Texto Completo(PDF-436 Kb)

@ Autor de correspondencia

Bacteriófagos: de la terapia con fagosa la biología combinatoria

@ Nelson S Vispo, Yaquelin Puchades

Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. Ave 31 e/ 158 y 190, Playa. AP 6162, CP 10600,Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: [email protected]

RESUMENLos virus más estudiados y los que más han contribuido al desarrollo de la Biología Molecular son los bacteriófagos.Su acción lítica sobre bacterias patógenas permitió su uso como alternativa terapéutica frente a infeccionesbacterianas. Su eficacia ha sido probada incluso contra microorganismos resistentes a antibióticos. Las bibliotecascombinatorias de péptidos o proteínas presentadas en la superficie de fagos filamentosos ha permitido la identificaciónde moléculas novedosas con propiedades de unión muy útiles para aplicaciones médicas e industriales. Lasinvestigaciones con fagos continúan aumentando la complejidad de los métodos de presentación de proteínassobre su superficie. Es posible que estas bibliotecas biológicas brinden solución a la mayoría de los problemas deunión entre moléculas, cuya aplicación más efectiva resulte la que explore exhaustivamente esta dificultadcombinando ciclos de selección (biopanning) y determinación de secuencias de ADN. Esta tecnología tiene elpotencial para generar extensas bases de datos que incluyan las relaciones entre la estructura de las proteínas y sufunción biológica.

Palabras claves: bibliotecas combinatorias, presentación en fagos, terapia con fagos

Biotecnología Aplicada 2001;18:135-147

ABSTRACTBacteriophages: from Phage Therapy to Combinatorial Biology. Bacteriophages (phages) are the most studiedviruses and the major contributors for the development of Molecular Biology. Their lytic action over pathogenicbacteria makes them useful as an alternative therapy for the treatment of bacterial infections. Their efficacy hasbeen proven even against several drug-resistant bacteria. Phage display of a wide range of polypeptides has beenincreasingly used to identify novel molecules with useful binding properties for research, medical and industrialapplications. Bacteriophage researchs have improved the sophistication of methods used for phage display ofproteins. These biological libraries will probably give a solution for most of the binding problems between molecules,and the best application would be that exploring this difficulty by means of combination of selection rounds(Biopanning) and determination of DNA sequences. This technology has the potential to generate vast databasescontaining relationships between protein structure and biological activity.

Keywords: combinatorial libraries, phage display, phage therapy

AntecedentesEn 1896, Hankin reportó que el agua de los ríosGanges y Jumna, en la India, tenía una acciónbactericida marcada y que podía pasar a través de unfino filtro de porcelana sin perder esta propiedad. Laactividad se perdía si se hervía el agua. Hankin estu-dió este efecto, en particular sobre Vibrio cholerae, ysugirió que la sustancia responsable hacía que la epi-demia del cólera no se expandiera si se ingería estaagua [1]. Edward Twort [2] y Félix d’Herelle [3]informaron por separado el aislamiento de entidadesfiltrables capaces de destruir cultivos de bacterias oproducir pequeñas áreas de color más claro cuandolas bacterias eran crecidas a confluencia en placas demedio sólido. Fue el canadiense Félix d’Herelle, cuan-do trabajaba en el instituto Pasteur de París, quiendio el nombre “bacteriófagos”, utilizando el sufijo“fagos” no en el sentido estricto de comer, sino en elde vivir a expensas de [4].

Se han descrito 12 familias de bacteriófagos condiferentes características estructurales y genéticas(Tabla 1). En todos los grupos, con excepción de lospertenecientes al género Inovirus, el ácido nucléicoestá contenido en una cápsida polihédrica unida en

algunos casos a otra estructura que permite la adsorciónal hospedante.

Las primeras investigaciones con fagos estuvieronrelacionadas con la definición de la naturaleza de es-tas partículas; sin embargo, su capacidad de provo-car la lisis celular de microorganismos patógenosconstituyó la base de muchos trabajos encaminadosa su uso terapéutico. La terapia con bacteriófagoscomenzó en 1921 por Bruynogue y Maisin [5] en eltratamiento de infecciones por estafilococos. Aun-que los resultados fueron muy promisorios se hizomuy poco en los años sucesivos. La idea de la aplica-ción terapéutica de los bacteriófagos se abandonódespués de la introducción de las sulfonamidas en lapráctica médica y, con ellas, de los antibióticos. Apesar de esto, la acción lítica de los bacteriófagosin vitro permitió a los investigadores usar fagos espe-cíficos para diferenciar entre varias especies de bac-terias y se desarrollaron métodos de diferenciaciónque son muy útiles actualmente en las investigacionesepidemiológicas [6].

A pesar del fracaso en el uso terapéutico de losbacteriófagos, grupos aislados de investigadores con-

REVIS

IÓN

Biotecnología Aplicada 2001; Vol.18, No.3136

Nelson S Vispo, Yaquelin Puchades Bacteriófagos

tinuaron los trabajos con el uso de estos agentes parael tratamiento de enfermedades infecciosas como latuberculosis y la neumonía. La mayoría de los esfuer-zos se concentraron en Rusia y la India, donde losaltos precios y la ausencia de disponibilidad de losantibióticos estimularon la búsqueda de alternativasterapéuticas. Aunque la mayoría de estas investiga-ciones mostró resultados positivos, no hubo cuantifi-cación clínica ni grupos controles, lo que impidiódeterminar la efectividad de esta terapia.

Las bacterias resistentes a antibióticos se están ex-pandiendo por el mundo, incluso resistentes a los deúltima generación como la vancomicina [7, 8]. Esta re-sistencia se disemina principalmente a través deplásmidos, transposones y elementos de inserción. Losmarcadores de selección pueden ser transmitidos entrelas células de diferentes especies de bacterias. El trata-miento con antibióticos para eliminar microorganismosresistentes a múltiples medicamentos es inefectivo y elcrecimiento de las bacterias patógenas resistentes es degran importancia para la práctica médica.

Existen resultados del período 1987-1999 [9] quemuestran que la terapia con bacteriófagos es muchomás efectiva que con antibióticos. En este estudio seincluyeron pacientes con enfermedades infecciosaspersistentes causadas por cepas resistentes aantibióticos. Inicialmente se aislaron y caracterizaronlas cepas patógenas, se determinó su sensibilidad abacteriófagos y se preparó un extracto estéril de fagosque fue administrado por varias vías. Además del efectoterapéutico —desaparición de los síntomas y exáme-nes bacteriológicos negativos—, se demostró que losbacteriófagos incrementan la protección contra infec-ciones bacterianas mediante destrucción de los micro-organismos y regulación del sistema inmunitario. Estasalternativas se pueden usar en combinación con agen-tes antimicrobianos como los antibióticos o como únicotratamiento en las infecciones ocasionadas porpatógenos de importancia clínica, por ejemplo, las ce-pas de los géneros Enterococcus, Mycobacterium,Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas, Streptococ-cus y Staphylococcus, entre otras.

Varios investigadores concuerdan en que el mayorobstáculo para la terapia con bacteriófagos es el pro-

pio sistema inmunitario, que tiende a eliminarlos rá-pidamente. Esta evidencia sugiere que los fagos nopermanecen viables en el torrente sanguíneo o en lostejidos del organismo el tiempo suficiente para lograralcanzar los sitios de infección e infectar las bacte-rias patógenas. Esta desventaja potencial, unida a laaparición de bacterias resistentes a antibióticos, hapropiciado la búsqueda de variantes novedosas defagos capaces de evadir los mecanismos del sistemainmunitario.

Con este objetivo se han desarrollado varios méto-dos, pero los más útiles son la selección de fagos,mutados o no, con mayor tiempo de vida media en lostejidos del organismo mediante pases múltiples en ra-tones, y la obtención de bacteriófagos modificadosgenéticamente que presenten en su superficie péptidoso moléculas que antagonicen una o varias de las fun-ciones del sistema inmunitario. Dentro de las molécu-las que se pueden expresar en la cápsida de los fagosfilamentosos con posibilidades de impedir la inacti-vación del virus, se encuentran los péptidos y molé-culas antagonistas de cualquiera de las vías del sistemadel complemento, las interleuquinas y otrascitoquinas, así como proteínas glicosiladas y facto-res de inhibición [10].

Estudios de Biología MolecularLa era moderna de los estudios con fagos comenzócon los trabajos de Max Delbrück en 1938. Rápida-mente otros investigadores como Salvadore Luria seunieron a Delbrück en el estableciemiento de la inves-tigación de los bacteriófagos como vía para poder com-prender las características fundamentales de la vidabiológica. Mientras se desarrollaban estos estudios sedefinió la naturaleza viral de los fagos, se determinó lacomposición química del virión (proteínas y ADN),se aislaron nuevos fagos a partir de diferenteshospedantes microbianos, y se obtuvieron algunosprogresos en el entendimiento del ciclo de vida viral.Las primeras microfotografías electrónicas de fagosfueron obtenidas en 1942 por Thomas Anderson [11].

A pesar de que los fagos son virus simples estructu-ral y genéticamente, han resultado particularmente úti-les en el estudio de varios fenómenos moleculares. Los

Tabla 1. Grupos y géneros de bacteriófagos.

Grupos o familias Género Ejemplo Morfologíade la partícula Envoltura Genoma

Corticoviridae Corticovirus PM2 Isométrica No ADN bicatenario

Cystoviridae Cystovirus Ø6 Isométrica Sí 3 segmentos de ARNbicatenario

Inovirus Colifago fdInoviridae

Plectrovirus Fago AcholeplasmaVarilla No ADN circular de simple cadena

Levivirus Colifago MS2Leviviridae

Allolevirus Colifago QbetaIcosahédrica No 1 cadena ARN (+)

Lipothrixviridae Lipothrixvirus Fago Thermoproteus Varilla Sí ADN lineal bicatenarioMicrovirus Colifago ØX174Spirovirus Fago SpiroplasmaMicroviridae

Fago Mac-1Icosahédrica No ADN circular de simple cadena

Myoviridae Colifago T4 Fago con cola No ADN linear bicatenarioPlasmaviridae Plasmavirus Fago Acholeplasma Pleomórfica Sí ADN circular bicatenarioPodoviridae Colifago T7 Fago con cola No ADN lineal bicatenarioSiphoviridae Fagos del grupo lambda Colifago lambda Fago con cola No ADN lineal bicatenarioSulpholobus shibataevirus SSV-1 En forma de limón No ADN circular bicatenario

Tectiviridae Tectivirus Fago PRD1 Icosahédrica No ADN lineal bicatenario



descubrimientos realizados con bacteriófagos constitu-yeron la base del desarrollo de la biología molecular.Durante los primeros años posteriores a su descubri-miento y hasta principios de la década de 1960, el tra-bajo con estos virus permitió identificar los ensayos deplacas de lisis [3, 12], la naturaleza del ciclo de vidaviral [13, 14], los tipos de mutaciones genéticas [15-17], que los genes son segmentos de ADN [18], la trans-ferencia de genes entre células mediadas por virus [19],las enzimas de restricción y modificación [20, 21], lacolinealidad de genes y proteínas [22], y el ADNgenómico de simple cadena del bacteriófago φX174 [23].

A partir de 1960, las investigaciones con bacteriófa-gos continuaron mostrando resultados asombrosos: ladescripción del ARN mensajero [24], la naturaleza delcódigo genético [25], el carácter físico de la recombinacióngenética [26], el mecanismo de acción de los factores detranscripción [27, 28], la recombinación sitio específica[29-31], la descripción de la ADN ligasa [32] y laantiterminación como mecanismo de regulación trans-cripcional [33]. Se describieron nuevas característicasdel mecanismo de replicación del ADN: la síntesis dis-continua de una de las cadenas mediante los fragmentosde Okazaki [34], el mecanismo de replicación por círcu-lo rodante [35] y el papel de los cebadores de ARN en laetapa de iniciación de este proceso [36]. Se logró la vi-sualización y separación de proteínas medianteelectroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida(SDS-PAGE) de acuerdo a su peso molecular [37, 38].Otros estudios con fagos conllevaron a la identificaciónde las chaperoninas [39], a la caracterización de secuen-cias de inserción y transposones [40], al hallazgo de genessobrelapados [41], a la descripción de la retroalimenta-ción negativa como mecanismo de regulación transcrip-cional [42], y al uso de fagos reporteros de actividadluciferasa para el diagnóstico médico [43].

Alrededor de 1970, el mundo de la biología comenzóa transformarse producto de la “revolución del ADNrecombinante”, con la cual se logró introducir genes decualquier organismo, sin importar su complejidad, en elgenoma de fagos. Esta revolución provocó profundoscambios en las investigaciones con bacteriófagos, al igualque en otras áreas de la biología. El número de inves-tigadores que trabajaban directamente con bacteriófa-gos disminuyó precipitadamente, lo que hizo posible elestudio de genes de organismos más complejos conmétodos tan sencillos como los que permitieron el es-tudio de los fagos y las bacterias. Al mismo tiempo seincrementó el número de científicos que usaban algunasformas de bacteriófagos en sus estudios, ya que la ma-yoría de las técnicas de la biología molecular modernason derivadas de fagos. Y así como la tecnología deADN recombinante y otras técnicas hicieron posible elestudio molecular de varios organismos, tambiénincrementaron la complejidad de los experimentos quese realizan con bacteriófagos. De manera que para aque-llos problemas científicos donde los fagos representanun sistema ventajoso, éstos continúan resultando unaherramienta de estudio sencilla y versátil.

Biología CombinatoriaLos fagos filamentosos pertenecen a una familia deInovirus que infectan las bacterias Gramnegativas.Están constituidos por una envoltura proteica tubularen cuyo interior se encuentra una molécula de ADN

circular de simple cadena de 6,4 kb. La partícula viraltiene 900 nm de largo y 6,5 nm de diámetro y estáintegrada por cinco proteínas: pIII, pVI, pVII, pVIIIy pIX. El cuerpo de la partícula está formado por 2 700copias de pVIII [44]. Los extremos son cerrados porcinco copias de las proteínas pVII y pIX en un lado, ypVI y pIII en el otro. Estos virus infectan solamentebacterias que expresan las fimbrias sexuales, codifica-das por el factor F. La unión del fago a esta estructuraocurre a través de pIII (Figura 1).

En 1982, Dulbecco [45] sugirió que péptidosinmunogénicos derivados de epítopos bien caracteriza-dos de agentes patógenos, podían ser fusionados a lasproteínas de la cápsida del fago lambda u otros virus.La partícula viral resultante que presenta el péptidoforáneo en su superficie, podía ser utilizada como com-ponente principal de vacunas libres de células.

En 1985, George Smith [46] demostró que elgenoma de los fagos filamentosos o fd podía ser ma-nipulado con facilidad para obtener partículas fágicasque presentaran péptidos fusionados a proteínas desu superficie y estos péptidos expuestos podían serreconocidos por el anticuerpo correspondiente. Es-tas observaciones estimularon las investigacionesposteriores en este campo y favorecieron el estable-cimiento de la tecnología de presentación de péptidosy proteínas.

Figura 1. Representación esquemática de la estructura de losfagos filamentosos.

900

nm

Proteínade fusión

g3p4143 kD

g6p5112 kD

Fusiónal gen 3

ADN (simple cadena)

6500 pb

g8p28005 kD

g7p513,5 kD

g9p513,5 kD

6 nm



Los rápidos avances ocurridos en los últimos añosen las estrategias experimentales usadas para identifi-car y caracterizar los sitios de unión de un receptor asu ligando, han dado una nueva dimensión a este pro-blema de la ciencia. Estas nuevas tecnologías se basanen un tema común: la preparación de mezclas de ungran número de moléculas cuyas secuencias o estruc-turas han sido aleatorizadas previamente, y el diseñode métodos que permitan identificar propiedades deunión específica dentro de este repertorio. Esta con-cepción ha llevado a los químicos a la creación derepertorios “sintéticos” y, por ende, al desarrollo de laQuímica Combinatoria, y a los biólogos moleculares,a la creación de repertorios “genéticos” y al desarrollode la Biología Combinatoria. De estos últimos, el sis-tema que más atención ha recibido en esta década, porsu simplicidad y versatilidad, es la llamada “tecnolo-gía de presentación de péptidos y proteínas en la su-perficie de los fagos (bacteriófagos) filamentosos(TPFF)” (phage display technology).

Tecnología de presentación de proteínasy péptidos en la cápsida de bacteriófagosfilamentososLa tecnología de presentación en la superficie de fagosse basa en la capacidad de exponer un péptido o unaproteína de interés en la cápsida de un bacteriófago.Comienza con la fusión de un polipéptido X a una pro-teína de la cápsida del fago para estudiar sus propieda-des de unión a una molécula blanco Y. Con este objetivoes necesario clonar la secuencia nucleotídica del poli-péptido X fusionada al gen de la proteína de la cápsida.El segundo paso consiste en la construcción de unagran colección de clones, cada uno de los cuales sinte-tiza una variante diferente de la secuencia del polipép-tido originalmente fusionado. La molécula blanco Yunida a una fase sólida puede ser usada para separarpor afinidad aquellos fagos que presenten un polipépti-do X con propiedades de unión a dicha molécula. Launión física entre el polipéptido X y su gen, mediadapor la fusión a la proteína de la cápsida, permite laclonación y determinación de las secuencias nucleotí-dicas que codifican las variantes del polipéptido X quese unen a la molécula blanco Y [47].

Las dos proteínas de la cápsida que se han utilizadopara la presentación de péptidos foráneos son pIII ypVIII. En los dos casos, la inserción tiene lugar en elextremo amino o cerca de él. El gran número de copiasde pVIII en una partícula fágica contrasta con las cin-co que existen de pIII. Esto constituye una diferenciaimportante entre los dos tipos de fusión, lo que lashace características para propósitos diferentes: la se-lección de uniones de baja afinidad o de alta afinidad,respectivamente [48].

Se han desarrollado dos tipos de vectores fundamen-tales: el primero se utiliza para obtener partículas fágicasen las que todas las proteínas de la cápsida se encuen-tran modificadas (sistema de un solo gen), y en el se-gundo, se producen virus quiméricos en los que seobtienen dos versiones de las proteínas de la cápsida:una modificada y otra de tipo salvaje (sistema de dosgenes). El primer tipo de vectores se ha utilizado prin-cipalmente para pIII, cuyas funciones biológicas nose afectan significativamente con las fusiones a su ex-tremo amino. Por el contrario, la inserción de péptidos

de más de 10 aminoácidos en todas las copias de laproteína pVIII ha sido un fracaso debido a que no per-mite el ensamblaje de la cápsida [49].

George Smith [46] fue el primero en demostrar quepIII podía ser utilizada para presentar péptidos en lasuperficie de fagos filamentosos utilizando un sitio derestricción de la enzima BamHI cerca del centro de lasecuencia codificadora de la proteína. Parmley y Smith[50], describieron una familia de vectores en los cualesel ADN foráneo puede ser insertado en el extremo 3'de la señal de secreción de la proteína pIII.

Los vectores del sistema de dos genes utilizan laexpresión concomitante de la molécula recombinantey la de tipo salvaje. Esto se logra mediante la fusión entándem del gen en el genoma del fago, donde una de lasdos copias se modifica, o utilizando un sistema defagómidos. Los fagómidos son plásmidos que portanla región intergénica de un fago filamentoso y puedenser empaquetados como ADN de simple cadena enpartículas virales con la ayuda de un fago auxiliador[51]. En estos plásmidos, los genes III y VIII recom-binantes son presentados en un vector de expresiónque contiene el origen de replicación de los fagos [52].Las bacterias transformadas con estos plásmidos sonsuperinfectadas por un fago auxiliador y el resultadoes la liberación de un fago híbrido al medio de cultivo.

El fago auxiliador denominado M13K07 se cons-truyó con el objetivo de incrementar la produccióncualitativa y cuantitativa de ADN plasmídico de sim-ple cadena. Este fago derivado del M13 presenta unasustitución de bases G por T en el gen II, la cualcambia el codón 40 de M a I. Esto resulta en unaproteína pII que funciona eficientemente en un origende replicación que sólo contiene el dominio A. Ade-más, tiene el origen de replicación de p15A y el gen deresistencia a kanamicina del transposón 903, ambosinsertados en el sitio AvaI del origen de replicación.De este modo, los dominios A y B quedan separadosentre sí y a los efectos de la replicación este origensólo tiene el dominio A.

Cuando el fago M13K07 se cultiva solo; o sea, enausencia de fagómido, pII funciona con suficiente efi-ciencia en el origen de replicación alterado producien-do altos títulos de fago. En cambio, cuando crece enpresencia de un fagómido, el origen de replicación deM13K07 es menos eficiente que el origen de tipo sal-vaje presente en el fagómido. Este hecho, unido al altonúmero de copias del fagómido, conduce al empaque-tamiento preferencial del ADN fagomídico en las par-tículas virales [51].

El origen de replicación de p15A le permite al fagoreplicarse independientemente de la función de pII, yasí evitar los efectos de interferencia que aparecen cuan-do el fago crece en presencia de un fagómido; es decir, lareducción del número de copias del fago, puesto que elfagómido interfiere en su replicación. El gen de resis-tencia a kanamicina permite la detección del fago conuna alta sensibilidad como unidades de transducción,ya que si se siembran células infectadas en un mediocon kanamicina, una sola infección exitosa conduce a unclon visible. El uso del fago auxiliador M13K07 para laproducción de ADN plasmídico de simple cadena, per-mite obtener normalmente títulos de 1 x 1011 UT/mL(unidades de transducción/mL). Se ha logrado elempaquetamiento de fagómidos como ADN de simple



cadena con insertos de hasta 9 kb, sin pérdida significa-tiva de rendimiento ni inestabilidad [51].

El empleo del fago auxiliador en combinación conun fagómido tiene ventajas importantes: las célulasinfectadas sobreviven, crecen y continúan secretandopartículas virales indefinidamente. Los clones puedenser propagados como plásmidos y como fagos. Dadoque el fago contiene un genoma de ADN circular desimple cadena, la secuencia nucleotídica se puede ana-lizar rápidamente. La información foránea se puedeclonar y expresar como parte de una proteína estruc-tural del virus, y como el virus recombinante essecretado por la célula en el sobrenadante del cultivo,su purificación se simplifica considerablemente.

Los primeros trabajos en los que se aplicó la tecno-logía de presentación en la superficie de fagos emplea-ron la fusión a pIII. El primero de ellos lo realizóSmith en 1985 [46] y consistió en la clonación de unfragmento del gen de la endonucleasa EcoRI de 171 pben un sitio BamHI del gen III, de modo que la secuen-cia foránea quedaba insertada entre los dos dominiosde pIII, sin afectar su función. Esta proteína híbrida seincorporó en el virión, que mantuvo la infectividad ypresentó los aminoácidos foráneos de forma inmuno-lógicamente accesible, ya que mediante el uso de unanticuerpo anti-EcoRI se obtuvo una reducción de lostítulos de fago. La actividad neutralizante de fago fuetotalmente bloqueada por preincubación con laendonucleasa EcoRI purificada. Mediante una purifi-cación por afinidad con el anticuerpo mencionado, estefago fue enriquecido entre 1 500 y 7 200 veces enrelación con el fago de tipo salvaje.

El siguiente trabajo lo desarrollaron Parmley y elpropio Smith en 1988 [50]. En él se propuso un mejo-ramiento del diseño del vector tomando como sitio declonación el extremo amino de pIII —con lo cual dis-minuyen los efectos de los insertos en la función de laproteína— y utilizando como vector parental a fd-tet,que permite la propagación como plásmido indepen-dientemente de la infección continua, reduce la de-manda de la función de pIII y puede ser detectadosensiblemente como unidades de transducción graciasal gen de resistencia a tetraciclina. En este vector me-jorado se realizó la clonación de varios insertos dediferente talla y orientación. Todos ellos fueron esta-bles y no produjeron efectos notables en la función depIII. Los aminoácidos foráneos se expresaron en lasuperficie del fago y algunos clones que portaban frag-mentos de un gen blanco expresaron determinantesreconocidos por un anticuerpo específico contra elproducto génico. En este trabajo se describe por pri-mera vez el método de biopanning para la purificaciónpor afinidad del fago que porta el fragmento foráneo.

El procedimiento de biopanning es una purificaciónpor afinidad donde la biblioteca de fagos se hace reac-cionar con un anticuerpo (Figura 2). Los fagos unidosse recuperan por ruptura de los enlaces no covalentesentre la molécula presentada y la molécula blanco a pHácido (pH 2), sin eliminación de la infectividad del fago.En los primeros trabajos se explotaba la fuerte uniónbiotina-estreptavidina y la biblioteca de fagos se hacíareaccionar con un anticuerpo biotinilado, posteriormen-te los reaccionantes específicos se unían a una placade Petri revestida con estreptavidina. Este método deselección se ha desarrollado y actualmente se utilizan

diferentes soportes como perlas y placas depoliestireno, donde la molécula selectora se une direc-tamente al soporte sólido sin necesidad de biotinilar.

El método de biopanning es muy ventajoso con res-pecto a las técnicas de análisis tradicionales, puestoque la selección por afinidad es mucho más fácil y efec-tiva que el análisis masivo de un gran número de clones.El biopanning permite obtener mayores rendimientosy enriquecimientos con requerimientos de anticuerpomás bajos [45]. Mediante este método se seleccionanpreferencialmente clones que portan péptidos que seenlazan al sitio de unión del ligando con contactos ató-micos similares a los del epítopo natural; o sea, péptidosrelacionados con el antígeno originalmente utilizado paraproducir el anticuerpo [48].

Cuando se realizan dos o más rondas continuas debiopanning, se produce un efecto acumulativo queconsiste en una reducción significativa del número departículas del fago blanco, con la posible pérdida declones raros. Esto se puede solucionar mediante unaamplificación intermedia después de la cual los fagosresultantes pueden ser sometidos nuevamente abiopanning sin pérdida de esos clones poco frecuen-tes. El siguiente ejemplo ilustra este hecho: en el pro-pio trabajo de Parmley y Smith [50], después de dosrondas de biopanning sin amplificación intermedia, seobtuvo un enriquecimiento global de 106. Sin embar-go, cuando se realizaron tres rondas con amplificaciónintermedia, dicho parámetro fue de 1,25 x 107.

El método de biopanning no discrimina entre unio-nes de afinidad moderada (Kd micromolar) o alta (Kdnanomolar). Como se explicó anteriormente, la selec-ción de fagos que portan péptidos que se unen a sublanco con afinidad relativamente baja, se debe ainteracciones multivalentes entre el fago y la moléculablanco. No obstante, es posible combinar ventajosa-mente condiciones que favorezcan interacciones multi-y monovalentes: en las primeras rondas de biopanningse debe promover la interacción multivalente puestoque la unión de alta avidez permite la selección de unagran muestra de péptidos que se han unido a su blancoen un rango amplio de afinidades. Esto debe ir acom-pañado de lavados rigurosos que disminuyan el fondo

Figura 2. Representación esquemática del procedimiento de bioppaning.

Repertorio de diversassecuencias presentadas

en fagos

Incubación con elrepertorio presentadoen fagos con antígeno

Eliminación de losfagos no absorbidos

Elución de los fagosabsorbidos



de fagos que se unen inespecíficamente. En las últimasrondas se deben favorecer las interacciones monova-lentes para lograr el enriquecimiento de los péptidosque se unen con mayor afinidad [53].

Bibliotecas peptídicas.Localización de epítopos linealesLa construcción de grandes bibliotecas de péptidosaleatorios fusionados a pIII se reporta por primeravez en 1990 [54]. En los últimos años, diferentes gru-pos se han enfrascado en la construcción de bibliote-cas peptídicas y en la selección contra una moléculablanco.

Los AcM se encuentran en el centro de muchoscampos de aplicación. Su utilización en el diagnósticoinmunológico para la detección, localización y cuanti-ficación de un antígeno, la inmunoradioterapia, losprocesos de inmunopurificación, la inmunomodula-ción, la terapia mediante su unión a toxinas y su em-pleo eficaz en los estudios de estructura y función, losconvierten en poderosas herramientas de la biotecno-logía. La identificación y caracterización de los resi-duos aminoacídicos que intervienen en la unión de unanticuerpo a su antígeno específico, abre numerosasposibilidades en el diseño de vacunas sintéticas desubunidades y de agentes terapéuticos peptídicos tantonaturales como sintéticos.

La identificación de los epítopos reconocidos porlos AcM se ha realizado tradicionalmente probandocolecciones de fragmentos peptídicos derivados delantígeno, hasta identificar el segmento mínimo de lasecuencia que reacciona con el anticuerpo. Otros gru-pos han utilizado también colecciones de péptidossintéticos o de fragmentos de ADN complementarioexpresados in vitro.

La utilización de bibliotecas peptídicas de fagosfilamentosos presenta como ventajas adicionales sobrelas demás técnicas químicas o biológicas, la asociaciónfísica entre la información genética y el fenotipo, y laselección y amplificación de esta información enEscherichia coli. Este procedimiento permite identi-ficar y caracterizar los péptidos seleccionados auncuando se recuperen sólo pequeñas cantidades en elproceso de selección (en teoría, hasta el nivel de unasola partícula). Estos péptidos que mimetizan alantígeno natural se denominan fagótopos.

Scott y Smith en 1990 [54] describieron la construc-ción de una biblioteca de péptidos de seis residuosaminoacídicos que contenía alrededor de 200 millonesde clones fusionados al extremo amino de pIII. Estabiblioteca fue utilizada para seleccionar clones que seunen específicamente a dos AcM que reconocen la se-cuencia DFLEKI en el péptido lineal y como parte de laproteína miohemeritrina. Los autores fueron capacesde aislar clones independientes similares al epítopo ori-ginal que contenían la secuencia consenso DFL.

Cwirla y colaboradores [53] también reportaron otroejemplo de imitación del antígeno a partir de clonesseleccionados de una biblioteca de péptidos donde elepítopo original es representado por una secuenciacontinua del péptido. Se construyó una biblioteca dehexapéptidos en el extremo amino de pIII y se hizoreaccionar el AcM 3E7, el cual reconoce la secuenciaYGGF de la b-endorfina. Los cincuenta y un clonesseleccionados por afinidad presentan una tirosina en la

primera posición y la mayoría expone una glicina en lasegunda posición. Casi todos estos clones selecciona-dos muestran una baja afinidad por el anticuerpo, peroa bajas concentraciones de 3E7 durante la selecciónpor afinidad se logró seleccionar fagos con mayor afi-nidad y los dos mismos aminoácidos presentes en laprimera y segunda posición. La mayoría de los clonestenían la secuencia YGGFL, que se une al anticuerpocon gran afinidad.

Un epítopo es continuo (lineal, secuencial o prima-rio) si se encuentra formado por residuos adyacentesen la secuencia primaria y, por lo tanto, presentes en laproteína desnaturalizada o en un fragmento apropiadode ésta [55]. Los AcM contra epítopos lineales peque-ños de un antígeno proteico han sido utilizados pordiferentes grupos como sistema modelo para seleccio-nar fagos que portan el péptido reconocido específica-mente por el AcM. En la mayoría de los casos, elpéptido presentado por el clon seleccionado muestrauna secuencia similar a la del antígeno original.

Como parte de un trabajo integral en estudios deestructura y función de diferentes moléculas, nuestrogrupo caracteriza los sitios de unión y la especificidaddetallada de varios AcM con lo que aumenta la infor-mación disponible desde su uso por primera vez. LaTabla 2 muestra algunos ejemplos de anticuerpos ca-racterizados, su epítopo reconocido, y el fagótopoidentificado.

Un factor limitante del éxito de la tecnología de pre-sentación en fagos es el tamaño de las bibliotecas quese obtienen. Para maximizar las interacciones entre elligando seleccionado y el blanco al cual se une, seríaconveniente presentar péptidos aleatorios relativamen-te largos. El desarrollo de una tecnología novedosacomo el enfoque del Cosmix-Plexing supera esta li-mitación [58]. Las bibliotecas utilizadas en esta técnicacontienen un sitio único de recombinación dentro deldominio hipervariable. Aunque la principal ventaja dela recombinación inducida por Cosmix-Plexing seobtiene a través del incremento de la diversidad duran-te la selección, también se puede utilizar para la pro-ducción de bibliotecas grandes (por ejemplo, >109

variantes). Además, se facilita la producción de biblio-tecas extendidas mediante la introducción de casetesespecíficos en las bibliotecas existentes [59].

Localización de epítopos discontinuoso topográficosLa utilización de péptidos sintéticos solapados para ob-tener información acerca de la estructura del determi-nante antigénico no es válida cuando se trata de epítoposdiscontinuos. Los epítopos discontinuos, también llama-dos conformacionales o topográficos, involucran resi-duos aminoacídicos separados ampliamente en lasecuencia primaria de las proteínas, pero unidos en laproximidad espacial de la proteína plegada. De aquí seexplica que un anticuerpo que reconozca este tipo deepítopo pierda la capacidad de unión si se desnaturalizao se fragmenta el antígeno.

Tabla 2. Ejemplos de anticuerpos monoclonales caracterizados en nuestro laboratorio.AcM Epítopo Fagótopo ReferenciasCB Hep-1 TGPCKTCTTPAQG CKTCHRPIQ Felici y colaboradores [56]CB IL-2.1 LNLAQSKNFHLRPR SLSPQLFPR Vispo y colaboradores [57]CB IL-2.2 SETTFM TTFMSQSTG Vispo y colaboradores [57]



Las evidencias de que un péptido presentado porun fago es capaz de imitar un epítopo discontinuoson todavía limitadas. Felici y colaboradores [60] hi-cieron el primer reporte en 1993, quienes utilizaronuna biblioteca de nonapéptidos presentados en pVIIIy el AcM 1B7, que reconoce un epítopo discontinuode la toxina de Bordetella pertussis. Se selecciona-ron clones independientes y se probó la capacidad deinteracción de los mismos con el AcM. En este casono fue posible identificar los aminoácidos presentesen la proteína que formaban el determinante antigénicoy no se encontró una secuencia consenso entre losdiferentes clones.

Balass y colaboradores [61] utilizando el AcM quereconoce el sitio de unión del receptor de la acetilcolina(AcChoR), seleccionaron fagótopos a partir de una bi-blioteca de hexapéptidos presentados en pIII. Este an-ticuerpo reconoce un epítopo conformacional puestoque reacciona con la proteína nativa y no con la formadesnaturalizada del AcChoR. Los fagos seleccionadosno presentaron ninguna secuencia consenso presenteen el antígeno. Un péptido sintético derivado de losfagótopos competía con el anticuerpo por la unión alreceptor y era capaz de inhibir su acción neutralizanteen ensayos in vivo. Aunque en estos dos ejemplos seseleccionaron fagótopos que imitan epítopos conforma-cionales, no se pudo correlacionar la secuencia obteni-da mediante selección con el fago con la región delantígeno que participa en la unión al anticuerpo.

La tecnología de presentación funcional de péptidosen fagos ha sido muy utilizada para identificar losaminoácidos que participan en las interacciones entremoléculas. Estos ligandos presentados en la cápsidade fagos filamentosos han sido fusionados fundamen-talmente al extremo amino de la proteína pIII. En es-tas interacciones, el ligando puede reconocer unasecuencia continua en la molécula blanco y ser fácil-mente reproducida por un péptido lineal presentadoen la cápsida del fago. Si el ligando reconoce una se-cuencia discontinua, cuyos aminoácidos de la molécu-la blanco se encuentran unidos sólo en la estructuraterciaria, será más difícil encontrar péptidos linealesque sean capaces de imitar el ligando. Por otro lado,los péptidos fusionados expuestos al solvente sonflexibles y pueden presentar varias conformaciones,por lo que el precio en reducción de entropía que debepagar en la unión con una molécula complementaria eselevado. Además, la obtención de datos de estructuraa partir del uso de péptidos pequeños se dificultafrecuentemente por el tamaño de la molécula.

Una solución propuesta a este problema es añadircisteínas en posiciones que promuevan la ciclización dela molécula. Sin embargo, una estrategia alternativa hasido construir bibliotecas donde el péptido presentadoesté limitado a un número de conformaciones medianteel constreñimiento en el marco de una estructura másrígida. Un ejemplo de esto sería la ubicación del péptidoen un lazo entre dos hélices α de una proteína biencaracterizada y cuya estructura sea relativamente in-sensible a sustituciones lo que reduce el costo enentropía y hace a la molécula más asequible a análisisestructurales. Nuestro grupo utilizó la proteína Rop deE. coli, cuya estructura es relativamente invariable conlas sustituciones. La introducción de un nonapéptido enel lazo ubicado entre dos hélices α atentó contra la es-

tabilidad de la molécula. Sin embargo, con la introduc-ción de péptidos de cuatro y siete aminoácidos se logróobtener un dímero de Rop estable [62]. Nagi y Reagandemostraron que a medida que aumenta el tamaño delpéptido insertado, la desnaturalización química y la es-tabilidad térmica de la proteína disminuye [63].

La localización de epítopos discontinuos mediante elempleo de las bibliotecas constreñidas por cisteína fuereportada por primera vez por el grupo de O’Neil en1992 [64]. Este grupo construyó una biblioteca de seisaminoácidos flanqueados por dos cisteínas y fusiona-dos a la proteína pIII, para la obtención de un antago-nista de la glicoproteína plaquetaria gpIIb/IIIa.

En 1993, el grupo de Luzzago [66] constriñó la bi-blioteca que construyó Felici en 1991, mediante la in-corporación de dos cisteínas a ambos lados de la secuenciade nueve aminoácidos expuesta en la proteína VIII.Con esta nueva biblioteca se definieron los residuosque participan en la interacción de un AcM generadocontra la cadena H de la ferritina humana. Este anti-cuerpo reconoce un epítopo topográfico dentro de lamolécula de ferritina. Con el uso de esta biblioteca seaislaron clones que imitaban dos zonas diversas peromuy cercanas dentro de la estructura terciaria de lamolécula. Con los resultados de este trabajo, la utili-zación de las bibliotecas constreñidas por cisteínascomenzó a ser de uso común en la caracterización deepítopos topográficos. En el mismo número de la re-vista Gene, donde Luzzago publicó su trabajo,McLafferty [66] presentó una biblioteca de péptidosde 18 residuos flanqueados por dos cisteínas y fusio-nados a la proteína pIII, con lo que se logró seleccio-nar clones de mayor afinidad por un AcM contra laβ-endorfina.

En 1995, Koivunen [67] logró seleccionar moléculasligando contra los receptores de superficie de lafibronectina, la vitronectina y el fibrinógeno, a partirde bibliotecas peptídicas cíclicas de cinco y seis resi-duos, y una biblioteca lineal de nonapéptidos presen-tados en la proteína III. Los péptidos seleccionadosmuestran mayor afinidad cuando se encuentran cons-treñidos entre residuos de cisteína.

En 1996 se publicaron dos trabajos sobre la utiliza-ción de bibliotecas constreñidas con cisteínas. El prime-ro abordaba la selección de un péptido a partir de unabiblioteca de talla variable entre cuatro y ocho aminoá-cidos flanqueados por cisteínas [68]. Este péptido fueseleccionado contra la proteína ICAM1, que funcionacomo receptor de LFA-1 en la migración de los leucocitosen los procesos inflamatorios. El péptido seleccionadoinhibe la unión entre las dos moléculas y funciona comoantagonista de este sistema. En el segundo artículo selogró seleccionar péptidos cíclicos que interaccionan conla calmodulina, proteína citoplasmática que se une a cal-cio y regula la actividad de muchos blancos intracelularesa través de interacciones proteína-proteína [69]. Se se-leccionó un péptido antagonista de mayor actividad quelos seleccionados previamente a partir de una bibliotecano cíclica.

Las bibliotecas de insertos constreñidos permiten laidentificación de fagos que se unen con gran afinidad ala molécula blanco. Debido a que el péptido se encuen-tra en un contexto más rígido, el número de conforma-ciones que asume son más limitadas que las de unpéptido lineal flexible.



El conocimiento de los mecanismos de restricciónconformacional es aún incompleto y, por lo tanto,con vistas a aumentar las posibilidades de unión deun ligando específico a una molécula blanco dada (yasea un anticuerpo u otra molécula), es aconsejable siem-pre utilizar varias bibliotecas. Con el propósito delograr la maduración de la afinidad de los clones selec-cionados, es recomendable un segundo paso y cons-truir una subbiblioteca a partir de la anterior para laselección del clon de mejor capacidad de unión.

Fagótopos que imitan epítopos no peptídicosTambién se han seleccionado fagótopos cuyas secuen-cias peptídicas son estructuralmente análogos aparentesde estructuras no proteicas. Devlin y colaboradores [70]y Kay [71] y su grupo aislaron fagótopos que reaccio-nan con la estreptavidina. Este péptido es capaz de fun-cionar como análogo de la biotina en ensayos decompetencia. Los péptidos seleccionados muestran lasecuencia consenso HPQ. Webwer y colaboradores[72] determinaron la estructura cristalina del complejoentre la estreptavidina y el péptido FSHPQNT, y de-mostraron que la mayor estabilidad la brindaba la redde enlaces de hidrógeno de las cadenas laterales de lahistidina, la prolina y la glutamina.

Otras demostraciones de moléculas peptídicas quepueden sustituir ligandos no proteicos se obtuvo delos trabajos de Oldenburg [73] y Scott [74] quienes usa-ron la lectina concanavalina A para seleccionarfagótopos. Ambos grupos identificaron diferentes fa-milias de fagótopos con la secuencia YPY en los clonesde mayor afinidad. Se construyeron péptidos sintéti-cos a partir de la información obtenida de estas se-cuencias y se demostró la inhibición de la unión demetil α-D-manopiranósido, su ligando natural.

Estos hallazgos indican que es difícil el diseño demedicamentos no peptídicos que se deriva del análisisde los datos de cristalografía del complejo con elpéptido. Las características estereoquímicas del ligan-do natural no se pueden inferir con facilidad del análi-sis del péptido seleccionado y su interacción con elligando. Esto constituye un acercamiento esencial paraaquellos proyectos en los que se desconoce la natura-leza del ligando o se conoce que intervienen elementosno proteicos importantes para el reconocimiento de lamolécula.

Selección de fagótopos específicosde una enfermedadEn los acápites anteriores se describió la selecciónmediante el empleo de AcM o moléculas selectorasbien definidas. Sin embargo, esta tecnología se puedeaplicar a situaciones en las que la molécula selectorano se conoce o no se está definida, como, por ejemplo,los anticuerpos policlonales presentes en el suero san-guíneo. Esta aplicación más general de la tecnología depresentación de péptidos por fagos abre nuevas víaspara la identificación y caracterización de moléculasque pudieran ser utilizadas en sistemas de diagnósticoo para la preparación de vacunas nuevas.

El suero de pacientes que padecen una enfermedadinfecciosa contiene frecuentemente una gran cantidadde anticuerpos diferentes contra el agente infectivo.La caracterización de la naturaleza, la especificidad yla afinidad de estos anticuerpos sólo es posible si se

tiene el microorganismo patógeno o si se dispone de laproteína para utilizarla como reactivo. De la mismamanera, en otras entidades como las enfermedadesautoinmunitarias, la caracterización de los trastornosinmunológicos se realiza con aquellos anticuerpos paralos que se ha identificado un autoantígeno.

En todos estos casos en los que se desconoce elantígeno natural o no está disponible fácilmente, esposible utilizar bibliotecas de péptidos presentadosen la superficie de fagos filamentosos. Para esto serequiere un juego de muestras de suero de pacientesafectados por la enfermedad en estudio (suero especí-fico o SE) y un juego de sueros de individuos sanos(IS). El objetivo es identificar fagótopos específicosde suero, que reaccionen con todos los sueros de indi-viduos enfermos y no con los de individuos sanos.

El protocolo para este procedimiento fue desarro-llado con sueros de individuos inmunizados con unapreparación comercial de la vacuna contra el virus dela hepatitis B (VHB), que contiene el antígeno desuperficie del virus obtenido por vía recombinante.El suero de los individuos inmunizados fue utilizadocomo SE. Primeramente se realizó una purificaciónpor afinidad contra el primer SE y con los clonesseleccionados se realizó una inmunoidentificación.De esta forma se seleccionaron fagótopos reconoci-dos por los dos SE, los cuales se hicieron reaccionarcon un juego de sueros SE y con un juego de suerosIS. Finalmente se lograron identificar fagótopos queimitaban al antígeno en experimentos de competen-cia; además, uno de estos clones era muy similar a lasecuencia primaria del determinante “a” del antígenode superficie del virus. En este clon estaba presentela secuencia CKTC altamente reconocida por los sue-ros de individuos vacunados y por los sueros de in-dividuos infectados [75].

Mediante un estudio de caracterización del AcMCB.Hep-1, específico para el antígeno de superficiedel VHB y utilizado en el proceso de purificación delantígeno vacunal Heberbiovac, se identificaron se-cuencias que reproducen la región nativa en el antígenoy otras que imitan esta unión mediante cadenas latera-les diferentes con superficies topográficas similares.Este resultado garantiza que durante la inmunopurifi-cación se seleccionen aquellas moléculas de antígenoque presentan adecuadamente esta región esencial parael desarrollo de una respuesta inmunitaria protectorafrente a subtipos virales diferentes [56].

Esta tecnología nueva y poderosa para el diagnósti-co de enfermedades virales fue confirmada posterior-mente con el estudio de la infección por el virus de lahepatitis C (VHC). Se siguió la misma estrategia des-crita anteriormente y se logró identificar fagótopos [76]que, aunque no representaban una imagen del antígenodel VHC podían ser reconocidos por un panel de SE yno por los sueros IS.

Otros trabajos que han seguido esta línea de inves-tigación aplican esta tecnología en la caracterizaciónde enfermedades autoinmunitarias en los que el agentecausal no se conoce pero pueden estar involucradasentidades infecciosas. De esta forma, Dybward y co-laboradores [77] identificaron fagótopos que reaccio-naban con una muestra significativa de sueros deindividuos con artritis reumatoide. Por su parte, utili-zando la misma biblioteca de nonapéptidos fusionados



a pVIII, el grupo de Mennuni logró seleccionarfagótopos que imitan un ligando presente en el suerode los individuos con diabetes mellitus tipo I [78]. Unaño más tarde definirían fagótopos seleccionados conel suero de individuos prediabéticos [79].

Uno de los elementos que está en detrimento del mi-metismo efectivo de los péptidos seleccionados con estatécnica es inherente a la propia metodología. Los anti-cuerpos policlonales obtenidos contra péptidos presen-tados por el fago que se encuentran parcialmenteestructurados, tienen una baja probabilidad de reaccio-nar contra el antígeno original. Otro aspecto a tomar enconsideración es que los fagótopos seleccionados conAcM presentan péptidos que se unen específicamentea este anticuerpo, pero la forma en que representen unaimagen positiva del antígeno original depende de cómorepresentan verdaderamente una imagen negativa delanticuerpo que lo seleccionó. El proceso de caracteriza-ción para los AcM tiende a seleccionar un solo sitio deunión en particular del repertorio que se adaptadiferencialmente al epítopo. Desde el punto de vista dela unión, el mejor fagótopo seleccionado con un AcMpuede tener una adaptabilidad excelente para un parátopoen particular, pero esta capacidad de imitar al antígenooriginal depende completamente de la forma y las pro-piedades moleculares del sitio de unión del anticuerpo.Por eso, es posible que los fagótopos seleccionados conAcM no sean los mejores para inducir el repertorio dereceptores de células B, que después de la inmuniza-ción, proceden a presentar el antígeno al sistema inmunevirgen a través de células presentadoras de antígeno pro-fesionales. Sobre la base de estas consideraciones, sepuede concluir que una familia de anticuerpos contra elmismo epítopo (en vez de un solo AcM) puede darnosuna imagen negativa más estricta del antígeno.

Fagótopos como inmunógenosLa respuesta inmunológica que se obtiene cuando seinyectan las partículas virales de los bacteriófagosfilamentosos es dependiente de células T y no requie-re el uso de adyuvantes. El uso de los fagos filamentososcomo adyuvantes inmunológicos fue propuesto porprimera vez por de la Cruz y colaboradores [80] en1988. Estos investigadores mostraron que la fusión deun péptido corto del circumsporozoito de la malariaen el extremo amino de pIII produce un fagorecombinante capaz de inducir anticuerpos específi-cos contra el péptido.

Este hallazgo fue explotado por el grupo de Perham,quienes clonaron las secuencias que codifican péptidosde la malaria fusionadas a pIII y pVIII, y obtuvieronuna buena respuesta de células T y B [81, 82].Minenkova [83], en 1993, fusionó el determinanteantigénico de la proteína gap del VIH a pVIII y loutilizó como inmunógeno, con lo que obtuvo buenostítulos de anticuerpos en conejo.

Los fagótopos seleccionados por su capacidad deunirse a AcM de manera específica son buenas imi-taciones del antígeno, pero esta propiedad no está co-rrelacionada en todos los casos con la inducción de laproducción de anticuerpos contra el antígeno naturalcuando se usan como inmunógenos. De manera ge-neral, cuando los AcM utilizados como moléculas deselección son específicos contra epítopos continuos,se obtiene una buena respuesta contra el antígeno ori-

ginal [84, 85]. La situación se hace más complejacuando se necesita un mimetismo más elaborado.Fagótopos seleccionados con AcM que reconocenepítopos discontinuos, como el de B. pertussis, no lo-gran inducir una respuesta antitoxina en ratones [60].Por otra parte, dos fagótopos diferentes selecciona-dos con un AcM contra un epítopo complejo de laoncoproteína HER2/neu mostraron ser buenosmimótopos del antígeno, pero solo uno de ellos fuebuen inmunógeno [86].

Mimótopos presentados como fusión a pIII opVIII, e incluso péptidos sintéticos que reproducenla imagen del fagótopo seleccionado con un AcM,son capaces de inducir la producción de anticuerposque reaccionan contra el antígeno original. Sin embar-go, la conformación del péptido expuesto es impor-tante para la obtención de una respuesta inmunitariaadecuada. Menéndez y colaboradores [87] expresa-ron el péptido correspondiente a la región variable 2de la proteína de clase 1 de Neisseria meningitidisfusionado a pVIII. Emplearon dos variantes delpéptido: una que presenta la secuencia flanqueadapor cisteínas y la otra que la presenta flanqueada porcisteínas y tres glicinas. En ratones BALB/cinmunizados con los fagos se detectó que la presen-cia del espaciador de tres glicinas le permite al péptidoadoptar una conformación más adecuada capaz deinducir anticuerpos funcionales contra N. meningitidis.

Presentación de proteínas foráneasfusionadas a pIII. Aumentode la afinidad de interacción entrela proteína y la molécula blancoLos trabajos que describimos a continuación utilizanpIII como molécula de fusión y están encaminados abuscar aumentos de afinidad en las interacciones entreestas moléculas. Explotan las bondades de este siste-ma de permitir la selección a partir de una bibliotecade mutantes, del fenotipo deseado y, junto con él, sugenotipo.

La hormona de crecimiento humana (hGH) fue elprimer candidato para la obtención de mutantes demayor afinidad por su receptor. La hGH fue presenta-da en la cápsida de los bacteriófagos [88]. Esta hormo-na había sido ampliamente estudiada y se contaba conuna gran cantidad de mutantes puntuales y con losdatos de las zonas de interacción con el receptor. Ade-más, la estructura cristalina del complejo hormona-receptor había sido resuelta [89]. La hormonainteracciona con su receptor con una alta afinidad(Ka = 3 x 109 M-1) a través de una interfaz que implicados hélices, dos minihélices y regiones lazo (sitio 1).Después de la unión al sitio 1, otra zona de la hormona(sitio 2) se une a otro receptor para transmitir la señal.

Para aumentar la afinidad del sitio 1 se construyeroncinco bibliotecas de este sitio, con aleatorización decuatro residuos aminoacídicos. Se realizaron diferentesrondas de selección utilizando el dominio extracelulardel receptor y se analizaron los mutantes seleccionados.Se encontraron mutantes que aumentaron su afinidadentre 3 y 6 veces. En algunos casos se mantuvieron losresiduos críticos para la unión. Se seleccionaron, ade-más, mutantes más conservados (Arg a Ala) o más radi-cales (Phe a Ala), fundamentalmente en la periferia delsitio de unión. Los mutantes coseleccionados permitían



obtener una mayor afinidad de forma cooperativa. To-das estas mutaciones se lograron combinar en un“supermutante” con 15 cambios en relación con la mo-lécula de tipo salvaje, y que se unía al receptor con unaafinidad 400 veces mayor (Ka = 1012 M-1). Con la in-corporación de un mutante que no permitía la unión alsitio 2, se logró obtener un potente antagonista de lahGH. La estructura del “supermutante” con receptor[90] mostró que muchos de los cambios son sutiles; porejemplo, la sustitución de Phe10 por Ala produce unareorientación ligera de una hélice que incluye varios si-tios de contacto.

Cunninghan y Wells [91], y Clakson y Wells [92],a partir del análisis de la importancia energética delos 31 residuos involucrados en la interfaz entre lahGH y el dominio extracelular de su receptor, hanmostrado evidencias de que el epítopo del sitio deunión funcional es mucho menor que el epítopo es-tructural (determinado por cristalografía) . Además,el cálculo teórico de los residuos relacionados con laantigenicidad de una proteína de forma activa indicaque están formados por pocos aminoácidos energéti-cos rodeados de una superficie que contribuye a lacomplementariedad [93].

La presentación en la superficie de fagos tambiénha sido utilizada para cambiar especificidad. El inhibidorde la tripsina pancreática bovina (BPTI, del inglésbovine pancreatic trypsin inhibitor) inhibe diferentesproteasas de serina, pero presenta una afinidad baja(Ka = 4 x 106 M-1) por la elastasa humana de neutrófilos(HNE, del inglés human neutrophil elastase).

Con la introducción de cuatro mutaciones directasy la construcción de una pequeña biblioteca (900clones) de 5 residuos presentes en un lazo que se uneal sitio activo, se seleccionó una variante del BPTI quese une a la HNE con una Ka = 1012 M-1. Esta afinidades 50 veces mayor que la del mejor inhibidor de laHNE que se tenía [94]. En este caso no se utilizó unabiblioteca aleatorizada, sólo se necesitaron codonesespecíficos para residuos hidrofóbicos.

La IL-2 humana está definida como una clasefilogenéticamente bien conservada con un papel im-portante en la regulación de la respuesta inmunitaria.Esta proteína se expresó en la superficie de los bacte-riófagos plegada correctamente y biológicamente acti-va, según se demostró en un ensayo de proliferaciónen la línea celular CTLL-2 dependiente de estacitoquina. Estos fagos resultaron infectivos y fácilesde propagar, purificar y enriquecer en relación con losfagos utilizados como control [95].

El mismo diseño se ha empleado para lograr un au-mento de la afinidad de otras proteínas por su ligando.Un factor común en estos estudios es tener una base dedatos extensa de las estructuras de las moléculas paraidentificar específicamente los residuos que deben seraleatorizados. Otra variante es aleatorizar la moléculacompleta, pero en este caso se necesita, por ende, laconstrucción de bibliotecas mayores. Debido al númerolimitado de residuos que se pueden examinar por losmétodos tradicionales, es necesario conocer los residuosde la molécula blanco que interviene en la unión a suligando. Por lo tanto, la tecnología de presentación en lasuperficie de fagos es extremadamente poderosa cuan-do se compara con los estudios tradicionales de análisisestructural y funcional en una interfaz de unión.

Presentación de anticuerpos en la superficiede fagos filamentososDurante la década pasada, la presentación de fragmen-tos de anticuerpos en la superficie de fagos filamentososha constituido el objetivo principal de diversas inves-tigaciones [96, 97]. Como resultado, las bibliotecascombinatorias de anticuerpos expresados en fagos sehan convertido en herramientas útiles para el descu-brimiento de nuevos fármacos e, incluso, algunos deestos anticuerpos se encuentran en fases avanzadasde ensayos. Aunque la mayoría de las bibliotecas deanticuerpos se han construido mediante la clonacióndel repertorio inmunitario natural en fagómidos, sehan obtenido adelantos importantes en el desarrollode bibliotecas sintéticas de alta calidad de las regionesdeterminantes de complementariedad (CDR) [98].

Los genes de las regiones variables de algunos anti-cuerpos se han clonado en vectores fagemídicos fusio-nados al gen III de fagos filamentosos. La proteínahíbrida creada tiene los dominios de anticuerpo en elextremo amino, seguidos de pIII. Esta proteína se plie-ga correctamente, es incorporada al fago y conservalas propiedades de unión del anticuerpo soluble origi-nal. Cada genoma recombinante de fago contiene elADN que codifica el anticuerpo específico presentadoen su superficie, lo que permite que la partícula de fagoque porta el gen del anticuerpo sea seleccionada direc-tamente a partir de las propiedades de unión de la pro-teína expresada [99]. Estos sistemas se han empleadopara expresar fragmentos Fab, scFv y scFv diméricos.Estos últimos difieren de los scFv monoméricos en queel péptido líder tiene una longitud reducida y tienden aasociarse como dímeros.

A pesar de la posibilidad de obtener anticuerpos es-pecíficos directamente a partir de repertorios vírgenespresentados en la cápsida de bacteriófagos, otra aplica-ción importante de esta tecnología es la humanización yla maduración de la afinidad de los anticuerpos murinosconvencionales. Estos anticuerpos han demostrado suefectividad en un número significativo de aplicacionesterapéuticas. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado anti-VEGF se encuentra en ensayos clínicos para el trata-miento del cáncer y otros investigadores han empleadoesta tecnología para obtener variantes con potencia yafinidad incrementadas cerca de 100 veces [100].

ConclusionesLa biología moderna debe gran parte de su desarrollo alas bondades de los bacteriófagos. Las aplicaciones enlos estudios biológicos clásicos marcaron las pautaspara el vuelco de la ingeniería genética en la últimadécada. Las aplicaciones terapéuticas de los fagos sehacen más promisorias para los próximos años comométodos alternativos de incalculable valor, tanto des-de el punto de vista clínico como económico.

La tecnología de presentación de péptidos o proteínasen la cápsida de bacteriófagos es una metodología queha incursionado rápidamente en los campos de lainmunología, la bioquímica de proteínas, la ingeniería deproteínas y la biología celular. Esta tecnología se ha utili-zado con el propósito de localizar epítopos, crearmimótopos, identificar antagonistas y agonistas de di-ferentes moléculas blancos, generar anticuerpos huma-nos, optimizar la especificidad de los anticuerpos y crearnuevas moléculas con actividades diferentes.



En el campo de las bibliotecas de péptidos, en depen-dencia del tipo de interacción que se busca con la molé-cula blanco, el tamaño de los péptidos varía así como sunivel de entropía. Con algunas moléculas blanco las bi-bliotecas de péptidos que se encuentran constreñidashan funcionado mejor que las lineales. La gran diferenciaentre ambos tipos de bibliotecas es que en las lineales elpéptido se encuentra libre y puede asumir múltiplesconformaciones, de ahí que quizás sean más versátilesen el sentido que para epítopos lineales generalmente seencuentran más clones positivos que cuando se utilizanlas bibliotecas constreñidas. La ventaja de las bibliote-cas constreñidas es que el péptido no es libre de asumircualquier conformación, por lo que si se encuentran clonespositivos probablemente tendrán mayor afinidad por lamolécula blanco que el péptido lineal.

El problema de la utilización de pIII o pVIII comoproteína de presentación en los últimos trabajos se haresumido con la explotación de ambas. Diferentes gru-pos emplean la multivalencia de pVIII y a partir de las

moléculas seleccionadas construyen nuevas bibliote-cas donde se buscan mayores afinidades utilizando lamonovalencia de pIII. El uso de estas dos proteínaspermite manipular las afinidades de los ligandos selec-cionados y mejorar considerablemente la interacciónentre moléculas.

A finales de la década de 1990, el problema funda-mental que se encuentra para seguir adelante con labúsqueda de nuevas moléculas y con el mejoramientode las ya existentes, se deriva de los sistemas de selec-ción desarrollados. Es en este punto donde se estan-can los resultados obtenidos en la generación derepertorios moleculares. El método de selección ideales aquel que imita una función biológica determinadaque queremos mejorar o bloquear. El diseño de estosreceptores in vitro está abriendo numerosas posibili-dades en este campo. En tal sentido, la utilización dela tecnología de presentación en la superficie de fagoscomienza a dar los primeros frutos con la exposiciónde moléculas receptoras en la cápsida del virus.

1. Hankin EH. L’action bactericide des Eauxde la Jumna et du Gange sur le vibrion ducholera. Ann de l’Inst Pasteur 1896;10:511.

2. Twort FW. An investigation on the natureof ultramicroscopic viruses. Lancet 1915;1915II:1241.

3. D’Herelle F. Sur un microbe invisibleantagoniste des bac. dysentèriques. Cr rAcad Sci Paris 1917;165:373.

4. D’Herelle F. The bacteriophage: its rolein immunity. Baltimore: Williams and WilkinsCo./Waverly Press; 1922.

5. Bruynogue R, Maisin J. Essais de thera-peutique au motern du bactériophage.C.R.Soc Biol. 1921;85:1120–1.

6. Ackerman H, Dubow M. Virus de proca-riotas. Propiedades generales de los bacte-riófagos. Boca Raton (Florida): CRC Press;1987.

7. Novak R, Henriques B, Charpentier E,Normak S, Tuomanen E. Emergence ofvancomicin tolerance in Streptococcus pneu-moniae. Nature 1999;399:590–3.

8. Valdvogel F. New resistance in staphylo-coccus aureus. N Engl J Med 1999;340:556–7.

9. Weber-Dabrowska B, Mulczyk M, GórskiA. Bacteriophage therapy of bacterial in-fections: an update of our institute’s expe-rience. Archivum Immunologiae et therapieexperimentalis 2000;48:547–51.

10.Merri l CR, Carlton RM, Adhya SL,inventors; Exponential Biotherapies, Inc.,ass ignee. Ant ibacter ial therapy withbacteriophage genotypically modified todelay inactivation by the host defensesystem. US Patent 5,688,501, 1996.

11. Luria SE, Anderson TF. The identificationand characterization of bacteriophages withelectron microscope. Proc Natl Acad Sci USA1942;28:127-30.

12.Hershey AD, Kalmanson G, Bronfenbren-ner J. Quantitative methods in the study ofthe phage-antiphage reaction. J Immunol1943;46:267–79.

13.Ellis EL, Delbrück M. The growth of bacte-riophage. J Gen Physiol 1939;22:365–84.

14.Doermann AD. Lysis and lysis inhibitionwi th Escherichia coli bacter iophage.

J Bacteriol 1948;55:257–75.

15. Luria SE, Delbruck M. Mutations of bac-teria from virus sensitivity to virus resistance.Genetics 1943;28:491.

16.Hershey AD. Spontaneous mutations inbacterial viruses. J Cold Spring Harbor SympQuant Biol 1946;11:33–7.

17.Kellenberger E. Cooperativity and regu-lation through conformational changes asfeatures of phage assembly. Phil Trans Roy SocLond 1976B;276:3–13.

18.Hershey AD, Chase M. Independentfunctions of viral protein and nucleic acid ingrowth of bacteriophage. J Gen Physiol1952;36:39–56.

19.Zinder ND, Lederberc J. Geneticexchange in Salmonella. J Bacteriol 1953;64:679–9.

20.Bertani G, Weigle JJ. Host controlledvariation in bacterial viruses. J Bacteriol1953;65:113.

21.Dussoix D, Arber W. Host specificity ofDNA produced by Escherichia coli. II. Con-trol over acceptance of DNA from infectingphage lambda. J Mol Biol 1962;5:37–9.

22.Benzer S. On the topology of the geneticfine structure. Proc Natl Acad Sci USA 1959;45:1607–20.

23. Sinsheimer RL. A s ingle-strandeddeoxyribonucleic acid from bacteriophageØX174. J Mol Biol 1959;1:43–54.

24.Brenner S, Jacob F, Meselson M. Anunstable intermediate carrying informationfrom genes to ribosomes for protein synthesis.Nature 1961;190:576–581.

25.Crick FH, Barnett L, Brenner S, Watts-Tobin RJ. General nature of the genetic codefor proteins. Nature 1961;192:1227–32.

26.Meselson M, Weigle M. Chromosomebreakage accompanying genetic recombi-nation in bacteriophage. Proc Natl Acad SciUSA 1961;47:857–68.

27. Jacob F, Monod J. Genetic regulatorymechanisms in the synthesis of proteins. JMol Biol 1961;3:318–56.

28. Ptashne M. Isolation of the lambda phagerepressor. Proc Natl Acad Sci USA 1967;57:232–4.

29. Campbell A. Episomes. Adv Genet 1962;11:101–45.

30. Signer ER, Weil J. Recombination in bac-teriophage lambda. I. Mutants deficient ingeneral recombination. J Mol Biol 1968;34:261–1.

31. Echols H, Gingery R, Moore L. Integrativerecombination function of bacteriophage l:evidence for a site-specific recombinationenzyme. J Mol Biol 1968;34:251–60.

32. Zimmerman SB, Little JW, Oshinsky CK,Gellert M. Enzymatic joining of DNA strands:a novel reaction of diphosphopyridinenucleotide. Proc Natl Acad Sci USA 1967;57:1841–8.

33. Roberts JW. Termination factor for RNAsynthesis. Nature 1969;224:1168–74.

34. Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K,Sugimoto K, Sugino A. Mechanism of DNAchain growth. I. Possible discontinuity andunusual secondary structure of newlysynthesized chains. Proc Natl Acad Sci USA1968;59:598–605.

35. Gilbert W, Dressler D. DNA replication:the rolling circle model. J Cold SpringHarbor Symp Quant Biol 1968;33:473–84.

36. Brutlag DL, Schekman R, Kornberg A. Apossible role for RNA polymerase in theinitiation of M13 DNA synthesis. Proc NatlAcad Sci USA 1971;68:2826–9.

37. Laemmli UK. Cleavage of structural pro-teins during the assembly of the head ofbacteriophage T4. Nature 1971;227:680–5.

38. Studier FW. Analysis of bacteriophageT7 early RNAs and proteins on slab gels. JMol Biol 1973;2:237–48.

39. Georgopoulos CP, Hendrix RW, CasjensSR, Kaiser AD. Host participation in bacte-riophage lambda head assembly. J Mol Biol1973;76: 45–60.

40. Hu S, Ohtsubo E, Davidson N, Saedler H.Electron microscope heteroduplex studiesof sequence relations among bacterial plas-mids: identification and mapping of theinsertion sequences IS1 and IS2 in F and Rplasmids. J Bacteriol 1975;122:764.

41. Godson GN, Fiddes JC, Barrell BG,Sanger F. Comparative DNA sequenceanalysis of the G4 and 4X 174 genomes. In:


146 Biotecnología Aplicada 2001; Vol.18, No.3

DT Denhardt D, Dressler, Ray DS, editors.The single stranded DNA phages. ColdSpring Harbor: Cold Spring HarborLaboratory Press; 1978. p.5l–86.

42.Guarneros G, Hernández T, MascarenhasD, Montanez C, Schindler D, Schmeissner U, etal. Regulation of the integration-excisionreaction by bacteriophage lambda. Cold SpringHarb Symp Quant Biol 1981;45: Pt 1, 439–45.

43. Jacobs WJ, Barletta RG, Udani R, ChanJ, Kalkut G, Sosne G, et al. Rapid assessmentof drug susceptibilities of Mycobacteriumtuberculosis by means of luciferase reporterphages. Science 1993;260:819–22.

44. Stacy A, Kelly O, Aubrey L, Vispo NS,Cesareni G, Thomas GJ. Novel tyrosine markersin raman spectra of wild-type and mutant(Y21M and Y24M) Ff virions indicate unusualenviroments for coat protein phenoxyls.Biochemistry 1994;33(5):1037–42.

45.Dulbecco R, inventor; Salk Institute Bio-technology/Industrial Associates, Inc.,assignee. Viruses with recombinant surfaceproteins. US Patent 4,593,002, 1986.

46. Smith G. Filamentous fusion phage: anovel expression vector that display clonedantigens on the virion surface. Science1985;228:1315–7.

47.Castagnoli L, Vetriani C, Gonfloni S, VispoNS, Cesareni G. Selection from a peptide libraryof the antigenic determinants of a protein. In:Terhorst C, Malavasi F, Albertini A, editors.Generation of antibodies by cell and geneimmortalization. Basel: Year Immunol; 1993.p.41–9.

48.Cesareni G. Peptide displays on filamen-tous phage. A new powerful tool to study pro-tein-ligand interaction. FEBS Lett 1992;307:66–70.

49. Iannolo G, Minenkova O, Petruzzelli R,Cesareni G. Modifying filamentous phagecapsid: limits in the size of the major capsidprotein. J Mol Biol 1995;248:835–44.

50. Parmley SF, Smith GP. Antibody selectablefilamentous fd phage vectors: affinitypurification’s of target genes. Gene 1988;73:305–18.

51.Viera J, Messing J. Production of singlestranded plasmid DNA. Meth Enzymol 1987;153:3–11.

52.Dente L, Cesareni G, Cortese R. pEMBL:a new family of single stranded plasmids. JNucleic Acids Res 1983;11:1645–55.

53.Cwirla S, Peters E, Barret R, Dower W.Peptides on phage: a vast library of peptidesfor identifying ligands. Proc Natl Acad SciUSA 1990;87:6378–82.

54. Scott J, Smith G. Searching for peptideligands with an epitope library. Science1990;249:38–90.

55.Berzofsky G. Intrinsic and extrinsicfactors in protein antigenic structure.Science 1985; 229:932–40.

56. Felici F, Puchades Y, Fernández de CossíoME, Vispo NS. Exposición multivalente utili-zando la proteína pVIII de la cápsida de losfagos filamentosos. In: Vispo NS, editor. Bio-logía combinatoria. La Habana: ElfosScientiae; 2001. En prensa.

57.Vispo NS, Araña MJ, Chinea G, OjalvoAG, Cesareni G. Characterization ofepitopes on human interleukin-2 usingphage displayed-peptide libraries: insightsinto antibody-peptide interactions. Hybri-doma 1999;18(3):251–5.

58.Collins J, Röttgen P. Evolutive phage-dis-

play –a method as basis for a company. GBFScientific Annual Report 1997;19–28.

59.Horn N, Vispo NS, Szardenings M, CollinsJ. Cosmix-Plexing: un modo novedoso degenerar y utilizar bibliotecas combinatoriasexpuestas en fago. Biotecnología Aplicada2001.

60. Felici F, Luzzago A, Folgori A, Cortese R.Mimicking of discontinuous epitopes by phagedisplayed peptides, II. Selection of clonesrecognized by a protective monoclonalantibody againts the Bordetella pertussis toxinfrom phage display libraries. Gene 1993;128:21–7.

61.Balass M, Heldman Y, Cabilly S, Givol D,Katchaslski K, E-Fuchs S. Identification ofhexapeptide that mimics a conformation-dependent binding site of acetylcholine recep-tor by use of a phage-epitope library. Proc NatlAcad Sci USA 1993;90:10638–42.

62.Vispo NS, Felici F, Castagnoli L, CesareniG. Hybrid-Rop-pIII proteins for the display ofconstrained peptides on filamentous phagecapsid. Ann Biol Clin 1993;50:917–22.

63.Nagi A, Reagan L. An inverse correlationbetween loop length and stability in four helixbundle protein. Fol Des 1997;2:67–75.

64.O´Neil K, Hoess R, Jackson S, Rama-chadran N, Mousa S, DeGrado W. Identifi-cation of novel peptide antagonist for GPIIb/IIIa from a conformational constrainedphage peptide library. Protein Struct FunctGenet 1992;14: 509–15.

65. Luzzago A, Felici F, Tramontano A, PessiA, Cortese R. Mimicking of discontinuousepitopes by phage displayed peptide. I.Epitope mapping of human H ferritin using aphage library of constrained peptide. Gene1993;128:51–7.

66.McLafferty M, Kent R, Ladner R,Markland W. M13 bacteriophage displayingdisulfide-constrained microproteins. Gene1993;128: 29–36.

67.Koivunen E, Wang B, Ruoslahti E. Phagelibraries displaying cyclic peptides withdifferent ring sizes: ligand specificities of theRGD-direct integrins. Biotechnology 1995;13:265–70.

68.Welply J, Steininger C, Caparon M,Marshall L, Michener M, Howard S, et al. Apeptide isolated by phage display binds toICAM-1 and inhibits to LFA-1. Proteins 1996;26:262–70.

69. Pierce H, Adey N, Kay B. Identificationof cyclized calmodulin antagonist from aphage display random peptide library.Molecular Diversity 1996;1:259–65.

70.Devl in J, Panganiban L, Devl in P.Random peptide libraries: a source ofspec i f i c p ro te in b ind ing molecu les .Science 1990;249: 404–6.

71.Kay B, Adey N, Manfredi J, MaratagnonA, Fowlkes D. An M13 phage library displa-ying random 38-amino-acid peptides as asource of novel sequences with affinity toselected targets. Gene 1993;128:59–65.

72.Webwer P, Pantoliano M, Thompson L.Crystal structure and ligands-binding stu-dies of a screened peptide complexed withstreptavidin. Biochemistry 1992;31:9350–4.

73.Oldenburg K, Loganathan D, GoldsteinI, Schultz P, Gallop M. Peptide ligands for asugar binding protein isolated from arandom peptide library. Proc Natl Acad SciUSA 1992;89:5393–7.

74. Scott J, Loganathan D, Easly R, Gong X,Goldstein I. A family of concanavalin A-

binding peptides from a hexapaptides epiotpelibrary. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:5398–402.

75. Folgori A, Tafi R, Felici F, Galfre G, Cortese R,Monaci P, et al. A general strategy to identifymimotopes of patological antigens using onlyrandom peptides libraries and human sera.EMBO J 1994; 13:2236–43.

76. Prezzi C, Nuzzo M, Meola A, Delmastro P,Glafre G, Cortese R, et al. Selection of antigenicand inmunogenic mimics of hepatitis C virususing sera from patients. J Immunol 1996;156:4504–3.

77.Dybward A, Forre O, Kjeldsen-Kragh J,Natvig B, Soiud M. Identification of new Bcells epitopes in the sera of rheumatoidarthr i t is pat ients us ing a randomnanopeptide phage library. Eur J Immunol1993;23:3189–93.

78.Mennuni C, Santini C, Dotta F, Farilla L,Di-Mario U, Fierabracci A, et al. Selection ofphage displayed peptides mimicking type 1diabetes-specific epitopes. J Autoimmun1996;9: 431–6.

79.Mennuni C, Santini C, Domenico L,Dotta F, Farilla L, Fierabracci A, et al. Iden-tif ication of a novel type 1 diabetes-speci f ic epi tope by screening phagelibraries with sera from pre-diabeticspatients. J Mol Biol 1997;268: 599–606.

80.de la Cruz V, Lal A, McCutchan T. Imm-nogenecity and epitope mapping of foreignsequences via genetically engineered fila-mentous phage. J Biol Chem 1988;263:4318–22.

81.Greenwood J, Willis A, Perham R. Multipledisplay of foreign peptides on a filamentousbacteriophage. Peptides from Plasmodiumfalciparum circumsporozoite proteins asantigen. J Mol Biol 1991; 220:821–7.

82.Willis A, Perham R, Wraith D. Immunolo-gical properties of foreign peptides in multipledisplay on a filamentous bacteriophages.Gene 1993;128:79–83.

83.Minenkova O, Ilyichev A, Kishchenko G,Petrenko V. Design of specific immunogensusing filamentous phage as the carrier. Gene1993;128:85–8.

84.Keller P, Arnold B, Shaw A, Tolman R, vanMiddlesworth F, Bondy S, et al. Identificationof HIV vaccine candidate peptides by scree-ning random phage epitope libraries.Virology 1993;193: 709–16.

85.Motti C, Nuzzo M, Meola A, Galfre G,Felici F, Cortese R, et al. Recognition byhuman sera and immunogenicity of HBsAgmimotopes selected from an M13 phagedisplay library. Gene 1994;146: 191.

86.Orlandi R, Menard S, Colnaghi M, BoyerC, Felici F. Antigenic and inmunogenicmimicry of the HER/neu oncoprotein byphage displayed peptides. Europ J Immunol1994;24: 2868–73.

87.Menéndez T, de Haz I, Delgado M,Garay H, Martín A, Vispo NS. Immuniza-tion with phage-displayed variable region2 f rom meningococca l PorA outermembrane protein induces bactericidalantibodies against Neisseria meningitidis.Immunol Lett En prensa.

88. Bass S, Greene R, Wells J. Hormonephage: an enrichment method for variantproteins with altered binding properties.Proteins 1990;8:309–14.

89. Lowman H, Wells J. Affinity maturationof human growth hormone by monovalentphage display. J Mol Biol 1993;234:564–73.

90.Ultsh M, Somer W, Kossiakoff A, Vos A.


147 Biotecnología Aplicada 2001; Vol.18, No.3

The crystal structure of affinity-maturedgrowth hormone at 2Å resolution. J Mol Biol1994; 227:286–99.

91.Cunningham B, Wells J. Comparison of astructural and functional epitope. J Mol Biol1993;234:554–63.

92.Clakson T, Wells J. A hot spot of bindingenergy in a hormone receptor interface.Science 1995;267:383–6.

93.Novotny J, Bruccoleri R, Saul F. On theattribution of binding energy in antigenantibody complexes McPC603, D1.3 andHyHEL-5. Biochemistry 1989;28:4735–46.

94. Roberts B. Protease inhibitor display M13

phage: selection of high-affinity neutrophilelastase inhibitor. Proc Natl Acad Sci USA1992;89:2429–33.

95.Vispo NS, Callejo M, Ojalvo AG, SantosA, Chinea G, Gavilondo JV, et al. Displayinghuman interleukin-2 on the surface of bac-teriophage. Inmunotechnology 1997;3:185–93.

96. Dall’Acqua W, Carter P. Antibody enginee-ring. Curr Opin Struct Biol 1998;8:443–50.

97. Griffiths AD, Duncan AR. Strategies forselection of antibodies by phage display. CurrOpin Biotechnol 1998;9: 102–8.

98.Knappik A, Ge L, Honegger A, Pack P,

Recibido en mayo de 2001. Aprobadoen junio de 2001.

Fischer M, Wellnhofer G, et al. Ful lysynthetic human combinatorial antibodyl ibraries (HuCAL) based on modularconsensus f r amework s and CDRsrandomized with trinucleotides. J Mol Biol2000;296:57–86.

99.Hoogenboom H. Designing and optimi-z ing l ibrary se lec t ion s t ra tegies forgenerat ing h igh-af f in i ty ant ibodies .TIBTECH 1997;5 :62–70.

100. Chen Y, Weismann C, Fuh G, Li B,Christinger HW, McKay P, et al. Selectionand analysis of an optimized anti-VEGFantibody: crystal structure of an affinity-matured Fab in complex with antigen. JMol Biol 1999; 293:865–81.

Veracruz, septiembre 10-14 del 2001Veracruz, septiembre 10-14 del 2001


Texto Completo(PDF-436 Kb)

Documents