CD. OBREGON, SONORA, MARZO DEL 2005. INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA DEPTO. BIOTECNOLOGÍA Y CIENCIAS ALIMENTARIAS EVALUACIÓN DE LA CALIDAD SANITARIA DEL OSTIÓN PROCEDENTE DEL ESTERO EL RIITO EN EL MUNICIPIO DE HUATABAMPO, QUÍMICO TESIS QUE PARA OBTENER EL TITULO PRESENTA DALIA MORENO VALENZUELA
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SEGUNDO CAPITULO “Evaluación de la calidad sanitaria en ostión
procedente de Yavaros, Huatabampo, Sonora”
CD. OBREGON, SONORA, MARZO DEL 2005.
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA DEPTO. BIOTECNOLOGÍA Y CIENCIAS ALIMENTARIAS
EVALUACIÓN DE LA CALIDAD SANITARIA DEL OSTIÓN PROCEDENTE
DEL ESTERO EL RIITO EN EL MUNICIPIO DE HUATABAMPO,
QUÍMICO
TESIS QUE PARA OBTENER EL TITULO
PRESENTA
DALIA MORENO VALENZUELA
ÍNDICE Pagina
ÍNDICE DE TABLAS....................................................................................... i RESUMEN...................................................................................................... ii INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….. iv JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………… vi OBJETIVO GENERAL Y ESPECÍFICOS........................................................ vii HIPÓTESIS .................................................................................................... viii I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1. Ostión (Crassostrea angulata)...................................................... 1
1.1.1. Morfología………………………………………………………….... 2
1.1.2. Composición Química……………………………………………. . 4
1.1.3. Alteraciones de las Ostras…………………………………….... 5
1.1.4. Factores de Contaminación………………………………………. 6
1.2 Cultivo de ostión................................................................................ 6 1.2.1. Antecedentes ………………………………………………………. 6
1.2.2. Calidad del agua de cultivo……………………………………….. 9
1.3. Calidad sanitaria del ostión.............................................................. 10 1.3.1 Fundamentos de las técnicas de evaluación sanitaria …. .... 11
II. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................. 20 2.1 Generalidades de la zona de muestreo...................................... 20
2.2 Periodo y frecuencia de muestreo............................................. 21
2.3 Recolección y manejo de las muestras para el análisis............ 21
2.4.1.4 Recuento e identificación de Vibrio cholerae.................... 31
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN........................................................................ 32 3.1 Cuenta total viable de mesófilos aerobios.................................. 32
3.2 NMP de coliformes totales y fecales por 100 g de muestra.......... 33
3.3 Identificación de Salmonella y Vibrio cholerae............................. 35
Tabla Descripción Pagina 1 Pescado y mariscos: Composición química 4
Porcentual aproximada.
2 Valor nutritivo de algunos mariscos 5
3 Ubicación de la zona de muestreo 19
4 Fechas de muestreo 20
5 Resultados de organismos mesófilos aerobios 32
(UFC/g) en muestra de ostión.
6 Resultados NMP/100 g para coliformes totales 33
y fecales en muestra de ostión
i
RESUMEN
El ostión en los últimos tiempos ha sido uno de los mariscos mas
consumidos por el hombre, esto debido a sus características nutricionales, sin
embargo para que este no cause trastornos a la salud debe de conservar buena
calidad sanitaria. El presente trabajo se realizó en laboratorio de Microbiología de
la Dirección de Recursos Naturales del Instituto Tecnológico de Sonora (Unidad
Centro), en el periodo comprendido de Junio a Octubre de 2004, analizándose una
muestra por semana en un total de 15 muestreos; El objetivo fue realizar análisis
microbiológicos en ostión procedente del estero el Riito del municipio de
Huatabampo, Sonora, con el fin de evaluar su calidad sanitaria.
Los análisis realizados al ostión fueron: cuenta total viable de mesófilos
aerobios por el método de vaciado en placa conforme a la NOM-092-SSA1-1994,
el número más probable NMP de coliformes totales y fecales por la técnica de
tubos de fermentación múltiple, así como también aislamiento e identificación por
pruebas bioquímicas de Salmonella sp y Vibrio Cholerae. ii
Los resultados obtenidos en cuanto al conteo de mesófilos aerobios fue que
no sobrepaso el limite establecido en la norma NOM-031-SSA!-1993 de 500000
UFC/g, ya que el conteo mas alto se presentó en la muestra 15 con 168000 UFC/g
de muestra.
En cuanto al número más probable de organismos coliformes fecales
excedió el límite permitido de NMP de 230/100 g según la norma NOM-031-
SSA1-1993 en un 60%, en cuanto a coliformes totales se presentaron en un
99.99% de las muestras; por lo que respecta a Salmonella sp y Vibrio cholerae,
no fueron detectadas durante la investigación.
Por ultimo se llega a la conclusión de que el ostión no es recomendable
para consumo humano en forma fresca ya que este presentó incidencia de
organismos coliformes fecales; debido a que se alimentan filtrando el agua que
los rodea su microflora varia y refleja la calidad microbiana del agua en la que se
desarrollan (Doyle, 2001) es recomendable poner al molusco en tanques que
contengan agua limpia y libre de cualquier microorganismo para eliminar toda su
carga bacteriana antes de ser comercializado.
iii
INTRODUCCIÓN
En la actualidad los alimentos se seleccionan tomando en cuenta no sólo el
sabor sino también sus propiedades nutritivas y el ostión sigue siendo uno de los
alimentos marinos más apreciados por el hombre, aventajando a la leche, los
huevos y la carne de res (Cifuentes y colaboradores, 2004).
El ostión presenta externamente color grisáceo, sus dos conchas son
desiguales y alargadas; la inferior es mayor y abombada. Presenta
frecuentemente configuraciones retorcidas, por su íntima unión al sustrato y a
otros ostiones(Ruiz, 1993). La superficie de sus conchas es muy rugosa, con
anillos de crecimiento fuertemente escamados. Los labios de sus valvas suelen
ser muy frágiles, por lo que se pueden abrir rompiendo éstos con un cuchillo e
introduciendo éste por tal rotura para cortar el músculo aductor (Cifuentes y
colaboradores, 2004). iv
Los ostiones son moluscos del grupo de los lamelibranquios o bivalvos, al
que pertenecen gran número de especies comestibles que el hombre aprovecha
como alimento por su alto valor nutritivo y por las grandes posibilidades que tiene
el cultivarlos (Cifuentes y colaboradores, 2004).
Entre los lamelibranquios se encuentran las ostras, manjares muy
apreciados que el mar ofrece; están consideradas como uno de los moluscos de
mayor prestigio y ocupan un lugar importante en la pesca mundial. Su gran valor
económico se debe a que es uno de los organismos más estimados por los
aficionados al buen comer y su consumo se realiza en grandes cantidades
(Cifuentes y colaboradores, 2004).
Al estar cultivadas en aguas contaminadas se puede considerar como un
peligro a la salud de los consumidores, debido a que puede contener bacterias
patógenas como las que producen las fiebres intestinales y la tifoidea. Para evitar
este peligro, en algunos países, trataban a las ostras con rayos ultravioleta, hasta
que se descubrió que con sólo colocarlas en agua potable fácilmente se
eliminaban las bacterias, es decir, se "purifican" (Cifuentes y colaboradores, 2004).
Un factor importante es la manipulación que se le da al momento de ser
recolectadas, ya que estas deben de conservarse a temperaturas de 15 a 20°C,
para evitar la proliferación de microorganismos como la Salmonella sp, Echerichea
coli, Vibrio cholerae, entre otros, que pueden alterar la calidad sanitaria del
alimento.
Por lo antes es realizar exámenes microbiológicos a este tipo de alimento
ya que es una fuente portadora de diferentes tipos de microorganismos por lo que
se analizara y evaluara la calidad sanitaria del ostión procedente del estero el
Riito, en el municipio de Huatabampo, Sonora.
v
JUSTIFICACIÓN
La calidad de un producto puede definirse como su valoración al
compararlo con un estándar, de un precio determinado, considerado excelente y
satisfactorio, tanto por el productor como por el consumidor La calidad se mide
teniendo en cuenta las propiedades organolépticas, la composición química, los
atributos físicos y la flora microbiana (Fortsythe, 2003).
En los últimos años se ha incrementado la contaminación de las aguas de
mar, debido a industrias u otras fuentes como drenes, ríos que arrojan sus
desechos a las mismas y a causa de esto la fauna que vive cerca, resulta
afectada; un ejemplo es el ostión, ya que su aparato digestivo se encuentra
adaptado para filtrar agua; podemos decir que es uno de los moluscos con mas
problemas de contaminación ya que este puede anidar fácilmente bacterias u
otros microorganismos.
Debido a estas características, a su valor nutricional y a la demanda que
tiene el consumirlo fresco, resulto de gran utilidad analizarlos y evaluarlos, para
así obtener resultados confiables con respecto a la calidad sanitaria, para las
diferentes personas que consumen de este producto marino. vi
OBJETIVOS Objetivo General Realizar análisis microbiológicos en ostión procedente del estero el Riito del municipio de Huatabampo, Sonora, con el fin de evaluar su calidad sanitaria. Objetivos Específicos
⇒ Determinar la cuenta total viable de organismos mesófilos aerobios por la técnica de vaciado en placa
⇒ Cuantificar número más probable (NMP) de organismos coliformes totales
y fecales por la técnica de tubos de fermentación múltiple.
⇒ Analizar e identificar por pruebas bioquímicas a Salmonella sp y Vibrio cholerae.
⇒ Evaluar la calidad sanitaria de este alimento de acuerdo a la norma NOM-
031-SSA1-1993.
vii
HIPOTESIS
Es posible que los ostiones analizados provenientes del estero el Riito en
el municipio de Huatabampo, Sonora, no cumplan con las especificaciones
establecidas en la norma NOM-031-SSA1-1993.
viii
I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1. Ostión (Crassostrea angulata)
Los moluscos son, después de los insectos, el grupo más extendido sobre
el planeta, del cual se han clasificado aproximadamente 200 mil especies. Se les
encuentra lo mismo en la copa de los árboles que en las profundidades abisales
marinas. El estudio de estos animales ha ofrecido a los científicos, a través de la
historia, temas por demás interesantes, por lo que es uno de los grupos mejor
entendidos en la actualidad (Cifuentes y colaboradores, 2004).
Se cuenta también con los conocimientos aportados por los coleccionistas
aficionados, algunos de los cuales además del interés que les despierta la belleza
de la concha, se han adentrado en el estudio de la biología de estos animales.
Otros se han dedicado a conocer a los moluscos de interés puramente culinario,
porque éstos, además de ser altamente nutritivos, tienen sabores especialmente
agradables (Cifuentes y colaboradores, 2004). 1
Poco a poco los moluscos se fueron incorporando a la dieta de la
humanidad, aumentando el consumo de algunos de ellos, como las ostras,
los ostiones, las almejas y los pulpos, entre otros; sin embargo, en la
mayoría de los casos su explotación fue para hacer artesanias y para
consumo doméstico (Cifuentes y colaboradores, 2004).
1.1.1. Morfología
El ostión es unisexual, es decir, que cada individuo es siempre y solamente
macho o hembra. A partir de los 18° C de temperatura del agua, desde junio a
noviembre, son expulsados al agua los gametos de distintos sexos, produciéndose
la fecundación en el fondo, ya de 24 a 36 horas el huevo fecundado se transforma
en larva ciliada, siguiendo a partir de este momento una vida prácticamente igual a
la descrita para la ostra. El ostión que habita tanto en el mar como en aquellas
zonas litorales donde se mezclan aguas saladas y dulces, ya sean esteros,
desembocaduras de río o lagunas costeras (Cifuentes y colaboradores, 2004).
Las conchas que poseen son producidas por la misma ostra a través de un
órgano llamado manto y están formadas por dos valvas las cuales son ovaladas
de forma irregular y asimétrica (Ruiz, 1993); la valva inferior se fija al sustrato o a
algún objeto sumergido y está ahuecada para alojar a la masa del cuerpo que es
la que se consume; la mitad superior de la concha es más pequeña, achatada y
delgada (Cifuentes y colaboradores, 2004).
Externamente la concha presenta color grisáceo, es áspera y lisa por
dentro, en donde el carbonato de calcio que la compone se transforma en una
sustancia fluorescente de bella tonalidad que ha sido denominada "nácar (Ruiz,
1993).
2
Las estructuras que forman el cuerpo de las ostras están poco
diferenciadas; el aparato digestivo se encuentra adaptado para filtrar agua; se
calcula que penetran a la concha 150 litros al día llevando protozoarios,
huevecillos, larvas de otros organismos y pequeñas algas que son el alimento del
ostión; al salir, el agua lleva los desechos (Cifuentes y colaboradores, 2004).
Su aparato respiratorio está estructurado por las branquias de forma
laminar que son bañadas por el agua, de la que fijan el oxígeno y luego
desprenden el bióxido de carbono que sale en el agua que el animal expulsa. Su
sistema nervioso es completo y tiene un corazón formado por un solo ventrículo.
Además, el ostión tiene dos tubos llamados "sifones" que se encargan de hacer
circular el agua dentro de la concha del molusco (Figura 1) (Cifuentes y
colaboradores, 2004).
En relación a sus hábitos alimenticios, son individuos activos filtradores de
particulas alimenticias que se nutren básicamente de plancton (Ruiz, 1993).
Las dos conchas están firmemente unidas por un músculo llamado
por lo común "callo" que es muy apreciado por los aficionados a
comer ostiones, quienes opinan que es la parte más sabrosa (Cifuentes y
colaboradores, 2004).
Figura 1. Partes del Ostión (Enciclopedia Encarta, 2002)
3
1.1.2. Composición Química
Los moluscos tiene en un alto valor nutritivo, ya que contienen
vitaminas A, B, C y D; compuestos glicerofosfóricos; cloruros; carbohidratos, y
proteínas en cantidades adecuadas y de fácil digestión. Las proteínas
que están presentes son digeribles casi en un 100%, contra el 63% de
las de carne de res. Algunos moluscos, como las ostras, poseen altas
cantidades de yodo, compuesto que interviene en el funcionamiento de la
tiroides; antianémicos como el cobre y el fierro, lo cual explica la añeja
popularidad que tienen estos organismos como alimento muy nutritivo (Tabla 1)
(Cifuentes y colaboradores, 2004).
Tabla 1. Pescado y marisco: Composición química porcentual aproximada.
El periodo comprendido para el muestreo fue de tres meses, muestreando
cada semana y las fechas de muestreo se observan en la tabla 4.
Tabla 4. Fechas de muestreo
Muestras
Meses 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Junio 24 28
Julio 05 12
Agosto 04 09 16 23
Septiembre 04 13 20
Octubre 04 11 18 25
2.3 Recolección y manejo de la muestra
Lavar los moluscos bivalvos con agua potable retirando la arena y cualquier
material extraño. Desconchar la carne con cuidado, sin lesionar el cuerpo del
molusco. Colectar aproximadamente 150 gramos de carne. Descartar las conchas,
moler la carne en una mezcladora o licuadora hasta la homogeneización, pasar la
cantidad de 10 g a un frasco de dilución con 90 ml de solución buffer para ser la
primera dilución 10-1 y pasar 1 ml a un tubo con 9 ml de solución buffer la cual
será la segunda dilución 10-2 continuar hasta 10-5 (NOM-031-SSA1-1993).
21
2.4 Análisis bacteriológicos
2.4.1 Metodología para cada análisis bacteriológico
2.4.1.1 Recuento de Mesófilos aerobios.
La técnica comúnmente utilizada para determinar el contenido de
microorganismos viables en un alimento es el recuento en placa, en medios de
cultivo con un soporte nutricional adecuado y libres de agentes inhibidores
(López y colaboradores, 1993).
Metodología 1. Realizar diluciones seriadas de 10-1 a 10-5
2. Inocular 1 ml de las diluciones 102, 10-3, 10-4, 10-5 en las cajas de petri estériles
previamente rotuladas. Distribuir unifórmente en toda la área de las cajas petri
de 15 a 29 ml de medio de cultivo (agar cuenta estándar) fundido y a una
temperatura tolerable (45°C aproximadamente), sin olvidar los testigos.
3. Inmediatamente incorporar el inoculo al medio mediante 6 movimientos de
derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido
contrario y 6 de atrás hacia delante. Evitar el derrame de liquido y su contacto
con la cubierta de la caja. El tiempo transcurrido desde la preparación de la
primera dilución hasta la incorporación del medio de cultivo a todas las cajas
no debe exceder de 20 minutos.
4. Dejar solidificar e incubar a 35± 2 °C durante 48± 2 horas.
5. Reportar los promedios de colonias desarrolladas por gramo o por ml de
muestra analizada (multiplicando el numero de colonias por el inverso de la
dilución) en las 2 repeticiones.
Con los datos anteriores discutir los resultados y derivar conclusiones.
(NOM-092-SSA1-1994).
22
2.4.1.2 Recuento de organismos coliformes totales y fecales. Metodología para recuento de organismos coliformes por la técnica del numero más probable (NMP). 1. Realizar diluciones decimales de 10-1 a 10-3.
Prueba presuntiva. 2. Inocular 1 ml de cada dilución en cada uno de los tres tubos con 10 ml de
caldo lauril sulfato triptosa.
3. Incubar los tubos a 35± 2°C durante 48± 2 horas.
4. Examinar los tubos a las 24± 2 horas y observar si hay producción de gas en
la campana de fermentación, si no hay, seguir incubando hasta las 48± 2
horas.
La presencia de gas, en cualquier cantidad, dentro del tiempo de incubación
hace positiva la prueba (NOM-112-SSA1-1994).
Prueba confirmativa
5. Agitar suavemente los tubos de caldo lauril triptosa que resultaron positivos
en la prueba presuntiva.
6. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo lactosa bilis verde brillante.
Al efectuar la reinoculación sostener el tubo primario (lauril sulfato triptosa) en
un ángulo tal que se pueda tomar la asada evitando la película que existiera
en el medio. Sacar el asa del liquido en sentido perpendicular a su superficie
de manera que se forme un menisco bien definido.
7. Incubar el caldo lactosa bilis verde brillante a 35± 2°C durante 48± 2 horas.
8. Considerar la prueba positiva si hay formación de gas en cualquier cantidad.
9. Determinar el numero de organismos coliformes de acuerdo con la tabla
correspondiente, tomando como base el numero de tubos en que se observe
producción de gas. 23
10. Reportar: Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de
muestra (NOM-112-SSA1-1994)
Procedimiento para recuento de NMP de organismos coliformes fecales
1. Realizar diluciones decimales de 10-1 a 10-3.
Prueba presuntiva. 2. Inocular 1 ml de cada dilución en cada uno de los tres tubos con 10 ml de
caldo lauril sulfato triptosa.
3. Examinar los tubos a las 24± 2 horas y observar si hay producción de gas en
la campana de fermentación, si no hay, seguir incubando hasta las 48± 2
horas.
La presencia de gas, en cualquier cantidad, dentro del tiempo de incubación
hace positiva la prueba (NOM-112-SSA1-1994).
Prueba confirmativa 4. Agitar suavemente los tubos de caldo lauril tritosa que resultaron positivos
en la prueba presuntiva.
5. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a tubos de caldo EC (Eijkman) con
sus respectivas campanas de Durham.
6. Incubar los tubos de 44.5± 0.2 °C en baño de agua y observar si hay
producción de gas a las 24 o 48 horas.
7. La presencia de gas en cualquier cantidad, dentro de las 48 horas de
incubación, hace positiva la prueba.
8. Alternativamente transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo en la prueba
presuntiva, a tubos con caldo lactosa bilis verde brillante y agua peptonada
(Mackenzie).
9. Incubar los tubos a 44.5± 0.2 °C en baño de agua y observar si hay
producción de gas las 24 a 48 horas. 24
10. Adicionar al tubo de agua peptonada de 2 a 3 gotas de reactivo de Kovac
(prueba de indol). Una coloración roja hace positiva la prueba.
11. Reportar: Numero más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de
muestra (NOM-112-SSA1-1994).
2.4.1.3 Recuento e identificación de Salmonella sp.
La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un
esquema general que consiste de 5 pasos básicos:
1. Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio
nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas
a una condición fisiológica estable.
2. Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de favorecer las
poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.
3. Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que
restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y permite el
reconocimiento visual de colonias sospechosas.
4. Identificación bioquímica, este paso permite la identificación génerica de los
cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.
5. Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación
específica de un cultivo (NOM-114-SSA1-1994).
25
2.4.1.3.1 Aislamiento de Salmonella
Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de
preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la
mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de
caldo selenito cistina (NOM-114-SSA1-1994).
Incubar de 18 a 24 h a 35°C o, para alimentos fuertemente contaminados a
42°C por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente
enriquecidos en medios selectivos (NOM-114-SSA1-1994).
Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina
desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de
los medios selectivos adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto
o Agar SS) (NOM-114-SSA1-1994).
Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.
Incubar las placas 24± 2 h a 35°C.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de
Salmonella, de acuerdo con las siguientes características:
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro
negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio
enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.
Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En
algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras (NOM-114-
SSA1-1994).
26
Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés,
grises o negras; con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante
(halo) es café, tornándose posteriormente negro. Algunas cepas producen
colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran
colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales ( NOM-114-
SSA1-1994).
Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan
centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas ( NOM-114-
SSA1-1994).
2.4.1.3.2 Identificación bioquímica
Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se
encuentren bien aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular
dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina
(LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo (NOM-114-
SSA1-1994).
Incubar por 24 ± 2 h a 35°C.
Almacenar en refrigeración de 5 a 8°C las placas con medios selectivos por si es
necesario retomar más colonias (NOM-114-SSA1-1994).
Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para
Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones:
Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la
fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo
más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de
la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de
la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico ( NOM-114-SSA1-1994). 27
Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la
descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que
produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar ( NOM-114-SSA1-1994).
La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfihídrico en este medio
con ennegrecimiento a lo largo de la punción (NOM-114-SSA1-1994).
Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de
Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en
Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan
reacciones en LIA típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya
que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas
de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos
que muestren reacciones atípicas en ambos medios (NOM-114-SSA1-1994).
Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el
cultivo presenta reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de
las placas de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior y sembrar las pruebas
bioquímicas nuevamente (NOM-114-SSA1-1994).
Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos
recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad
analítica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de
enriquecimiento (NOM-114-SSA1-1994).
Prueba de ureasa
• Prueba de ureasa (convencional). Con una asa estéril, tomar crecimiento del
cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos
de caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire púrpura de las
reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35°C.
Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den
la prueba negativa (sin cambio de color del medio) (NOM-114-SSA1-1994). 28
2.4.1.3.3 Pruebas bioquímicas complementarias
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados
atípicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación
(NOM-114-SSA1-1994).
Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar
citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para
confirmar la presencia de la especie S. arizonae.
Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:
Agar citrato Simmons
Inocular por estría el tubo.
Incubar 96 ± 2 h a 35±2°C.
Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.
Medio SIM
Inocular por punción.
Incubar 24 h a 35±2°C.
Movilidad.
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.
Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.
Producción de ácido sulfihídrico.
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el medio.
Prueba negativa: ausencia de color negro.
Producción de indol: Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac.
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.
Prueba negativa: sin cambio de color. 29
Caldo RM-VP
Inocular un tubo con el medio.
Incubar 48 ± 2 h a 35±2°C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM.
Prueba de Voges-Proskauer (VP)
Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h.
Adicionar 0,6 ml de solución de alfa naftol.
Adicionar 0,2 ml de solución de hidróxido de potasio 40%.
Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).
Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35±2°C o 4 h a temperatura ambiente.
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.
Prueba negativa: sin cambio de color.
Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2°C.
Prueba de rojo de metilo (RM)
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.
Interpretar los resultados inmediatamente.
Prueba positiva: desarrollo de color rojo.
Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.
Caldo malonato
Inocular un tubo conteniendo el medio.
Incubar 40 ± 2 h a 35±2°C.
Prueba positiva: desarrollo de color azul.
Prueba negativa: sin cambio de color.
(NOM-031-SSA1-1993).
30
2.4.1.4 Recuento e identificación de Vibrio cholerae.
Metodología
Se transfieren 25 g de muestra a un matraz que contenga 225 ml de caldo
peptona alcalino e incubar durante 24 ± 2hrs.
Transcurrido el tiempo de incubación sembrar en superficie en agar TCBS
haciendo estría por agotamiento para así aislar las colonias de Vibrio, incubar
durante 24 horas.
Sembrar colonias características en pruebas bioquímicas.
- Agar TCBS. Las colonias de V. cholerae (El Tor y Clásico) son grandes, lisas,
amarillas (positivas para la fermentación de la sacarosa) y ligeramente achatadas,
con el centro opaco y los bordes translúcidos (NOM-031-SSA1-1993).
Nota: Las especies de Vibrio no producen colonias pequeñas de color crema en
agar TCBS.
Las colonias de V. mimicus, que están estrechamente relacionadas con la
especie anterior, son verdes (sacarosa negativas). La mayoría de las demás
especies de Vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y verdes
(NOM-031-SSA1-1993).
Diferenciación.
Diferenciación de los Vibrios sospechosos de los microorganismos que no son
Vibrios.
- TSI,KIA y agar inclinado de Arginina y Glucosa (AGS). Inocular las
colonias individuales en medios de cultivo TSI (Agar de Triple Azúcar y Hierro),
KIA (Agar de Hierro Kliger) y AGS, picar y estriar en el agar inclinado. Incubar los
tubos inoculados, con el tapón no muy apretado, durante 18 a 24 horas de 35-
37ºC (NOM-031-SSA1-1993).
Se recomiendan estos medios porque las reacciones permiten efectuar una
diferenciación presuntiva entre la mayoría de las especies de Vibrio, Aeromonas,
Plesiomonas shigella y otras bacterias(NOM-031-SSA1-1993).
31
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el presente trabajo se realizaron 15 muestreos procedentes de una
ostricola ubicada en el Estero el Riito, en el municipio de Huatabampo, Sonora,
recolectándose una muestra de 15 ostiones por semana, en el periodo
comprendido de Junio a Octubre del 2004.
3.1 Cuenta total viable de mesófilos aerobios
La cuenta total viable de mesófilos aerobios es un indicador de las posibles
bacterias presentes en el ostión (Tabla 5) ya que los resultados arrojados
durante las 15 muestreos no se observo un alto número de UFC/g en estas,
aunque la muestra 15 fue una de las mas altas seguida de la muestra 10, pero de
acuerdo a la NOM- 031-SSA1-1993 que establece un limite máximo de 500 000
UFC/g, quedaron dentro del limite permitido. 32
Tabla 5. Resultados de organismos mesófilos aerobios (UFC/g) en muestras de ostión.
MUESTRA FECHA DE MUESTREO
UFC/g DE MESOFILOS AEROBIOS
1 25-Jun-04 1470
2 28-Jun-04 260
3 05-Jul-04 190
4 12-Jul-04 130
5 04-Ago-04 360
6 09-Ago-04 210
7 16-Ago-04 100
8 23-Ago-04 510
9 01-Sep-04 260
10 13-Sep-04 31200
11 20-Sep-04 1210
12 04-Oct-04 1170
13 11-Oct-04 1140
14 18-Oct-04 1740
15 25-Oct-04 168000
3.2 NMP de coliformes totales y fecales por 100 g de muestra
Los coliformes son un indicador importante de la calidad sanitaria de
cualquier alimento. Según la SSA el limite permitido para este microorganismo es
de 230/100g de NMP por muestra establecido en la NOM-031-SSA1-1993, en la
Tabla 6 se pueden observar los resultados obtenidos durante los 15 muestreos.
33
Los estudios para coliformes totales y fecales, realizados en la laguna
Madre de Tamaulipas (Téllez y colaboradores, 1999), no excedieron el limite de
230/100 g situación que no se presento en las muestras analizadas procedentes
del Estero el Riito en el municipio de Huatabampo, ya que el 60% de la muestras
hubo incidencia de coliformes fecales por lo que la calidad sanitaria de este
alimento no es apta para consumo humano; mientras que el 40% restante solo se
identificaron coliformes totales (muestras 4,5,6,9 y 13. Tabla 6).
Tabla 6. Resultados NMP/100 g para coliformes totales y fecales en
muestras de ostión.
MUESTRA FECHA DE
MUESTREO COLIFORMES
TOTALES COLIFORMES
FECALES
1 25-Jun-04 110000 20000
2 28-Jun-04 2300 2300
3 05-Jul-04 2300 900
4 12-Jul-04 50000 0
5 04-Ago-04 2300 0
6 09-Ago-04 400 0
7 16-Ago-04 400 400
8 23-Ago-04 9000 9000
9 01-Sep-04 900 0
10 13-Sep-04 2000000 200000
11 20-Sep-04 20000 900
12 04-Oct-04 2300 2300
13 11-Oct-04 0 0
14 18-Oct-04 2300 0
15 25-Oct-04 5000000 50000
34
3.3 Identificación de Salmonella y Vibrio cholerae
La incidencia de Salmonella y Vibrio Cholerae, en cualquier alimento
debe ser nula ya que este tipo de microorganismos son causantes de
enfermedades patógenas para el ser humano.
La presencia de Salmonella y Vibrio Cholerae fue totalmente negativa
durante el análisis, pero se logro la identificación Enterobacterias como, Proteus,
Providencia y Escherichia coli, esto en comparación de los resultados de las
pruebas bioquímicas.
35
CONCLUSIONES
En presente trabajo se llegó a las siguientes conclusiones:
• En organismos mesófilos aerobios el 100 % de las muestras cumplió con el
limite permitido siendo este de 500 000 UFC/g.
• El 99.99% de las muestras analizadas fueron positivos para coliformes
totales, presentándose una incidencia del 60% para coliformes fecales.
• En el 100 % de las muestras no hubo incidencia de Salmonella sp.
• El 100 % de las muestras no hubo incidencia de Vibrio Cholerae.
Los parámetros bacteriológicos del ostión cumplieron para mesófilos
aerobios, Salmonella y Vibrio Cholerae, de acuerdo al NOM-031-SSA1-1993,
para moluscos frecos-refrigerados y congelados debido a que no se detecto la
presencia de estos microorganismos, en cuanto a coliformes fecales el limite
permitido de 230/100 g excedió, por lo que no cumplió con el requerimiento en
dicha norma.
36
RECOMENDACIONES
• Conforme a los resultados obtenidos se recomienda no consumir el ostión
en forma fresca ya que se encontraron organismos de tipo fecal que
pudieran causar daño a la salud.
• Verificar que no existan posibles descargas de agua residual en el lugar
donde sea cultivado el ostión que puedan perjudicar la calidad sanitaria de
este.
• Realizar monitoreos al agua de cultivo, para cerciorarse de que esta
realmente cumpla con especificaciones sanitarias.
• Finalmente hay que hacer la observación de que el ostión por
autodepurarse y alimentarse por filtración de agua y al colocarse en agua
de buena calidad microbiología eliminan de su organismo cualquier
bacteria que pueda causar daño al ser humano (Roberts, 2000)
37
BIBLIOGRAFIA Adams, M.R. y Moss M.O. 1997. Microbiología de los Alimentos 1era edición.
Wood, P.C. 1977. Manual de higiene de los mariscos. Editorial Acribia S.A.
Zaragoza España. Pag 23-28.
http://www.mundoostion.co.cl/proceso.htm 2004.
http://ecologia.unex.es/ostras/ostras.html 2004.
http://omega.ilce.edu.mx:3000/sites/ciencia/volumen2/ciencia3/087/htm/sec_10.htm 2004. El océano y sus recursos X. Pesquerías. Autores: Juan Luis Cifuentes Lemus/ Pilar Torres-García/ Marcela Frías M. 39