TESIS DE DIPLOMA Aplicación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa en el diagnóstico rápido de Mycobacterium tuberculosis. Autor: Moisés Puma Yance Morales. UNIVERSIDAD DE LA HABANA Facultad de Biología INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL “PEDRO KOURI” Centro Colaborador OPS/OMS para la Referencia e Investigaciones en Tuberculosis y Micobacterias 2009
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TESIS DE DIPLOMA
Aplicación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa en el diagnóstico rápido de
Mycobacterium tuberculosis.
Autor: Moisés Puma Yance Morales.
UNIVERSIDAD DE LA HABANA
Facultad de Biología
INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL “PEDRO KOURI”
Centro Colaborador OPS/OMS para la Referencia e Investigaciones en Tuberculosis y Micobacterias
2009
UNIVERSIDAD DE LA HABANA
Facultad de Biología
“TESIS DE DIPLOMA”
Empleo del gen hsp65 en el diagnóstico rápido de Mycobacterium tuberculosis.
Dentro de las pruebas fenotípicas, los métodos basados en el análisis lipídico, tales
como la cromatografía líquida de alta eficiencia (siglas en ingles, HPLC), la
cromatografía en capa delgada (siglas en ingles, TLC) y la cromatografía de gas
líquido (siglas en ingles, GCL), han sido aplicadas en la identificación de
M. tuberculosis. Estos procedimientos suelen ser caros, engorrosos, no son lo
suficientemente discriminativos y sólo se encuentra accesibles para algunos
laboratorios clínicos (Uribe et al., 2001).
Las técnicas serológicas pueden ser de gran utilidad en determinadas ocasiones, sin
embargo estas no logran discriminar entre los estados de infección y enfermedad, lo
cual constituye una gran limitación de estas pruebas. A este inconveniente se adiciona
la presencia de actividad cruzada como consecuencia de la infección causada por
micobacterias ambientales (Castro et al., 2005).
Introducción
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En la pasada década, se han logrado mayores avances en el conocimiento de la
composición genética micobacteriana. Como consecuencia, se han desarrollado
diversos sistemas de amplificación y sondas genéticas para emplearlas en el
diagnóstico de la TB. Dentro de estos sistemas se encuentran las pruebas comerciales
Accuprobe® (Gen-Probe, Inc., San Diego, California, EUA) e INNO-LiPA
(Mycobacteria, Inmunogenetics, Bélgica) los cuales son muy confiables; pero con la
limitante de ser extremadamente costosas para países de bajos recursos (Gómez et
al. 2007).
En 1989, Hance et al. reportaron, la amplificación de un fragmento del gen de la
proteína de estrés térmico de peso molecular 65 kDa (hsp65), el cual acoplado con
pruebas específicas para especies permitía la identificación de micobacterias
provenientes de muestras clínicas. Posteriormente, Plikaytis et al. (1992) y Telenti et
al. (1993), perfeccionaron el método mediante la amplificación de dicho fragmento por
reacción en cadena de la polimerasa (RCP) y el análisis del polimorfismo de la longitud
de los fragmentos de restricción (PLFR). Esta técnica fue denominada PRA (Laborín et
al., 2001; Yzquierdo et al., 2007).
En la actualidad, los métodos de identificación bioquímicos continúa siendo la técnica
de referencia para el diagnóstico de la TB. Sin embargo presentan serias limitaciones
en cuestiones de tiempo y una precisa identificación, retardando el diagnóstico y un
tratamiento adecuado del paciente.
Dado el incremento progresivo del número de casos de la TB, su elevada peligrosidad
en pacientes portadores del virus de inmunodeficiencia adquirida (VIH), y la necesidad
de un diagnóstico temprano para su posterior tratamiento con las drogas de primera
línea, nos hemos propuesto evaluar la técnica del PRA-hsp65, en el Laboratorio
Nacional de Referencia e Investigación de Tuberculosis y otras Micobacterias del
Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (LNRTB-IPK).
OBJETIVOS
Objetivos
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1.1 Objetivos
General:
Contribuir al diagnóstico rápido de la Tuberculosis en el LNRTB del Instituto de
Medicina Tropical ¨Pedro Kourí¨.
Específicos:
1. Aplicar la técnica del PRA-hsp65 en la identificación de especies
micobacterianas.
2. Realizar las principales pruebas bioquímicas de identificación de Micobacterias.
3. Determinar la sensibilidad y coeficiente de concordancia del PRA-hsp65 con
respecto a las pruebas bioquímicas de identificación.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Revisión bibliográfica
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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Antecedentes históricos:
La TB presenta una larga historia. Se presume que se originó hace 150 millones de
años atrás. Fue documentada en Egipto, India y China en los años 5000, 3300 y 2300,
respectivamente. En la antigua literatura griega existen indicios de la enfermedad
refiriéndose a esta como Tisis, definida por Hipócrates como la más grande
enfermedad de todos los tiempos, pues fue casi siempre fatal para los que la
padecían. A inicios del siglo XVII se produjo en Europa una epidemia de TB a la cual
se le dio el nombre de “Gran plaga blanca”, considerándola como una muerte
inevitable. En el siglo XVIII surgen los primeros indicios sobre el principal agente
causal de la TB. El físico ingles Benjamin Marten (1704-1722) conjeturó, por primera
vez, que la TB era provocada por “criaturas de vida diminuta”. Posteriormente los
doctores Jean-Antoine Villemin (1827-1892) y William Budd (1811-1880), concluyeron,
a través de estudios epidemiológicos, que la TB se difundía por la sociedad a través
de gérmenes específicos (Leão, Portaels, 2007).
No fue hasta la tarde del 24 de Marzo de 1882, en Berlín, ante una escéptica
audiencia compuesta por prominentes hombres de ciencia alemanes pertenecientes a
la sociedad fisiológica que, Robert Koch (1843-1910), realizó la famosa presentación
de Mycobacterium tuberculosis como agente causal de la TB, lo que marcó el primer
hito en el estudio de esta enfermedad (Kaufmann, 2003). Estos hallazgos, seguidos
por el desarrollo y refinamiento de las técnicas de coloración y cultivo realizadas por
Paul Erhlich (1854-1915), Franz Ziehl y Friedrich K.A. Neelsen proporcionaron las
primeras herramientas para combatir racionalmente la TB. A más de un siglo de la
introducción de estas herramientas, se desarrolló una vacuna y varios agentes
quimioterapéuticos para combatir esta enfermedad. Aun así, en la actualidad, la TB
sigue siendo la mayor causa de muerte en el mundo debida a un único agente
infeccioso (Chacón et al., 2004).
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2.2 Taxonomía:
La clasificación de las micobacterias se inició en 1896 cuando Lehman y Neumann
propusieron por primera vez el género Mycobacterium incluyendo a M. tuberculosis y
M. leprae, ubicándolos en la familia Mycobacteriaceae orden Actinomycetales y clase
Actinomycetes (Leâo et al., 2004).
El género Mycobacterium, el cual incluye más de cien especies, se divide en 3
grandes grupos: Complejo M. tuberculosis, complejo leprae y las Micobacterias no
tuberculosas o atípicas (MNT). El complejo Mycobacterium tuberculosis incluye
M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG (derivado atenuado de la cepa de M. bovis
comúnmente utilizado como vacuna para la protección contra M. tuberculosis),
M. africanum (causante de la TB humana en el continente africano), M. canetti
(subespecie de M. tuberculosis) y M. microti. Todas estas causan la TB en humanos.
También alguna de ellas presentan otros reservorios de infección como son: M. bovis
que infecta principalmente el ganado bovino y M. microti es patogénica en roedores
(Arráiz et al., 2006).
2.3 Características generales: M. tuberculosis es un patógeno intracelular facultativo de crecimiento lento que puede
sobrevivir y multiplicarse dentro de los macrófagos y otras células animales como
células dendríticas, mastocíticas, etc. (Persson et al., 2008). Es gram-positivo, aerobio
estricto y no forma esporas, su morfología es delgada de forma recta o ligeramente
curvada en frotis teñidos, y su tamaño suele ser de 1-4 micras de largo por 0,3-0,5
micras de ancho. El tiempo de duplicación de M. tuberculosis en condiciones óptimas
de cultivo es de 15 a 18 horas, tardando varias semanas (de 1 a 3) en aparecer
colonias visibles en medios de cultivo (Casal et al., 1999). Estos bacilos al igual que
otros pertenecientes al mismo género poseen una composición única de su pared
celular.
La pared micobacteriana es una efectiva barrera frente a muchos de los agentes
antimicrobianos convencionales y está constituida por el complejo macromolecular
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formado por ácidos micólicos arabinogalactano-peptidoglucano (mAGP). La misma
está separada por un espacio periplásmico y posee un elevado contenido en lípidos,
confiriéndole un carácter hidrofóbico que la hace refractaria al ataque por hidrólisis
enzimática (Gorocica et al., 2005). Estudios de difracción de rayos X, han demostrado
que los ácidos micólicos se encuentran orientados en paralelo y perpendicular al plano
de la superficie celular (Song et al., 2008). Las características de esta pared la
convierte en una bacteria ácido-alcohol resistente (BAAR), ya que retiene los
colorantes en presencia de alcohol ácido (North, Jung, 2004).
La membrana celular tiene las características biológicas y bioquímicas de cualquier
membrana, aunque en las micobacterias los derivados de los fosfolípidos se
caracterizan por estar altamente glicosilados dando lugar a moléculas como el
lipoarabinomanano (LAM), que tienen un papel fundamental en la patogénesis de la
tuberculosis (Gorocica et al., 2005).
Figura 1: Estructura de la pared celular de las Micobacterias
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2.4 Virulencia: Los atributos importantes de la virulencia de M. tuberculosis incluyen su posibilidad de
sobrevivir y multiplicarse intracelularmente, la habilidad de entrar en estado de latencia
ó infección (incluso décadas) y la capacidad de interferir en la respuesta inmune del
hospedero (Bokum et al., 2008).
El más notable atributo biológico de este patógeno lo constituye la composición de la
pared celular, como mencionamos anteriormente compuesta por el complejo mAGP, la
cual le confiere una hidrofobicidad, protección y sobrevivencia dentro de la célula
infectada. Se ha demostrado también la presencia de lípidos libres los cuales tienen
una gran participación en la virulencia, entre ellos se encuentran: el factor cuerda y los
sulfolípidos (Brennan, 2003).
El factor cuerda se encuentra ubicado en la capa más externa de la membrana celular
y presenta una elevada toxicidad. El mecanismo bioquímico que ejerce este factor está
relacionado con la actividad de la enzima NADasa. Esta enzima actúa sobre la
coenzima nicotinamida adenín dinuleótido (siglas en ingles, NAD+) que se encuentra
involucrada en los niveles de energía de distintos órganos del hospedero,
especialmente en el pulmón, hígado y tejido del bazo. Actúa también reduciendo la
actividad enzimática microsomal NAD-dependiente que participa en la producción de
peróxido de hidrogeno (H2O2). Su acción es también atribuible a un efecto directo
sobre las membranas mitocondriales, resultando en la interrupción del flujo de
electrones de la cadena respiratoria mitocondrial y la fosforilación oxidativa. Por otra
parte los sulfolípidos se piensa que está involucrado en el bloqueo de la fusión
fagosoma-lisosoma, sin embargo esta teoría está siendo cuestionada en la actualidad
(Brennan, 2003).
La secuenciación completa del genoma de M. tuberculosis H37Rv, ha conducido a
innumerables avances. Una fuerte evidencia indica que los genes presentes dentro de
la región de diferenciación 1 (DR1, siglas en ingles) son esenciales para la virulencia
en los miembros del complejo M. tuberculosis. Esto queda evidenciado con la deleción
de esta región en M. bovis, originada por una mutación, provocando una atenuación
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de su virulencia y derivando en la cepa vacunal bacilo Calmett Güerin (BCG). Estos
genes intervienen en la codificación de las proteínas CFP-10 (Rv3874) y ESAT-6
(Rv3875), que en la actualidad son evaluadas como candidatos vacunales y como
antígenos, en la estandarización de nuevos métodos de diagnóstico de la TB. Estas
proteínas también juegan un doble rol en el mecanismo de patogénesis de la
micobacteria tanto en el empleo vacunal como la virulencia produciendo la
desactivación del macrófago y la activación de células T (Guinn et al., 2004; Ernst et
al., 2007; Ganguly et al., 2008).
Otros genes que se encuentran en estudio son el de la proteína MgtC (Rv1811),
involucrada en la sobrevivencia intracelular del bacilo en el macrófago y la adaptación
a las limitaciones de magnesio (Alix et al., 2006) y el operon mce4 que es expresado
durante la fase estacionaria de crecimiento en cultivos y durante el curso de infección
en mamíferos hospederos. Como la proteína Mce4A es expresada durante la fase
tardía del crecimiento esto sugiere la posibilidad de que juegue un rol en la
persistencia de la infección tuberculosa (Saini et al., 2008).
2.5 Genética:
El estudio de la genética micobacteriana ha florecido en los últimos años, por el
desarrollo en los diversos métodos genéticos, secuenciamiento del ácido
desoxirribonucleico (ADN), y la secuenciación del genoma de M. tuberculosis H37Rv
que fue completada en 1998 por The Institute for Genomic Research y por the Sanger
Center-Pasteur Institute consortium (Cole et al., 1998).
El genoma de M. tuberculosis consiste de 4.4 x 106 pares de base (pb) con un alto
contenido de Guanina y Citocina (Blackwood et al., 2000). Presenta aproximadamente
4000 genes que codifican proteínas y 50 que codifican ácido ribonucleico (ARN). La
secuenciación del genoma mostró que esta bacteria tiene características únicas.
Presenta regiones bien conservadas de ADN las cuales contienen las características
de género (RD) y regiones hipervariables propias de cada especie por lo que estas
últimas son usadas para su identificación. Entre las regiones hipervariables se
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encuentran el gen hsp65, que codifica la proteína de 65 kDa (estrés térmico), regiones
genómicas de la subunidad ribosómal 16S, la región intergénica 16S-23S y los
elementos de inserción o transponibles (IS) siendo el más conocido el IS6110. De los
4000 genes que codifican para proteínas, 200 codifican para enzimas que intervienen
en el metabolismo lipídico y de estos, 100 son predecesores para la función de la β
oxidación de ácidos grasos, a diferencia de E. coli que presenta solo 50. Esta
característica está estrechamente relacionada con la peculiar composición de la pared
de M. tuberculosis (Curtiss, Haydel, 2003)
Tabla I: Distribución general de los genes de M. tuberculosis en base a su función.
Otra inusual característica del genoma de M. tuberculosis es la presencia de genes
que codifican para familias de proteínas acídicas, Pro-Glu (PE) y Pro-Pro-Glu (PPE),
que con secuencias encontradas en dos regiones conservadas N-terminal. Estás son
únicas en los miembros del complejo M. tuberculosis y muchas se encuentran
localizadas en la pared y membrana celular. Algunas de estas proteínas juegan un
papel importante en la variación antigénica de M. tuberculosis durante la infección
(Smith, 2003).
FUNCIÓN Nº de genes % del total Metabolismo lipídico 225 5.7 Vías de información 207 5.2 Pared celular y procesos celulares 517 13.0 codificación de ARNs 50 1.3 Elementos de IS y bacteriófagos 137 3.4 Proteínas PE y PPE 167 4.2 Respiración e intermediarios del metabolismo 877 22.0 Proteinas regulatorias 117 4.7 Virulencia, detoxificación y adaptación 91 2.3 función hipotética conservada 911 22.9 funcion desconocida de proteinas 607 15.3
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Figura 2: Mapa circular del cromosoma de M. tuberculosis H37 Rv. 2.6 Diagnóstico convencional: 2.6.1 Baciloscopía: Dentro de las técnicas para el diagnóstico de la TB, la baciloscopía que incluye la
tinción microbiológica de Ziehl–Neelsen ha sido la técnica de referencia en la mayoría
de los laboratorios. Se basa en la capacidad de las micobacterias para formar
complejos estables con ciertos colorantes de arylmetano como la fucsina, la cual
penetra en la pared celular uniéndose a los complejos micolil-arabinogalactano. Este
complejo retiene el colorante aún después de su exposición al alcohol ácido o ácidos
minerales (Araujo, Waard, 2004). Esta técnica diagnostica a los enfermos con TB que
son bacilíferos, o sea, que son fuente de diseminación de la enfermedad, Sin
embargo, es en este sentido donde se han observado las mayores limitaciones, ya que
este sistema necesita un número superior a 104 bacterias por mililitro para arrojar un
diagnóstico positivo. Un dato adicional que complica la aplicación de este método
como el único sistema para diagnosticar a pacientes tuberculosos, es la estimación de
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que más de la mitad de los 10 millones de casos reportados anualmente, son
infecciones pulmonares y extrapulmonares con baciloscopías negativas, los cuales
pueden diagnosticarse con un criterio clínico, histopatológico, epidemiológico,
radiológico e inmunológico (Cuevas, 2003).
2.6.2 Cultivo microbiológico: En respuesta a lo anterior, se propuso como segundo frente de batalla en el
diagnóstico de la TB, el cultivo bacteriano líquido o sólido, que se emplea para
confirmar o descartar baciloscopías negativas así como para identificar de qué agente
se trata, apoyándose en un diagnóstico clínico y radiológico positivo. El medio más
usado en los laboratorios de TB es el Löwenstein-Jensen, el cual contiene sales
definidas, glicerol y sustancias orgánicas complejas como huevo fresco o yema de
huevo o harina de papa y verde malaquita (para inhibir el crecimiento de otras
bacterias y hongos contaminantes), entre otros componentes. Otros medios
propuestos son el agar semisintético Middlebrook 7H10 y 7H11, los cuales dentro de
su composición presentan hidrolizados de caseína y albúmina que actúan inhibiendo
los efectos tóxicos de los ácidos grasos. Por otra parte los medios líquidos
Middlebrook 7H9 y 7H12 requieren de la adición de Tween (ésteres hidrosolubles de
ácidos grasos), para un crecimiento más disgregado del bacilo en el medio líquido. No
obstante, estos métodos tienen la desventaja de que tardan entre dos a ocho semanas
para arrojar un resultado (Montoro et al., 2001).
A principios de la década de los 80 salió al mercado un sistema denominado BACTEC
460, hoy en día comercializado por la compañía Becton Dickinson (BD). Este consiste
en frascos con medio líquido Middlebrook 7H12 que contienen ácido palmítico como
única fuente de carbono, éste marcado radioactivamente. Constituye el patrón de
referencia con el que se comparan todos los medios antes de ser aprobados para su
uso diagnóstico. La principal ventaja de este sistema es el incremento de la
sensibilidad y la reducción en tiempo para el diagnóstico; sin embargo su uso se
encuentra limitado por la necesidad de una infraestructura adecuada para trabajar con
material radiactivo (Harvell et al., 2000).
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A partir de 1995 empiezan a salir al mercado medios líquidos que obvian el problema
de la radiactividad y del tener que inyectar el frasco (con la teórica posibilidad de
contaminar un frasco con bacterias del frasco anterior). Estos medios se introducen en
equipos que incuban los frascos y a su vez realizan una monitorización continua de la
actividad metabólica que hay en su interior con el objetivo de determinar la presencia o
no de crecimiento. El primero en salir al mercado fue el medio de cultivo liquido,
llamado tubo indicador de crecimiento micobacterial (siglas en ingles, MGIT) el cual
contiene Middlebrook 7H9 modificado y utiliza un sensor de fluorescencia (Somoskövi,
Magyar, 1999). Seguido a este, nuevos sistemas se han puesto a prueba, como son:
el sistema MGIT BACTEC 960 (Kontos et al., 2003), el ESP Culture System II (Trek
Diagnostic Systems) y el MB/BacT ALERT 3D (BioMerieux). ESP y MB/BacT utilizan
sensores de presión y color respectivamente para detectar el crecimiento. Estos
sistemas se han introducido en la mayor parte de los laboratorios ya que reducen el
tiempo de detección de crecimiento con una alta sensibilidad lo que constituye un gran
avance (Piersimoni et al., 2001; Hines et al., 2006; Dorronsoro, Torroba, 2007;
Nyendak et al., 2009). La principal desventaja continúa siendo el alto costo para
países de bajos ingresos, donde la TB constituye un creciente problema de salud.
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2.6.3 Pruebas bioquímicas: La diferenciación entre las micobacterias del complejo M. tuberculosis y las MNT, está
determinada por tres pruebas bioquímicas fundamentales: niacina, catalasa
termoestable a 68°C y reducción del nitrato.
Prueba de la Niacina:
La niacina (ácido nicotínico) juega un papel vital en las reacciones de oxidación-
reducción que ocurren durante el metabolismo de todas las micobacterias.
M. tuberculosis la produce muy activamente y la acumula en gran cantidad porque no
puede procesarla posteriormente. En dicha prueba, el ácido nicotínico reacciona con el
bromuro de cianógeno dando lugar a una sustancia que, al unirse a una amina
aromática como la anilina o la bencidina, forma una compuesto final que se colorea de
amarillo o rosado, respectivamente. Las cepas de M. tuberculosis negativas a la
niacina son muy poco frecuentes. La acumulación del ácido nicotínico se produce en
gran medida en la fase exponencial del crecimiento de la micobacteria es decir en la
fase comprendida entre la cuarta o quinta semana del cultivo (Konno, 1956).
Prueba de la catalasa termoestable a 68° C: La catalasa es una enzima que presentan los microorganismos para protegerse del
peróxido de hidrógeno, compuesto secretado por las células del organismo hospedero.
En las micobacterias pertenecientes al complejo M. tuberculosis la actividad de esta
enzima es inhibida a 68 °C. Para evaluar su termoestabilidad, en los laboratorios se
adicionan a todos los medios analizados peróxido de hidrógeno al 3%. Esta adición
produce un abundante burbujeo en aquellas cuya enzima sea termoestable. La falta de
burbujeo es interpretado como la inactivación de la enzima y la consiguiente
negatividad de la prueba (Kubica et al., 1966).
Prueba de reducción de nitrato: Es una prueba complementaria a las anteriores y está fundamentada en la capacidad
de M. tuberculosis y algunas micobacterias ambientales de asimilar el nitrato como
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una fuente de nitrógeno (estas prefieren el amonio o la asparagina). Consiste en la
presencia de la enzima nitrato reductasa a nivel de membrana que tiene la capacidad
de reducir rápidamente el nitrato a nitrito (Virtanen, 1960).
Tabla II: Esquema de diferenciación de M. tuberculosis de las MNT.
2.7 Nuevas técnicas de identificación: Si bien las técnicas de identificación convencionales en la actualidad continúan siendo
consideradas como las técnicas de referencia para el diagnóstico microbiológico, dado
su accesibilidad en costo a todos los laboratorios de TB, queda claro que presentan
limitaciones en cuestiones de tiempo, identificación exacta y oportuno diagnóstico para
un tratamiento adecuado. A través de los años, con los avances tecnológicos y el
estudio molecular, se han desarrollado diversos métodos con el objetivo de corregir
estas limitaciones. Nuevas técnicas de identificación no convencionales se han puesto
a disposición de los laboratorios microbiológicos como: La TLC, usado en los
laboratorios de rutina para identificar aislados micobacteriales, la HPLC y la GCL.
Estos se basan en el análisis metil éster de los ácidos micólicos de la pared celular
(Chou et al., 1998; Queico et al., 2005).
M. tuberculosis MNT
Velocidad de crecimiento Lenta a partir de la tercera semana luego de inoculada una muestra en medio a base de huevos
Lenta o rápida
Aspecto macroscópico de la colonia Rugosa no pigmentada Lisa puede tener pigmentación
Aspecto microscópico Bacilos dispuestos en "cuerdas"