Testiranje toksičnosti Doc. Dr. sc. Domagoj Đikić Zavod za animalnu fiziologiju Prirodoslovno matematički fakultet Sveučilište u Zagrebu
Testiranje toksičnosti
Doc. Dr. sc. Domagoj Đikić Zavod za animalnu fiziologiju
Prirodoslovno matematički fakultet Sveučilište u Zagrebu
Farmakološka istraživanja Toksikološka istraživanja
Farmakološki i terapeutski učinci novih lijekova
Određivanje terapeutske (TD) odnosno učinkovite (efektivne ED) doze Biotrasnformacija Farmakodinamika Farmakokinetika Biološke interakcije i učinci(specifični npr. receptorski i nespecifični npr. sistemski)
Regulatorna toksikologija
Određivanje toksične doze (LD50, IC50, LC50) Biotransformacija Toksikodinamika Toksikokinetika Biološke interakcije i učinci(specifični npr. receptorski i nespecifični npr. sistemski) Procjena otrovnosti
Procjena rizika ksenobiotika
Klinička toksikologija
Toksikologija hrane
Toksičnost industrijskih kemikalija
Agrokemikalije
Ekotoksikologija
Indutrijske kemikalije i onečišćenje okoliša Ostala toksikološka istraživanja (kozmetička toksikologija i sl.)
Sigurnost lijekova i otrovnost novih i starih lijekova, (poklapa se sa područjem toksikologije)
Petina svih životinja u pokusima u svjetu koristi za testiranje toksičnosti Oko milijun životinja godišnje upotrebljava se u testiranju toksičnosti
Industry
Contract animal testing for pharmaceuticals, agricultural products, food additives, industrial and consumer chemicals.
Number of locations United Kingdom, United States, Japan
Key people Brian Cass, managing director
Employees 1,600
Website Huntingdon Life Sciences
INVERESK RESEARCH INTERNATIONAL LTD.
Podaci o toksičnosti sakupljaju se iz nekoliko izvora
Toksikološki podaci: -Konstantna reevaluacija starih podataka - Evaluacija novih proizvoda
SAD - EPA
U Europi -donose se novi standardi za testiranje kemikalija, OECD Toksikološko testiranje ksenobiotika -„Nove kemikalije“ , 10 kg/godišnje, -„Stare kemikalije (u upotrebi do 1981) Od 2003. g. REACH (Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals) program propisuje da se sve kemikalije moraju testirati
http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-4-health-effects_20745788
EU - OECD
Dvije glavne vrste toksikoloških pokusa in vivo 1.TOKSIKOKINETIKA , ADME,
TOKSIKODINAMIKA
2.Testovi toksičnosti
Raspodjela toksikanta u organizmu.
PLAN TOKSIKOKINETIČKOG POKUSA
Faze metabolizma toksina i ksenobiotika
Reakcije Faze I. : - Oksidacije - Redukcije - Hidrolize
Reakcije Faze II: - Konjugacije
- Glukuronidom - Glutationom - PAPS
Reakcije 1. faze CITOKROMSKE: • Aromatske hidroksilacije • Alifatske hiroksilacije • N – dealkiliranje • O – dealkiliranje • S – dealkiliranje • Okisdativne deaminacije • Dehalogeniranje • N – oksidacija • S - oksidacija
NECITOKROMSKE: • Hidrolize • Redukcije • Oksidacije
Izbor načina aplikacije ovisi o
1. putevima prolaska ksenobiotika kroz tijelo
2. biotransformaciji
3. eliminaciji
s. c.- subkutano; i. m.– intramuskularno; i. v. – intravenski; i.p. – intraperitonealno; prilagođeno iz: Principles of Biochemical Toxicology (Timbrell, 2000.)
Izbor soja za toksikološki pokus
Akutna toksičnost
Vrsta životinje Štakor se preporučuje za inhalacijsku i dermalnu toksičnost, za dermalne testove preferiraju se zečevi kao i za testove iritacija oka (Draizeov test, primjenjuje se od 1944); osim glodavaca vrlo rijetko se koriste ostale životinje
Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci
Broj životinja 5-10 za srođene sojeve, 10 ili više za nesrođene sojeve
Doza Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka koja se aplicira jednokratno ako je aplikacija intraperitonealna, oralna, subkutana, intradermalna, intramuskularna; Za inhalacijsku aplikaciju izloženost minimum 4 sata a za dermalnu izloženost vrijeme izlaganja je do 24 sata (do analize)
Vrijeme trajanja pokusa i vrijeme analize
Do 24 sata od aplicirane doze, iznimno do 48 sati ako se istražuje eliminacija neke kemikalije
RAZVRSTAVANJE TVARI PREMA OTROVNOSTI
Zamjenski testovi za oralni LD50 na sisavcima (EPA i OCD prihvatile): --Maximum tolerated dose (MTD) , posebice u farmakologiji i na ne glodavačkim modelima --Up and down procedure (doza, 48 h.............up/down- ½ log doze novoj životinji) --Acute Class method (OECD TG 423) 5, 50, 300 and 2000 mg/kg bw. --Fixed Oral dose for acute toxicity
-Za Dermalnu toksičnost:
-Murine local lymph node assay (LLNA) for skin sensitization -Corrositex® in vitro membrane barrier skin corrosivity test -EpiDerm™ in vitro human skin model skin corrosivity test -EpiSkin™ in vitro human skin model skin corrosivity test -Rat TER in vitro skin corrosivity test
Acute Class method
-Za inhalacijsku toksičnost i iritabilnost oka nema pouzdanih i odobrenih
zamjena
-Kozmetički preparati i kozmetika, za razliku od drugih kemikalija i lijekova nije propisana u skupinama tvari koje se testiraju prema OECD standardima
Subkronična toksičnost Vrsta životinje Glodavci i to najčešće štakori a rjeđe miševi; zečevi uglavnom za
dermalnu toksičnost;
Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci
Broj životinja Minimum 10 po spolu za nesrođene sojeva glodavaca; 5 za srođene sojeve, 4 za druge veće životinjske vrste (pas svinja) iznimno 1 životinja ako je pokusna životinja primat
Doza Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka, preporučuje se svakodnevna aplikacija pojedinoj dozi osim za bioakumulativne kemikalije koje zahtijevaju posebne protokole
Vrijeme trajanja pokusa i vrijeme analize
28 dana ili 90 dana, ovisno o vrsti životinje
Kronična toksičnost Vrsta životinje Glodavci i to najčešće štakori, miševi i psi, pokusi se moraju
provoditi na minimalno dvije vrste kako bi se kompenzirale razlike u fiziologiji
Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci Broj životinja Minimum 20 po spolu za nesrođene sojeva glodavaca; 5 za srođene
sojeve, 4 za druge veće životinjske vrste (pas, svinja) iznimno 1 životinja ako je pokusna životinja primat
Doza Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka, preporučuje se svakodnevna aplikacija pojedinoj dozi osim za bioakumulativne kemikalije koje zahtijevaju posebne protokole
Vrijeme trajanja pokusa i vrijeme analize
12-24 mjeseci, ovisno o vrsti životinje, za aditive u hrani minimalno 24 mjeseca do tri godine
PLAN POKUSA SUBKRONIČNE, KRONIČNE TOSKIČNOSTI I KANCEROGENOSTI
Završne točke u standardnim toksikološkim istraživanjima Smrtnost ili preživljenje Kliničko praćenje (težina tijela, veličina tumora, apetit, promjene u ponašanju i dr.) Klinički parametri (biokemija krvi, hematologija, poremećaji u zgrušavanju, analiza urina, i dr) Patološki parametri (patohistološke analize) Procjena toksičnosti na staničnoj razini (genotoksičnost, citotoksičnost i dr.) U studijama kancerogeneze ---pojavnost tumora
Analiza strukturnih aberacija kromosoma
Izmjene sestrinskih kromatida (SCE)
Mikronukleus test
Komet test
ZAMJENSKI I POTPORNI TESTOVI TESTIRANJU KANCEROGENOSTI - TESTOVI GENOTOKSIČNOSTI
• Mikronukleus test u uvjetima in vivo – ANEUGENI POTENCIJAL, do 48h nakon izlaganja
na stanicama koštane srži (polikromatski i normokromatski eritrociti) i retikulocitima sisavaca
Izrada preparata (agaroza + uzorak pune krvi)
Liza staničnih struktura; pH 10
Denaturacija i elektroforeza; pH 13
Bojenje preparata fluorescencijskom bojom (etidij bromid)
Mikroskopska analiza preparata i mjerenje kometa
Neutralizacija; pH 7,5
• COMET Assay, do 24h nakon izlaganja, KLASTOGENI
IMUNOTOKSIČNOST
IMMUNOTOXICITY FLOWCHART
REPRODUKTIVNA TOKSIČNOST
POSTOJE I KOMBINACIJE PROTOKOLA Npr. RAZVOJNA IMUNOTOKSIČNOST ILI
NEUROTKSIČNOST
NEKI PROPISANI TESTOVI JOŠ SE STANDARDIZIRAJU
ZA GLODAVCE I SISAVCE Pr. ENDOKRINI DISRUPTORI
NANOTOKSIKOLOGIJA
NOVO REGISTRIRANA ILI SINTETIZIRANA TVAR MORA PROĆI NIZ PARALELNIH TESTOVA U TAKOZVANOM VEZANOM
STUPNJEVITOM TESTIRANJU
(TIERED APPROACH)
Što sa podacima ??
Internetski izvori koji reevaluiraju i obavještavaju o Zamjenskim testovima
toksičnosti
DIRECTIVE 2010/63 EU
Mouse Strains
Hvala na pozornosti