenină(fig.C) pe fluxul tehnologic de obŃinere a berilor experimentale XAN şi

STD în staŃia pilot a USAMV Cluj-Napoca

XXXIV

ANALIZA COMPARATIVA

0

100

200

300

400

500

600

XANA

XANB

XANC

XAND

XANE

XANF

STD1

STD2

STD3

B 1 B2 B 3 B 4 B 5 B 6 B 7 B 8 B 9 B 10 B 11 B 12

tipul de bere

con

cen

trat

ia to

tala

de

pre

nilf

lavo

no

ide,

n

g/l

xantohumol izoxantohumol 8-prenilnaringenina

Fig.13 Analiză comparativă între berile experimentale XAN şi STD obŃinute în staŃia pilot USAMV Cluj-Napoca şi beri din reŃeaua comercială fabricate în România în raport cu concentraŃia de xantohumol, izoxantohumol şi 8-prenilnaringenină.

Evaluarea rezultatelor obŃinute prin derularea experimentelor tehnologice a

fost realizată prin compararea berilor obŃinute experimental în staŃia pilot a

USAMV Cluj-Napoca cu alte 12 beri fabricate în România, reprezentative pentru

piaŃa berii româneşti.

După cum se observă din figura 13, berile experimentale XAN au o

concentraŃie mult mai ridicată de xantohumol faŃă de toate celelalte beri analizate,

cu până la 50%, ceea ce dovedeşte că prin optimizarea operaŃiilor tehnologice şi

alegerea unor materii prime corespunzătoare se pot obŃine beri funcŃionale cu

concentraŃii ridicate de prenilflavonoide.

XXXV

III.2.3 Rezultate şi discuŃii privind evolu Ńia capacităŃii antioxidante a

mustului şi berii pe fluxul tehnologic de obŃinere a unei beri funcŃionale

Evaluarea potenŃialului bioactiv al berilor obŃinute în staŃia pilot a USAMV

Cluj-Napoca a fost realizată prin determinarea capacităŃii antioxidante, exprimată

ca şi activitate antiradicalică (RADPPH) şi a cantităŃii de compuşi antioxidanŃi,

exprimate ca şi mmoli/ trolox.

Parametrii calitativi şi cantitativi ai activităŃii antioxidante au fost evaluaŃi

de la materia primă şi până în produsul finit. In figura 14 este prezentată evoluŃia

capacităŃii antiradicalice a musturilor experimentale XAN şi a berii STD pentru

must nehameiat, must hameiat şi bere. După cum se observă, capacitatea

antiradicalică creşte considerabil după procesul de hameiere, datorită solubilizării

compuşilor polifenolici antioxidanŃi din hamei, din care fac parte şi substanŃele

prenilflavonoidice. Pe parcursul fluxului tehnologic, se observă o diminuare cu

33% a capacităŃii antiradicalice, datorită consumului de compuşi antioxidanŃi

pentru protejarea mustului şi berii de efectele oxidante ale oxigenului dizolvat.

EVOLUTIA CAPACITATII ANTIOXIDANTE

0

5

10

15

20

25

XAN A XAN B XAN C XAN D XAN E XAN F STD

sortimente de bere

RA

DP

PH

, %

MUST NEHAMEIAT MUST HAMEIAT BERE

Fig. 14 EvoluŃia capacităŃii antioxidante a berilor experimentale XAN şi

STD din mustul nehameiat în bere, exprimată ca şi procent de inhibiŃie RA DPPH.

Pentru berea îmbuteliată evaluarea capacităŃii antioxiante în corelaŃie cu

conŃinut total de substanŃe polifenolice este prezentată în figura 15.

XXXVI

Cele mai ridicate valori ale capacităŃii antiradicalice RADPPH s-au obŃinut

pentru berile XAN A (13,93%) şi XAN F(12,57%). Coeficientul de corelare

(Pearson) între cantitatea de substanŃe polifenolice totale şi capacitatea

antiradicalică RADPPH, r2este de 0,72 (p<0,05) pentru berile analizate.

O corelaŃie pozitivă este raportată şi de Kanada (1995), care pune în

evidenŃă faptul că şi compuşii de oxidare ai polifenolilor exercită efecte

antiradicalice. Ishiwata (2001) corelează capacitatea antioxidantă a berii cu

concentraŃia de substanŃe polifenolice totale dar şi cu concentraŃia de sulfiŃi

rezultaŃi din metabolismul secundar al celulei de drojdie, pentru ambele existând o

corelare pozitivă.

Fig.15 Capacitatea antioxidantă berii obŃinută în staŃia pilot USAMV Cluj-Napoca,

exprimată ca şi capacitate antiradicalică RA DPPH şi mmoli trolox/l în funcŃie de

conŃinutul total de polifenoli (mg/l)

Ishikawa (2001) corelează capacitatea antioxidantă a berii cu concentraŃia

de substanŃe polifenolice totale dar şi cu concentraŃia de sulfiŃi rezultaŃi din

metabolismul secundar al celulei de drojdie, pentru ambele existând o corelare

pozitivă. Lugasi (2005), analizează capacitatea antiradicalică a diferitelor băuturi,

bere blondă, bere brună vin roşu, vin alb şi băuturile distilate (wisky) şi realizează

următoarea clasificare : RADPPH vin roşu >RADPPH vin alb = RADPPH berea caramel

Rezultate comparative bere

0,00

5,00

10,00

15,00

XAN A XAN B XAN C XAN D XAN E XAN F STUD

sortimente de bere

RA

% D

PP

H /

mM

tro

lox/

l

50,00100,00150,00200,00250,00300,00350,00400,00

po

life

no

li t

ota

li

mg

/lRA % DPPH mmoli trolox/l Polifenoli totali mg/l

XXXVII

>RADPPH bere blondă > RADPPH wisky. In consecinŃă se poate spune, că berea

prezintă aceeaşi capacitate bioactivă ca şi vinul alb, dar la un consum echivalent,

aportul de alcool etilic corespunzător berii în dieta zilnică este net inferior, ceea ce

poate fi un argument în favoarea alegerii berii.

Analiza statistică a berile experimentale caramel XAN A...XAN F şi berea

blondă STUDENT indică faptul că există diferenŃe foarte semnificative şi

semnificative între berile caramel (XAN A, XAN B, XAN F) şi berea blondă

(STUD), în favoarea berilor XAN, în ceea ce priveşte capacitatea antiradicalică.

CONCLUZII In raport cu obiectivele studiului de faŃă se pot evidenŃia următoarele

concluzii generale:

1. Au fost identificate şi caracterizate răşinile amare reprezentând fracŃiunea

nespecifică din soiurile de hamei selecŃionate prin analiza răşinilor totale,

răşinilor moi, răşinilor dure, valorii conductometrice a hameiului şi

fracŃiunii β pe fluxul tehnologic de prelucrare a hameiului din floare în

peleŃi de hamei

2. Prelucrarea termică a hameiului prin uscare, măcinare şi peletizare

determină modificarea raporturilor între componenŃii fracŃiunii nespecifice,

datorate în special proceselor de oxidare, puse în evidenŃă prin scăderea

valorii conductometrice şi a răşinilor moi şi creşterea concentraŃiei de răşini

dure.

3. Prin analiza statistică a fost pus în evidenŃă faptul că modificarile

compoziŃiei chimice a hameiului pe parcursul peletizării se datorează în

special condiŃiilor de lucru şi sunt influenŃate mai puŃin de soiul de hamei.

4. A fost dezvoltată şi validată o metodă de separare, identificare şi

cuantificare a acizilor amari din fracŃiunea specifică a hameiului utilizând

tehnici avansate de cromatografie lichidă de înaltă performanŃă, cuplată cu

detecŃia în UV.

XXXVIII

5. Pe baza metodei dezvoltate au fost identificaŃi şi caracterizaŃi acizii α

(cohumulonă, humulonă, adhumulonă) şi acizii β (colupulonă, lupulonă şi

adlupulonă) din soiurile de hamei analizate, precum şi raporturile dintre ei.

6. A fost dezvoltată şi validată o metodă proprie de separare, identificare şi

cuantificare a unor compuşi prenilflavonoidici din hamei utilizând tehnici

avansate de cromatografie lichidă de înaltă performanŃă, cuplată cu detecŃia

MS/MS a spectrelor de masă şi fragmentării specifice a ionilor de interes.

7. Pe baza metodei dezvoltate au fost identificaŃi şi caracterizaŃi compuşii

prenilflavonoidici xantohumol, izoxantohumol şi 8-prenilnaringenina din

soiurile de hamei analizate.

8. Pentru valorificarea superioră a hameiului în biotehnologia berii se propune

ca marker de calitate raportul compuşi prenilflavonoidici/ acizi α. Acest

marker cuantifică disponibilitatea dozei de hamei în ceea ce priveşte

cantitatea de substanŃe prenilflavonoidice care se dozează în bere.

Soiul de hamei Magnum

• se caracterizează printr-o concentraŃie ridicată de acizi α de 12,6 %

şi din acest punct de vedere este un considerat un soi superalfa.

Valoarea obŃinută este specifică soiului şi comparabilă cu valori

obŃinute în alte condiŃii pedoclimatice de cultură.

• Raportul cohumulonă/acizi α este de 17%, un raport foarte bun din

punct de vedere brasicol şi specific pentru soiul cultivat în România,

comparativ cu valorile de peste 25% raportate pentru alte condiŃii de

cultură.

• Prezintă cea mai ridicată concentraŃie de compuşi prenilflavonoidici

dintre soiurile analizate de 0,54%.

• Raportul prenilflavonoide/ acizi α este de 0,040.

Soiul Brewers Gold

• Prezintă o compoziŃie atipică faŃă de celelalte soiuri analizate cu o

concentraŃie ridicată de colupulonă şi un raport colupulonă/acizi β de

57%, faŃă de 47 % calculat la soiul Perle.

XXXIX

• ConcentraŃia mare de colupulonă, protejează principiile active din

hamei de procesele oxidative şi pentru acest soi se înregistrează cele

mai puŃine transformări nedorite ale principiilor active.

• Are cel mai mare raport prenilflavonoide/ acizi α de 0,054.

Soiul Hüller Bitterer

• Are o concentraŃie de acizi α de 8,75 %, ceea ce reflectă caracterul

dual (aromat şi amar) al acestui soi. Pentru varietatea cultivată în

România tendinŃă este de soi amar.

• Prezintă raportul cohumulonă/acizi α sub 30, care îl recomandă

pentru utilizare în obŃinerea unor beri de calitate.

• Are un raport prenilflavonoide/ acizi α de 0,027.

Soiul Perle

• Are cel mai scăzut raport acizi α/aciziβ dintre soiurile analizate, cu o

valoare apropiată de a soiurilor nobile germane.

• Are cea mai scăzută concentraŃie de acizi α de 7,54%, caracteristică

soiurilor aromate.

• Are cel mai scăzut raport prenilflavonoide/ acizi α de 0,021.

9. Utilizând metode statistice avansate (Analiza Clusterelor) au fost clasificate

soiurile de hamei pe baza caracteristicilor răşinilor amare şi compuşilor

prenilflavonoidici şi a fost realizat profilul caracteristic pentru fiecare soi

analizat. Metoda propusă poate fi utilizată ca şi instrument de analiză în

certificarea hameiului pentru obŃinerea denumirii de origine;

10. Pe baza markerilor de calitate analizaŃi a fost ales soiul Brewers Gold

pentru obŃinerea unei beri cu proprietăŃi funcŃionale în staŃia pilot a

USAMV Cluj-Napoca.

11. A fost realizat un protocol experimental pentru obŃinerea unei beri

funcŃionale cu o concentraŃie ridicată de compuşi prenilflavonoidici.

Protocolul a fost dezvoltat prin optimizarea unor parametrii tehnologici în

XL

vederea reducerii coeficientului de izomerizare a xantohumolului în timpul

fierberii cu hamei a mustului de bere.

12. Au fost realizate două module experimentale şi un modul de control,

obŃinut printr-o biotehnologie clasică, care au fost conduse în staŃia pilot de

biotehnologie a berii din cadrul USAMV Cluj-Napoca.

13. Pentrul fiecare experiment au fost identificaŃi şi cuantificaŃi xantohumolul,

izoxantohumolul şi 8-prenilnaringenina în toate etapele tehnologice din

fluxul de fabricaŃie pentru studiul trasabilitaŃii compuşilor

prenilflavonoidici.

14. Pe baza studiul de trasabilitate din hamei în bere a fost evidenŃiat faptul că

recuperarea compuşilor prenilflavonoidici în berea finită este condiŃionată

în special de procesul de extracŃie şi izomerizare din timpul fierberii

mustului de bere. Coeficientul maxim de recuperare pentru operaŃia de

fierbere a fost de 15% iar pentru întreg fluxul tehnologic de 10%.

15. Analiza comparativă a modulelor experimentale cu modulul control a fost

realizată prin analiza statistică (one-way ANOVA) utilizând diferite teste

post calcul (Tuckey).

16. Utilizând o biotehnologie optimizată şi materii prime selecŃionate au fost

obŃinute diferite tipuri de beri cu o concentraŃie de xantohumol cuprinsă

între 54 şi 147 ng/ml şi o concentraŃie totală de compuşi prenilflavonoidici

cuprinsă între 150 şi 558 ng/ml, comparativ cu berea control în care au fost

cuantificată o cantitate maximă de 31,9 ng/ml xantohumol şi 197,7 ng/ml

compuşi prenilflavonoidici totali.

17. Berile obŃinute experimental în staŃia pilot a USAMV Cluj- Napoca au fost

comparate cu 12 beri comeriale fabricate în România, din punct de vedere

al conŃinutului de xantohumol, izoxantohumol şi 8-prenilnaringenină.

18. In berile comerciale valoarea concentraŃiei de xantohumol a variat între 0

şi 46,4 ng/ml, iar concentraŃia de compuşi prenilflavonoidici între 115, 7 şi

229,7 ng/ml.

19. Din cele prezentate se observă că berea experimentală are o concentraŃie

dublă de compuşi prenilflavonoidici faŃă de berile comerciale disponibile

XLI

pe piaŃa românească şi o funcŃionalitate ridicată datorată unei concentraŃii

mari de xantohumol.

20. Evaluarea funcŃionalitaŃii berii obŃinute a fost realizată prin determinarea

capacităŃii antioxidante, exprimată ca şi activitate antiradicalică RADPPH,

pentru întreg fluxul tehnologic şi pentru toate materiile prime utilizate în

procesul biotehnologic, în corelaŃie cu conŃinutul total de polifenoli, din

care fac parte şi compuşii prenilflavonoidici.

21. MalŃul caramel obŃinut în staŃia pilot USAMV Cluj- Napoca are o activitate

antiradicalică mai ridicată decât malŃul blond din care s-a obŃinut. Această

creştere se datorează formării compuşilor melanoidinici care au caracter

antiradicalic şi potenŃial reducător ridicat. In concluzie, putem spune că

activitatea antiradicalică a malŃului creşte cu creşterea culorii.

22. Soiurile aromate de hamai Huller Bitterer şi Perle au o concentraŃie mai

ridicată de substanŃe polifenolice totale în comparaŃie cu soiurile amare

Magnum şi Brewers Gold şi în consecinŃă prezintă o activitate

antiradicalică RA DPPH mai mare.

23. Există corelaŃii perfect pozitive statistic r2=0,95 (p<0,05) între capacitatea

antiradicalică exprimată ca RA DPPH şi cantitatea totală de polifenoli din

hamei.

24. Se propune parametrul concentraŃie polifenoli totali ca şi marker de calitate

la certificarea hameiului pentru obŃinerea denumirii de origine.

25. Capacitatea antiradicalică a mustului de bere RADPPH creşte cu 20% după

dozarea hameiului, direct proporŃional cu creşterea cantităŃii de substanŃe

antiradicalice din hamei (mmoli/l trolox).

26. Capacitatea antiradicalică RADPPH a mustului hameiat se corelează cu

cantitatea de substanŃe polifenolice totale r 2= 0,71(p<0,05).

27. Berile experimentale obŃinute în staŃia pilot au o activitate antiradicalică

RADPPH de minim 9,73% şi maxim 13,98%, mult mai ridicată decât a berii

control de 8,32%.

28. Există o corelare pozitivă r2 = 0,72 (p<0,05) între capacitatea antiradicalică

a berii şi cantitatea de substanŃe polifenolice totale din bere.

XLII

BIBLIOGRAFIE SEELECTIVA

1. BIENDL, M., MITTER, W., PETERS, U., (2002), Use of a

xanthohumolrich hop product in beer production. Brauwelt Int., 20, 39-42.

2. DE KEUKELEIRE D., (2003) Beer, hops, and health benefits. Scandinavian Brewers’s Review, 60 (2): 10-17.

3. FORSTER, A., GAHR, A., KETTERER, M., BECK, B. AND MASSINGER, S., (2002) Xanthohumol in beer – possibilities and limitations of enrichment. Monatsschr. Brauwiss.,55, 184-194.

4. GERHAEUSER, C.,FRANK, N.,(2005). Xanthohumol, a new all-rounder? Molecular Nutrition and Food Research 49: 821-823.

5. GERHAUSER, C., ALT, A.P., KLIMO, K., (2002), Isolation and potential cancer chemopreventive activities of phenolic compounds of beer. Phytochem Rev 1, 369–377.

6. HOFTA, P., DOSTÁLEK, P. AND BASAŘOVÁ, G., (2004) Xanthohumol – a hop resin or hop polyphenol? Chem Listy 98 (9): 825-830.

7. HUGHES, P.S., (2000) The significance of iso-α-acids for beer quality. J. Inst. Brew., 106(5), 271-276.

8. MAGALHÃES, P. J., GUIDO, L. F., CRUZ, J. M. AND BARROS, A. A., (2007) Analysis of xanthohumol and isoxanthohumol in different hop products by liquid chromatography-diode array detection-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr.A, 1150, 295-301.

TEZ Ă DE DOCTORAT CERCET ĂRI PRIVIND TRASABILITATEA … · fierberea mustului de bere. Spectrul compu şilor prenilflavonoidici care se reg ăsesc Spectrul compu şilor prenilflavonoidici

Documents