ANTECEDENTES GENERALES
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UNIVERSIDAD DE CONCEPCIN
FACULTAD DE AGRONOMA
PROPAGACIN Y DESCRIPCIN MORFO ANATMICA DE SPHACELE
CHAMAEDRYOIDESPOR
JOS MANUEL RUBILAR OCAMPO
MEMORIA PRESENTADA A LA FACULTAD DE AGRONOMA DE LA UNIVERSIDAD
DE CONCEPCIN PARA OPTAR AL TTULO DE INGENIERO AGRNOMO.
CHILLN CHILE
2010
UNIVERSIDAD DE CONCEPCIN
FACULTAD DE AGRONOMA
PROPAGACIN Y DESCRIPCIN MORFO ANATMICA DE SPHACELE
CHAMAEDRYOIDESPOR
JOS MANUEL RUBILAR OCAMPO
MEMORIA PRESENTADA A LA FACULTAD DE AGRONOMA DE LA UNIVERSIDAD
DE CONCEPCIN PARA OPTAR AL TTULO DE INGENIERO AGRNOMO.
CHILLN CHILE
2010Aprobada por:
Profesor Asistente, Anglica Urbina P.
____________________
Licenciada en Biologa.
Gua
Profesor Asociado, Humberto Serri G.
____________________
Ing. Agrnomo, Mg, Sc.
Asesor
Profesor Asociado, Edgar Pastene N.
____________________
Qumico Farmacutico, Mg, Sc.
Asesor
Profesor Asociado, Ral Cerda G.
____________________
Ing. Agrnomo, Mg, Ad y Ec de Empresas. Decano
TABLA DE CONTENIDOS
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Resumen...................................................................................1
Summary.......1
Introduccin..........2
Materiales y Mtodos............................5
Resultados y Discusin............................9
Conclusiones.....................................26
Referencias..........26
INDICE DE FIGURAS Y TABLAS
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Tabla 1Tabla 2Tabla 3Tabla 4
Tabla 5
Tabla 6Tabla 7Tabla 8Tabla 9Figuras
Tabla 10
Tratamientos de ensayo I (A), estratificacin ms escarificacin
con cido sulfrico (H2SO4)..
Tratamientos de ensayo II (B), lixiviacin de inhibidores ms
aplicacin de giberelinas....
Tratamientos de ensayo III (C), escarificacin trmica con agua ms
estratificacin..
Tratamientos de ensayo IV (D), aplicacin de giberelina..
Propagacin vegetativa (E), aplicacin de cido indolbutrico
(IBA)....................................................
Porcentajes de germinacin en ensayo 1: escarificacin con cido
sulfrico y estratificacin..Porcentajes de germinacin en ensayo 2:
lixiviacin de inhibidores con agua a diferentes temperaturas y
aplicacin de giberelina...Porcentajes de germinacin en ensayo 3:
escarificacin trmica y estratificacin...Porcentajes de germinacin
en ensayo 4: aplicacin de cido giberlico.Imgenes del proceso
germinativo de Sphacele chamaedryoides mediante Microscopa
Electrnica de Barrido
Resultados de propagacin vegetativa. Porcentajes de
enraizamiento
56778
10
1112
1314
25
PROPAGACIN Y DESCRIPCIN MORFO ANATMICA DE SPHACELE
CHAMAEDRYOIDES
PROPAGATION AND MORPHO-ANATOMICAL DESCRIPTION Of SPHACELE
CHAMAEDRYOIDES
Palabras ndice adicionales: germinacin, dormancia,
escarificacin, estratificacin.RESUMEN
Con el propsito de identificar un mtodo efectivo para obtener un
alto porcentaje de germinacin y enraizamiento, en semillas y
estacas de Sphacele chamaedryoides (Balbis) Briq. y observar los
cambios morfolgicos que experimenta la semilla durante el proceso
de germinacin, se realiz esta investigacin durante el ao 2009 y
2010 en la Facultad de Agronoma de la Universidad de Concepcin. Se
efectuaron cuatro ensayos de germinacin: a) escarificacin con cido
sulfrico y estratificacin, b) lixiviacin de inhibidores con agua a
diferentes temperaturas ms concentraciones de cido giberlico, c)
escarificacin trmica ms estratificacin y d) aplicacin de cido
giberlico, en diferentes concentraciones. El mayor porcentaje de
germinacin se obtuvo con el tratamiento de escarificacin trmica y
estratificacin. Con respecto a la propagacin vegetativa, se
realizaron ensayos con diferentes concentraciones de cido
indolbutrico (IBA) aplicado a base de las estacas, los mayores
porcentajes de enraizamiento se obtuvieron con aplicacin de 1.000 y
4.000 mg L-1 de IBA. Los cambios morfolgicos de la semilla durante
el proceso de germinacin se observaron mediante Microscopio
Electrnico de Barrido (MEB), estas observaciones permiten
identificar caractersticas anatmicas y estructurales.SUMMARYThe aim
of this work was to identify an effective method to improve the
rate andpercentage of germination and the rooting of seeds and
cuttings of Sphacele chamaedryoides (Balbis) briq. Morphological
changes experienced by the seed during the germination process also
were followed by microscopy. This research was conducted during
2009 and 2010 in the Faculty of Agronomy of the University of
Concepcin. Four germination tests were assayed: a) sulfuric acid
scarification and further stratification, b) leaching of inhibitors
with different water temperatures plus different concentrations of
gibberellic acid, c) thermal scarification plus stratification and
d) gibberellic acid application at different concentrations. The
highest percentage of germination was obtained with thermal
scarification and stratification. Vegetative propagation test
consisted of different concentrations of indole butyric acid (IBA)
applied to the stem base. So, the highest percentage of rooting was
obtained with the application of 1.000 and 4.000 mg L-1 IBA. The
morphological changes of the seed during the germination process
were observed by scanning electron microscope (SEM). These findings
allowed identifying characteristics of highly lignified
pericarp.INTRODUCCIN
La flora nativa de Chile destaca por su gran riqueza botnica con
gneros y especies muy particulares, los que se desarrollaron
durante la evolucin sin mucho intercambio de material gentico con
sus parientes, debido al aislamiento geogrfico del pas (Vogel,
2000). Esta flora representa un recurso gentico importante, con un
alto porcentaje de endemismo de especies y gneros (Massardo y
Rozzi, 1996).
Sphacele chamaedryoides, conocida vulgarmente como salvia
(Hoffmann et al., 1992), lahuen lahuen (Urbina et al., 1998) o como
alhuelahun, pertenece a la familia de las Labiadas y al gnero
Sphacele (Montenegro, 2002; Riedemann y Aldunate, 2004), es una
familia amplia y cosmopolita (Hoffmann et al., 1992), constituida
por hierbas, rara vez por arbustos o rboles (Niembro, 1989). Esta
planta es endmica de Chile (Stark, 2009) crece en cerros asoleados
de la zona costera entre la V y la X Regin, en suelos pedregosos,
con buen drenaje pero con algo de humedad. Es un arbusto ramoso,
perenne y redondeado, de crecimiento muy rpido, a partir de
semillas, de hasta 2 m de alto por 1.80 m de dimetro. El follaje es
bastante denso, las hojas tienen un tono verde-ceniciento
(Riedemann y Aldunate, 2004) de 1.5 - 4 cm de largo por 0.5 - 1 cm
de ancho (Pea et al., 2000), de forma oblongo-elpticas, pice
redondeado y base atenuada, opuestas y decusadas, rugosas y
pubescentes. Bordes suavemente crenados, nervadura reticulada y muy
notoria (Stark, 2009). Las flores, de unos 2 cm de largo se
disponen en verticilos como en todas las especies de la familia
Labiadas, cada uno de los cuales presenta de 4 a 6 flores, stas
aparecen durante la primavera y comienzos del verano y presentan un
color celeste-grisceo (Montenegro, 2002; Riedemann y Aldunate,
2004). El cliz es tubular de 5 spalos y la corola es bilabiada
(Montenegro, 2002) compuesta por 5 ptalos fusionados. El fruto es
una ncula, madura a fines del verano y contiene una pequea semilla
negra (Riedemann y Aldunate, 2004).
La planta, evidencia la presencia de tricomas glandulares, tanto
en superficie superior como inferior, adems, en la superficie
abaxial existen tricomas dendroides, los que contribuiran a evitar
la prdida de agua y otros elementos en la especie (Urbina et al.,
1998).
Esta planta chilena, es usada en la medicina popular para tratar
enfermedades infecciosas, desrdenes menstruales, y enfermedades
inflamatorias (Pastene et al., 2005). Tambin destaca, segn Hoffmann
et al. (1992) y Seplveda et al. (1998) su uso como cicatrizantes, y
en fricciones en caso de parlisis.
Qumicamente, la planta contiene 0.2 % de aceites esenciales en
el cual se han caracterizado 65 substancias voltiles. Entre los
compuestos no voltiles presentes, han sido identificados los
triterpenos cido urslico y cido betulnico. Tambin se ha aislado la
horminona, una diterpenquinona que se encuentra en varias especies
de la familia Lamiaceae, su actividad citotxica y antibacteriana ha
sido descrita en otros trabajos (Pastene et al., 2005). Segn Montes
y Wilkomirsky (1985) los constituyentes basados en las hojas de la
planta seran aceite esencial: 7.35 g/kg, con un 3 % de alfa pineno,
3.2 % de beta pineno, 15.2 % de falandreno, 32.4 % de
limoneno-eucaliptol, 9.3 % de timol y en menos proporcin linalol,
alcanfor, terpineol y borneol.
La germinacin de esta especie, comienza con la imbibicin de agua
por parte de la semilla y culmina con la emergencia de la plntula a
travs de las cubiertas (Azcon-Bieto y Taln, 1993; Bewley y Black,
1994), pero esto slo ocurre cuando las semillas han madurado y las
condiciones ambientales son adecuadas, algunas no germinan hasta
pasado un tiempo, incluso si disponen de condiciones ambientales
favorables, ya que experimentan un perodo de dormancia (Meyer et
al., 1960; Baldini, 1992). La dormancia en las semillas se puede
deber a varios factores. Hartmann y Kester (1987), Hess (1980) y
Meyer et al. (1960), sealan factores como: impermeabilidad de la
cubierta seminal a los gases y agua, cubiertas de semillas duras y
presencia de inhibidores de la germinacin. Hartmann y Kester (1987)
sealan diversos tratamientos para superar el letargo de las
semillas, como escarificacin mecnica con agua caliente y con cido,
estratificacin de la semilla a bajas temperaturas, lixiviacin de
inhibidores, o combinacin de los anteriores. Tambin sealan
tratamientos para facilitar la germinacin, como lo son el uso de
hormonas y otros estimulantes qumicos como giberelinas. Cualquiera
de los tratamientos anteriores sirve para superar letargos
mecnicos, por presencia de pericarpios lignificados. S.
chamaedryoides, tambin se puede propagar, mediante reproduccin
asexual o vegetativa. Segn Baldini (1992) y Felipe (1999), a partir
de porciones de plantas, se obtienen descendencia homognea desde el
punto de vista gentico e idnticas a la planta de la que se ha
tomado el material de propagacin. La regeneracin por estacas es el
medio ms utilizado e importante de propagacin de muchas especies
agrcolas y ornamentales (Hartmann et al., 1990; Azcn-Bieto y Taln,
2008).
Existen distintos tratamientos a que se pueden someter las
estacas de tallo, con el fin de aumentar la capacidad rizgena. Uno
de los ms recomendados es el uso de reguladores de crecimiento para
estimular la diferenciacin de races adventicias. Sin embargo, este
tratamiento puede slo aumentar la capacidad rizgena, pero no puede
crearla. Entre los reguladores de crecimiento el ms utilizado es el
cido indolbutrico (IBA), ya que no es txico en un amplio rango de
concentraciones para un gran nmero de especies (Baldini, 1992).
Segn seala Muoz y Solanes (1983) las concentraciones ptimas de cido
indolbutrico (IBA) para promover enraizamiento, varan entre 1.000 y
2.000 mg L-1. Los objetivos de esta investigacin, fueron determinar
el tratamiento ms efectivo para promover la germinacin de semillas
de S. chamaedryoides, evaluar el efecto de la aplicacin de cido
indolbutrico en el enraizamiento de estacas y formacin de callos, y
describir los cambios morfolgicos de la semilla en el transcurso
del proceso de germinacin.MATERIALES Y MTODOS
El presente estudio se realiz en la Facultad de Agronoma de la
Universidad de Concepcin, Campus Chilln, durante el ao 2009 -
2010.
Las nculas de Sphacele chamaedryoides se colectaron en la comuna
de Hualqui, Provincia de Concepcin, Regin del Bo - Bo, la primera
semana de abril del ao 2009, y la recoleccin del material
vegetativo se realiz en el mismo sector, los primeros das de
octubre del mismo ao.
GerminacinLas nculas recolectadas se guardaron en bolsas de
papel para la posterior realizacin de los ensayos. Previo a esto,
pasaron por un proceso de limpieza y desinfeccin con fungicida
(Benlate 0.7 g + Captan 1.5 g en 1 litro de agua). Los tratamientos
a los cuales fueron sometidas las nculas, para romper la dormancia
de las semillas, se describen a continuacin:Ensayo I: Se tomaron
1.200 nculas y fueron sometidas a distintos tratamientos de
escarificacin y estratificacin (Tabla 1).Tabla 1: Tratamientos de
ensayo I (A), estratificacin ms escarificacin con cido sulfrico
(H2SO4).Estratificacin (4oC)Escarificacin con H2SO4 (mg L -1)
0 min10 min20 min30 min
0 dasA 1A 2A 3A 4
15 dasA 5A 6A 7A 8
30 dasA 9 A 10 A 11 A 12
La escarificacin fue de tipo qumica y se realiz utilizando cido
sulfrico al 24.2 % por perodos de 0, 10, 20 y 30 minutos. Para
esto, se depositaron en un vaso de precipitado agregndoles el cido
sulfrico a la concentracin antes mencionada, hasta cubrirlas
totalmente. Luego de exponer las nculas al tiempo antes indicado,
fueron lavadas con agua destilada durante un perodo de 24 horas
para eliminar los posibles residuos.
Despus del lavado, fueron puestas a estratificar por un perodo
de 0, 15 y 30 das en placas petri, cubiertas en su interior por
papel absorbente hmedo y dentro de una cmara refrigerada a una
temperatura de 4 oC en condiciones de oscuridad.Ensayo II: Se
tomaron 1.200 nculas y fueron sometidas a tratamientos de
lixiviacin de inhibidores con agua a diferentes temperaturas y
luego se trataron con diferentes concentraciones de cido giberlico
(Tabla 2). Las nculas fueron lavadas con agua a 25 oC y 50 oC,
durante 5 minutos, ms un tratamiento sin lavado, para
posteriormente ser sumergidas en tres diferentes concentraciones de
giberelina. Para esto, las nculas fueron depositadas en tubos de
ensayo con 2 ml de solucin de giberelina GA3 (Sigma), a
concentraciones de 250, 500 y 1.000 mg L-1, por un perodo de tiempo
aproximado de 24 horas, adems de un tratamiento testigo sin
aplicacin de giberelinas.
Tabla 2: Tratamientos de ensayo II (B), lixiviacin de
inhibidores ms aplicacin de giberelinas.
Lixiviacin de inhibidores (agua)Giberelinas (GA3 Sigma)
0 mg L-1250 mg L-1500 mg L-11.000 mg L-1
-B 1B 2B 3B 4
25 oCB 5B 6B 7B 8
50 oCB 9 B 10 B 11 B 12
Ensayo III: Se tomaron 1.200 nculas y fueron sometidas a
diferentes tratamientos de escarificacin trmica con agua caliente y
estratificacin a 0, 15 y 30 das (Tabla 3). Para la escarificacin,
las semillas fueron inmersas en agua, dentro de un vaso de
precipitado a 15, 30, 70 y 100 oC respectivamente. De inmediato, se
retiraron de la fuente de calor y se dejaron durante un tiempo de
24 horas en el agua, que se fue enfriando gradualmente.
Transcurridas las 24 horas, fueron puestas a estratificar por un
perodo de 0, 15 y 30 das en placas petri, cubiertas en su interior
por papel absorbente hmedo y dentro de una cmara refrigerada a una
temperatura de 4 oC en condiciones de oscuridad.
Tabla 3: Tratamientos de ensayo III (C), escarificacin trmica
con agua ms estratificacin.Estratificacin (4 oC)Escarificacin
Trmica (agua)
15 oC30 oC70 oC100 oC
0 dasC 1C 2C 3C 4
15 dasC 5C 6C 7C 8
30 dasC 9 C 10 C 11 C 12
Ensayo IV: Se tomaron 1.200 nculas y fueron tratadas con cido
giberlico, en concentraciones de 1.000, 2.500 y 5.000 mg L-1, ms un
tratamiento testigo sin giberelinas (Tabla 4). Se mantuvo el mismo
procedimiento que el ensayo II. Tabla 4: Tratamientos de ensayo IV
(D), aplicacin de giberelinas.Giberelinas (GA3 Sigma)
0 mg L-11.000 mg L-12.500 mg L-15.000 mg L-1
D 1D 2D 3D 4
Para los 4 ensayos, una vez listos los tratamientos, las nculas
fueron colocadas en placas petri de 10 cm de dimetro, con una lmina
de papel filtro y en una cmara de germinacin a 24 oC, a humedad
constante y 12 horas alternadas de luz y oscuridad para evaluar la
germinacin de las semillas.Se consider la semilla germinada cuando
la radcula emergida alcanz 1 mm de longitud.
Descripcin morfolgica de nculas, y cambios observados durante la
germinacin de la semilla
Las observaciones morfolgicas de la semilla en el trascurso del
proceso de germinacin, se realizaron con nculas maduras, fijadas en
glutaraldehido y buffer cacodilato de sodio, por un mnimo de 24
horas, postfijadas en tetrxido de osmio y sometidas a secado de
punto crtico. Este material, se mont en portas y se metaliz con
oro-paladio y posteriormente se examin con Microscopio Electrnico
de Barrido (MEB), en el Laboratorio de Microscopa Electrnica de la
Universidad de Concepcin.Las evaluaciones y los registros se
realizaron diariamente desde el da 0.Propagacin vegetativaSe
utilizaron estacas de tallo leoso de S. chamaedrioydes recolectadas
de plantas en ambiente natural. Se emple una cmara de proteccin de
2,4 m 1,6 m y 4 bandejas speedling. El agua fue suministrada de
forma manual mediante un pulverizador, dependiendo de las
condiciones observadas.
El sustrato utilizado consisti en 2/3 de arena, ms 1/3 de tierra
de hoja, material proveniente de la Universidad de Concepcin,
Campus Chilln. El sustrato fue esterilizado mediante autoclave a
121 oC por 1 hora, para eliminar semillas de malezas y patgenos.
Tabla 5: Tratamientos propagacin vegetativa (E), aplicacin de cido
indolbutrico (IBA).cido indolbutrico(mg L-1)
01252505007501.0002.0004.000
E 1E 2E 3E 4E 5E 6E 7E 8
Se confeccionaron 128 estacas de aproximadamente 8 centmetros de
largo y 0,4 centmetros de dimetro, y se formaron 8 grupos de 16
estacas, elegidas al azar, estos grupos fueron desinfectados con
una solucin acuosa al 0.75 % (v/v) de hipoclorito de sodio por 5
segundos. Una vez secas, fueron depositadas en frascos de vidrio,
con cido indolbutrico en diferentes concentraciones, sumergiendo
slo la base del material. De los 8 grupos, los tratamientos del 1
al 5 permanecieron en IBA durante las 12 siguientes horas, los
otros grupos slo estuvieron en agua. El da del establecimiento, la
base del material de los tratamientos 6 a 8, fue inmersa en las
concentraciones de cido indolbutrico por 5 segundos para ser
transferido en seguida al sustrato de enraizamiento (Tabla 5).
Con el propsito de mantener un control preventivo de
enfermedades se realizaron pulverizaciones peridicas con una
solucin acuosa de Benlate 0.7 g + Captan 1.5 g en 1 litro de agua.
Los parmetros evaluados fueron: porcentaje de enraizamiento y
formacin de callo.Diseo experimental y anlisis estadstico
Todos los ensayos de germinacin se realizaron con diseo
completamente aleatorio. Los ensayos I, II y III con 12
tratamientos y 4 repeticiones. La unidad experimental fue de 25
semillas por repeticin. En el ensayo de propagacin vegetativa, el
diseo experimental fue de bloques completos al azar, con 8
tratamientos y 4 repeticiones, la unidad experimental fue de 4
estacas.
Para determinar diferencias entre tratamientos, se realiz un
anlisis de varianza no paramtrico propuesto por Kruskal Wallis
(1952), y el procedimiento Conover (1999) (Balzarini et al.,
2008).
RESULTADOS Y DISCUSIN
Germinacin Ensayo I: No se observ diferencias significativas en
el porcentaje de germinacin entre los tratamientos, mediante el
anlisis de varianza. El mayor porcentaje de germinacin obtenido (2
%), fue en el tratamiento con 15 das de estratificacin y sin
escarificacin qumica con cido sulfrico (Tabla 6).
El efecto abrasivo del H2SO4 sobre la cubierta seminal de
diferentes especies, mejora la aireacin e hidratacin de la semilla,
lo que se traduce en una mayor eficiencia del proceso germinativo
(Prez y Martnez-Laborde, 1994). Segn Hartman y Kester (1987) la
duracin del tratamiento con cido sulfrico depende del tipo de
semilla, pudiendo variar desde 10 minutos en algunas especies,
hasta 6 horas o ms en otras, y al tratarse de semillas con
tegumentos gruesos, los perodos de tratamientos en estos casos son
largos. Para esta especie, los tratamientos son destinados a
escarificar el pericarpio de las nculas. De acuerdo a los
resultados podemos deducir que los tiempos destinados a la
escarificacin, posiblemente no fueron los correctos, debido a que
el pericarpio de los frutos de S. chamaedryoides est formado por
una capa de clulas esclereidas dispuestas en empalizada,
constituyendo un factor de latencia importante, dejando en
evidencia la impermeabilidad de la semilla. Esto se concluye, ya
que las semillas que fueron tratadas con acido sulfrico y el
control, no presentaron diferencias de volumen, lo que indica que
no embebieron agua. La imbibicin de agua es un fenmeno fsico y
puede efectuarse an en semillas muertas (Hartmann y Kester, 1987;
Sivori et al., 1980). Tambin es importante destacar, que la accin
escarificante del cido sulfrico sobre nculas de la familia
Labiatae, vara dependiendo de la especie, esto se fundamenta en
estudios realizados por Cabello et al. (1998), en nculas de
Lavandula stoechas, en donde obtuvo 83 % de germinacin utilizando
cido sulfrico.
Tabla 6. Porcentajes de germinacin en ensayo 1: escarificacin
con cido sulfrico y estratificacin. Estratificacin (4
oC)Escarificacin con H2SO4 (mg L-1)
0 min10 min20 min30 min
0 das0 0 0 0
15 das2 0 1 1
30 das0 0 0 0
No se presentan diferencias significativas mediante anlisis de
varianza (P < 0,05).Ensayo II: Al analizar los resultados, se
determin que no existen diferencias significativas en el porcentaje
de germinacin, segn las diferentes concentraciones de giberelina
utilizada para estimular el proceso germinativo, y las distintas
temperaturas del agua utilizadas para provocar un lavado de
posibles inhibidores presentes en la semilla o en la superficie de
la ncula. Los mayores porcentajes de germinacin (3 %) se obtuvieron
para los tratamientos con agua a 15 oC ms 250, 500 y 1.000 mg L-1
de giberelina, sumado a estos, el tratamiento 7, en el cual se
utiliz agua a 25 oC ms 500 mg L-1 de giberelina (Tabla 7).
En algunos casos, las semillas no germinan, aunque se den las
condiciones adecuadas (Jensen-Salisbury, 1988; Prez y
Martnez-Laborde, 1994). Segn seala Jensen-Salisbury (1988), una de
las principales causas fisiolgicas que pueden determinar la
dormancia de las semillas, es la presencia de sustancias
inhibidoras en diferentes tejidos de la semilla. Los resultados de
este ensayo, permiten deducir la ausencia de estos inhibidores en
la semilla y pericarpio, ya que no hubo respuesta al tratamiento de
lavado con agua a diferentes temperaturas.
Tabla 7. Porcentajes de germinacin en ensayo 2: lixiviacin de
inhibidores con agua a diferentes temperaturas y aplicacin de
giberelina.Lixiviacin de inhibidores (agua)Giberelinas (GA3
Sigma)
0 mg L-1250 mg L-1500 mg L-11.000 mg L-1
-0 3 3 3
25 oC0 2 3 0
50 oC1 1 1 1
No se presentan diferencias significativas mediante anlisis de
varianza. (P < 0,05).
Barcel et al. (2001), seala que los tejidos reproductores
contienen mayores cantidades de giberelina, sin embargo, el
contenido de la hormona vara en relacin con el crecimiento, edad de
la planta, floracin, desarrollo del fruto, dormancia y germinacin.
Aparentemente las giberelinas se producen cuando se necesitan, ya
que en semillas en germinacin hay un aumento brusco al aumentar
estas de tamao. Jensen-Salisbury (1988), indica que las
concentraciones de giberelina aumentan durante la primavera en
semillas latentes, y es posible que participen en condiciones
normales para romper el estado de latencia. Barcel et al. (2001) y
Sivori et al. (1980), seala que la aplicacin de giberelinas puede
romper el perodo de dormancia en semillas, ya que puede sustituir
tratamientos de estratificacin, que es donde aumenta el contenido
de giberelinas.
Basndose en los resultados anteriores, se puede determinar que
la giberelina no pudo penetrar en la semilla, debido a la dureza e
impermeabilidad del pericarpio, an cuando se esperaba tener un
efecto de escarificacin trmica sobre ste, al realizar lixiviacin de
inhibidores con agua a 50 oC.Ensayo III: El anlisis de varianza
detect diferencias (P 0,05) entre los tratamientos de este ensayo.
El mayor porcentaje de germinacin (65 %), se obtuvo con
escarificacin trmica a 100 oC y estratificacin por 30 das (Tabla
8). El efecto abrasivo de la escarificacin trmica, tiene como
objetivo, al igual que el cido sulfrico, mejorar la permeabilidad
de la semilla y de la ncula, en este caso por medio de lesiones
fsicas provocadas por la temperatura del agua, y facilitar por
medio de stas segn Prez y Martnez-Laborde (1994), el ingreso de
agua y el intercambio gaseoso de la semilla, de modo que el embrin
pueda iniciar su actividad metablica.Tabla 8. Porcentajes de
germinacin en ensayo 3: escarificacin trmica y
estratificacin.Estratificacin (4 oC)Escarificacin Trmica (agua)
15 oC30 oC70 oC100 oC
0 das0 a0 a0 a0 a
15 das0 a0 a0 a0 a
30 das 5 ab 10 b 61 b 65 b
Tratamientos con letras distintas indican diferencias
significativas. Test de Conover (P < 0,05).
Los tratamientos 10, 11 y 12 que fueron sometidos a
escarificacin trmica con temperaturas de 30, 70 y 100 oC y 30 das
de estratificacin a 4 oC, en completa oscuridad, presentaron
diferencias en el porcentaje de germinacin con respecto al resto de
los tratamientos. Estos resultados fueron obtenidos al final del
perodo de estratificacin, sin incidir las condiciones de la cmara
de germinacin.
Los resultados anteriormente mencionados, concuerdan con los
obtenidos por Berti et al. (2006), quien logr germinar semillas de
Luma apiculata estratificando durante 30 das sobre arena estril
hmeda a 2 oC, la germinacin comenz a los 28 das, durante el perodo
de estratificacin, y al cabo de 30 das alcanz un 80 % de
germinacin.
Estos resultados son coherentes con el hecho de que la testa
seminal est cubierta por el pericarpio del fruto, fuertemente
lignificado, lo que implica una mayor necesidad de que se favorezca
la eliminacin de esta estructura para facilitar la germinacin.La
luz promueve o inhibe la germinacin de semillas en algunas
especies. La inhibicin de la germinacin por la luz se presenta,
principalmente, en semillas de especies no domesticadas y de
malezas. De este modo, de forma natural, las especies cuentan con
un banco permanente de semillas en el suelo que tiende a garantizar
su persistencia en condiciones adversas (Salisbury y Ross,
2000).
Lo anterior concuerda con los resultados obtenidos, confirmando
una posible fotoblastia negativa en semillas de S. chamaedrypiodes.
Resultados similares obtuvo Cabello et al. (1998), en nculas de
Lavandula stoechas, familia Labiatae, las cuales no presentaron
germinacin en condiciones de luminosidad.La estratificacin tambin
juega un papel importante en la germinacin, provocando un aumento
transitorio del contenido de giberelinas y citocinina, con la
consecuente disminucin del cido abscsico, estimulando la
germinacin.
Todos estos factores en conjunto lograron anticipar el inicio
del proceso germinativo.Ensayo IV: Los resultados obtenidos, no
mostraron diferencias significativas entre los tratamientos con 0,
1.000, 2.500 y 5.000 mg L-1 de cido giberlico (Tabla 9).Tabla 9.
Porcentajes de germinacin en ensayo 4: aplicacin de cido
giberlico.
Giberelinas (GA3 Sigma)
0 mg L-11.000 mg L-12.500 mg L-15.000 mg L-1
0 0 3 2
No se presentan diferencias significativas mediante anlisis de
varianza. (P< 0,Las giberelinas son los reguladores de
crecimiento ms utilizados para romper la dormicin de semillas de
numerosas especies vegetales (Prez y Martnez-Laborde, 1994). Segn
Azcon-Bieto y Talon, (2008), cuando los niveles de giberelina (Gas)
endgena son insuficientes, con el tratamiento de giberelina se
puede romper la dormancia y promover la germinacin, ya que las Gas
suplen los requerimientos de luz y fro que precisan muchas semillas
para germinar. En el caso de aadir una giberelina especfica, sta a
lo ms coincidir con una de las naturales que tiene la planta. Por
tanto, si un proceso no responde a la adicin de giberelina exgena,
no puede decirse que no es regulado por giberelinas, pues puede que
no se haya aplicado la giberelina especfica que regula el proceso
(Barcel et al., 2001).Los bajos porcentajes de germinacin, se deben
a la no penetracin de la giberelina a la semilla, debido a la
dureza del pericarpio.Descripcin morfolgica de nculas, y cambios
observados durante la germinacin de la semilla
Da 0: Las nculas de S. chamaedryoides de forma oval redondeada,
presentan tamaos variables, entre 2.5 mm de longitud y 1.2 mm de
dimetro, (Figura 1 a), y la semilla de igual forma presenta 2.3 mm
de longitud y 1.1 mm de dimetro aproximadamente (Figura 1 b), estos
datos se basan en muestreo de 160 frutos.Figura 1. Sphacele
chamaedryoides. a. Ncula (B: 500 m). b. Semilla (B: 500 m). c.
Excrecencias (B: 100 m). d. Hilo (B: 100 m).
c: cubierta del fruto, d: dimetro, ex: excrecencias, h: hilo, l:
longitud.
Las nculas poseen una superficie lisa y muricada, provista de
excrecencias ms o menos cilndricas, cortas y endurecidas, las
cuales se disponen en forma perpendicular a la superficie de la
semilla, sin presentar un patrn de distribucin definido, estas
varan entre 10.4 m a 37.9 m de longitud y 8.35 m a 11.4 m de
dimetro (Figura 1 c). En la superficie del pericarpio, ms
especficamente en la zona polar basal, se observa la zona hilar
(Figura 1 d) la cual posee una superficie lisa desprovista de
excrecencias, y el hilo, el cual presenta forma lineal, con 270 m
de largo y 40 m de ancho, que corresponde a la cicatriz dejada por
el desprendimiento del funculo del vulo, al secarse la semilla
(Figura 1 d) (Besnier, 1989).Figura 1. Sphacele chamaedryoides. e.
(B: 50 m) y f. (B: 100 m). Corte transversal.
cs: cubierta seminal, em: embrin, pe: pericarpio.
En un corte transversal de la ncula, perpendicular al plano de
los cotiledones, se distinguen claramente tres estructuras:
pericarpio, correspondiente a la pared del fruto, cubierta seminal
y embrin (Figura 1, e y f).
El pericarpio presenta 57.1 m de grosor, y est formado por
esclereidas de 42.8 m de longitud, las cuales se disponen
perpendicular a la superficie de la semilla (Figura 2 a). Dimitri y
Orfila (1985), sealan que la testa de semillas que son liberadas
por el fruto, y que deben afrontar las exigencias del medio, son
gruesas y resistentes, entre las modificaciones que le otorgan
dureza e impermeabilidad se encuentra la esclerificacin. En esta
especie, las modificaciones antes mencionadas las adquiere el
pericarpio, dando proteccin a la semilla. Lo anterior es sealado
por Martn et al. (2005) en estudios en nculas de Lycopus L.
(Lamiaceae), indicando que la capa en empalizada adquiere gran
importancia, ya que confiere cierta dureza a la ncula constituyendo
a la proteccin del embrin. Figura 2. Sphacele chamaedryoides. a.
Esclereidas (B: 10 m). b. Embrin (B: 500 m). c. Detalle del embrin
(B: 200 m). d. Grnulos de almidn (B: 100 m).
co: cotiledn, cs: cubierta seminal, es: esclereidas, em: embrin,
g: grnulos de almidn, pe: pericarpio, r: radcula.
El epicarpio evidencia la presencia de mucilago, lo cual es
frecuente en numerosas especies de la familia Lamiaceae (Martn et
al., 2006), este carcter mucilaginoso queda en evidencia tras la
hidratacin del fruto. Martin et al. (2004) y Martn et al. (2006)
por su parte, indica que la excrecin de mucilago confiere a nculas
de la familia Lamiaceae ventajas de dispersin, fijacin al suelo y
germinacin.
La cubierta seminal presenta un grosor aproximado de 58 m,
fusionndose con el pericarpio, esto ocurre generalmente con
semillas del gnero Lamiaceae.
En un corte longitudinal de la semilla, se observa el embrin, el
cual segn la clasificacin propuesta por Besnier (1989), corresponde
al tipo folioso espatulado. ste alcanza un tamao de 1.911 m de
longitud, donde la radcula mide aproximadamente 665 m y los
cotiledones, ambos de igual tamao, rectos ovados, con el borde
entero y el pice redondeado, presentan 1.622 m de longitud,
mientras que de ancho se observan medidas de 622 m y 933 m de
radcula y cotiledones respectivamente (Figura 2, b y c).
El grosor de cada uno de los cotiledones es de 460 m, y estn
formados por tejidos parenquimaticos, esponjoso y en empalizada
respectivamente. En la Figura 2 d, se distinguen los grnulos de
almidn de forma esfrica y superficie regular, con dimetros
promedios de 4.2 m. Besnier (1989), indica que los hidratos de
carbono constituyen la reserva ms comn en las semillas y, de ellos,
el almidn es la forma en que aparece con ms frecuencia, acumulndose
en los cotiledones en forma de granos cuyo tamao y forma son
bastante tpicos para cada especie.
Figura 2. Sphacele chamaedryoides. e. Detalle de radcula y
micrpilo (B: 200 m). f. Corte longitudinal mostrando funculo y
arilo (B: 50 m).
a: arilo, co: cotiledn, cs: cubierta seminal, f: funculo, mi:
micrpilo, pe: pericarpio.
En la Figura 2 e, se puede apreciar la superficie lisa del
dermatgeno y el micrpilo, sobre el pice de la radcula, mostrndose
como una abertura que interrumpe la capa de esclereidas y los
respectivos tejidos hacia el interior de la semilla.
En otro corte longitudinal se puede observar al funculo y el
arilo. El primero de 196 m de longitud y 153 m de dimetro, y el
arilo, que corresponde a una excrecencia del funculo, o del
tegumento exterior, presenta 166 m de dimetro y 130 m de ancho
aproximadamente (Figura 2 f).Da 1 10: La semilla incrementa su
volumen, el embrin aumenta de tamao a 2.590 m, correspondiendo
2.295 m a la longitud de los cotiledones y 763 m a la longitud de
la radcula, en el undcimo da. El ancho, tanto de los cotiledones
como del eje hipoctilo radcula, aument a 1.113 m y 818 m
respectivamente (Figura 3, a y b). Figura 3. Sphacele
chamaedryoides. a. Embrin (B: 500 m). b. Detalle de radcula (B: 100
m). c. Ruptura de la cubierta seminal (B: 200 m). d. Detalle
cotiledones (B: 200 m). co: cotiledn, cs: cubierta seminal, de:
dermatgeno, em: embrin, gl: glndulas, pe: pericarpio, ps: parnquima
esponjoso, pp: parnquima en empalizada, pg: pelos glandulares, r:
radcula.
Hartmann y Kester (1987) y Dimitri y Orfila (1985), indican que
el embrin y el tejido de reserva se hinchan por la imbibicin de
agua, se diluye el protoplasma celular activndose las funciones que
se traducen en el crecimiento de la plntula. Estos acontecimientos
indican que la germinacin ha comenzado. Al duodcimo da la cubierta
seminal y el pericarpio comienzan a romperse en el extremo polar
basal de la semilla, y en forma paralela al plano de los
cotiledones.
Da 11 20: La ruptura de la cubierta seminal y el pericarpio
contina extendindose, debido al aumento de tamao del embrin,
identificndose epicarpio, mesocarpio y endocarpio. De igual manera,
se aprecia parte de la cubierta seminal (Figura 3 c).
Figura 3. Sphacele chamaedryoides. e. Cotiledones (B: 200 m). f.
Radcula emergiendo de la semilla (B: 500 m). ps: parnquima
esponjoso, pp: parnquima en empalizada, pg: pelos glandulares, r:
radcula.
En un corte transversal, realizado el da 11 se observan los
cotiledones, en stos se aprecia el parnquima en empalizada con tres
capas de clulas alargadas perpendiculares a la superficie adaxial,
y el parnquima esponjoso, situado hacia la superficie abaxial del
cotiledn, este ltimo est conformado por clulas polidricas
irregulares, las cuales no presenta disminucin en el material de
reserva (Figura 3 d), en un mismo tipo de corte, realizado el da
19, se puede apreciar claramente la disminucin del material de
reserva en clulas del parnquima esponjoso permitiendo medir
dimetros de 13.7 m aproximadamente para este tipo de clulas (Figura
3 e). Es posible observar la superficie lisa con presencia de
glndulas y pelos glandulares en la superficie abaxial y adaxial del
cotiledn (Figuras 3, d y e). A partir del da 19, la cubierta
seminal y el pericarpio se rompe completamente generando una
fractura que se extiende desde el polo basal hacia el opuesto de
ste, dejando visible la primera parte del embrin, el extremo de la
radcula, la cual presenta un dimetro de 584.4 m. Es de forma
redondeada sin presencia de excrecencias ni glndulas (Figura 3 f),
la cual inicia su crecimiento para convertirse en la raz primaria y
pone fin al proceso de germinacin (Bewley y Black, 1994 y Dimitri y
Orfila, 1985).Figura 4. Sphacele chamaedryoides. a. Raz primaria
(B: 1 mm). b. Hipoctilo (B: 200 m). c. Pelos radicales (B: 500 m).
d. Embrin (B: 1 mm).
pg: pelos glandulares, pr: pelos radicales, rp: raz primaria,
hp: hipoctilo.
Da 21 30: A partir del da 22, el embrin aumenta rpidamente de
tamao, con una notoria diferencia entre la raz primaria y el
hipoctilo, los cuales presentan 3.6 mm y 2.2 mm de longitud
respectivamente (Figura 4 a). El hipoctilo contina aumentando su
longitud y dimetro, provocando un aumento de la ruptura del
pericarpio y cubierta seminal, por donde saldrn los cotiledones
(Figura 4, b y c). Tambin es posible apreciar la superficie lisa
con clulas alargadas y la presencia de pelos glandulares en el
hipoctilo, y una gran cantidad de pelos radicales en la zona
pilfera.
A partir del da 24, el embrin alcanza 9.8 mm, acentuando la
diferencia entre la raz primaria y el hipoctilo, los cuales
presentan 4.5 mm y 3.3 mm de longitud respectivamente (Figura 4 d).
Los cotiledones y el eje hipoctilo radcula presentan un dimetro de
2 mm aproximadamente.Figura 4. Sphacele chamaedryoides. e. Zona
pilfera y caliptra (B: 1 mm), f. Corte transversal de la raz (B:
100 m).ca: caliptra, ci: cilindro vascular, cx: crtex, er:
epidermis, hp: hipoctilo, pr: pelos radicales, zp: zona
pilfera.
En la radcula alargada que conforma la raz primaria,
perfectamente diferenciada, se distingue la zona pilfera con
abundantes pelos radicales y la caliptra (Figura 4 e). En un corte
transversal de la raz, especficamente en la zona pilfera se
distingue el cilindro vascular, el crtex y la epidermis, con
detalle de los pelos radicales (Figura 4 f).
Los cotiledones presentan una superficie lisa, con clulas de
forma regular y una notoria diferencia entre una y otra,
presentando gran cantidad de glndulas en la superficie abaxial
(Figura 5 a). A los 29 das aproximadamente, el embrin se desprende
de la cubierta seminal (Figura 5 b), permitiendo distinguir
claramente entre sta y el pericarpio (Figura 5 c). La fractura slo
ocurre en el sector polar basal de la semilla, permitiendo salir
cotiledones y dejando intacta el resto de la cubierta seminal,
aprecindose la forma polidrica regular de sus clulas, comenzando de
esta forma la etapa de plntula.Figura 5. Sphacele chamaedryoides.
a. Cotiledones (B: 500 m). b. Cavidad dejada por la salida del
embrin (B: 500 m). c. Detalle cubierta seminal y pericarpio (B: 100
m). d. Primordios foliares (B: 1 mm).
co: cotiledn, cs: cubierta seminal, cv: cavidad, gl: glndulas,
pr: pelos radicales, pg: pelos glandulares, pe: pericarpio, tr:
tricomas, pf: primordio foliar, ei: epictilo, hp: hipoctilo.
Da 31 40: A los 33 das aproximadamente, el epictilo tiene una
longitud de 0.73 mm y 0.3 mm de dimetro, en el brote se observan
primordios foliares de 0.9 mm de longitud, los cuales presentan
borde crenado, y nervadura reticulada, acompaados de tricomas y
clulas glandulares bien desarrolladas, presentes slo en stos.
Tricomas de longitud 0.03 mm se encuentran presentes tanto en los
primordios como en el epictilo. En tanto el hipoctilo presenta
pelos y tricomas glandulares en toda su superficie (Figura 5 d).
Los cotiledones presentan pelos glandulares en la cara abaxial y
adaxial (Figura 6 a), estomas slo en la superficie abaxial, estos
poseen 29 m de largo por 25.5 m de ancho aproximadamente con clulas
oclusivas muy notorias, presentando un complejo estomtico
anomoctico (Figura 6 b).Figura 6. Sphacele chamaedryoides. a.
Estomas y pelos glandulares (B: 50 m). b. Detalle de estomas (B: 10
m). c. Primordios foliares (B: 500 m). d. Tricomas dendroides y
glandulares (B: 100 m). et: estoma, pg: pelo glandular, tr:
tricoma, tg: tricoma glandular, td: tricoma dendroide.
A los 34 das aproximadamente, el primer par de hojas se extiende
alcanzando 1.4 mm de longitud (Figura 6 c). Estas observaciones
indican que la planta es fotosintticamente activa, y que ha
iniciado su fase juvenil (Hartmann y Kester, 1987).
Segn Riedemann y Aldunate (2004), S. chamaedryoides alcanza 50
cm de crecimiento a partir de semillas el primer ao. En este
estado, podramos observar la presencia de tricomas glandulares y
dendroides. En las siguientes fotografas se pueden apreciar estas
estructuras sobre el nervio central de la hoja (Figura 6, d, e y
f).Figura 6. Sphacele chamaedryoides. e. Detalle de tricomas (B: 20
m) f. Ubicacin de estomas en la hoja (B: 10 m). et: estoma, tg:
tricoma glandular, td: tricoma dendroide.
Propagacin vegetativaAl analizar la Tabla 10, se puede apreciar
que no hubo efecto del cido indolbutrico aplicado, sobre el
enraizamiento de estacas de S. chamaedryoides, ya que no se
presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, segn
anlisis de varianza. Los mejores resultados de enraizamiento (25 %)
se obtuvieron con 1.000 y 4.000 mg L-1 de cido indolbutrico
(IBA).
Se puede apreciar que existi una capacidad natural de
enraizamiento de un 6,25 % en las estacas, sin aplicacin de
hormona. Esto indica que el nivel endgeno de promotores de
enraizamiento no sera un factor limitante en la rizognesis.
Resultados similares apreci Cornejo (1997), en propagacin
vegetativa en olivo, donde obtuvo un 5 % de capacidad natural de
enraizamiento, sin la aplicacin de IBA.Estos resultados son
similares a los informados por Palma (2001), quien realiz ensayos,
para inducir enraizamiento de estacas de plantas femeninas de
maqui, empleando cuatro concentraciones de AIB (0, 1.000, 2.000 y
4.000 mg L-1). Al analizar los resultados, concluy que el mayor
porcentaje de enraizamiento (36.6 %) se obtuvo con aplicacin de
1.000 mg L-1 de IBA. De igual manera, Cornejo (1997) en propagacin
vegetativa de olivo, obtuvo sus mejores resultados (70 % de
germinacin) al someter las estacas a una concentracin de 4.000
mgL-1 de cido indolbutrico.Tabla 10. Resultados de propagacin
vegetativa. Porcentajes de enraizamiento
(%).
cido indolbutrico (mg L-1)
01252505007501.0002.0004.000
6,256,2512,5002518,725
No se presentan diferencias significativas mediante anlisis de
varianza. (P< Segn Hartmann y Kester (1987), los factores que
afectan el enraizamiento de estacas son muy numerosos, ya que
influyen caractersticas fisiolgicas, morfolgicas y genticas, junto
a condiciones ambientales. El estado nutricional del material pudo
haber influido directamente en el porcentaje de enraizamiento, ya
que las estacas no fueron uniformes, variando los dimetros de estas
entre 0.2 y 0.7 cm y por tanto obtenindose estacas con diferentes
suministros de carbohidratos. Otro factor mencionado por Baldini
(1992), corresponde a la poca de recoleccin del material, indicando
que estacas colectadas en otoo enrazan mejor que aquellas
recolectadas en invierno. Las estacas utilizadas en este trabajo,
se recolectaron en primavera, siendo esta una posible razn de la
obtencin de resultados insatisfactorios de enraizamiento, por lo
cual se recomendara otra fecha de recoleccin.No fue posible evaluar
la formacin de callos en las estacas, debido a que no hubo
resultados. Con frecuencia, el proceso de rizognesis puede venir
acompaado de la formacin de callo, pero la presencia de este, no
tiene influencia sobre el proceso mencionado (Baldini, 1992;
Hartmann y Kester, 1987). Muoz y Solanes (1983), sealan que las
estacas tienen la capacidad de formar callo, siempre y cuando sean
recolectadas en la poca oportuna. Por lo tanto la ausencia de callo
podra deberse a la fecha no adecuada de recoleccin del material,
reafirmando lo indicado por Baldini anteriormente.
CONCLUSIONESLos resultados de la presente investigacin permiten
concluir que:1. Los tratamientos donde se utiliz escarificacin
trmica entre 70 y 100 oC, y estratificacin a 4 oC, sin luz, por 30
das, fueron los ms efectivos para interrumpir la dormancia de
semillas de S. chamaedryoides, ya que se logr un porcentaje de
germinacin entre 61 y 65 %.
2. Los bajos porcentajes de germinacin en la mayora de los
tratamientos son producto de un letargo mecnico, producto del
pericarpio lignificado que presentan las nculas.
3. Mediante las observaciones realizadas en Microscopia
Electrnica de Barrido, se pudo identificar caractersticas de clulas
esclereidas, las que conforman el pericarpio lignificado.
4. En los tratamientos de propagacin vegetativa, la aplicacin de
IBA no tuvo efecto en el enraizamiento de estacas, ni en la
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