1 .1 il [) /.e\ . UNIVfílSIDAO NACmNAL Ot MtXl'CO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR APLI- CADAS AL DIAGNOSTICO DE ALGUNAS HEMOGLOBINOPA1'1AS ( REVISION BIBLIOGRAFJCA) T E s s QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO PRESENTA RICARDO ANTONIO GARCIA MERLO DIRECTOR: Q F.I. GILDA FLORES ROSALES CUAUTITLAN IZCALLI, MEX. --------'! TESIS COR FALLA DE 1988
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TESIS: TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR APLICADAS AL ...
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UNIVfílSIDAO NACmNAL A~rnNOMA Ot MtXl'CO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN
TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR APLICADAS AL DIAGNOSTICO DE ALGUNAS
HEMOGLOBINOPA1'1AS ( REVISION BIBLIOGRAFJCA)
T E s s QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:
QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO
PRESENTA
RICARDO ANTONIO GARCIA MERLO
DIRECTOR: Q F.I. GILDA FLORES ROSALES
CUAUTITLAN IZCALLI, MEX. --------'! TESIS COR FALLA DE OIU~
Ill. TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR .........•••••• , • 61 A. OBTENCION DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO ••••• 64 B. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION .......•.••••.. 67 C. ELECTROFORESIS DE FRAGMENTOS DE RESTRICCION
IV. DIAGNOSTICO DE HEMOGLOBINOPATIAS Y TALASEMIAS MI. DIANTE TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR •••••••••• 95 A. DETECCION INDIRECTA DE LOS DEFECTOS MOLECU-
LARES DE LOS GENES DE LAS GLOBINAS •••.•••.• 96 B. DETECCION DIRECTA DE LOS DEFECTOS MOLECULA-
RES EN LOS GENES DE LAS GLOBINAS ...•.•••.•• 128 l. Mutaciones Puntuales que Afectan Sitios
de Restricci6n Conocidos • • • • • • • • • • • • • • • 128 2. Uso de Sondas Oligomericas Alelo-Especi-
;;;;:;.,,;~;!;:!!i!f };¡\/,:};¿{i\~~~~;~\~~~1:~~f:¡,;¡¡ de . este f en6meno· ha ofrecido ya'' re's~l Údoiíi'en :1,;:, 1:.,rapia de las h~moglobinopatias (3),
Las Hemoglobinas huma·nas· ~~an·~~m~i·~-s~ · s~n~ ai permitir la observacibn de los efectos "de una gran diver~·idad d~- errores ge-nét_ic~s sobre la estructura y -funci6n de uná
p~o~e,tna su relación con laS manifestacione·s clín_~cas.
Desde un punto de vista biolbgico, la acumulaci6n del gen
falciforme en regiones endémicas de malaria es una de las
m-&-s. ··-c-OriVincentes ilustraciones de la evolución por selccci6n
naturál (4);.
Como resultado de ser un modelo biol6gico de los
---más7'-estudiados _es ~_Ógico, como se mencion6 en párrafos ante
riores, que la vanguardia de la -Señét-ica molecular, la ingen;_~
ría genética, dirija sus esfuerzos al conocimiento de la He
moglobina, de sus patologías, el diagn6stico de estas y su
prevención y/o tratamiento.
Aún cuando las hemoglobinopatías no son un proble-ma
de salud camón en México (4), se decidi6 hacer una recopila
ci6n y revisibn sobre el uso de las técnicas de genética mole
cular en el diagnóstico de las hemoblobinopatl.as por los si
guientes motivos (sin establecer una jcrarqula):
I I. HEMOGLOBINA; ESTRUCTURA, - l'UNCIONES Y MUTACIONES
4
- : ;)': - • ~-- - : .. - > • '-.. '. -
A. ESTRUCTURA DE LA HEM§GLO~INA ÍIUMANA)ÓRMAL - .; :::· '.
-L~ e~-truc·tura t·erci·a~ia de ia cadena esta determinada
principalme.nté pór la. posici6n en la hélice de los aminolicidos
pa'larés· Y-.·: no'' políires; Así es que debido a la periodicidad
de. la_,tiÜice _ (3,6 aaiinolicidos en cada vuelta completa). la
cera interna dj la hélice es ~o polar (hidrof6bica) y la super-
ficie es polar (hidrofilica). Los aminoácidos internos no
polares son de vii:al importancia para la estructura y funci6n
dP la ·cadena¡ s-us -c-adenas laterales hidrof6bicas se unen,
ya sea un·a con .otra, con arilinoácidos de hélices adyacentes
o Con el grupo hem. Los aminoácidos polares externos permiten
la solubilidad en el agua de las cadenas (8),
2. El· Grupo Hemo
. El g~-·~p·o;:·.-.;heiDO e~_ u.~-~-.-PO~fir_ina. que contiene un átomo
de· hierro; ·La P.orfirin.a o· protóporfirina III comprende ella
misma:_.~ ,4 anillÓS. p~r.ro·¡-, con extremos nitrogenados, unidos
por PUf':!'.Ot·e·s .:mete.no . c.:..:cff-} .·y. oé:ho cadenas laterales; metil,
vinil -- ¿ áci_do p~opi_~."_ic_o~ El átomo .de hierro se sit6a en el :·ce.ni:.ro.:.-de . la· porfirina·,-, Íija'do a los cuatro nitrogenos
de los n6cleos pirrol quedandole dos vaiencias libres (Fe 2+)
(B) (Figura 2).
El grupo hemo se sitúa en un repliegue de la estructu
ra terciaria de cada monomero ·de globina llamada "bolsa del
hemo 11, y se fija en su sitio, por una parte, por las uniones
Figura 1. Representnc1on d1agramat1ca de la co~ f1guracion tercia.ria de la globina de los mnmif~ roa •• Se muestra la posic1on dal grupo hamo (en. negro)dentro de la bolsa del hemo. (7)
6
_¡¡
Figura 2. La molecula del hemo. AP acido pr,g pionico; M = metil¡ V = vinil. (8)
Cadena de globina
Aproxinl!l cion por ':<~::z=:z:=J::Z:::Wiil~--las cadenas cido J'.lrol'.lionicas del homo
Figura :;.. Las uniones hemo-globina. (8)
7
8
. -·-
que inté.~éambian las cadenas 'laterales del .écido propi6nico
del hem y.·.la globina; por otra, el hierro qu.e dispone de dos
vBlencias./libres fija una de ellas difecfamente sobre un re
siduo ·histidina llamado ."proximal" y .. la''otra act6a poi: la
cara opuesta a la molécula del hemo fijando una molécula de
ox~gé_no y, gracias a· su acci6n asegura· -·üna_ aproximaci6n suple
ménúiria sobre otro residuo de hist"i.dina llamado "distal"
d~·la globina (8), (figura 3),
3, El Tetramero
El i:etramero de hemoglobina (Rb A pór ejemplo) puede
ser considerado como un par de cadenas alfa acom~dadas simétri
camente sobre un par sim~trico de cadenas beta,· pero diagram6ti
c6mente puede representarse como se muestra en la figura 4.
--Existen dos regiones de contacto entre cftdenas diferentes,
c6no~ldas como region~s de contacto alfa 1-beta1 (o alfa 2-beta2 )
y el contacto alía 1-beta2 (alfa2 -beta1). El contacto alfa1 -
beta 1 es grande y firme (formado por el contacto entre 35
aminoácidos) y estabiliza a las cadenas en dimeros de alfa
beta (7).
El ot~o contacto,· el-a~fa 1 -beta2 (formado por contac
to entre 19,. am'inoácid_os)_, .. ,-es _ei contacto funcional¡ es a tra
vés de el que· se sucede el ·cambio estructural de la molécula
dti~antc· los procesos de oxigenaci6n-desoxigenaci6n (7).
B. FUNÍ:ÍONES DE LA HEMOGLOBINA: RELACION ESTRUCTURA-FUNCION
Siendo la hemoglobina el pigmento respiratorio de
los globulos rojos, asegura varias funciones:
La funci6n principal es el transporte reversible
de oxigeno desde los pulmones hasta los tejidos. Cada molé-
Figura 4. Representacion diagramatica de las relaciones entre las cadenas alfa y beta del tetramero de hemoglobina •• El contacto alfa 1-beta1 (alra2 -beta2) es el contacto estabilizante: el contacto alra1- beta2 (alra2-beta1) es el contacto al tra-ves del cual las cadenas beta se deslizan durante la o:dgenacion y dcsoxigonacion. (?)
9
10
cu la de· hemoglobina fija una molééula de oxígeno. (02 )· sobre
eí" .hi cr.ro .... de cada grupo hemo, Const~ tuy~ndO ia· -'<iXi.h_·~.moglob-in.a. La molécula humana de· henioglobina e~hibe otras tres: pro.pieda~ deS·· q·üe f~vOrecen a su fu'nción pl-inc.ipal: prin!ero ··:~ª- .-~-ñ·terac·cióñ hcmO-:hemo o efe e to cooperativo, s~g·u-~do·:<t · la:·/Jl.átiiiiiad· para l.igar.· iones H+ (efecto Bohr) y
de'.!iga~ fosfatos orgánicos (2, 3-DPG) (7,
. Ya se mencionó que el agua debe ser manten.ida fuerá
'de -Ya ffÓlsa del hemo para que este pueda funcionar.. La expli
·éac{óñ -i{·e·s-tO· puede verse al examinar la -reacc.ión hemo-oxígeno.
En ->Sü e_St8do reducido el átomo de hierro tieñe dos cargas
(+)y ~n electr6n desapareado (e-). En la oxigenac16n, el
o:d.g~no_ ~otra a la bolsa del hemo y comparte este electrón.
La ·unión qúímica entre el oxigeno y el átomo de hierro es
un enlace i6nico dHil y se rompe facilmente al disminuir
:la conceritraci6n de oxígeno en los tejidos:
.• Fe+:'°-(2) + o2 ~ Fe+++-(e)-02
(reversible)
.Cuando el oxígeno se libera, el electrón es devuelto
al átomo de h~_~r~~-1 z:egresando este a su estado ferroso
(Fe++:(~)-). Sin embargo, si el agua (H20) ganara acceso al
hemo,, desplazaría al oxígeno, reaccionaría con el Fe++ y acep
taría al electr6n del átomo ferroso, oxidandolo irreversible
mente a su estado férrico (metahemoblogina):
2. Interacción Hemo-Hemo
Cuando un grupo hemo adquiere una molécula de oxígeno
11
sufre un cambio en su conformaci6n de tal manera que se alteran
las relaciones entre las cadenas. Este movimiento se reduce
a _un ·désplazamiento de las cadenas beta sobre las uniones
ál~aJ:~beta2,. Durante la oxigenaci6n la molécula se 11 abre11
y :en-.-1a desoxigenaci6n se ~'cierra'~. Este cambio en la confor
maC.i6n ·~u~enta la capacidad de los otros hemo para ligar oxí
geno.- El_ P_roceso in.verso se observa cuando la molécula cede
al ~~Íg~~~. Este. fen6men6 se llama interacci6n hemo-hcmo
(!).
3.
c· •• \ .•.• :cLB ·~anfidad de OXÍgeno que la hemoglobioa puede ligar
a Cu~lq~.~er _ _..'"concentraci6n de o2 es conocida como afinidad
por· .el .o.xigeno .(exprezada como P50 - la p0 2 requerida para
saYurar 81 so% la mo°lécula).
·El pH y la presencia de fosfátos orgánicos influen
cian a esta propiedad (7).
4. Transporte de Bioxido de Carbono
Otra funci6n de la hemoglobina es el transporte del
C02 desde los tejidos a los pulmones. Solamente una parte
del co2 (alrededor del 40%) es transportada en esta forma.
La hemoglobina fija al bioxido de carbono no sobre el átomo
de hierro como hace con el oxigeno, sino sobre los grupos
aminados laterales de la globina, para constituir la carboxi
hemoglobina (8).
C. VARIACIONES NORMALES DE LA HEMOGLOBINA
edades.
La hemoglobina humana no es la misma a todas las
Las diferentes hemoglobinas que se presentan ·en las
12
"ªriadas etapas del desarrollo del !ndi.viduo se forman por
las -dist:inl:áS comb.i'nacion~s entre cadena·s monomerica~ de glo
bina. Las. cadenas m0nomeric8s p~eden ser alfa-like (alfa
y ietii)". de 141 aminoácidos .de largo º'' beta-like (epsilon,
gama, delta o beta) con 146" aminoác.ido·s (3).
La configuraci6n - tridim~~sional de las cadenas alfa,
zeta, epsilon'1 ·, ga.ma, delta y. be.ta es la µiisáu~ .. (figura 1).
Las diferencias entre ellos reside en la secuencia y. número -
de aminoácidos :que. las .forman (3).
En lá tabla· ·1 se indican los diferentes tipos de
hemoglobinas ·que se presentan durante el desarrollo del indi
viduo sano: En los tres primeros meses de la gestaci6n humana,
los islotes sanguineos del saco vitelino sintetizan las llama
das hemoglobinas embrionarias, que asocian cadenas embriona
rias (zeta y epsilon), fetales (gama) y del adulto (alfa),
según la edad del embri6n: Gower 1 (zeta 2-epsilon 2 ), Gower
2 (alfa 2-eps!lon 2 ) y, Hb Portland (zeta 2-gamma2); esta última
es hallada en trazas normalmente en el cordon umbilical.
Subsecuentemente el hígado fetal y la médula ósea se activan,
siendo este Último el principal órgano eritropoyetico en la
vida adulta (figura 5 ), La principal hemoglobina durante
la vida fetal es la hemoglobina fetal HbF (alfn2
-gama2), cuya
afinidad por el oxígeno es más fuerte que la de la HbA. Alre
dedor del nacimiento ocurre el más interesante de los cambios
en el desarrollo del individuo: el cambio de HbF a llbA (alfu,
beta2). Otro tipo de hemoglobina del adulto es la HbA2
(alfa;
delta2), la cual aparece al mismo tiempo, pero permanece como
componente minoritario (1-3.5%) durante la vida adulta (tabla
11). Poco se sabe sobre los factores que disparan el cambio
de la llbF a la adulta; se ha observado que la desaparición
de las cadenas zeta y epsilon ocurre paralelamente, sugiriendo
un cambio coordinado de la expresi6n de los genes embrionarios
(zeta y epsilon) a los fetales (alfa y gama), junto con el
Heoes de Gestacion
Saco Vitelino
Higa do
Medula osea
Figura 5. Representacion esquematica de la actividad de los diferentes genes globinicoa (parte superior) y ~e loa diferentes organoa hematopo -yeticos (parte inferior) durante la gestacion, _ niñez tempr~na y vida aC.ulta. (9)
13
14
TABLA I. Las He:noglobinas Humanas (9)
Tipo de hemoglobina Composicion Presente en de
Cadenas
Hb t. «L (!li_ Vida adulta(95''); trazas en la vida fetal
Hb F O(~".% Vida fetal (:pre do-·. minan temen te); en
vida adulta( 1-2'~)
F.b A2 «%, ~z. Vida adulta ( 1 -2"i)
Gower-1 ~ '-.e ~12 semanas
Gower-2 o<i'-& <12 semanas
Portland ·~ "(L <12 semanas
TABLA II. liemoglobinas del Adu1 to Sano (9)
Hemo15lobint1 A (At&t>z) .......................... .. 97-99. %
quC- s_f~v:~~>·~-~~J~.~-_ña~:-:~_p:·a~,a-"' ia·:;realiZ~ci6n corree.ta de los cortes y···. ~mp~lm~.C· d.él. ARN·. •.: Los dinucleótidos GT en el extremo
5' (d~~ad:~r) >}i•,\'c e~· ~i 3' (aceptor) del intron, son esencia
les ·en :est~s ·;;ecu.~ncias de reconocimiento (38).
s'ec~Cnci'irn con cierta similitud a las señales de
empelm.·e p·-~e~~~- 's'.er encontradas en otros sitios que no sean
los l:!mites intron-exon. Por ejemplo, en el gen de la globina
ti''eta, -el dfnucle6tido GT se presenta 44 veces dentro de se
cuenci&s· ·similares en un 60% a los sitios de empalme, y el
dinucle6tido AG, 49 veces. Estos sitios de empalme 11 ocultos"
son· raramente (si es qu-e alguna vez) usados durante el proce
samiento normal del ARN pero 1 pueden activarse por mutaciones
que los asemejen aún más a un sitio de empalme activo o como
resultado de la inactivaci6n de un sitio de empalme original
(36).
Se han descrito tres diferentes mutaciones en el
sitio donador (de GT a AT o TT) tanto del IVS-1 como del IVS-
2, y dos en el sitio aceptar del IVS-2, que originan una su
presi6n total del empalme en las uniones alteradas (tabla
V). Como consecuencia no hay formaci6n de ARNm maduro y el
fenotipo resultante es de betaº.
Otras dos mutaciones descritas para los nucleótidos
5 y 6 del sitio donador del IVS-1 (tabla V), originan una
reducción del empalme normal, originando una disminuci6n de
entre 25 a 50% del ARNm normal maduro. Estas mutaciones dan
lugar a fenotipos beta+.
Se han descrito ciertas mutaciones que generan nuevos
en la r~a1Í:zaCi6ri,,del e'~~alm~ del .ARN.' Álgu~os .ÁRN llegan a-. s~:r ~~-~~~~ad~~s.- -ri~~~:~·1m~~-~-te·?~: Ei':o f~-~:~t-Í.'pO ::-'~~su:it~Ote_ e'·s ··por
tant~ beta+ .. (36);.
Dist;ibUci6ii de' las
·-,· Lo_~~-B~J1~S se concentran primordial-
_·'mente_ 8)r·e4~dOi:_:_ ·~e-· la·- cuenca, del mediterraneo, en la India,
:~~----~'~'-~i-~i:~~-e-~~---~-u·~- ·y_ occidental y en pob~aciones negras. La -- deit-a.::6e°ta~'º~ta-lasém:la se halla limitad.a a Grecia, pudiendosele
encontrar r.Bramente en la India. En la raza negra la beta
tBl-kSem~a e·s en general mejor tolerada y menos sintomática.
Existe la misma distribuci6n geográfica de los genes talaslmi
cos ,: el gen falciforme, el gen para la deficiencia de la enzima
G6PD (glucosa 6 fosfato deshidrogenasa) y la malaria, asumien
d~se el .que estos genes confieren al portador cierta resisten
cia ante la infecci6n (4),
Manifestaciones Clínicas y Diagn6stico de las Beta-Talasemias
• ·~~ ~},ü~V'a d;i· .·iDet~bÍ~uifito ¡le sodio es útil para
: ~ t adbii;suril6farttº~r .~h¡se/m;o.f:c.:i:gáo~ltoeozs'.~:s~.s1neaja ! ~:: t: :is s a nsger e m :rn: ~:: s:: ~ ¡.~~ c~i~i~_;\'.{~ .. .. .. . .. · ..... ···. se deforman por completo en u_n-á~=:~:do-~.-:\~~or~a:s.·r.r,~1~~c~~'ra-i( :_ q ~e· -l_a·s_ ··de-- he te roe igotos r eq uer iran
:·ia~~-~~ª212~~j2;o;5:>Ht¡ .~}::tr;:;;e:~sH~: 2 ~a ~:morgelsotb0in:8 m~:;~ No se 'cietecta ·ÍlbA. (7; 8) •
Tratamiento. __ .
Desafortunadamente a la fecha no existe una terapia
específica para la anemia falciforme. Existen una serie de
agentes que se piensa pueden ser efectivos en la prevcnsi6n
de la formación de drepanocitosis pero ninguno hn comprobado
su inocuidad y eficacia. Por tanto, el manejo de estos pacien
tes se limita a la prevcnci6n de graves complicaciones. Se
les inmuniza contra probables agentes infecciosos, se les
suplementa la dicta con ácido fólico para prevenir la aplasia
megaloblástica 1 se les hidrata oralmente para evitar crisis
vaso-oclusivas y las crlsis aplásicos se trdtan con transfu
siones sanguineas acompañadas de terapia de quelactón (39).
Hemoglobina C.
La hemoglobina C es el resultado de la sustituci6n
del ácido glutamico por lisina de la sexta posici6n en la
cadena beta (alfo 2-beta2 6 Glus-<> Lis), Esta variante hemoglo
b:!nica produce cristales que al precipitarse reducen la de
formidad de la membrana eritrocitaria. El gen de la hemoglo-
54
bina ,·C ,e~_· muy· comun en :el:'_A(rica_-o'cc.ideri·taf. Eil lo·s :·_negrOs
~-ort~'ame~;¡-ca·~·a·s--: ;e >e·n~~~n-~r·a, ai,-_:g·~~-: e~ ,un· 2% dC fo·s individuos
y. e~ rarame~t~ ~is ta en hlarÍcos (42).
Él ·estado homocigoto ·ce~ aunque raro•· pr~_duce una
anemia -de le:ve ·a moderada con esplenomegalia leVe, _icterici·a
y·, extraordfnariamente, fen6menos vaso-oclusivos .. En el frotis
sanguineo la presencia de HbC origina c6lulas e.n diana. En
la electroforesis la l!bC comigra con la HbA2 (39).
El. mayor riesgo de la HbC es su · inteiacCió·a· ·~·on ¡',; HbS para producir la anemia CS falciforme. Esta condición
~~esenta manifestaciones similares a las de la ·anemia S falci~
forme.· La anemia CS falciforme tiende a ser menos grov':;
pero puede producir todas las complicaciones vistas_ en los
estados SS.
Al encontrar a individuos con electroforesis sugesti
vá de HbSC pero con sintomatolog{a más severa, debe de sospe
charse de una heterocigosis para HbS y HbO Arab (beta
ron conceptos pilares para la genética moderna: i) El estable
cimiento de la relaci6n "un gen-una enzima 11; ii) La descrip
ci6n de que la unidad de mutaci6n es la base nuclcica; la
unidad de recombinaci6n es también la base nucleica, ya que
las recombinaciones pueden efectuarse entre dos bases adyacen
tes; y que la unidad funcional es el gen que está formado
por unBs mil bases; iii) Los experimentos de Avery y Mcl..eod
por un lado y los de Hershey y Chase por otro que establecie
ron sin lugar e dudas que los ácidos nucleicos son el mate
rial portador de la herencia; iv) La elucidación por parte
de J. Watson y F. Crick de lo estructura en doble hélice del
ADN; v) El concepto del Operan, de J. Monod y F. Jacob, como
sistema regulador de la actividad génica y; vi) Como punto
culminante el desciframiento por W. Niremberg, J.H. Hatthae
y S. Ochoa, del c6digo genético que permite el flujo de infor
maci6n de los ácidos nucleicos a las proteínas explicandose
as{ la relaci6n funcional: genotipo-fenotipo (49,50).
Cuando se pretende formular una dcfinici6n se co
rre el riesgo de caer en la sobresimplificnción y/o en el
rcduccionismo. Es por ello que cuando se estudia a la Vida
63
_en vez de _tratar de definirla sé prefiere enunciar sus cuali
dades y pro-piedades. De la misma manera, antes que dar una
def inid6n de lo que es la Genética Molecular es preferible
enumerar- sus carocter{sticas, objetivos, métodos y campo de
acci6n: La Genética Molecular aisla segmentos de ADN, locali
za aquellos que corresponden al gen que quiere estudiarse
y determina la secuencia de sus bases. El gen así aislado
puede ser obtenido flanqueado por sus regiones adyacentes,
de las que también pueden determinarse las secuencias. Se
accede de este modo a las bases nucleicos que, situadas con
frecuencia en el exterior de los genes sobre el mismo segmento
de ADN, pueden cumplir la función de lugares de reconocimiento
para los proteínas de regulaci6n. Conociendo, efectivamente,
la secuencia de las bases de un segmento de ADN cuya funci6n
es desconocida, es posible deducir la secuencia de los amino
ácidos de la proteina cuyo sintesis rige, Este tipo de gen{,ti
ca permite tambi6n actuando directamente por v!a química sobre
una o varias bases de un segmento de ADN, inducir mutaciones,
que, en este caso, son mutaciones dirigidas. De donde, o6n,
la posibilidad por una parte de hncer síntesis de proteínas
modificadas en sus propiedades y que podrían ser de interés
agron6mico, industrial o ml!dico, y por otra parte, de conocer
mejor los procesos que operan en el funcionamiento de los
seres vivos (49).
La v~nguardia de la genética molecular es la inge
niería genétiCa, la cual, al permitir el análisis fino del
S_o_p_or-i::e--o-riat·i?r'tal ___ de--1n herencia -hace posible su modificaci6n;
su aplicaci6n a las ciencias de la salud reside en los
originales métodos de producci6n de sustancias biolbgicas
de interés ml.dico y en el diagn6stico de enfermedades heredi
tarias.
La genética, una ciencia relativamente joven, tiene
: ,_,_ ,'
ya un brillante- .,p8s640 •... Su f~~-~r~, "n~·, {~:::.~S~ .. :_·m,~n'Ol~ ._·P~_estO_ que los ml!todos que. empl~D son de: Una frnur.i•. yc'de Un~ 'precisi6n
in.com'p·arablés~ __ Y_. son· a~gunas ·d~ -.é-~t~:¿·-"·m~-·~od'ti·ios_!~~-:,._:._c¡U_~: h-~-~ servido para, el diagnóstico de :dÍ.vkrso.s U pos .·de hemoglobirio
patl.as, l'as que se describen a c~ntinua2i6n~
A. OBTENCION.DE.ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO HUMANO
Muchos de los estudios de la gen6tics molecular
se inician con la obtenci6n de ADN de et.lulas humanas en un
É!stado i"o suficientemente puro que permita un análisis confia
ble' del mismo. El paso crucial en su purificnci6n, la remo
ci6n de proteínas, puede lograrse extrayendo la solución acuo
sa de ácidos nucleicos con fenal y/o cloroformo. Sin embargo,
medidas adicionales son requeridas cuando los ácidos nucleicos
se purifican a partir de una mezcla compleja de moléculas
como un lisado celular. En estos casos, se destruye a la
mayoría de las proteínas digiriendolas con enzimas proteolí
ticas antes de realizar las extracciones con solventes org&ni
co (84).
l. Fuentes de ADN Humano
El leucocito es un tipo celular conveniente para
la extracci6n de ADN; suficiente ADN (aproximadamente 200 ug) pueden obtenerse de 10 a 20 ml de sangre (7,8).
para el diagn6!ú:icoc'preiiatal, pueden obtenerse por diferentes
métodos:
., Amniocentesis; su aparici6n en 1960 la hace la
técnica mas antigua para la detecci6n en útero de alteraciones
fetales. En la decimoséptima semana de gestación puede obtc-
ncrse liquido amni6tico con numerosas' ~éiuiBs descamadas del
feto. La punci6n se efect6a' ii t'ravés de la> pared. abfominal
con la ayuda de una aguja. 'La ecografía que visualiza la
maniobra permite, con gran se.guridad, controlar con precisión
el lugar y la profundidad de la punci6n. La técnica es extre
madamente fiable si es realizada por técnicos diestros. En
19 años de práctica, el riesgo para el feto está bien evalua
do: varia de 0.5 a 1.0% seg6n la experiencia de los equipos
(52). Los amni6citos colectados mediante la centrifugaci6n
de 5-20 ml de Hquido amni6tico proveen suficiente ADN para
los an6lisis pertinentes.
técnica es lo tardio del
Sin embargo una limitaci6n de esta
examen: decimoséptima semana de
gestaci6n ¡ este retraso significa que en caso de descubrir
una anomalía grave en el feto, la madre sufriría un aborto
de Segundo trimestre, que, en este momento y desde cualquier
punto de vista, es particularmente penoso.
Obtenci6n de sangre fetal; los mhodos de obtenci6n
de .sangre fetal aparecen en 1973; los principales son la fe
toscopia la punci6n directa bajo control ecográfico. La
feto~copia es en principio un m6todo de visualizaci6n del
feto: un tubo rígido que contiene fibras 6pticas y una aguja
que permite puncionar los vasos de la base del cord6n umbili
cal. Esta técnica que impone la hospitalizaci6n de la mujer,
comporta un riesgo fetal elevado, entre un 1 y un 4%. Uno
vez más, la ecografía ha permitido progre.5ar fttcilitando la
técnica y reduciendo el riesgo: la obtención de sangre puede
ser realizada ahora por punci6n directa de la vena umbilical
con la ayuda de una aguja que atravieza la pared abdominal.
Esta técnica presenta para el feto un riesgo inferior al 1%.
Estos dos métodos se practican entre las semanas decimosépti
mas Y vigésima presentando, por tanto, el mismo inconvenien
te de diagnóstico tardío que la amniocentesis (52).
66
Biopsia ·de las vellosidades del cori6n: esta tilc
nica, _,de~8:rr'ollad~ a finales de. )os años 60 1 s pero puesta
•en prácd.ca cHnica· a iÍliGios de 1980, permite la obtenci6n
de· células i~tales en un estadio precoz ·del embarazo (53).
Al .~principio de la embriogénesis, alrededor del embri6n apa
re·c~ · progresivamente una en vol tura externa, el cori 6n. En
una parte del cori6n situada en contacto con el tejido ( trofo
blas.to} que se convertirá en placenta, se desarrollan prolon
gaciones celulares (vellosidades) de origen fetal, La idea
bhica de esta técnica es la de obtener por la via vaginal
-e1-· cori6n tiene un acceso relativamente directo- estas vello
sidades (aunque recientemente se ha reportado un caso de mues
treo transabdominal (54)). La obtenci6n puede llevarse a cabo
de forma precoz, entre la novena y undécima semana de gesta
ci6n y no necesita anestesia. Con respecto al riesgo que
acarrea al feto esta biopsia, los Últimos resultados conocidos,
publicados en 1984 y que provienen de 42 centros europeos
y americanos, arrojan un riesgo de 4% de pérdida fetal (en
aquellos. centros que han superado las 100 biopsias el riesgo
fetal ob~-erva_do es de 2.3% (52).
~Bs indicaciones de este nuevo método para el mues-
__ treq. pre~etBl están en estudio. A este respecto hay dudas
sobre'_ .·la· calidad del proceso de obtenci6n; la contaminaci6n
~~-r :céiul~s mat.ernas puede ser una grave fuente de error (55,
56); ._Las primeras aplicaciones de este método se han llevado
a_ c.abo0
. para .ia·.detecci6n de la anemia falciforme (57).
2. Puriffcaci6n del ADN
El ADN de las células en estudio; leucocitos, amnio
citos o trofoblastos, es obtenido de la siguiente manera (58):
a. Laa células son Usadas mediante tratamiento
una vez -C.~D ·-f-enoi, seguido de otra extracci6n' con una mezcla
1 d d~ friñol y cloroformo, y por 61timo con cloroformo. Este
p~ocedimiento aprovecha el hecho de que la desproteiniznción
eS-- más efectiva cuando se usan dos solventes orgánicos en
vez de uno solo. Aún más, la Última extracci6n con cloroformo
elimina restos de fenal presentes en la prcpnraci6n de ácidos
nucleicos que podrían inhibir a las enzimas modificadoras
del ADN utilizados en pasos posteriores.
e. El ADN en la fose acuosa es concentrado por
prccipitaci6n al adicionar etanol fria. El precipitado de
ADN, que se forma a bajas temperaturas (-20 C) y en presencia
de concentraciones moderadas de cationes monovalentes, es
recuperado por ccntrifugaci6n y redisuclto en un buffer adecua
do.
El ADN as! obtenido es de aproximadamente 40-100
kilobases de largo y suficientemente puro para ser sustrato
de enzimas modificadoras del ADN (58),
B. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
El ADN obtenido y purificado del sujeto en estudio
debe de ser analizado para determinar el tipo de alelo presen-
68
te en el locus de interh. Esto significa que se requiere
localizar caracterizar a un fragmento de aproximadamente
1000 pares de bases, o 1 kilobase, de entre un total de -
6 000 000 kilobases que conforman el genomio completo de un
ser humano. En términos prácticos esto significa que un re
quisito para el a·nUisis directo de un gen es la habilidad
para identificar a un fragmento de ADN del tamaño de un gen
de entre 6 millones de fragmentos de tamaño similar. Para
~ograr. esto se requiere de una estrategia metodológica que se
inic-ia - con la fragmentaci6n del ADN por medio de las enzimas
de restricci6n.
Una definici6n que se ha dado en forma general para
lo que es una enzima de restricci6n es: Endonucleasa que degra
da ADN duplex modificado impropiamente (59). Estas enzimas,
especificas de cepa, son parte de los sistemas de defensa
bacterianos
rápidamente al
excisiones en
sobre el ADN.
permiten a la bacteria reconocer destruir
ADN extraño, como ol de los vjrus, al causar
la doble cadena en un número limitado de sitios
Para tener una actividad de restricci6n, cada
una de estas cepas bacterianas posee una metilasa ADN-cspecí
ficn que transfiere grupos metilo S-adenosil metionina (Ado
Met) a Adenina específica o o residuos de citosina en el ADN.
De esta manero, ~l ADN de las células es protegido contra
su propio actividad restrictivo (60).
Por muchos años se ha sabido que los virus bacteria
nos tienen un rango limitado de hospederos. Desde 1952, va
rios grupos de investigoci6n describieron el fen6meno de modi
ficaci6n del cromosoma viral inducida por el hospedero; fenó
meno por el cual el espectro de bacterias hospedadoras para
ciertos virus depende de lo cepa bacteriana en que este se
hubiera propagado originalmente (61). A principios de los
años 1960's, Arber (61) demostr6 que la replicaci6n viral
69
exitosa se acompañaba de la permanencia del ADN vírico en
su forma macromolecular intacta, mientras que el fracaso en
la infecci6n se caracterizaba por la destrucci6n del genomio
viral. Arber predijo la existencia de enzimas que hidroliza
rian el ADN extraño mientras que el ADN propio seria modifica
do para evitar ser reconocido por tales enzimas. A principios
de los años 1970's, Smith y llilcox (62) describieron a las
endonucleasas de restricci6n que destruían al ADN extraño,
mas no al ADN de la bacteria hospedadora. Smith y otros han
purificado y descrito mas de 200 de tales enzimas, la mayoría
de las cuales tiene una especificidad de secuencia absoluta
(63).
Originalmente las endonucleasas de restricci6n fueron
clasificadas en dos grupos en base a su complejidad estructu
ral y a sus requerimientos de cofactores. Conforme el conoci
miento ha avanzado se han establecido criterios adicionales
para,_ dif.erenciar entre varios sistemas de restricci6n y modi
fic·aci6n. Como resultado actualmente se reconocen tres tipos
diferentes de enzimas de restricción: Las enzimas del tipo
I y- III portan las actividades de modificaci6n (mctilaci6n)
y de restricci6n dependiente de ATP (excisi6n) en la misma
prote!na~ Ambos tipos de enzima reconocen secuencias no mcti
l_ádas eri· 'el ·-ADN sustrato, pero las del tipo I realizan cortes
~_zarpsos, ___ m;entras que las del tipo III cortan el ADN en sitios
específicos,
Las enzimas del sistema de restricci6n/modificaci6n
tipo II consisten de una endonucleasa de restricción y de
una metilasa de modificaci6n separadas una de otra. Un gran
número de enzimas de rcstrícci6n tipo II han sido aisladas
(63), muchas de las cuales son indispensables en las metodolo
gías de genética molecular (véase Tabla X donde aparecen
nu~vc populares). Estas enzimas cortan al ADN dentro o cercn
?O
TABLA X. Endonucleasaa de restriccion rle uso comun y sus especificidades de corte~ c59> Enzima Secuencia blanco
Bam HI GIG A T e e e e T A GIG
Bgl I G e e N~N G G e CGGN NCCG
Eco RI GfA A T T C e T T A AIG
Hae III a ªle e e e G a
Hind III AIA a e T T T Te a AIA
Msp I C~G G C
Pst I e T Ge A!G GJA e G T e
Taq I Tt.g-g,A A T
Xba I TLC TA G A A G A T CIT
+ Las secuencias reconocidas y restringidas por una enzima de restriccion es tipicamente un palin--dromo: esto quiero decir que se lee igual de 1z quierda a derecha, QUe cuando se invierte de d,!J, recha a izquierda. N= cualquier base nucleica.
71
de sus-. ~·~-e~.~~.¿~~ª-- pár~~cu~~re~: de reCon~~im~.~-nt~-~·-~ ~u~ ti_~ic~- -ment.e s<in de 4·:··.·a 6 .nucleotidos de largo. co.n' un doÚe 'eje de
simetría: La i.'nzima Úó RI, por ejeinplo, (llamada asi porque
EstéiS Co'ites~-"desfesíidos orfgi~a~ frag'mentos de ADN con extremos
5 ! .. · c_~h~~'.~ .. ~.~~~:'_~ · .. _--,.~~~--~q ~_ie~~'.~- 'd,~_ :.-'e·at~s·. -e~t remos puede aparear se con.:~~tr_o:--e~frerD_O.·'·Orfgfná.d_O·:-p·o~ la actividad de la misma enzima
de restricci6n. ·As! pues, cualquier molEcula de ADN que
posea. erit·aS··.-e?Cfr~m-~:s c·oheáivos -complementarios puede ser un1da
Muchas enzimas de rcstricci6n, como Eco RI, generan
-'-~-~~~~e-~~~-ª ~e- ADN con extremos 5' cohesivos; otras (por ejemplo Pst I) generan fragmentos con extremos 3' cohesivos, mientras
otras (por ejemplo Bal I) cortan en el eje de simetría produ
ciendo extremos rasurados (64).
~lgunns enzimas de restricci6n se emplean en el labo
ratorio para cortar al ADN humano en fragmentos definidos
para su posterios manipulaci6n y análisis. Un gran número
72
d-e e'nzi~~s de~ res.tric'ci6n, ·de dif~fentes bacterias, son comer
~--1.aim:ent·~:. acCeS:Ú~·les~ /La ·~m-~y~i{~ >~o~··\estables por meses si
se almacerian a -20 C, y cÓÍ:ta~·'ie1 ÁDN a 37 ºe en buffers sim
p~~~---·qu1{:·:~ontengan a.al~·~. --~--~_g·~:~-~·i:~: y' un agente que prevenga
su oxidaéi6n como. el ditfotr~itol.
El genomio ·humano-- diploide puede ser cortado por
una enzima de restricci6n en cerca de l 000 000 de fragmentos
discretos con tamaños que van de los 100 a los 100 000 pares
de, bases de largo. Solo uno de tales fragmentos (o dos o
- _tres- ·s·f_ el gen de interéB tie·ne·· sitios de corte internos para
la enzima empleada) contendrá al gen en estudio, Estos frag
mentos portadores del gen en estudio pu~den ser separados
d~l- re_~to,_ en base a su tamaño, mediante la técnica de electro
foresis (84).
C. ELECTROFORESIS DE FRAG~ENTOS DE RESTRICCION DEL ADN
Se define como electroforesis a la migraci6n de por-
·-t{ciJlas, cargadas eléctricamente, en una soluci6n bajo el
influj.o de un campo eléctrico. Los métodos electroforéticos
-se--div_iden -en -dos categorías, que dependen de si la separaci6n
se efe~túa en ausencia o en presencia de un medio de sosten
o estabilizador. La electroforesis de soluci6n libre, que
fue la· primera en desarrollarse, presenta muchas dificu1 tndes
que _se-evitan si la separaci6n se efectGa en un medio de sopor
te como un papel, una capa de s6lido finamente dividido como
celulosa, geles de almid6n o de poliecrilamida, polvos de
vidrio, geles de agar, etc. (84).
En la electroforesis convencional, la corriente eléc
trica es conducida por medio del buffer a través de un medio
de soporte tal como el gel o la poliacrilamida. La separaci6n
tfene lugar a :un pll y· fuerza i6nica constantes. Los iones
73
de la muestra_ se desplazan dependiendo de su carga neta hacia
el ánodo-· o cátodo, en el caso de los ácidos nucléicos estos
migran hacia el ánodo debido a su carga neta negativa (84).
La electroforesis a través de geles de agarosa es
el método estandar para separar, identificar y purificar frag
mentos de ADN (fig, 10), La técnica es simple, rápida y capaz
de resolver (resolver = separar a los fragmentos de ADN en
virtud de sus tamañas moleculares) mezclas de fragmentos de
ADN que no pueden ser separados adecuadamente por otros proce
dimientos, como la centrifugaci6n en gradientes de densidad.
Aún más, la localizaci6n del ADN dentro del gel puede determi
narse directamente: Las bandas de ADN en el gel son teñidas
con bajos concentraciones del colorante, intercalante, bromu
ro de ctidio; tan poco como 1 ng de ADN puede ser detectada
mediante observaci6n directa con luz ultravioleta (65).
La migraci6n electroforética del ADN a través de
los geles de agarosa depende de cuatro factores principalmen
te:
a. El tamaño molecular del ADN. Las moléculas linea
les de ADN duplex migran a través de la matriz del gel a velo
cidades inversamente proporcionales a el log10
de sus pesos
moleculares (66) (Véase fig. 11)
b. La concentraci6n de agarosa. Un fragmento de
ADN con un tamaño determinado migra a diferentes velocidades
a través geles con diferentes concentraciones de ogarosa.
Existe una relaci6n lineal entre la movilidad elcctrofor6tica
del ADN y la concentraci6n del gel.
Así pues, al usar geles con diferentes concentracio
nes, es posible resolver una amplia gama de tamaños de molécu-
Fieura 10. Preparacion
de geles de agarosa;
1 - 3 1 preparacion del molde
con báse de vidrio o acri
lico '· en que se formara
el gel;4, colocacion del
"peine" que originara
los p'.l;us en los que se
colocaran lns .~ues".;rfls;
liquiUa¡G y 7, al onrrl~~
:; solidificar la agarosr.
co.1 cuiJ,,Jo p~ra 110 ares
t.~r la integr:t..10.U de los
pozos; 3, se retiran los
1iordt:G clel r.tolde y; 9,
el gel es colocado on la
camara de electroforesis
a
~ ~ 'º
previamente aforada con la solucion buffer de electroforesis; 10,
la enmara de electroforesis se conecta a u11n fuente de poder, con
la cual se establece la fuerza del campo electrico bajo el cual
se llevara a cabo la corrida electroforetica (34).
5
.. o
"' Ti .., o
4 "' ... o g
"' 'O .. Q)
" "' "' .. o
3 ... Q) 'O CJ,':'.
o o,á"" o ...
2 2 3 4 5 e 7
distancig recorrida (cm)
FiGUra 11. Comportamiento electroforetico del ADll en
galos de agarosa en funcion de su tamaño~molocular •
(adaptado de la referencia 84)
75
las de .ADN _ (84),
Cantidad d~:agarosa en
eL.geL·. (%) - -
0~'3 '0;6c
'• 0;'7--'--co .. --~-C'-------1 :2
LS 2;0
e• Conformaci6n del ADN.
76
Rango efic~ente de sepa
ra¿i6n de mol6culas de -
ADN (Kb)
60 -
20 -
io - o.a 7 - 0.5
6 - 0.4
4 - 0.2
3 - 0.1
Fragmentos de ADN del
mismo tamaño pero con diferente conformación {cerrado circu
lar (tipo !) , circular con excisión en una de las cadenas
(tipo II), y lineal (tipo III)), migran con diferentes velo
cidades a trav~s de geles de agarosa (67, 68), Las movilidades
relativas de las tres formas depende primordialmente de lo
concentraci6n de agarosa en el gel pero están también influi
das por la inter1sidad de la corriente aplicada, lo fuerza
i6nica del buffer de electroforesis, y de la cantidad de tor
ciones supcrhelicoidales presentes en la forma I del ADN (69).
En algunas condiciones la forma I migra más r.c'!pido que lo
III; en otras, el orden se invierte. Una forma de identificar
lns diferentes especies conformacionales del ADN es el llevar
a cabo electroforesis en presencia de cantidades crecientes
de bromuro de etidio. Conforme L1 concentrución del coloran
te aumenta, m6s de este compuesto se une al ADN. Las torciones
negativas presentes en la forma I de las moléculas se eliminan
progresivamente, y su velocidad de migrnci6n va decreciendo.
Cuando todas las lorciones negativas han desaparecido, la
velocidad de migraci6n de la forma I alcanza su valor mínimo.
77
Si·- se añade mas bromuro de etidio, Se generan torciones super- -
helicoidales positivas, y la movilidad· de la forma I aumenta
rápidamente.
d. La corriente aplicada. A voltajes bajos'· la
velocidad de migrad6n del .ADN lineal es proporcional al vol
taje aplicado. Sin embargo, conforme la intensidad del campo
eléctrico se incrementa, la movilidad de los grandes fragmen
tos de ADN aumenta diferencialmente. Así es que, la efectivi~
.dad ~~ ia~~epa~aci6n de fragmentos de ADN en geles de agarosa
disminuy-e conforme el voltaje es elevado. Para obtener la
máxima resoluci6n de los fragmentos de ADN, los geles deben
correrse a· no mas de 5 volts/cm. (84).
e. Composición nucleotidica y Temperatura. El com-
port.amiento electroforl.tico del ADN en geles de agarosa no
es afectado significativamente ni por la composición nucleotí
dica dC las muestras (70}, ni por la temperatura a la que
se corre el gel. Así es que en geles de agnrosa la movilidad
electroforética de los fragmentos de ADN de diferentes tamaños
no varía entre 4 y 30 °C. En general, los geles de agnrosa
se corren a temperatura ambiente. Sin embargo, los geles
con menos de 0.5% de agarosa son muy delicados y se recomienda
corr:erlos a 4°C, temperatura a la cual adquieren mayor rigi
dez,
El m~todo mas conveniente para visualizar al ADN
en geles de agarosa es mediante el uso del colorante fluores-
cente, bromuro de etidio (65). Estn sustancia contiene un
grupo planar que se intercala entre las bases del ADN. La
posici6n fija de este grupo y su proximidad a las bases provo
ca que el colorante unido al ADN fluorezca mas que el que
está libre en soluci6n. La radiaci6n ultravioleta absorbida
a 260 nm por las bases nucleicas, transmitida al colorante
78
o a 300 y 360 nm por el colorante
mismo-, se· .. emite a 590 nm en· la regi6n rojo-naranja del espec
tro v"isible. ·cuando la eleé:trofo-resis se ha completado, el
gel es inmer~o en una soluci6n _de bromuro de etidio (Q;S ug/ml)
por 45 mini.itas,, y ·se procede a observar lBs bandas· de ADN
por i~ansilbminaci6n con luz,ultraviolet~ (65).
n. IDENTIFICAáON DE SECUENCIAS GENICAS PARTICULARES
La localizaci6n de una secuencia de ADN en particular
,_(p~; ~~-j. el: gen en estudio) de entre los fragmentos de restric
ci6n-- d~l·-·-ADN- que han sido separados por tamaños gracias o
u_n·li:-~- el~cctror·o-resis- en gel de agarosa se logra por medio del
uso de· dos t~cnicas muy comunes en genética molecular: la
transferencia Southern (71) y la hibridaci6n con sondas génicas
moleculares radiomnrcados: Los fragmentos ya resueltos en
el gel de agarosa son desnaturalizados, transferidos a un
filtro· de nitrocelulosa, e inmovilizados en el. Las posiciones
relativas de los fragmentos de ADN en el gel se conservan
durante la transferencia a el filtro. El ADN unido al filtro
es hibridado a ADN o a ARN radiomarcado con 32r, y la autorra
diografía es empleada para localizar la posici6n de la(s)
banda(s) complementaria(s) a la sonda radioactiva (84).
l. Transferencia Southern (71, 84)
Los fragmentos de ADN ye ref!~e}_tos en el gel de aga
rosa- son desnatilralizandos, volviéndolos de cadena sencilla,
mediante inmersiones repetidas del gel en una soluci6n 0.5
M de NaOH. Enseguida el gel se coloca encima de un papel
filtro cuyas orillas estén inmersas en un recipiente que con
tenga una solución salina concentrada (fig. 12). Encima del
gel se colocd una hoja de papel filtro de nitrocelulosa previa
mente humectado y encima de esta se colocan varios papeles
Fif;ura 12. Metoclo para transferir AD'.l ele geles de agarosa
a filtros de nitrocelulosa (transferencia Southern). El
buffer establece un flujo capila1• desde el deposito hacia
los papeles absorbentes arrastrando consigo a loa rragmen
tos do /Jlll que se adsorben a la nitrocelulol>a (34).
79
ESTA TESfS SAUI D(· LA
H6 Dm BISUITECA
80
' -absorbentes· con un- objeto pe,;~-do rematando el .conjunto (fig.
12). · La. soluci6n: saHna >estable.ce un flujo capilar: del r~d::pie.~te que -ia -~on~iene. hacia los papeles absorbentes, a .. ~ravés_ del" gel - y del filtro de nitrocelulosa, y en _el p_rocesci
acarrea al ADN de una sola hebra del gel hacia el: fÚtro; de
nitrocelulosa. Después, de 12-24 .horas de t·~ansfer~nci:a·,,· .los
fragmentos de -ADN. se encuentran ya ·adsorbidos_·· al: ·filtro-.; de·
'nitrocelulosa. Un h.orneado posterior de los ,fili:~os/ ·a· ·ao•" C durante 2 'horas, estabiliza la uni6n filtro"."ADN.
- - -·· ·.·
El ADN "de· cadena sencilla unido a. -la· nitro~elul~sa" aún··· pu~de c--_ªP~rJa~-~~··- a·- ··s~~úe~-c-1á~ comp-1e~e-n-fa·r-i1is ~-~~-e--~-.ADN; -uñ. -
proceso llamado hibí-idáCi6n.
2. 'i1i~~i~a:~6'.ri; con -Sondas ·Génicas Moleculares
Una vez que se cuenta con una réplica en nitrocelulo
sa de los ff"agmentos resueltos, de la restricci6n del ADN,
se requiere localizar e identificar al gen particular que
deseamos estudiar. Para lograrlo se requiere contar con un
fragmento de ADN que sea complementario a la secuencia, o
a parte de ella, del gen en estudio. A este fragmento de
ADN se le llama sonda g6bica molecular (en adelante referida
solo como sonda) y debe de estar radiomarcada para poder ser
visualizada. De esta manera, cuando se pone a la réplica
en nitrocelulosa del ADN en uno solución de la sonda, esta
Última se apareara por complementnriedad (hibridara) con el
gen de interés, y a6lo con el, y la posici6n del hibrido puede
determinarse mediante la autorradiografia.
Sondas Genéticas Moleculares
·Una· so~da :sénica molecular 'puede ser definida 'como
un ác_idó.nucléico: radioactivo de_ ca_dena sencilla que 'es empleado
_---·::;\:_:__._ - .. ·- s-oi.t~~·-~:·c-o-nO_c_e------1a·· s-ecüencia aminoac idica, total o par
ci,8!'• :de 18,:,"pr'o'úÍn~ codificada por el gen de interés, la
.cd-~·~-'es};·ci'ódie~t-~>.s-ec.~encia del ADN puede ser inferida gracias
· ·-~a.1:~-~~~ .. o~-~{.1:~¡-~~-~~: .. dé.--que triple te codifica para cada aminoácido
·.-:--(1·2·;--.:_:--·~;-:EO'=-·:·;e·s~~~cio, se estudia lo secuencia de la proteína : -:· ~ - ..
en.\_bu~.é-~ ·d·e -áreas ricas en aminoácidos codificados por sólo
un·:,~,od6'~ (po',, ej. metionina, AUG; trp, UGG) o a lo más por
ti_dina·, CAU, ·cAC). Conociendo la frecuencia con la cuol se
--·_emp.lean diferentes codones degenerados (p. ej. glutamina es
us_µ~lm~~te codificado por CAG) y aprovechando los aparcamien
tos G:T, a menudo es posible reducir la lista de oligonucleb
tidos Posibles a una cifra manejable. Estos oligonuclc6tidos
son entonces sintetizados in vitre, mediante una serie de
reacciones químicas en cadena que van añadiendo un nucle6ti-
·- ·d·~- en--cada ciclo, ya sea por el método del fosfodiester (73)
o ·el mas eficiente del fosfotriester (74). (Para una discu-
si6n completa de estos métodos v~ase la referencia (75).
Una vez que se ha sintetizado químicamente a aquellos
oligonucleonútidos que representan todas las posibles combina-
e.iones codificantes para una
aminoacldica de la proteína
pequeña porci6n de la secuencia
de interés, se requiere saber
82
cual ___ de e·11o·s fOrma un -dúplex perfectamente ap_areado con la
secuencia del ADN gen6mico. Ya que los .oligonucleótidos
que no sean 100% complementarios al ADN gen6mico sufrirán
de errores de apareámiento, si las cciñdiciOries de hibridaci6n
se h~~en severas, s6lo los duplex perf~ctamente complementarios
serán estables y de esta manera podremos eiegir al oligonuclho
tido .que nos servir& como sonda.
Sintesis de ADN copia
La conversión enzimáiica j~l ARNm poliA en ADN copia
de doble cadena es una herramienta fundimental de la biología
molecular de los eucariotes. El procedimiento más com6n para
sintetizar copias de ADN de doble cadena a partir de ARNm
conste de los siguientes pasos: síntesis de la primera cadena
de ADN copia gracias a la transcriptasa inversa (ADN polimera
sa dependiente de ARN), remoci6n del templado de ARN por degra
daci6n alcalina 1 sin tesis de la segunda cadena de ADN con
la ADN polimerasa I de g. sill (usando como cebador para ini
ciar la síntesis un pasador formado en el extremo 3' de la
primera cadena de ADN copÍa), finalmente, la digestión,
con la nucleasa Sl (especifica de cadena sencilla), de la
conexión covalente que liga a la primera con la segunda cadena
de ADN copia (90).
Una c6lula tlpica de mamífero contiene alrededor
de 10-5 microgramos de ARN, del cual 80-85% es ribosomal
(285, lBS SS), 10-15% esta constituido por una variedad
de especies de bajo peso molecular (ARN de transferencia,
ARN nuclear, etc.). Todos estos ARN5
son de tamaño y secuen
cia definida pueden ser aislados mediante electroforesis,
centrifigUaci6n en gradientes de densidad, o por cromatogra
fía de intercambio i6nico. En contraste, el ARNm' que consti
tuye entre un 1 y un 5% del ARN celular total, es heterogéneo
83
tant·ó en tS'maño comO :en. SéC:ueíl¿i~-/ Sf~:':~mbargo·J----vii:tue~ment~ tod-~s los ARN · df? mamíf,~ros- · poS·~en··::_·e~\-~u ~,~-"xt~e'~o: 3' un .residuo
poliadenil ico m que.• per~ite alslarl.~ •• media~te. cromatografía
de afinidad 'en una 'colu'm~a; con ~e_lüló:~:a 'llgada a deoXioligoti-
midinas (90);
Una forma'·. 'pr·á.cticá de ·iniciar el aislamiento del
ARNm, dé .{~fe~é( ~s ''¡jaftie~do de polirribosomas (grupo de ribo
~~omas. ·~n~~d.~-~;- p~r una· ··larga molécula de ARNm) provenientes
de -·Ú·n·a-·:_ ;c'é"ful~- e~p-ec·ializada , que transcriba activamente el
Figura 17. Curso de la accion aotiurl.crobiafla del "1edi-
camento clornnfenicol. El medicaljlento rue añadido en el
momento tle crecimiento expouencial, co::10 señaln.n lns
flechas (91).
90
91
tante de la restricci6n, ADNc y plasmido linearizado, es sujeta
• electroforesls en un gel de agarosa de bajo punto de fusi6n.
Con bromuro de etidio ~ luz ultravioleta se visualiza l~-~~pa
raci6n del inse-rto y del plasmido linearizado y se corya la
por¿i6n ~el" gel en que se encuentra el inserto. E•t~ fr~gmen~ to :,dél gel es sUjeto a extracciones con fénol -"y Ci~r¿-f_¿-r~;nd, quedá.ndo_ en lo fase ?CUOSB e.l ADNC puro qu~ e~ c'·a'nc~ó'tr~'do por precipitaci6n con etano_l (81)._
-Pára que el ADNc sirva como sonda en la identifica
_:ci6n ;-.-de·- un· .. gen en~ pa"rticular de entre los varios presentes
"e.~ -:·~_a, r_~pÚ.-ca de nitrocelulosa, se requiere que esté marcado
i-adioactivamente para su visualizaci6n. El marcaje radioacti
vo ·de la sondo se realiza por el m6todo de traslaci6n de la
- ruptura (nick translati6n): La ADN polimerasa I de Jl_. coli
añade residuos nucleotldicos al extremo hidr6xi lo 3' que se
crea cuando una cadena de una molécula bicatcnario de ADN
sufre una ruptura.
exonucleolitica 5 1
5' de la ruptura.
Además, la enzima, gracias a su actividad
3', puede remover nucle6tidos del extremo
La eliminaci6n de nucle6tidos del extremo
S' Y la adici6n secuencial de nucle6tidos al extremo 3' resul
to en el desplazamiento de la rcuptura (traslaci6n de la
ruptura o nick translation) a lo largo del ADN (82). Si se
reemplaza a los nuclcótidos preexistentes por nucle6tidos
radioactivos, es posible preparar ADN marcado con 32 P (83)
(figura 18).
Hibridaci6n
Así pues, cuando se cuenta con una réplica en nitro
celulosa de los fragmentos de restricci6n del ADN, resueltos
por tamaño molecular, y una sonda radi.omarcada para identifi-
11 11 1111111
! ruptura en una cadena por la AD:iasa I
5' + 3' 3' '] 1 1 1 1 1 11 11 1 1 1 5'
I
ADN duplex escindido +
ADN polircerasa +
4 d NTPs (uno Je ellos marcado con 32p)
i ""'"" '";'."'" 1 1 11 1 1 1 5'
92
5'
3'
... ,.,.J.,,., ,, 1 11 1 1 u 1. 11 l 1 [ 5'
ADi! eacindi do, radioma.J: cado
Figura 18. Diagrama que ilustra la translacion de la
ruptura en el ADH. J..a ADN polimerasa I produce una
incision o ruptira en una cadena del ADN, a part"lr
ele este punto la 01dena puede ser clagrarlada, y re-
puesta por sintesis con nuevos nucleotidos (90).
93
car· al gen de interés, se procede a realizar la hibridaci6n.
Esta se realiza en un medio liquido salino y durante un perio
do de tiempo que depende del tamaño de los f ragmcntos de res
tricci6n, la actividad radioactiva específica de la sonda
(cpm/ug), y de la cantidad de sonda adicionada. Si la secuen
cia complementaria a la sonda se halla en la réplica de nitro
celulosa estas hibridarán. Y si sobre la r~plica de nitrocelu
losa, ya hibridada y lavada (para que s6lo la sonda que haya
hibiidado permanezca en ella), se coloca una placa radiográfi
ca,, en esta se imprimirán la o las bandas correspondientes
al gen.de interés (autorradiografia) (64).
Por Último, un resumen del proceso seguido pera iden
. tificar- ~-~\:_·p.~~~e,ncia de una secuencia g~nica especifica de
entre el.-~otal.de un genomio eucarionte se muestra en la figu
ra
Para :mayor. informaci6n sobre las t~cnicas de genética
molCcUlar' t<Su .~ ·,"8plicaci6n clínica / consultar las referencias
64-90.
LeucocÚos ,nlsnlados de
ann~e O PlasmiUo recombinante conteniendo al gen on ostud
0
io
ADll oxtraldo ~ ~igorido -e·c1n áriziinns de restriccion
! Liborncion dol e;on del plns~ido para au
uoo como noncl:l
Origen
ADH cli¡¡erido y
separado p0r electroforesis en e;olos do agnr : 11 t T '. ll I T._____.: T.__,..._._,:
t Trnnororoncia Ilit•ridHcion ílovolndo de lns l Southern con nonda bnnd.1s hibrltlndna
Mnrcat1oros do rndiomo.rc3dn por· nutorrn.dio-peso 1ooleculor
Figura 19. Diaer,111\a qua respresenla loo ditürenteo procoooo oocuidos para ln identificncion de un gen ospecirico de entro •l genomio com
pleto de un eucorionto ($5).
grafin Loa benJ.1s <lo la
aurorrmlioern fin c.Q.
rrooponden n los rrn,&
mentoo que contienon al t;on do. !nteres
IV. DIAGNOSTICO DE HEMOGLOBINOPATIAS Y TALASEMIAS MEDIANTE TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR
95
LaS técnicas de genética molecular, expuestas en
páginas anteriores, han desempeñado un papel muy- importante
en el campo de la genética clínica en los 6ltimos años,
estas nuevas metodologías han permitido el
los -mecanismos moleculares que subyacen en
algunas hemoglobinopatías, la detecci6n de
discernimiento de
la etiología de
portadores de las
mismas y el diagnóstico prenatal de fetos en riesgo de padecer
las (92).
El empleo de las técnicas de genética molecular por
divei-sos grU.pos científicos de trabajo, en diferentes sitios
y ~omentos, ha dado lugar al surgimiento de varios enfoques
experimentales dirigidos hacia el mismo objetivo (el análisis
molecular de las hemoglobinopatíos), en donde, obviamente
los enfoques mas recientes se enriquecen con el contenido
y experiencias de los anteriores. Los protocolos experimenta
les de estas metodologías comparten elementos comunes: todos
dependen de la digesti6n (fragmentaci6n o restricci6n) de
las muestras de A .D.N. con cndonucleasas de restricción, la
separaci6n de los fragmentos generados mediante electroforesis
(resoluci6n) y del uso de A.D.N. 's marcados radioactivamente
para estudiar los patrones obtenidos de las digestiones ya
resueltas (análisis de los fragmentos de restricci6n). Sin
embargo, debido a que cudn metodología posee una base te6rica
propia existen diferencias en los detalles de la realizaci6n
de cada protocolo. Estas incluyen diferencias en las estrate
gias de restricción enzimática del A.D.N., en el tamaño de
los A.D.N.s empleados como sondas --largos A.D.N.c u oligomeros
nuclcotidicos cortos para el análisis de los fragmentos
de restricci6n, asi como en las características de los geles
empleados para la resoluci6n. de los mismos.
La suma de estas variaciones determina el que cierta
metodología resuelva el problema de la identificaci6n del
defecto genito molecular directa o indirectamente. Y para
facilitar el análisis o integración de los resultados, que ..
estas metodologías han aportado al conocimiento de las hemoglo~
binopatías, en este trabajo se los han organizado en dos grupos
y sus respectivos subg~ripos:.
A. DETECCION INDIRECTA.· DE LOS. DE.FECTOS MOLECULARES EN. LOS GENES CODIFICANTES
hibridaciones.diferenciales.
A. DETECCION INDIRECTA DE LOS GENES DE LAS GLOBINAS
Polimorfismos en el tamaño de los fragmentos de restricci6n.
La primera de las metodologías es, como se señala
en el encabezado del capítulo, indirecta y depende de la aso
ciaci6n de cierta mutaci6n puntual con un polimorfismo del
A.D.N. Por ejemplo, si una enzima de restricci6n corta al
A.D.N. a ambos lados y en el medio de una secuencia que es
reconocida por una sonda específica para esa secuencia, en
una autorradiografía se observarían dos bandas. Si el sitio
de restricci6n intermedio se perdio a causa de una mutaci6n
97
·en uno_ ·.de_, __ los c~-omosoMas >del par·, 18 perso~a_ portadora de
e_s_o_s '.~·ro~~so~_aS m~straria - un patr6n ~e los · fragm~ntos de res-
- tricci6n difer~nte del normal (fig< 20). Uno de los cromosomas
ge'nerar_i8 :solo una banda que hibridaria con su sonda especifica
y· ·el~ otro -cromosoma produciría los dos fragmentos típicos.
A le_~< va~ieciónes presentes en el A.D.N. que son detectables
por ~l análisis de los fragmentos de restricci6n se les llama
polimorfismos en el tamaño de los fragmentos de restricci6n
(92). Da.tos de secuenciaci6n del A. D.N, humano sugieren que
en, aPro~imadamente 1 cada 100 o 200 nucleotidos de les regiones
del _A.D.N., no involucradas con la codificaci6n de proteínas,
e~iste un sitio. polimorfico que no causa ningun defecto aparente
en-los individuos (93, 94). Este elevado nivel de variaci6n
en las secuencias que flanquean al A.D.N. codificante puede
producir que cada cromosoma de un par origine un patr6n distin
tivo ·en el análisis de los fragmentos de restricci6n, Esto
e- su vez permite el que se pueda determinar cual cromosoma
de un par se heredo a la descendencia.
Para ser Útil en la asignación de un cierto gen a
determinado cromosoma, el sitio polimorfico debe de estar
suficientemente cerca del gen en estudio de tal manera que
ambos se hereden de manera ligada. Pero debido a que la fre
cuencia de ligamiento entre un gen y cierto polimorfismo nunca
es del 100% esta metodología requiere un estudio familiar
para determinar el patr6n de segregaci6n génica de los fragmen
tos de restricci6n polimorficos entre los miembros de una familia.
- Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricci6n
originandos con Hpal.
Relaci6n con el gen .de la. g_i:~bi~a beta _s
En 1978¡ K¿n t•~az~,(9S);••1•me.Íi'ante el mapéo con enzi-
98
(A)
z y
~ J. J. ~Electroforesis
Kb
' X
i que~ncela
~ mutacion un sitio de restriccion
(B)
Figura 20. Si el cambio de un nuclootido en uno de los cro
mosomas produce la ral ta del sitio de reconocimiento de la
enzima de restriccion, los fragmentos (A) mostraran un pa
tron electrororetico diferen'·e del nor1nal (B). X,Y Y· Z su-
puestos tamaños de los fragmentos de restriccion en kiloba-
ses (Kb)(92).
X
z
y
mas_ de traron
de la
99
restricci6i ~e los genes de las-globinas huma~as, _enc~n.·u~a"· ·.Vat-.f8ci6ñ genética en .un sitio de r~conoc~miento -
endoiíucleasa de restricci6n HpaI, que corta el A.D.N.
en.~e secuencie.GTTAAC, hallado e 5000 nucleotidos del extremo
3 1 del ien-esti~cturel de la globine beta.
Cuando el A.D.N. normal es digerido con _le enzima
Hpal, el gen estructural de la globina beta se Cf!CUentl-a en
~~ .• 2¿·: ~· -Uso ~n .ei: estud.io. de la .e.voluci6n de
binas:·sy··c enla: póbl8d6n mundial.
los genes de las hemoglo-
Lás . mutaciones beta S y beta C afectan al codon GAG
(G, guanina; A, .adenina) que codifica para el ácido glutamico
como sexto aminoacido de la cadena de la globina beta (99).
La mutaci6n beta S esta dada por GUG (U, uracilo) (codon para
Valina), y la mutaci6n beta C por AAG (lisina). Los genes
de beta s y de beta e seguramente surgieron independientemente
a partir del gen beta A ya que la tronsici6n de A a S o A
a C involucra el cambio de un solo nucleotido, mientras que
una mutaci6n S C necesitaría el cambio de 2 nucleotidos por
triplcte lo cual es altamente improbable. Ya que tanto el
gen S como el C estan ligados a el fragmento Hpnl de 13.0
Kb, Kan y Dozy concluyen que la mutación que produjo la varian
te Hpal de 13.0 Kb surge antes que los mutaciones para las
hemoglobinas S y C, las cuales surgieron despucs, por separado
en cromosomas que contenian la variante Hpal de 13.0 Kb ( 11).
La anemia falciforme puede encontrarse en Africa,
la regi6n mediterránea y Asia. Para determinar si en todas
ellas existía el ligamiento entre el fragmento Hpal <le 13.0
Kb Y el gen, S, Kan y Dozy extendieron sus estudios o Sicilia,
Chipre, Gnbon, Kenia, Snudia Arabia e India ( 4)(Tabln XlI).
En Sicilia le asociaci6n si se presenta y en proporción eleva
da. En cambio en Gabon (Africa Occidental), Kenia (Africa
Orientál)¡ s.~údiaArabia e I.ndia el gen S e~ta daso'ciad~ al f;agmento ·HpaI'. de. 7 ,6·Kb (Tabla . XII y l'fg,;.24)i .-
¿~s ~atoa. anteriores sobre la •Jli~tri~~din ~e~g¡¿~ica de lo,; áagmeátos HpaI asociados a' los 'gen.es s.·y e· pe;~úier6n elabot~r un arbol evolutivo de los Sitios HpaLy Ú su re1Bci6n
c0
on los genes de las globinas A, S y C_ .. (Fig,''25)( 4); En
la· mayor parte de la poblaci6n mundial, el gen de lá globina
beta. esta normalmente asociado al fragmento HpaI de 7 •. 6 Kb.
En Africa Occidental, una mutaci6n que afecto el sitio de
reconocimiento HpaI hallado al extremo 3' del gen de la glóbina
beta produjo un fragmento HpaI de 13.0 Kb (A-13.0 Kb). Las
mutuaciones S y C surgieron independientemente, cada una en
un cromosoma que con tenia la variante de 13.0 Kb (S-13.0 y
C-13.0). Una mayor proporci6n de fragmentos S-13.0 y C-13.0
que de A-13.0 se propago debido a que los genes S y C protegen
contra la malaria y asl aumentaron su frecuencia sobre A-13.0,
que no ofrecía ninguna ventaja selectiva. Parece ser que
despues el gen S ligado al fragmento HpaI de 13.0 Kb se propago
hacia Africa del norte y el mediterraneo. La asociaci6n entre
el gen S y el fragmento Hpal de 7,6 Kb en la poblaci6n Asiatica
favorece la conclusi6n de que la mutaci6n Asiática surgía
independientemente de la Africana ( 4).
Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricci6n
obtenidos con BamHI.
Cuando el A.D.N. humano es digerido con la enzima
de restricci6n BamHI, que corta en la secuencia GGTACC (T,timi
na), hibridado con una sonda radioactiva complementaria
al gen de la globina beta, se observan dos fragmentos (ya
que contiene un sitio de corte BamHI intragenico) uno de 1.8
Kb que contiene el extremo S' del gen de la globina beta y
otro de 9.3 Kb que contiene el extremo 3', un intron de aproxi
madamente 850 nucleotidos de largo y las secuencias no codifi-
-talasemia esta. sieoipré ligado al fragmento BamHI de 9.3 Kb.
Asi pues en esta poblaci6n Sarda el hallazgo del fragmento
BamHI de. 22.0 Kb, en el A.D.N. de un feto en riesgo de betaº
-talasemia, elimina la posibilidad de homocigosis para la
enfermedad (101).
La explicaci6n mas plausible para la invariable aso
ciaci6n del fragmento BomHI de 9.3 Kb con el gen de lo betaº
-talasemia es la de que la mutaci6n que dio lugar al gen de
beta 0 -talnsemia en la poblaci6n Sarda ocurrio en un cromosoma
que poseia el fragmento BamHI de 9.3 Kb (fig 28)(101).
Desafortunadamente en familias en las que tanto el
gen normal como el anormal estan asociado5 con el mismo frag
mento de restricci6n, esta metodología no es Útil para estudiar
a la descendencia a menos de que exista un segundo polin1orfismo
en los tamaños de los fragmentos de restricci6n. Tal fue
el caso que reportan Phillips y colaboradores (102), cuando
al intentar el diagn6stico prenatal del producto de una pareja
de negros americanos mediante el estudio del polimorfismo
de el sitio Hpal (95,96) se encontraron con que no era posible:
De la pareja de padres portadores uno presentaba un patr6n
llpal de 13 .0/7 .6 Kb mientras que el otro tenia un potr6n de
7.6/7.6 Kb. Lo pareja tenia un hijo previo afectado de anemia
falciforme cuyo patr6n Hpal era 13.0/7.6 indicando que el
fragmento Hpal de 13.0 Kb contenia el gen de beta globina
s (fig. 29).
Como se observa en la figura 29, el feto en estudio
habia recibido de su padre el fragmento Hpal de 13.0 Kb ligado
al gen S, Y un cromosoma 7.6 de su madre, pero lera el cromoso
ma beta S· o el beta A? en este caso el polimorfismo lipa! no
era· informativo.
115
'13º talasemia/ 9.3
A 9.3
A 22.0
Figura 28. Arbol evolutivo de los genotipos de globinas
beta y los rragmontoe ~e restriccion de la enzima llam HI
en la poblacion Sarda (101).
AS AS ¿ AS o SS
11G
SS
Figura 29. Allll restringido con Rpa I e hibridado con una sonda para el gen de la globina beta. Carriles: M, madre; P, padre; A, amniocitos; H, hijo primogenito afectado con anemia falciforme. El fenotipo hemoglobinico ae indica~ bajo de cada carril (95).
M P A H
·BBBB AS AS ¿ AS
o SS ?
SS
Kb
?.8
?. ,
Figura 30. ADN restringido con Hind III e hibridado con una sonda para el gen de la globina gama. Carriles: M,
madre; P, padre; A, amniocitos; H, primogenito afectado.
El fenotipo hemoglobinico se indica abajo de cada carril
descrito p·~e~·i:~:m~~·~:~ .: ... ,~'~ ·-~:p_ol_:i:nior_fismo, enzimíi .de.· r~·s~rt"~Ci6n. IÍÍmdIII en el
Jef f reys (93)
en el A.D.N.,
gen estructural
habian para la
de la
:::b7¡: .·.::~tiit:0
i~cutLt su c;::does :: :::::em::t:. ~~~:dohu:.:~ con Ú ~nh~~·;·Hiiiºc!tri y se hibrida con una sonda radioactiva
p~~a·.-:-re\:·._i~~?'dc!·:-,la ... 'glÓbina gamma, puede encontrarse al gen
de J.~-, gl.obirfa gamma en un fragmento de 7 ,8 Kb o en uno de
7. l. Kb ií.egun ,·el sitio de restricci6n para llind III este ausente
. . .PhilHps y colaboradores (102) procedieron a digerí r
el A;D.N. de los miembros de la familia en estudio con la
e~zi'!la "Hindlll encontrando lo siguiente: La madre presentaba
el patr6n 7,8/7.1 el padre el patr6n 7.l/7.1, el hijo afectado
7,8/7,l y el feto 7,1/7.l (Fig. 30),
El hijo afectado dcbio recibir el cromosoma con el
fragmento llindIII de 7 ,8 Kb por parte materna puesto que su
padre tiene el patr6n 7.1/7.1; ya que el niño es homocigoto
SS entonces en su madre el gen beta S se encuentra ligado
al cromosoma con el fragmento llindlll de 7 ,8 Kb. El hecho
de que el feto presente el patr6n 7. l/7 .1 nos indica que por
parte materna rccibio el gen beta A y por lo tanto el diagn6s
tico definitivo es el de portador del gen beta S (102). Usando
este mismo enfoque ha sido posible diagnosticar exitosamente
el genotipo de fetos en riesgo en casos en los que un solo
polimorfismo no es informativo (104, 105, 106).
Polimorfismos Originados con Ava II
Para el diagn6stico de la beta-talasemia, por med1.o
113
de polimOrfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción
en iridividuos del mediterraneo (Chipriotas, Griegos, Italia
nos. y ·Malte~es) se cuenta con un nuevo polimorfismo evidencia
ble con la endonucleasa de restricci6n AvaII ( 107). Cuando
el A.D.N. de estos individuos es restringido con la enzima
AvaII e hibridado con una sonda específica para el gen de
la globina psi-betta (pseudogen situado cerca (en términos
de· ligamiento) al gen de la globine betta), se observan varios
patrones en los fragmentos de restricci6n (Fig. 31). Estudios
familiares mostraron que hay tres tipos de individuos, de
a~uerdo a la herencia Mendeliana¡ homocigotos para los fragmen
tos menores de 1.1 2.8 Kb (genotipo +/+, carril 3, fig.
31)¡ homocigotos para el fragmento mayor de 3.9 Kb (-/-, carril
2, fig. 31); y hetcrocigotos que presentan los fragmentos
de 3.9, 2.8 y 1.1. Kb (+/-, carril 1 y 4, fig. 31). Estos
resultados muestran que la prcencia del sitio polimorfico
AvaII resulta en la escici6n del fragmento de 3.9 Kb en dos
fragmentos menores de 1.1 y 2,8 Kb respectivamente (107).
En estudios epidcmio16gicos se demostro que la ausencia del
sitio AvaII-psi-betta en el A.D.N. de individuos del mediterrá
neo, lo que origina el fragmento de 3.9 Kb, es raro en los
cromosomas normales (3.9%) y es mas frecuente en los cromosomas beta-talasemicos (22.3% en Italianos 71% en Chipriotas)
(108), lo que ha permitido exitosos diagn6sticos prenatales
de fetos para los cuales otros polimorfismos (101) no son
informativos (107).
Polimorfismos originados por delcciones o adiciones
Existen, también, casos en los cuales hay variaciones
en los tamaños de los fragmentos de restricción, pero no debido
a la presencia dimorfica de un sitio de restricci6n ligado
al gen de interés sino por raz6n de haberse sufrido una. dele
ci6n o una inserci6n en el locus en estudio.
2 3
+!- -1- +/+
119
Kb
3.9
2.8
1.1
Figura 31. Autorradiogrnfir, mostrando ejemplnres de
AD:I ( 1-4) digerido con Ava II e hibridado con una sou
da especifica para el pseudogen psi-beta. El genotipo
de cada muestra de AD~ se indica abajo de caJa carril
(107).
120
. .. . . -
cu'ando·. el .A.D;N •. de individuos sanos; nó talasemicos,
es .restringido· éon', la .enzima .de restriccion PstI e hibridado
con· ·una. so_nda .especifi.ca para el gen de la globina betta se
observa una han.da de 4.4 Kb que contiene el gen de la globina
, beta (109) Un tipo de gen talasemico betaº común entre los
hindúes es aquel que presenta una delecion de 700 pares de
- bases¡ e que incluye una porci6n del intron mayor del gen asi
como el extremo 3 1 codificante (110) (Fig. 32), Cuando se
digie_re el A.D.N. de individuos portadores u homocigotos para
este ~en de heta0 - talasemia y se hibrida con la sonda espe
-dfica «para globina beta, se evidencia un fragmento de 3. 7
Kb, en lugar del fragmento normal de 4.4 Kb, conteniendo al
gen de la globina beta (Fig. 33)
- Delecion de Génes'Completos
Los genes de la globina alfa estan, normalmente dupli
cados esto es que hay dos genes de globina alfa en cada cro
mosoma 16 (111). El A.D.N. genomico, de individuos normales,
al ser digerido con la enzima BamllT e hibridado con una sonda
especifica para el gen de la globina alfa, revela un frag
mento de 14 Kb (112). Este fragmento de A.D.N. contiene ambos
genes de la globina alfa. Asi pues, sujetos no talasemicos,
tienen tal fragmento en ambos cromosomas y mostraran un patron
de 14.0/14.0 Kb (fig. 34).
EN la poblaci6n negra americana se ha calculado que
hasta un 20 o 30% de los individuos poseen un cromosoma con
un solo gen de la globina alfa (113). Cuando el A.D.N. de
un individuo heterocigoto para un cromosoma 16 normal {alfa,
alfa) y un cromosoma 16 con un solo gen de globina alfa (alfa
se digiere con BamHI e hibrida con la sonda específica para
! ,, J, 5' cu/ 3
1~00.;.--..
¡ / ' I
l ff I/ i 5' ar
Figura 32. Defecto molecutax .te un tipo 1le gen beb."
-talasemico presente en los hindues. Las flechas in dicen los sitios de reatriccion de la endonucleaaa
i1at I ('10).
121
2 3 Kb
4.4
3.7
Fi¡;ura 33. AD:; restringido con Pst I e hibridado con
la sonda para el gen de globina beta. Carrlles: 1,
homocigoto betaA/betaA; 2, heterocigoto betaA/be
ta0; 3, homocigoto beta0/beta°C110).
122
123
'({
ll' 1 ~
5'~3' t 14 Kb t
...t --t 1 ~ .........
~ 11 ll' 1
~ \' 't
5•-:-@--::--- 3' t 10 Kb t
.-
5
5t.-................ .,_ 3'
Figura 34. Diferentes cromooomaa 16 que tienen cero,un~ 1 das,
o tres genes de la globina alfa. Las nech;:;s indican sitios
de restriccion Bnm HI. Las bandas se obtienen al restringir
el ADN con Bam HI e hibridarlo con una sonda para el gen de
la globina alfa (103).
Kb
:s.o
14.0
10.0
el gen de la ·g1obina alfa, se observan tanto el fragmento
normal de 14.0 Kb como un fragmento de 10 Kb, que es el resul
tado de la delecion de uno de los genes de la globina alfa
(113) (Fig, 34), De forma similar se han reportado casos
en los cuales han encontrado cromosomas 16 sin un solo gen
para globina alfa (113,114) dando como resultado el sindrome
de la hemoglobina 11 (heterocigotos para un cromosoma 16 con
un solo gen de globina alfa y un cromosoma 16 sin genes de
globina alfa (alfa,-/-,-), en estos casos existe un solo gen
funcional para globina alfa por celula diploidc y solo se
observa el fragmento de lOKb en el análisis de los fragmentos
de restricci6n con Bam!II. Este fragmento de 10 Kb representa
al único gen de globina alfa (Fig. 34).
- Adicion de Genes Completos
Un cromosoma 16 con tres genes de globina alfa ha
sido reportado también (115), El fragmento de A.D.N. que
contiene tres genes de globina alfa es de 18 Kb, en vez de
ser de 14 Kb, al ser digerido con Bam!II (Fig. 34),
Este nuevo cromosoma se encuentra en la poblaci6n
negra americana con una frecuencia de 0.0036 ;entre los grie
gos con una frecuencia de O.OS y no se le hallo entre los
Sardos. Los heterocigotos para el triple locus del gene de
la globina alfa con cinco genes de globina alfa por celula
diploide (alfa, ulfa, alfa/alfa, alfa) no muestran manifesta
ciones clínicas anormales (115),
El origen tanto de los cromosomas con un solo gen
para la globina alfa., como para los cromosomas con tres de
ellos puede explicarse por un entrecruzamiento no balanceado
(116) (Fig. 35), Este proceso debe de producir igual número
de cromosomas con un solo gen de la globina alfa como de cromo-
125
sOmas con el locus triplicado. Sin embargo, como se observa
en la tabla XV en las poblaciones negras y Sardas, la frecuen
cia del cromosoma (alfa,alfa,alfa) es muchisimo menor que
la del cromosoma (alfa,-), Esta di fercncia sugiere que el
cromosoma (alfa,-) es ventajoso evolutivamente, La prevalencia
de la alfa-talesemia en las áreas donde la malaria es endémica
sugiere que, por algún mecánismo, aún no definido, la alfa
talasemia protege contra la malaria (115).
12G
B
5'~3'
t 14.0 Kb T
Figura 35. Entrecruzamiento no balanceado: Es un mecanismo comun
de delecion o adicion de moterial genetico. A, entrecruzamiento
no balanceado intercromosomal entre los genes de globina alfa
explica tanto al cromosoma con un solo gen de e;lobina alfa como
al que lo tiene triplicado. B, entrecruzamiento intracrJbmosomal
en la region de los genes de globina alfa explica solo al cromOSQ
ma con un unico gen de globina alfa(115)
127
TAll;..A_XV. L~ frecuoncin de el cro~ooJ~~ con t:e3 genes de slob1na al!a(a,a,a) y del ·'l'lC tieC'O UIÍ SOlO gen (a,-) se muestran en di-ftrO!lhS poblacio;1c=. ( 115)
Poblacion Frecuencia Re foroncias a a a a -
:\t;tros /.mcr1canos :.o::::;6 0.16 (115, 117)
Surdo o ~.004 o. 13 (115)
Griccos 0.05 0.07 (115.11R)
128
B. DETECCION DIRECTA DE LOS DEFECTOS MOLECULARES EN LOS .GENES
CODIFICANTES PARA LAS GLOBINAS.
l. Mutaciones Puntuales que Afectan ~itios de Restricci6n
Conocidos.
Esta mctodologia depende directamente de la mutuaci6n
puntual que convierte al gen funcional en inactivo. Si la
mutaci6n crea o destruye un sitio de restricción, el ADN gen6-
mico puede ser estudiado directamente con la enzima de restric
ción especifica para ese sitio. Para visualizar los patrones
de los fragmentos de restricción esta metodologia como la
primera, emplea ADN marcado radioactivamente como sonda.
El ADN sonda detecta el (los) fracmento(s) gencrado(s) y aso
ciado(s) al gen normal asi como el (los) nuevo(s) fragmento(•)
gencrado(s) y asociodo(s) con el gen mutado. Este acercamiento
es más simple y directo que el de los polimorfismos en los
fragmentos de restricci6n ya que no necesita estudios familia
res. Sin embargo, esta más limitado en su uso, ya que no
todas las mutaciones afectan a un sitio de rcstricci6n conocido
A continuaci6n describiremos los resultados que se
han obtenido al aplicar esta metodologla al estudio diagnóstico
de varias hemoglobinopatias como:
Anemia Falciforme
En 1978 Niehuis sugirio que la mutoci6n responsable
de la Anemia Falciforme (CCTGAGG que cambia a CCTGTGG en el
ADN y que· origina que el aminoácido Valina en la posición
seis de la cadena de la globina beta sea sustituido por el
Acido Glutamico) podria ser detectada directamente con la
129
--· - .. •"'
. . ·- - -
-: . . - "·. ,,
-. 'o - ·'" _,• -~~
endonuClea~.a·· de·'·~~~t~·icc~b~ -Mrii ·:r, la cual reconoce la secuen
cia GAGG.,i.<11.9) •.. ··Esta secuencia esta presente diez veces en
ei· .. g1ú\·. de< la '.globina beta de individuos normales sanos y solo
n~~v~ vec~s·~~ el~gen de la globina beta falciforme, originando
asl. ·un patron de restriccibn diferente que permite distinguir
entre ·individuos sanos, portadores y enfermos (119). Desafor
tunadamente los fragmentos que se originan al digerir con
Mnl I son muy pequeños (de 60 a BO pares de bases ) y por
lo mismo no son adecuados para ser evidenciados confiablcmente
mediante la técnica de Southern. Con el descubrimiento de
la endonucleasa de restricción ílde (120), que restringe
la secuencia CCTNAG (donde N es igual a cualquier nucleosido),
el grupo de Gcevcr y cols, demostró poder diferenciar entre
el gen normal de la globina beta (betaA) y el gen falciforme
(betas) (121) (tabla XVI),
Al restringir el ADN de individuos sanos, no anémicos,
con la enzima Ddc I e hibridar con una sonda especifica para
el extremo 5' del gen de globina beta, se obtienen dos frag
mentos de 201 y 175 pares de bases respectivamente ( fig. 36).
Si se considera que la mutacibn de la anémia falciforme elimina
el sitio de restricción para Dde I beta5 +6 (fig. 36) entonces
en homocigotos para el gen HbS solo se debera de ver una banda
de 375 pares de bases complementaria a la sonda S' del gen
de globina beta y en hetorocigotos (betaA/beta 5 ) se espera
observar las tres bandas de 175,201 y 375 pares de bases res
pectivamente. efectivamente eso fué lo que encontraron
Geever y cols. al estudiar el ADN de diferentes individuos
(121) (fig. 37).
~an y Chang (122) y Wilson y cols. (123) demostraron
el poder diagnbstico de esta técnica al aplicarla exitosamente
a un par de embarazos con riesgo de padecer anémia falciforme.
Ambos tenian un genotipo AS, un hijo previo era SS.
130
TABLA XVI. Comparacion del sitio de mutacion de la Anemia
Falciforme en HbA y en HbS (121)
Tipo de Secuencia de am~noacidos (codones 5,6 y ?) Hb y secuencia nucleotidica correspondiente
A Pro-Glu-Glu QQ!::Q!Q-GAG
s Pro-Vol-Glu CCT-GTG-GAG
El sitio de reconocimiento de DdeI esta subrayado.
5+6 D p D _:. l 175 pbl
---h\\\\\\) 201 pb
l~St
sonda 5'
Figura 36. Mapa de la porcion 5' del gen de la globina beta.
Los sitios Dde I (D),incluyendo el que se arecta por la mu
t•cion !alcirorme (beta 5+6) 1 y los tamaños de los fragmen
tos Dde I en pares de bases. El tafüafio y especificidad de la
sonde empleada para detectar el extremo 5' del gen de la gl.Q
bina beta tarnbien se muestra (121). I'/S: intrones
131
132
3 Kb
376
201
175
Figura 37, Diagrama de la autorradio.:~·afia de los fragmen
tos Dde I que hibridaron con la sonda especifica para el
e;rtremo 5' del gen de lr.. globin:; beta. Carriles: 1, indivi
duo control (AA); 2, individuo homocigoto para la anemia
falciforme (SS); 3, individuo portador del gen de la anemia
falciforme (AS) (121).
133
El análisis 'con Dde I del ADN de . ambos padres revelo, como
s.e esperaba, los fragmentos de 175,201 y 376 pares de bases,
. el ADN del hijo afectado solo origino el fragmento de 376
·pares de· bases, conforme a lo esperado. En el ADN de los
amniocitos cultivados se hollaron los fragmentos de 175
201 pares de bases, lo que es indicativo de un genotipo AA,
lo cúal fue confirmado con estudios sanguineos del neonato.
Ya que existe evidencie de que la mutación falciforme
se origino mas de una vez en la poblaci6n mundial (4), Kan
y Chang se preguntaron si el ensayo con Ode I seria útil para
detectar al gen falciforme en diferentes poblaciones: Estudia
ron el ADN de negros americanos, de individuos del Mediterraneo
(Sicilia, Grecia), el este medio (Jordania, SnudiArabio),
Africa (Nigeria, Kenya) y Asia (India). En todos los casos,
el gen A produjo los fragmentos de 201 y 175 pares de bases
mientras que el gen S origino solo el fragmento de 376 pares
de bases (122).
Aunque este nuevo acercamiento a la detecci6n del
gen falciforme es mas sencillo, directo, no requiere de grandes
estudios familiares y sirve para diferentes poblaciones mundia
les, tiene dos limitaciones importantes: Primero, el análisis
con Dde I no detecta al gen betaC' ya que esto mutaci6n (betaA
CCTGAG-.. beta e CCTAAG) produce una secuencia que si es restrin
gible por Dde I, y por lo tanto no puede ser distinguida de
el genotipo bctaA. Entonces para la detecci6n de bctnC el
polimorfismo Hpo I es mas Útil ya que el 95% de los genes
betaC eston asociados con el fragmento Hpa I de 13 Kb (4,
123). Otro inconveniente de la técnica, es que se requieren
de 10 a 20 ug de ADN para el anil.lisis ya que los pequeños
fragmentos de ADN generados por Dde I producen débiles señales
de hibridaci6n. Esta cantidad de ADN solo puede obt·enerse
mediante el cultivo de amniocitos lo que aumenta el costo
alarga ·la,, . . ·de la prueba. Afortunadamente, poco
después, ,Charig 'y ,Kan, (124) y 'Orkin y cols. (125) introdujeron
una' mo'difi'~aci6n a la 'técnica hadendo uso de 'ta endonucleasa
de restri,cÚ6~, Hst II.
,La enzima MSt III reconoce la misma secuencia nuclco
tidica, que Dde, I (CNTAG) pero tiene ademas una especificidad
adici,onal, de ,dos bases mas (CCTNAGG), Asi pues la restricci6n
de'! ADN 'c.;n Mst í:I genera fragmentos mayores que los que origi
na Dde I ( fig. 38) 1 ya que los fragmentos grandes de ADN
favoie~eri ·la "hibridaci6n- y por_ lo mismo producen scfialcs fucr
t"cs •. el ·ensayo con Hst· II no requiere cultivo de amniocitos
):a. qu-~-=con tan poco co"mo -1 ug de ADN se puede realizar la
p~ueba (124).
-~¡ ·:~esti'ing.ir-·ADN normal de personas sanas, no ancmi
caS; -Con_- ·Mst>.-.- 11> e· '.hibridarlo con una sonda específica para
el extre~o S,~:,, del gen de la globina beta (fig. 38) se revela
un frágmeiíto~de,'. l', 15 Kb. Ya que la mutaci6n falciforme elimina
el sitfo Hs't' II beta5 • 6 • 7 (fig. 38) el ADN de homocigotos
para::¡,¡ gen ,:bet'aS al ser restringido con Hst II e hibridado
c~·n ·la sonda d.el extremo 5 1 del gen de globina beta revela
un 'fragmento de 1.35 Kb (fig, 39).
Este nuevo enfoque demostro ser Útil tambien para
el diagn6stico de fetos en riesgo de padecer anemia falciforme
(123, 125) ser Útil en diferenles poblaciones mundiales
(Negros americanos, Kcnianos, Hindues y de Snudi-Arabia (124),
con la ventaja de ser mas rápido y barato por no requerir
cultivo
ensayo.
al gen
tambien
de amniocitos para obtener el ADN requerido para el
Sine embargo este ensayo tampoco sirve para identificar
beta , pues lu enzima Hst 11, al igual que la Dde I,
reconoce al sitio mutante bctaC (124 1 125).
Region Adyacente
1 Gen de la Globina lleta
{}5,G,7
~.2Kb~ 5' + 1.15 Kb
sonda especifica para el extremo 5' del gen
Je globina beta \
/,. 1.15 Kb
s 1.35 Kb
r11su\
Figura 38. Diagrama de la region adyacente y del extremo
51 del gen estructural de la globina beta. Las flechas
indican los sitios Mst II, incluyendo el correspondie.n
te a la posicion de los aminoacidos 5,6,7. El fragmento
de 1. 15 Kb es visto en el ADN normal, y el de 1. 35 Kb en
el AD;! portador del alelo S del gen de la ¡;lobina beta.
IVS= intronee (12!¡).
135
2 3
~ § [] Kb
1.35
1. 15
Figura 39. ADN restringido con !4st II e hibridado con la
sonda especifica para el extremo 5' del gen de la globi
na beta. Carril 1, homocigoto AA;2, heterocigoto AS;3,
homocigoto SS (125).
Figura 40. Deteccion por analisis con la en<lonucleasa Eco RI
del defecto molecular en el gen de la globina beta-Arab. La
mutacion elimina un sitio de restriccion Eco RI. Las flechas
indican sitios de corte para Eco RI (127)
1.37
La glob·:Í..~a ·'.bet~O Arabiga, beta 1 21 GLu-Lis, in teractua
can la glabina ·fi!lcifarme y causa la enfermedad hemoglobinica
soArab, ia cual es cllnicamente tan severa como la anemia
f~lcifarme (126). La sustituci6n nucleotidica que do origen
a esta variante puede ser detectada en el ADN genomico usando
lá endonucleasa de reatricci6n Eco Rl (fig. 40). El sitio
de reconocimiento de Eco RI es un grupo de seis nuclcotidos
(5' G4AATTC 3') que codifica para los aminoacidos 121 y 122
(127) de la cadena normal de la globina beta. La sustituci6n
nucleotidica sencilla en el gen betaOArab(G-A) elimina el
sitio normal de corte de Eco Rl al cambiar la secuencia del
ADN a 5' AAATTC 3' (128). Cunndo el ADN genomico normal es
digerido con Eco Rl o hibridado con una sonda para el gen
de globina beta , se revelan dos bandas de 5.2 y 3.2 Kb de
largo. En el caso de un homocigoto para ilbOArab solo un frag
mento de restricci6n, de 8.4 Kb, es detectado debido a la
ausencia del sitio de reconocimiento para Eco Rl en los codoncs
121-122 (fig. 40) (97). Esta técnica se ha usado en combina
ci6n con el polimorfismo Hpa I paro diagnosticar prenatalmcnte
a fetos con riesgo de SOArab y tambien para detectar al gene
beta de la variante hemoglobinica DPunjab (beta 121 Glu-Gln)
(4).
Hemoglobina JBrouasais
Los genes humanos de la globina alfa contienen la
secuencia AAGCTT en el sitio que codifica para los aminoacidos
90 y 91 (129). Eeta secuencia codifica para lia-leu y es
tambien el sitio de corte para la endonucleasa de restricci6n
llind 111. La variante hemoglobinica HbJBroussais (126) tiene
en la posici6n 90-91 de la cadena alfa, lis-asn, siendo la
secuencia nucle6tidica que codifica para ellos AAGAAT. Este
cambio vuelve al ADN resistente al corte de Hind III en este
13S
Sitio.
Cuando se restringe el ADN de una pers.ona homocig~ta
p~ra· ·la HbjBroussais y se hi.brida con una s.onda P~.ra ::e,1 · gen
de _lo globina alfa, se revela un fragmento de 7 .5 -Kb. Este
fragmento esta formado por la fusi6n de l_as fragmentos_ de
4. 6-- y 3. 7 Kb observadas en las individuos sanos (130 )( Úg.
41).
Talasemia Beta0 (gene betaivs ·2 G-A)
Una mutaCÍ.6n puiltual en el _sitia de empalme (sitia·
de _uni6n °entre un - intran y- un exon) del segundo intra-n del - - - - o gen de _la glablna beta es una etiología de la talasemia beta •
La mutación (G-+A) elimina un sitia de reconocimiento para
la enzima·Hph -I (GATGA _en lugar de GGTGA) (131) (fig. 42).
Se sabe- que la endonuclessa de restricción Hph
tiene uno de sus Sitios de corte en el extremo S' del intron
II del gen de glabina beta (132) (fig. 42). Cuando el ADN
humano nor~al se digiere con Hph I y se hibrida con una sonda
específica para el intron II del gen de ln globino beta se
obtiene un fragmenta de 0,9 Kb de largo (fig. 42). llaird y
cols. (131) hallaron en tres pacientes homocigotos para talase
mia beta, uno Italiano y dos Iranies, un nuevo fragmento de
1.0 Kb de largo, en lugar del de 0.9 Kb, debida a la pérdida
del sitio de restricci6n para Hph 1 en el extremo 5' del intron
11 del gen de globina beta, y consiguiente alargamiento del
fragmento Hph I hasta el siguiente sitio de restricci6n hallado
100 pares de bases mas hacia el extremo 5' (fig, 42).
Avances en la Detecci6n de las Mutaciones Puntuales
En fechas mas recientes se han elaborado protocolos
Figura 41. Deteccion por analisis con Hind !II del defacto molecul.'.lr en el gen Je la hemoe;lobina J-Brou
ssais. La mutacion elimina ur1 sitio llind III. Las
flechas indican sitios Hind III (130).
139
Kb
7,5 4,6
3,7
1.0
0.9
Figura 1¡2. Analista c<on la ondonucle~sa Rph I del defecto molecular en un tipo de bet.l'-talasemia con una mutacion en
el extremo 5' del sitio de empalme Jel segundo intron. La
mutacion elitnlna un sitio de restriccion Hpit I. L-Os sitios Hph I se indican con flechas ( 131).
140
c..... .; .. -
novedoá.os; que :.·i~t·~'~d·~·~e~'., ~odi fi~,fi~i~¡ries :~··i~:~'· .'.~-~,:~-~i~~-¡·6~-:/d·i·~"e.cta :: 6:u;·:~:~:~~;¡;~t:·~:.sdt~ti6~NJLe1m~r~~::;i~:~.j~f de ····~es~ric-
·: :·.¡:.' . -r··- --;,)~ ··:., >,,: ~ -- Usod~Mi.nis~i~s'.~ la R~~";1~~i6~··d~;Fri~me~if~~ de Restricc'i6n
uso
'-~
é~~¿,;~·se•ih~ expuesto ~n los párrafos
de;. erl~-o-nti·cÍ~eB:sas de re-stricci6ri para la
anteriores,
detecci6n,
el
en
~~·f~~~'·: __ ~:-_~r~~%_t_~_:.·< d~ __ uña mutaci6n puntual que haya creado o destl-U'id-ó .. jin-.-_:_sit:t'O de l-estricci6n dentro de un gen de interés,
permÚ~·;·:el~~análisis de ADN genomico desde 1 (124) hasta 20
_ug-·_(4), Pa_ra obtener en aproximadamente dos semanas un diagn6s
_ti~_o· confiable del genotipo hemoglobinico de los sujetos en
estudio (121, 122, 124, 117). Law y cols. han desarrollado
un protocolo, para la preparaci6n y análisis del ADN genomico
de amniocitos, que es mas sensible, pcrmltiendo un diagn6stico
prenatal con tampoco ADN como 50 ng y en un lapso de cinco
días o menos (133). Este protocolo se hn aplicado satisfacto
riamente al diang6stico prenatal de: anemia falciforme con
Mst II, mapeo de los alelos betaA y beta3 con Dde I, mapeo
del alelo betaD Punjab con Eco RI, mapeo del alelo betaEcon
llph l y al estudio de muestras de ADN mediante polimorfismos
de los fragmentos de restricci6n ( 133). Los puntos novedosos
de este protocolo son:
a. Extracci6n del ADN. En los protocolos de lisis
celular convencionales, al rcsuspcnder a los amniocitos en
el buffer de lisis con S.D.S., se forman agregados celulares
que requieren prolongados periodos de incubaci6n para disper
sarse y lisarse. En el protocolo modificada por Law , las
células amnioticas (provenientes de 5 a 20 ml de líquido amnió
tico) se .suspenden homogcneamente antes de agregar el S.D.S,
dando como resultado que ln lisis se obtenga en dos horas.
El pequeño volumen de lisis usado (0.4 ml) permite rapidez
141
en las extracciones fenolicas, de tal manera que el ADN puede
se~ obtenido y cuantificado en unas dos horas.
b. Resoluci6n de los fragmentos de ADN. Una vez
que el ADN ha sido digerido con la-endonucleasa de restricci6n
requerida para el estudio en proceso. se procede a separar
los fragmentos de restricci6n obtenidos, mediante electrofore
sis horizOntal en minigeles de agarosa al 1.4% con dimensiones
de 6 x 10 x 0.5 cm, durante dos a tres horas.
c. Detecci6n del fragmento de interés mediante hibri
daciones con sondas radióactivas.
Los procesos de transferencia del ADN a papel de
nitrocelulosa y la posterior hibridaci6n con la sonda radioac
tiva precisa, son iguales que en los protocolos convencionales,
solo que aqui la sensibilidad con este nuevo ensayo se ve
aumentada. Mientras que con los geles de tamaño convencional
se requieren de 1 a 2 ug de ADN total para poder delectar
a un gen presente en una sola copia, por juego haploide cromo
somico, el uso de minigeles permite la detecci6n de estos
genes usando 200 ng de ADN totul y una cxposici6n autorradio
gráfica durante toda la noche. Aumentando el tiempo de cxposi
ci6n de la autorradiografía ( ';>' 2 días) la sensibilidad aumenta
hasta requerirse solo 50 ng de ADN total.
La mayor sensibilidad alcanzada con el ensayo con
minigelcs no implica perdida de la resoluci6n. Bajo las con-
diciones de Law y cols., la rcsoluci6n se mantiene comparable
a la obtenida con los geles convencionales.
- Amplificación Enzimática del Gen de Interés
Aunque esta metodología, desarrollada por Saiki
11¡2
cola, (134_), fue' ori.g-¡~;,lmente aplicada a la 'detecci6n de
los alelos_ de la ane~i~ 'falciform~; puedé'seic utiHzada para
cualquier- muta'ci6n pu'ntual que afecte a·_:un-_·sitio de .re;,tricci6n
conocido'.
Inicialmente, un
del gen de globina beta,
Dde I, es amplificado, A
fragmento de 110 pares de bases
que contiene al sitio diagn6stico
20 ng de ADN total desnaturalizado,
se le agregan cebadores para la replicaci6n (oligomeros sinté
ticos de 20 pares de bases) que se alinean a bandas opuestas
del ADN genomico que flanquea a la secuencia gcnica de interés
Estos cebadores quedan colocados de tal manera que en presencia
de la polimcrasa I de h coli y nucleotidos trifosforilados,
el producto de extensi6n de un cebador puede servir como bantla
molde para la sintesis replicativa del otro. Con esta estrate
gia de ciclos repetitivos de desnaturalizaci6n, alineuci6n
y extensi6n de los cebadores, se obtie11e unn acumulaci611 expo
nencial de 1 fragmento de 110 pares de bases componente del
gen de ln globina beta. Por ejemplo, 20 ciclos de amplifica
ci6n producen un aumento de 220,000 en la cantidad original
del fragmento genico de interés.
El ADN amplificado es hibridado con una oligosonda
de 40 nucleotidos de largo, complementaria a la región del
gen de globina beta que rodea a la mutación falciforme. En
el alelo betaA, la secuencia nucleotidica de esta regi6n contiQ.
ne un sitio de rcstricci.6n Dele I, que ha sido perdido en el
alelo beta 5 • Lo estrategia pnra gencrur productos de restric
ci6n especificas para cada alelo (mutante o normal), n partir
de las sondos radioactivas se muestra en la figura 43. Se
basa en la presencia invariable de un sitio de restricción
para llinf· III inmediatamente adyacente al sitio diagnóstico
de restricción para Ode I. La resolución en geles de pol ia
crilamida de los productos de restricción, generados a partir
en.·la .regi6n qué ~odea a Ú mutacf6n falciforme (tabla XVIII)
L~ posici6n y tamafio de la secuencia oligon~cleotidica fu~ establecido en base a una serie de consideraciones:l) Se d~
cidio que el oligonucleotido tuviera 19 nucleotidos de largo
para que asi tuviera una alta probabilidad de reconcer solo
una secuencia dentro del ADN genomico (137); 2) la mutación
falciforme se situo en el centro de !a oligosonda para exacer
bar· la inestabilidad termica de la hibridaci6n no complementa
ria; 3) las secuencias sintetizadas no son complementarias
a las regiones correspondientes en los genes de las globinas A O¡ ,,.
E,'{, lf• o d (tabla XIX).
Se obtuvo ADN de individuos sanos
de heterocigotos portadores del gen de la globinu falciforme
(beta A /betas); y de homocigotos para el gen falciforme (betas/
betas). Se restringio el ADN (10 ug) con la endonucleasa
Bam 11!, con lo cual el extremo 5 1 del gen de la globina bela
(que porta la secuencia complementaria a las oligosondas)
queda en un fragmento de 1.8 Kb. Se encentro que las condicio
nes adecuadas para que solo se produjeran hibridaciones cuando
la complementariedad entre la sonda y el gen fuera de 100%
eran: Hibridaci6n en Sauthern a 45°C en 0.9 M de iones Nn+
Y lavado del Southern a ssºc. Bajo estas condiciones estrictas
solo los duplex de ADN perfectamente complementarios son esta
bles (135, 136) (fig. 45),
De esta mBnera la técnica de las oligosondas demostra
ba ser igualmente Útil que el. ensayo con la cndonucleaso Mst
II ya que ambas técnicas requieren de una pequeña cantidad
de ADN, que .. pu~de ser··abtenida sin recurrir al cultivo celular,
150
Kb
(A) --(B) -- 1.8
Figura 45. Hibridncion do las sondas nonarlecanucleotidicas
(beta A y S) al ·AD:! genoinico humano. AD:; de individuos AA,
AS y SS fue di¡;erido con Bain HI y sometido a eloct1·oforruis,
transferido a papel de nitrocelulosa y: (A), hibridado a
la sonda beta A; (B), hibridado a la sonda beta S (135, 136)
TABLA XVIII. Secuencia nuo1eotidica de le.e son ae oligome
rioae nara el gen norona1 de la globina beta (beta A) y del 11:en f'al,.tform" (h .. t~ S l (' :;G)
G a
beta A beta A 5'CT GAG GAG AAG TCT GC3•
beta A' 3•GA GGA CTC CTC TTC AGA CG5•
beta. S beta s 5•CT CCT Ja GAG A.AG TCT GC3•
beta. S' 3•GA GGA CAC CTC TTC AGA CG5•
A_..,.T
e ~t Ar (
'fA
TABLA XIX. Secuencia de lllllinoaoido11 7 del ADN d~ 1011 gene11
humano11 de la familia de la11 globinas beta-like, en la r~
~ion nue hibrida con las oli~oeondas, \135)
Brrore11 de apareamiento
152
betaA betas
5' Phe Thr Ala Glu Glu Lia Ala Ala Val 3' 2 3 T'I''I' AaT Ge! GAG GAG AAG OCT GCC G'I'C
l'he 'I'hr Glu Gli A11p Lis Ala Thr Ile 7 p T'I'C ACA GAG GAG GAC AAG GCT AC'I' ATC
Leu Thr Pro Glu Glu Lia Thr Ala Val l 2 CTG ACT CC'r GAG GAG AAG ACT GCT GTC
Leu Thr Pro Glu Glu Li11 Ser Ala Val o l CTG ACT CCT GAG "GAG AAG TCT GCC GU
'P" Leu Thr Pro Val Glu Li11 Ser Ala Val l o CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT cae GT'I'
161
-,tos col~ctados a partir de 20 ml de líquido amniótico de tres embar8"os en riesgo de padecer beta O
39 talasemia. El ADN
de los._ individuos adultos se digirió con Bam HI, se hibridÓ
con l~s oligosondas betaA y betaº 39 y los resultados obtenidos
fueron que lo sonda betaA hibridó sOlo con el fragmento de
1.8 Kb del ADN normal (AA), la sonda betaO 39
hibridÓ scilo
con el ADN de individuos betaO 39 -talasémicos (betaO 39 /beta0
39 ).Ambae sondes hibridaron con el ADN de individuos heteroci
go~cis para beta O 39 talasemia (beta A/beta O 39 ). Al probarse
el ADN de los amniocitos se observo que en un caso ambas sondas
hibridaron con el fragmento de 1.8 Kb (fig. 49 carriles 1
y :1 1) indicando un genotipo de heterocigosis para betaº
39
talesemia; en los otros dos embarazos solo la sonda betaA
hibi-idÓ c·an el ADN, indicando que los fetos eran normales
(AA) (fig. '49 carriles 2,2', 3 y 3'). Estos resultados fueron
-~--~or~obor:-ados-, ·al nacer los productos, mediante estudios hemo
glob{nfco~ (141).
Esto misma técnica se ha empleado despué's para estu
dios masivos de parejas sardas que desean diegn6stico prenatal,
siendo de inter~s hacer notar que en estos estudios se usaron
oligosondas que eran ya un producto comercial registrado y
como tal fueron compradas al laboratorio fabricante (142).
De las 103 parejas comprendidas en estos estudios en 91.3%
de ellas ambos progenitores portaban la mutaci6n beta.O 39 ,
confirmando as! reportes previos sobre la incidencia de este
alelo en la ppblaci6n Sarda (143) y sugiriendo la posibilidad
de que el diagn6stico prenatal de beta talasemia en esta pobla
ción puede ser logrado, en la mayoría de los cosos, rápida
Y facilmcnte con el uso de un solo par de oligosondas alelo
específicas.
La mutaci.6n betaivs-l llO es producida por el cambio
de un solo nucleÓtido (G-A) en la posici6n 110 del primer
2 3 ,. 2' :;•
Kb
--- 1.8
(A) ('.})
Figura 49. ADN de tres retos con riesgo de padecer beta 39
talasemia, restringido con Bam HI e hibridado con : (A) , sonda especifica para el gen normal de la globin.> beta ¡ (B), sonda especifica para el gen mutante beta-39 talasemico. Las muestras de ADll de cada reto astan por duplicado : 1 , 1'
2,2• / 3,3' (141 ).
CTGCCTATTGGTCTATTTT sonda normal (A)
162
betaIVS I-110 A sonda mutante (tal)
Figura 50. Sondas sinteticas preparadas para hibridaciones m_g leculares. El gen de globina beta esta ilustrado en la parte superior. Abajo, la secuencia de AD!: normal y la sustitucion 1oononucleotidica en el gen beta IVS I-110 comun entre los habitan tes del ;.:edi torra neo, se muestra dentro del rectangulo (, 47).
intron (ivs .. l)':dei gen de lo globina beta (144). Esta sustitu
ci~~ gener~-u~~ nueva. sefial de empalme que origina la forma
ci6~ d·e·· u~', AR'Nm anormalmente procesado que es inestable "in
vivo"· (145)·; · Ya que algunos pocos ARNm normales son producidos .. +
este gen . prodüce un fenotipo de talasemia beta ( 144). El
grupo de Orkfo y cols. (146) ha estimado que alrededor de
dos·-. tercer·as partes de los genes beta+ talascmicos griegos
y un' tercia· de los italianos son de este tipo, y es por ello
que ellos mismos decidieron hacer uso de oligosondas alelo
espedficas para el diagn6stico de esta enfermedad en indivi
duos de estas iomtinidades (147);
Fueron sintetizados dos oligosondas nonadecanucleoti
dicas una complementaria al gen normal de la globino beta
humana y la otra complementaria a la mutaci6n betaivs-l l lO
del mismo gen (fig. 50).
Se obtuvo ADN de individuos normales y de individuos
portadores del gen betaivs-l llO ya fuera en forma heterocigota
u homocigoto, se digirio con Bam HI e h!brido en condiciones
estrictas con los oligosondas sintetizadas. El ADN de indivi
duos betaA/bctaA solo hl'brido con la sonda betaA; el ADN de
individuos bctoivs-l llO/betaivs-l llO solo hibrido con la
sonda betaivs-l 110 ; y el ADN de los heterocigotos hibrido
con ambas sondas demostrandose asi, la especificidad de cada
una de las sondas por la secuencia de ADN que le es 100% com
plementaria, y con ello su valor diagnostico (fig. 51).
En los párrafos anteriores se ha expuesto que el
alelo beta talasemico mas comun en Cerdeña es el betaº 39
Y en Grecia e Italia lo es el alelo betaivs-l l IO, pero es
un hecho 4ue entre las diferentes poblaciones del área Medite
rranea ha habido intermigraciones que han originado un 11 pool"
genico con características compartidas pero, que al mismo
(A) (B)
I~ A í•I l"I' p-ª¡·' f ~ F'~ ?:-' e>'f.J l·'
CEB Kb -- 1.3
Figura 51, AD:: de individuos con diferentes een.Q_
tipos para el ,;e1• ele la _;lolilM beta, dieerido
con !lam HI e hibriclado posterior.llonte con: (A),
sonda especifica para el gen normal de la globJ.
na ueta (beta A)¡ (B), sonda especifica para el
e;en de talasomin IVS I - 110 ( 147).
tiempo originan mayor variedad en los alelos-- presentes en
una -·comunidad determinada. Es por ello que surge 18·, i~terrogante 'd_e_ con.-cua~ta's oligosondas .se requi~.re Canta~ para _esta
·~·~~~t u~ p~og~~ma de diagn6stico __ prenata~ de~los hemoglobino
palfa-~ ··e_n uria poblaci6rt en particular. PBra contestar a esta
frite~fóg-ilntC, en lo referente- al· área Mediterranea, Thein
y cols. (148) realizaron un estudi6 mediante oligosondas alelo
espedfii:as- en el que hallaron que en la poblaci6n Chipriota
u,n áo% de los· genes beta-talasemicos eran del tipo betaivs-l -
l.lOJ"~Ya·- -mutaci6n beta O 39 no se hallo en ningun caso. En
los Italianos la mutaci6n betaivs-l llO se encentro en 22%
de los cromosomas beta-talascmicos la mutaci6n heteo 39
en 66% de ellos. Con base en estos resultados se han logrado
diagn6sticos completos (se refieren como diagn6sticos completos
cuando en ambos padres la mutaci6n puede ser identificada
medinnte las oligosondas) en 65% de familias Chipriotas usando la oligosonda para la mutaci6n betaivs-l llO y en 75% de fami
lias Italianas usando las oligosondas para las mutaciones betaivs-l llO y betaº 39 (148, 149).
Beta Talisemias en Asia
Impulsados por una inquietud similar a la Thein
cols (148) descrita en el párrafo anterior, el grupo de
Kazasian y cols decidieron determinar el espectro de mutaciones
responsables de la betaº talasemia en China y el sureste de
Asia para hacer posible un programa de detecci6n directa de
los genes mutantes de globina beta en esta rcgi6n del mun
do (150).
Mediante análisis de restricci6n del ADN y de hibrida
ci6n con oligosondas alelo-específicas encontraron siete dife
rentes mutaciones puntuales. De estos siete alelos beta-tala
semicos, dos constituyen el 62% del total y otros dos constitu
yen un 29%. Ya que solo cuatro alelos forman el 91% de los
genes beta .. níut~rii:e~, y eritre los· s:lete;,álelos. llegan ... al 96%
del .total ;de• genes betá,,-globinfr.of;, mut~ntes en ;~hipa el
. sureste: de Ásiií (talil~ XXII) eLdi~gno~Úco;'pre~~i:~l ;;; éstas
poblaciOnes sérh poslble 'mediant~ ·t&'c:niás. de de'tecci6n direc-
ta de l~ mu~aci6n p~n~'ual. .
El. grupo. de Saiki y cols ha publicado un protocolo
experimental ClSi) que hace uso de la amplificaci6n de regiones
esp~·c:t:ficas del ADN genomico total (ref. 134) y de oligosonda
sal~~o.:.e_specíficas ·para la detecci6n de mutaciones puntuales.
Aunque el reporte original (151) esta aplicado a la detecci.6n
de.los alelos betas y betaC falciformes esta metodología puede
ser útil para la detccci6n de cualquier mutaci6n puntual para
la cual se pueda contar con oligosondas alelo-específicas.
Inicialmente, siguiendo la estrategia de ciclos
repetitivos de desnaturalizaci6n, alincaci6n cxtensi6n de
cebadores (expuesta en las pags, 142 y 1 41 de este escrito},
se amp! i fica un fragmento de 110 pares de bases del gen de
globina beta (partiendo hasta de 1 ng de ADN total), El ADN
amplificado, obtenido de individuos con cualquier
combin8ci6n de los alelos beta A, beta 5 y beta C, se
posible
dividio
en tres porciones que se aplicaron a cada uno de tres filtros
para hibridaci6n en punto (dot blot hybridization). Cada
uno de los filtros fueron hibridados con una de tres oligoson-
das alelo-específicas radioactivas (fig. 52). La autorradio-
grafía (fig. 53) muestra claramente que cada oligosonda hibrido
solo con aquellas muestras de ADN que contienen por lo menos
una copia de algun alelo de globina beta que le sea 100% com
plementario.
3. Migraci6n Diferencial en Geles de Poliacrilamida
La desnaturalizaci6n diferencial del ADN, al migrar
electroforeticamente al travez de un gel desnaturalizante 1
TABLA XXII • Alsloe beta-tnl,.semico11 presentes en la po
blacion de China y del aureete de Asia y frecuencia de lns mismos. (150)
Figura 52. Secuencia de los cebadores y de las sondas y de
su relacion co11 el gen de la globina beta. Los dos cebado
res, (+) y (-), son de 20 pares de bases de largo y son CO.!!!
plementarios a las hebr11s positiva y negativa del ADll res
pectiva1nente. Las tres sondas, 19A, 195 y 19C, son de 19
pares de bases de largo y cubren del codon 4 al 17 del gen
e 151 >.
168
• AA
• • /J3
• SS
• • se
• ce
• • AC
19C 19s 19A
Figura 53. ADll someticlo a· ciclos de amplificacion
fue aplicado a filtros de nitrocelulosa para ser
expuestos despues a hibridacion con oligosonclas -
especificas de alelo (151).
169
170
es otro recurso ";para lá "detección de sustituciones de una
sola" base:"en el ADN (152). EN e"sta metodología, las moleculas
'de -:AON.:·.mu~·a·~t:~s-- y,. normales so~ s·epata-das mediante electrofore
sis en geles de:" poliacrila,m"ida que tienen un gradiente de
""formamida "y, urea" (desn,aturalizantes del ADN). Los fragmentos
,de" ADN dú~lex "migran al i:raves de estos geles a una velocidad
pr~·POI'.'C_~a·ri~~ 8-. sii:_-:pes() mo_lecular hasta que alcanzan una regi6n
·d-e1 -g-el c .. Oil 'Uria ·con·centraci6n tal de desnaturalizantes que
ha~en :"q~e,"'~1 :duplé"x se desnaturalice. Cuando el ADN se des na-
. _ t~-~~l·~--~a .:~·:~;~u,. '.mayilid_ad e lec trof o ret i ca decrece a bruptamcn te.
"D~"tal,,for~a-~~e, la posici6n final del fragmento de ADN depen
fei ~:d·é~'-~=: 5-b\~~tempE!ratu ra de des natural i zac i6n. La diferencia
er,_ -.-la te-iDPer~tura de desnaturalizaci6n entre dos fragmentos
qúe:' di-Íiel--~n ~-en un -solo nucleotido es suficiente para permitir
s·ú."Lse·p~ra~~.'.f6n -_e~ . el gel. Una mayor separaci6n es lograda
•" c"~ll" duplex"~ de ADff, que porten un error de apareamiento y en
ello se basaron Hyers y cols. (153) para elaborar un protocolo
ei~~riment~l destinado al "diegn6stico molecular de las hemoglo
binopa tías.
El trabajo de Hyers y cols. (153) fue sobre cuatro
mu~acioncs b~ta-talasemicas, que ocurren en las posiciones
l,5,6""y !lo ílel primer intron (ivs-1) del gen de la globina
beta .humana. El esquema general del protocolo experimental
e~el siguiente (fig. 54).
---- -·_·,-,--- ---L8 --muestra de ADN geno mico total (se trabajo con
ci·n-co muestras de ADN: la primera de un individuo sano y de
la·s otras cuatro cada una tenia en forma heterocigotu una
de las cuatro mutaciones mencionadas en el párrafo anterior)
se restringe con las enzimas Bam HI y Neo I (que cortan fuera
de la secuencia mutante de interés), se desnaturaliza por
calentamiento a ebullici6n y se mezcla con un exceso de 6,400
veces de sonda para el gen de beta globina humana normal.
171
3. 5' _____ ,.. Exon I
t Neo I l Ba! HI
restricclon con Neo I y Bam HI
".:'""'"Lll~ ~
1 Deenaturalizacion oor calenta
~ miento a ebullicion
1~y ADN de una sola hebra
l)Adicion de sonda especifica del gen normal, en exceso de 6,400 veces 2)Hibridacion en medio liauido 3)Digeetion de sonda no hibridJi da y de ADN de una sola hebra con nucleasa Sl 4)Restriccion con Hae III
-A------ ADN genomico sonda radioaotiva -v
lfeteroduclex con un malaparenmiento
l l)Bleotroforeeie en p:P.l de col.! acrilamida con gradiente dHn.1-tural i!:ante. 2)Autorradiografia
~igracion diferencial entre
el homoduolex y el hetero~
duclex.
Pig •. 54 Diagrama eequematioo de la eat~ategia de Myere y oole. cara distinguir genes mutantes de silvestres, P~ ra explicacion leer el texto.(152)
172
,_. ..
Se permite ·1'a h.ibrÍdacicSn en medio·,líquido y. se agrega nu.cleasa
Sl. para··,remov.e~:: p·~~'. hÚrolisis ii. la ... sonda que :no .híbrido y
a todo et ADN :de .una cade.na. El ADN duplex se· restringe con
Hoe IiI, q~·e s'~.;er~ ~n tragmen to de ADN duplex de 272 pares
de bases 'que :.~ontfene ,al primer intron del gen de globina
betá. E.st~, fragmeñ'to de ADN es sometido a electroforesis
en u~.gel de·polia~iialmida con un gradiente de desnoturalizan
tes_··Y-- m~d~ante-. autorradiografía se evidencian los resultados.
Com'o se muestra en la figura 55 1 cada uno de los
hete.rod_up.lex_· (duplex de ADN que contienen un error de aparea
miento) ... ' claramente se separa del homoduplex de ADN (duplex
de ADN 100% complementario) cuando se someten a la electrofore
sis en el gel desnaturalizant.e (carriles 1-5 de la fig, 55),
En e~tos casos la separaci6n entr~· los homoduplex y los hetero
duplcx vario dé uno a cuatro centímetros 1 dependiendo de el
tipo de mutaci6n. Estos resultados indican la posibilidad
de determinar sin ambigÜedades el genotipo hemoglobinico de
un sujeto haciendo uso de una sola sonda (la específica para
el gen normal) y no de varias como lo requiere la hi bridaci6n
con oligosondas alelo-específicas. Desafortunadamente en
el mismo reporte se hace notar que en algunas otras mutaciones
estudiadas no se observo diferencia en la migración entre
los hamo y heteroduplex. Este comportamiento puede ser debido
a que algunas mutaciones se localizan en sitios que no alcanzan
e desnaturalizarse bajo las condiciones empleadas.
Parte de la solución a la limitación de esta metodolo
gía podría ser la técnica recientemente reportada por Novack
Y cols. para detectar malapnreamientos únicos en el ADN ( 154)
lentes 1 e~~ _r~~~~du_~-~ de gu~ni11dat_os Y timidilatos no aparcados
en el 'ADN··superh.eÚcoidal sin .afectar a los bases de Watson
Crick intac'tas·· (fig. 51\). Novack y cola. (154) encontraron
que·· s1.'·\1 ,u~ _h~-ter~dupl·ex, de ·hasta 1,500 pares de bases, con
un sOlo- malapa'reamiento en que interviniera timina o guanina,
se ie hace-_-reaccfonar con la carboiimida yse le somete a elec
troforesis a través de un gel de poliacrilamida al 15%, su
corrimiento es claramente menor (aproximadamente 10%) que
el que muestra el homoduplex, el cual por ser 100% complementa
rio no reacciona con la carboiimida. Esta técnica promete
se~-6til para la asignaci6n de genotipos hemoglohÍnicos necesa
rios para el diagn6stico prenatal diferencial.
lfonnal ivsI,l ivsI,6 ivsL,110 ivsI,5
.JL
e D
A
Fig, 55 AutorraCliografia de la electroforesis, en ~el~e de noliacrilamida con gradiente deenaturalizante, de muestras de ADN; mutante (carriles 2-4) y normal (carril 1), hibridado con una sonda esoecifica para el nrimer intron (iveI) del gen de globina beta, A, migracion del homodunlex entre el ADN normal y la sonda; B,C,D, y E, migracion diferencial de loe heterci. dunlex entre cada uno de loe alelos beta talaeemioos y la Bonda, ( 152)
Formula estructural de la ciclohexil-3(2-(4-
(4-metill morfolin) etil) carbodiimida y de su nroduo_
to de reaccion con uracilo, Una reaccion similar, en
el sitio imino, ocurre con la timina y la guaniná!155,156)
V. COMENTARIOS Y PERSPECTIVAS
1.75
La tecnologfa del .-ADN. nos ha proporci.onado un cuadro
bestailtC 'comj>let~ ·de. las .. ml":t.a¿iOnes· que dan lugar a las hemo
globinopatías y Síndrom~s Talasémicos, asimismo han permitido
el diseño de métodos para el an&lisis directo del ADN y con
ello \.in · d·iagn.ósi:ico y consejo prenatal cada vez más seguro
y confiable; Ademtls estos estudios han arrojado luz sobre
la CV01uci6Íl''.1de -los -genes normales y mutantes y, en un futuro
esper . .snzador_a·men te cercano• tal vez permitan la corrccci6n
defiiitiva de los defectos génicos,-
La ürupcibn de la genética molecular en apoyo de
la ge.rihica cllnica, médica y de poblaciones no se ha dado
8610· .. ·en er estudio de los genes glob:lnicos, su evolución,
naturaleza 1 diagnóstico y tratamiento de sus mutaciones 1 sino
que .ha _encontrado aplicaciones sobre otras varias entidades
(véase tabla XXIII), De ésta manera, los métodos y técnicas
de 18_ genética molecular dejan de ser exquiciteces de la biotec-
_nologia para, eventualmente, convertirse en técnicas rutina
rias de anblisis y diagn6stico cllnico.
Uno de los principales impedimentos para emplear
como diagn6stico rutinario a las técnicas descritas en el
segundo capítulo de esta tesis, es el uso que hacen de isoto
pos radioactivos. El manejo de los radioisotopos conlleva
una serie de requerimientos y limitantes que impiden, de ini
cio, su uso rutinario masivo: Elevado riesgo biológico
para el personal, necesidad de instalaciones y/o equipo espe
cial para su manipulaci6n, alto costo ccon6mico y una corta
vida Útil (lo que implica que las sondas marcadas no pueden
almacenarse para su uso posterior sino que deben prepararse
cada vez que se necesiten).
En un intento para desarrollar métodos para el mar
caje de sondas, que no presentase.las desventajas del radiomar-
ABLA :;xr:r. EnferMdadea CU)'O diagnostico H posibilita 7/0 faci
Enfermedad
Halaria (.f, felCipN'llll)
P'.lbroeie c¡uiatica
Ciertos tW10rea
renilcetonuria
Policiatoeis renil
Distrofia auHula de Duchenne
Distrofia muscular de Becker
SindroM de Don
Lipopatiae
Tranetornos aentalee
HHofilia
Diabetea
Citrullnolda
Kal de Huntington
Referencia
(157)
( 158)
(159,160,1G1)
(162)
(163)
(164, 1G5)
(166)
(167)
(168)
(lG9, 170)
( 171)
( 172., 73)
(174)
(175)
177
ceje pero que al mismo tiempo fuera de alta sensibilidad y
gn!n e"specificidad, Langer y col s. (176) han sintetizado nu
c1"6tidos biotinilados (unidos a vitamina 11 = Biotina) que
siiye~ para marcar sondas ya que han demostrado ser sustratos
"adecuados para las ARN y ADN polimerasas, además de que los
pol;t.ni.tcle6tidos biotinilados resultantes muestran una cinéti
:ca __ de -_reasociaci6n similar a la de los polímeros sin biotina
y de esta manera representan sondas génicas funcionales (176).
El mbtodo para la detecci6n de los duplex de hibrida
ci6n de estas sondas biotinilados se basa en la gran afinidad
que, por la biotina, tiene la glucoproteína Avidina. La Avi
"dina, proteína de la clara del huevo y con un P.M. de 68 000
d, posee una elevada constante de uni6n a la biotina
(Kdis 11:1 l0- 15 ). De esta manera, si a la Avidino se le acoplan
las moléculas indicadoras apropiadas (fluorocromos, proteínas
electrondensas 1 enzimas o anticuerpos) es posible detectar
cantidades diminutas de las sondas biotiniladas, como lo de
muestra la técnica reportada por Lcary cols. (177), que
emplea polímeros de fosfatasa alcalina unidos a Avidina
que es de 20 a 50 veces mas sensible que las técnicas repor
tadas previamente para este sistema, siendo posible el detec
tar secuencias génicas presentes en una sola copia por gcno
mio. El marcaje de sondas oligonucleotídicas con biotina
y su uso en el diagn6stico de enfermedades genéticas ya ha
demostrado su factibilidad (178).
De este modo volvemos a comprobar que los escollos
se van allanando y que cada vez esta mas cerca el momento
de que las técnicas de la genética molecular sean un aliado
práctico en el laboratorio de diagn6stico y consejo genético.
Ahora bien lSon todas bondades en el desorrol lo del
diagn6stico genético? Tc6ricamcnte 1 lo detecci6n de "genes
malos" dentro de .. la pob~aci6n humana y, con ello, la posibili
_at arma t~yan n~ p oui' u ~o;f< c ___ ._ •• _;h'_Ne_ 'mi_e0'~8;h1u0:f_ªi--_-_--n'._- -_' {; , ._Ce l_l ú lar :·aGnrdu··• 0m0oi~c u,-C_ ré g~ la tiori u ;-'swÚ--~lil'ng; and
Stratton USA, 19795 _ _ -~ :,·;~:L~f\ '0>;};• < ---
Kan; Y; W.; !JOzy, - A: '' Ei~l\liD!· 'o{' the hemoglobin S
and C genes -in_ ~or'iil '. ~~-¡i_Ji'iftf'ons, Science fil: 388