Parte IV
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Parte IV
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PARTE IV: ANÁLISIS DE LA TRANSLOCACIÓN CALCIO-DEPENDIENTE DE LA ANEXINA A6 Líneas celulares
Los experimentos descritos a continuación fueron realizados en la línea
c1.1000 (=c1p), obtenida a partir de CHO y sobreexpresa establemente la
anexina A6-EGFP (ver Anexo I). En algunos ensayos, se utilizó
alternativamente la línea celular COS-1 (de riñon de mono) transfectada de
forma transitoria con pcDNA3.1(+)-Anexina A6-EGFP, al expresar estas células
en mayor cantidad los marcadores requeridos.
El empleo de anexina A6-EGFP junto con la posibilidad de realizar
videomicroscopía constituye una aproximación in-vivo que solventa artefactos
derivados del aislamiento bioquímico o de la fijación. Asimismo permite el
establecimiento de una secuencia de acontecimientos rápidos (t < 1 min) que
son obviados en otras aproximaciones.
La Anexina 6 sobreexpresada en células CHO salvajes y en células COS se
transloca desde el citosol a la membrana plasmática en respuesta a un
incremento de calcio intracelular.
Células CHO-AnxA6 o COS transfectadas transitoriamente con el vector
pcDNA 3.1(+)-Anexina A6-EGFP son deprivadas 1 hora en DMEM-Hepes-0%
FCS-0.1% BSA. Seguidamente las células se incuban en presencia de W13 (10
µg/ml) o bien IONOMICINA (1µM) añadidos al mismo medio de cultivo con el
fin de inducir un incremento transitorio de calcio intracelular. El análisis por
videomicroscopía del cultivo muestra cómo la anexina A6 rápidamente se
transloca desde el citosol hacia la membrana plasmática en respuesta al
tratamiento con el ionóforo. Esta translocación hacia la membrana inicialmente
acontece de forma generalizada, si bien posteriormente existe un reclutamiento
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hacia microdominios concretos. El tiempo (segundos) después de la adición de
la droga está indicado (ver Figura 1). Los controles (no mostrados) fueron
tratados del modo descrito con idénticas diluciones de DMSO (solvente de la
IONOMICINA) o W12 (análogo inactivo del W13), no observándose en ningún
caso la translocación de la anexina hacia la membrana.
El W13 (N-(4-aminobutil)-5-cloro-2-naftalensulfonamida) es una droga utilizada
previamente como inhibidor específico de la calmodulina (Hidaka H and Tanaka
T, 1983). No obstante, también ha sido descrita la capacidad de éste tipo de
inhibidores de disminuir el pH citosólico e incrementar el calcio intracelular a
partir de la liberación del catión de los reservorios intracelulares (Watanabe H
et al., 1999), parámetros (pH y calcio) capaces de modular la distribución de
las anexinas. La adición de Ionomicina (1 µM), ionóforo potente ampliamente
utilizado en la generación de incrementos de calcio intracelular, desencadenó
idéntica translocación, confirmando así la hipótesis del calcio y descartando el
papel de la calmodulina o del pH intracelular. Del mismo modo, la presencia de
HEPES en el medio de cultivo contribuye a estabilizar el pH, minimizando la
implicación de este factor.
Observación de los niveles de calcio intracelular
Con el fin de demostrar que el W13 era capaz de generar incrementos de
calcio también en nuestro sistema se monitorizaron los niveles in-vivo de calcio
intracelular en células CHO.
Brevemente, células CHO-AnxA6-EGFP deprivadas durante 1-2 horas en
medio 0% FCS, 0.1% BSA, DMEM-Hepes se cargan con el fluoróforo no-
radiométrico Fluo 4-AM (ver Material y Métodos). Después de lavar las células
en DMEM-Hepes, se enfoca el campo deseado y se comienza a grabar durante
2 minutos con el fin de descartar la existencia de picos de calcio espontáneos.
A continuación se añade cuidadosamente el W13 (10 µg/ml) disuelto en un
volumen de 100 µl de medio.
239
Figura 1. La anexina A6 sobreexpresada en células CHO-wt o COS se
redistribuye rápidamente desde el citosol a la membrana en respuesta a
un estímulo. Células COS o CHO transfectadas con el vector pcDNA-anexina
A6-EGFP y deprivadas 2 horas en DMEM-Hepes-0% FCS-0.1%BSA se
incuban con W13 o IONOMICINA para inducir un incremento del calcio
intracelular. Se observa como rápidamente (t = 30-90 segundos) se
desencadena una translocación masiva de anexina soluble hacia la membrana.
Una vez en la membrana, la anexina se concentra progresivamente en
dominios puntuales (t = 2-10 minutos).
0’’ 30’’ 60’’
90’’ 120’’ 150’’
180’’ 300’’ 600’’
0’’ 30’’ 60’’
90’’ 120’’ 150’’
180’’ 300’’ 600’’
240
En la Figura 2 (a) se muestra un campo seleccionado, donde se observan
varias células que desencadenan incrementos transitorios de calcio intracelular
(indicadas con flechas) ante el tratamiento con W13. En la gráfica (b) se
observa el espectro de fluorescencia a lo largo del tiempo para varias células
seleccionadas (ttotal = 10 min).
En el presente estudio se utiliza indistintamente el ionóforo IONOMICINA y la
droga inhibidora de la calmodulina W13. Ambos componentes actúan a través
de procesos muy diferentes y las oscilaciones del calcio intracelular son
distintas. Así, mientras que el ionóforo IONOMICINA permeabiliza la membrana
plasmática dejando entrar el calcio del medio extracelular hacia el citosol, el
W13 libera el calcio de los reservorios intracelulares (Watanabe H et al., 1999).
Esta diferente naturaleza se traduce en incrementos de calcio transitorios para
el W13 y permanentes en el caso de la IONOMICINA. Curiosamente, una vez
translocada la anexina A6, en ambos casos permanece asociada a la
membrana y se concentra progresivamente en los microdominios
mencionados, sugiriendo así la existencia de mecanismos independientes de
calcio a este nivel.
La observación detallada de dicha respuesta indica que la translocación de la
anexina A6 acontece de forma simultánea al incremento de calcio intracelular.
Del mismo modo, la mayor capacidad de la IONOMICINA de inducir
incrementos del catión se traduce en porcentajes más elevados de
translocación.
Caracterización de los dominios receptores de la anexina A6 translocada
Células COS transfectadas transitoriamente con anexina A6-GFP se tratan,
según se ha descrito con anterioridad, con el ionóforo IONOMICINA (1 µM), o
con W13 (10 µg/ml), por los tiempos indicados. Las células se fijan durante 30
minutos con PFA 4 % y permeabilizan 3 minutos en PBS-Triton 0.1%-BSA
0.1% a temperatura ambiente.
241
t = 0 t = 30''
t = 90'' t = 60''
(a)
W13W13
(b)
242
Figura 2. El incremento de calcio intracelular desencadena la
translocación de anexina A6. Células CHO-wt o CHO-AnxA6GFP se deprivan
1 hora 30 minutos en DMEM-Hepes-0% FCS-0.1 % BSA (los últimos 10
minutos de deprivación se realizan a temperatura ambiente). A continuación las
células se precargan con el fluoróforo Fluo4-AM 2 µM - Pluronic 0.02% disuelto
en el DMEM - Hepes - 0% FCS - 0.1 % BSA (ver Material y Métodos) durante
30-45 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar (3 × 1 min) las
células con HBSS, se añade medio DMEM-Hepes-0% FCS-0.1 % BSA a 37 ºC
y se incuba durante 5 minutos. A continuación se monitoriza la concentración
basal de calcio, y se añade W13 captando la fluorescencia emitida mediante
microscopía confocal in-vivo (a). Las líneas (b) representan las medidas de
fluorescencia capturadas por espacio de 10 minutos en células individuales. Se
observan incrementos transitorios del calcio intracelular pocos segundos (45-
60) después de la adición de W13. Estas oscilaciones de calcio coinciden en el
tiempo con la translocación de anexina A6 observada anteriormente, si bien la
anexina no retorna al citosol después de la recuperación de los niveles del
catión.
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La immunocitoquímica se realiza con anticuerpos monoclonales anti-EEA-1 o
anti-cadena pesada de la clatrina (X-22), ambos en rojo. Las imágenes
deconvolucionadas se obtuvieron en un microscopio de epifluorescencia
invertido (Zeiss© Axiovert 200) acoplado a una cámara digital Cool SNAP-HQ
(Photometrics©).
Anteriormente se había descrito la presencia de Anexina A6 en vesículas
recubiertas de clatrina de forma calcio-independiente (Turpin E et al., 1998) así
como su funcionalidad en el budding de estas vesículas (Lin HC et al., 1992).
Del mismo modo, la localización de diversas anexinas en el compartimento
endosomal, como la A2 o la A6, ha sido ampliamente demostrada (revisado en
Raynal P and Pollard HB, 1994). Las imágenes obtenidas (ver Figura 3)
confirman que las estructuras enriquecidas en GFP-anx A6 en respuesta al
incremento de calcio intracelular no son endosomas tempranos positivos para
EEA-1 (early endosomal antigen -1) ni vesículas recubiertas de clatrina (CCP).
Además, observamos como dichas estructuras son básicamente estáticas, con
la mayor parte de anexina A6 secuestrada en la membrana plasmática.
La subunidad B de la Toxina Colérica (CTB) colocaliza con las estructuras
positivas para anexina A6.
Células COS transfectadas con anexina A6- GFP se deprivan en DMEM-
Hepes-0%FCS-0.1%BSA durante 1-2 horas. Pasado este tiempo, las células se
incuban a 37 ºC en presencia de 10 µg/ml de CTB-Alexa 594 diluida en DMEM-
Hepes-0%FCS-0.1%BSA, durante 2 minutos. Después de lavar las células en
medio atemperado, se tratan con IONOMICINA del modo descrito, por los
tiempos indicados. Las secuencia de imágenes (ver Figura 4), obtenidas en un
microscopio de epifluorescencia invertido acoplado a una cámara digital,
revelan una abundante colocalización (flechas) de la anexina A6-GFP (en
verde) y la CTB-Alexa 594 (en rojo), indicando que estas estructuras podrían
ser lipid rafts.
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Figura 3. Caracterización de los dominios de concentración de anexina
A6. Células COS transfectadas con pcDNA-anexina A6-EGFP se deprivan y a
continuación se induce un incremento del calcio intracelular con W13 o bien
con IONOMICINA. La monocapa se fija, permeabiliza en PBS-Triton 0.1%-BSA
0.1% y somete a immunofluorescencia con un anticuerpo primario contra EEA-
1 o la cadena pesada de la clatrina (ambos en rojo). Las imágenes de
microscopía confocal sugieren que las estructuras que acumulan anexina A6-
EGFP (verde) no son endosomas tempranos ni vesículas recubiertas de
clatrina.
t = 0' t = 5'
t = 15' t = 10'
Anx A6-GFP / Anti-clathrin
Anx A6-GFP / Anti-EEA-1
Anx A6-GFP / Anti-EEA-1
Anx A6-GFP / Anti-EEA-1
245
0’
2’
8’
Figura 4. La subunidad B de la
toxina colérica (CTB) co-localiza
con las estructuras positivas para
anexina A6. Células COS
transfectadas con pcDNA-anexina A6-
EGFP se preincuban 2 minutos con
CTB-Alexa 594 (ver Tratamientos).
Después de lavar las células con
medio a 37 ºC, se tratan con
IONOMICINA o W13 por los tiempos
indicados. Las imagenes
deconvolucionadas, extractadas de
una secuencia de videomicroscopía,
indican que la anexina A6-EGFP (en
verde) se redistribuye hacia dominios
(flechas) positivos para la CTB (en
rojo), en respuesta a un incremento
del calcio intracelular.
2’
246
La translocación calcio-dependiente de anexina A6 hacia los lipid rafts había
sido descrita anteriormente por otros así como por nuestro propio grupo de
investigación. Así, el aislamiento bioquímico de lipid rafts a partir de
membranas de células CHO tratadas in-vitro con diferentes concentraciones de
calcio, muestra como la anexina A6 se distribuye en las fracciones de lipid rafts
en presencia del catión a concentraciones por encima de 2 µM (resultados no
mostrados). Otros han demostrado, incluso, como la anexina A6 es una de las
proteínas fosforiladas en estos microdominios (Sprenger RR et al., 2004)
La observación de la secuencia de imágenes obtenida en el presente apartado,
permite observar como, en paralelo a la redistribución de anexina A6 hacia los
microdominios donde se concentra la toxina colérica, se produce asimismo una
redistribución de éste marcador, parte del cuál se encontraba de forma
dispersa en la membrana. Esta observación nos hace pensar que la
translocación masiva y redistribución posterior de la anexina A6 podría
participar en procesos de coalescencia de lipid rafts (Simons K and Toomre D,
2000), de forma similar a lo postulado para la anexina A2 en células
musculares (Babiychuk EB and Draeger A, 2000).
Las estructuras positivas para anexina A6 codistribuyen parcialmente con F-
actina.
Células COS son transfectadas con anexina A6-GFP (en verde) y deprivadas
1-2 horas en DMEM-Hepes-0% FCS-0.1% BSA, preincubándose a
continuación con W13 (10 µg/ml) durante 10 minutos a 37 ºC. Las células se
fijan 30 minutos en 4 % PFA-PBS y se permeabilizan en PBS-0.1% TX-100-
0.1% BSA durante 3 minutos a temperatura ambiente. La F-actina (en rojo) se
marca con Faloidina-TRITC (30 µg/ml) diluida en PBS. Las imágenes son
captadas en un microscopio confocal espectral Leica© TCS SL con un objetivo
100X (grosor de sección óptica = 236 nm). La Figura 5 muestra una sección
óptica X-Y (a) y dos cortes X-Z de diferentes zonas de la misma célula (b). Se
observa parcial codistribución de F-actina y anexina A6 en la región
juxtamembrana (flechas).
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Figura 7. La anexina A6 de la membrana codistribuye parcialmente con F-
actina. Células COS transfectadas con anexina A6-GFP (en verde) y
preincubadas (ver Tratamientos) con W13, se fijan y permeabilizan. La F-actina
(rojo) se visualizó con faloidina-TRITC (30 µg/ml). Las imágenes de
microscopía confocal muestran un significativo grado de colocalización entre la
anexina y el citoesqueleto subyacente a la membrana. Se observa una sección
X-Y (a) y dos transversales X-Z (b).
(b)
(a)
(b)(b)
(a)(a)
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El marcaje de F-actina pone de manifiesto que parte de las estructuras que
concentran la anexina A6 contienen citoesqueleto cortical subyacente. La
observación de los cortes transversales indica además que son estructuras de
membrana o yuxtamembrana.
Ha sido descrito como la presencia de componentes de citoesqueleto
disminuye los requerimientos de calcio para la asociación de las anexinas a
componentes de lipid rafts (Babiychuk VS et al., 2000). Gerke y colaboradores
describen como el heterotetrámero anexina A2-p11 se concentra in-vivo en
estructuras macroscópicas ricas en F-actina, colesterol y glicosfingolípidos,
creados por la célula en respuesta a la infección con E.coli (Zobiack N et al.,
2002). Recíprocamente, la extracción del colesterol de la membrana conlleva la
disociación de anexina A2 junto con elementos del citoesqueleto de actina
(Harder T et al., 1997).
Las estructuras observadas en el presente estudio, que concentran anexina A6
y asimismo acumulan colesterol, se asemejan a estos dominios macroscópicos.
En ellos, la baja movilidad de la anexina A6 podría deberse a la estabilización
de esas regiones a través del citoesqueleto subyacente.
Del mismo modo, novedosos análisis por microscopía de la activación de Ras
han permitido observar una distribución subcelular coincidente con la mostrada
aquí para las formas activas de Ras e incluso para factores accesorios como
GAPs en respuesta a incrementos de calcio intracelular (ver Introducción).
Deficiente translocación de anexina A6 hacia la membrana plasmática en
células pre-tratadas con ciclodextrina.
Células CHO que sobreexpresan de forma estable GFP-Anexina A6 se
deprivan 1 hora a 37 ºC en DMEM-Hepes-0.1 % BSA y a continuación se
preincuban en presencia de una solución al 2 % de β-metil-ciclodextrina en
medio DMEM-Hepes-0.1 % BSA, durante 30 minutos a 37ºC. Después de lavar
en DMEM-Hepes-0.1 % BSA, las células se incuban con W13 (10 µg/ml) según
se ha descrito y por los tiempos indicados.
249
0' 2'
4' 10'
Figura 6. El pretratamiento con β-metil-ciclodextrina interfiere en la
translocación de la anexina A6 hacia la membrana. Células CHO que
sobreexpresan establemente la anexina A6 se deprivan y preincuban con un 2
% de ciclodextrina diluido en el medio, durante 30 min a 37ºC. Después de
lavar las células en DMEM-Hepes-0.1%BSA, se añade W13 (o IONOMICINA),
por los tiempos indicados. La microscopía in-vivo muestra, en estas
condiciones, una translocación deficiente de la anexina A6 hacia la membrana
plasmática.
250
Las imágenes de videomicroscopía obtenidas en el microscopio de
epifluorescencia invertido (ver Figura 6) muestran un deficiente grado de
translocación de la anexina A6-GFP hacia la membrana.
Estos resultados indican que la extracción del colesterol de la membrana inhibe
codistribución de anexina en estos lipid rafts. Esta observación había sido
descrita en células musculares (Draeger A en: “Molecular and Cellular
Physiology of the Annexins”, Banff 22-25/03/2003), en las cuáles las anexinas
A6 y A2 se asocian de forma dependiente de colesterol a lipid rafts no
caveolares.
En el presente trabajo observamos que existe un inicio de translocación
generalizada hacia la membrana en las células tratadas con ciclodextrina, que
no progresa hacia la redistribución dentro de la membrana, sino que la anexina
A6 retorna rápidamente al citosol, o, en menor grado, permanece retenida en
membranas de compartimentos intracelulares. Postulamos que los
mecanismos que regulan el anclaje (pero no la translocación inicial) de la
anexina a la membrana plasmática son dependientes de la presencia de
colesterol e independientes de calcio.
Lenta recuperación del pool citosólico de la anexina A6 a través de un
mecanismo asociado a membranas
Después del tratamiento descrito anteriormente se realiza un lavado de las
células y se deja recuperar el cultivo en medio DMEM-Hepes-0.1% BSA por los
tiempos indicados. Se observa (Figura 7) como, contrariamente a la rápida
translocación hacia la membrana plasmática, el retorno de la molécula desde
los microdominios descritos al citosol se realiza a través de un proceso más
lento, y parcialmente asociado a membranas. En este sentido, se observan
algunas vesículas conteniendo la anexina A6-EGFP que viajan desde las zonas
de concentración de la membrana plasmática hacia compartimentos
perinucleares por determinar (flechas).
251
Figura 7. A tiempos posteriores se observa anexina A6 asociada a
vesículas de apariencia endosomal. Células CHOwt transfectadas
establemente con pcDNA-anexina A6-EGFP se deprivan y tratan con W13. Con
posterioridad al reclutamiento calcio-dependiente hacia la membrana, se lava la
monocapa en DMEM-Hepes-0.1% BSA y se mantiene a 37 ºC. Una parte de la
anexina A6 se observa (t>10 min desde la adición de W13) asociada
estructuras de apariencia endosomal (flechas). Esta asociación precede a la
recuperación lenta del pool intracelular de anexina A6 (t= 30 min).
1’ 5’ 7’
9’ 15’ 30’
N
1’ 5’ 7’
9’ 15’ 30’
N
252
Postulamos que estas vesículas podrían ser endosomas, al observar su
movilidad, si bien se requieren evidencias adicionales confirmando esto último.
Así, nuestra hipótesis es que la translocación hacia la membrana en respuesta
a calcio así como la redistribución modulada por el colesterol podrían constituir,
además, un mecanismo para incorporar, de forma moderada y en un proceso
más lento (>30 minutos), parte de la anexina A6 al compartimento endocítico,
en el cuál ha sido ampliamente demostrado el papel de la anexina A6. Los
resultados obtenidos recientemente en células acinares (Thomas DD et al.,
2002), en las cuáles la translocación calcio-dependiente de la anexina A6 hacia
los lipid rafts podría servir para modular procesos de secreción, apunta en este
mismo sentido.
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