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UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU”

DE LAS VILLAS

UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA

Caracterización de Moniliophthora roreri Evans et al. y evaluación de

alternativas de control biológico en cacao, para la Amazonía ecuatoriana

TESIS PRESENTADA EN OPCIÓN AL GRADO CIENTÍFICO DE

DOCTOR EN CIENCIAS AGRÍCOLAS

KARINA MARÍA ELENA CARRERA SÁNCHEZ

SANTA CLARA, CUBA

2016

UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU”

DE LAS VILLAS

UNIVERSIDAD ESTATAL AMAZÓNICA

Caracterización de Moniliophthora roreri Evans et al. y evaluación de

alternativas de control biológico en cacao, para la Amazonía ecuatoriana

TESIS PRESENTADA EN OPCIÓN AL GRADO CIENTÍFICO DE

DOCTOR EN CIENCIAS AGRÍCOLAS

Autora: Ing. Karina María Elena Carrera Sánchez, M.Sc.

Tutor: Prof. Tit., Ing. Manuel Rafael Díaz Castellanos, Dr. C.

SANTA CLARA, CUBA

2016

DEDICATORIA

A Dios porque sin él nada soy.

A Pedro Carrera y Yolanda Sánchez mi ejemplo de vida.

A Byron Loaiza por su infinita paciencia, mi pilar fundamental y

compañero de vida.

A Sebastián y Emilia Loaiza Carrera mis adorados hijos, por ser mi

inspiración, por soportar mi ausencia y ser mi fortaleza.

A mi hermano Marcelo Carrera por darme ánimos y sostenerme siempre.

A toda mi familia.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, de manera especial al cuerpo docente

y científico, quienes contribuyeron en mi formación académica.

A las autoridades y docentes de la Universidad Estatal Amazónica quienes oportunamente

respaldaron el desarrollo de mi investigación doctoral.

A mi tutor de tesis, Dr. C. Manuel Díaz Castellanos por su amistad, experiencia, paciencia

y motivación para que pueda concluir mi investigación con éxito.

A los Dr. C. Alexander Bernal, Leonides Castellanos, Cristóbal Ríos, Luis Bravo y Javier

Domínguez, por la revisión del documento científico y su gran amistad.

A la Dra. C. Novisel Veita por ayudar en el procesamiento estadístico de la investigación.

A los Dr. C. Roldan Torres y Orelvis Portal, por su guía oportuna en la identificación

molecular del presente trabajo.

A mis grandes colaboradores Daisy Changoluisa, Laura Mosquera, Lizbeth Cevallos, Tirsa

Kuja y Henrry Tuqueres por su incondicional apoyo en la realización de la investigación.

Al Dr. C. Michel Leiva Mora por sus valiosos aportes en el montaje de los experimentos.

Al Ing. Henry Navarrete por su apoyo en la interpretación de la información geográfica.

Al personal técnico y docente del Instituto Biotecnológico de Plantas por todo el apoyo y

conocimiento brindado.

A todos los pequeños productores amazónicos de cacao, por engrandecer con su trabajo

diario a mi país Ecuador, de manera especial a la Asociación KALLARI, por todo el apoyo

brindado.

A Susy, María Victoria, Diana, Lorena, Yuri, Duby, Amanda y Carmita mis entrañables

amigas y soporte, gracias por estar siempre conmigo.

A Mayrita y mi familia cubana, los llevo en mi corazón.

A todos mis familiares y amigos, quienes pusieron un granito de arena para la realización

de mi sueño.

A todos mil gracias.

Mira que te mando que te esfuerces y seas valiente;

no temas ni desmayes,

porque Jehová tu Dios estará contigo

en donde quiera que vayas.

Josué 1:9

SÍNTESIS

El presente trabajo tuvo como objetivo caracterizar aislados de Moniliophthora roreri

procedentes de la Amazonía ecuatoriana para evaluar la respuesta de genotipos de cacao y

alternativas de control biológico de la Moniliasis en plantaciones orgánicas de cacao. A

partir de mazorcas colectadas en seis fincas de producción orgánica de cacao cultivar

Nacional, ubicadas en la provincias de Napo, Pastaza y Morona Santiago, se realizaron

aislamientos del hongo patógeno, que posteriormente fueron identificados mediante

caracterizaciones culturales, morfológicas, fisiológicas, moleculares y patogénicas.

Además, se determinó la respuesta de genotipos de cacao frente a la inoculación artificial

de M. roreri en ensayo monocíclico, utilizando mazorcas sanas y cinco genotipos de cacao

inoculados con una mezcla de los aislados más agresivos; se evaluaron las variables

Severidad Interna, Severidad Externa, Índice de Infección, Área Bajo la Curva del Progreso

de la Enfermedad, y susceptibilidad de los genotipos. Finalmente se evaluaron in vitro e in

vivo alternativas de control biológico de la Moniliasis del cacao mediante la determinación

del Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial, y la eficacia técnica de aislados de

Trichoderma spp. caracterizados cultural y molecularmente. Como resultado, se obtuvieron

20 aislados de M. roreri cuyas características culturales, morfológicas, fisiológicas,

moleculares y patogénicas se correspondieron con la especie. Todos los genotipos de cacao

inoculados artificialmente con M. roreri, manifestaron los síntomas característicos de la

Moniliasis en mazorcas, siendo el cultivar Nacional el más susceptible. Los mejores

resultados en cuanto al efecto in vitro e in vivo de los tratamientos con Trichoderma spp.

sobre M. roreri se obtuvieron con los aislados UEA-Th1 (Trichoderma harzianum) y UEA-

Tv3 (Trichoderma viride) este último mostró la mayor eficacia técnica en el control de

M. roreri en condiciones de campo.

INDICE

INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 1

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 6

2.1. Origen, importancia y clasificación del cacao................................................................6

2.2 Descripción botánica del cacao...................................................................................... 9

2.3 Variedades de cacao......................................................................................................11

2.4 Principales enfermedades fúngicas del cultivo............................................................13

2.4.1 Escoba de bruja ..................................................................................................... 14

2.4.2 Mal de machete ..................................................................................................... 14

2.4.3 Mazorca negra ....................................................................................................... 15

2.4.4 Moniliasis .............................................................................................................. 15

2.5. Área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE)......................................30

3. MATERALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 31

3.1 Caracterización cultural, morfológica, fisiológica, molecular y patogénica de aislados

de M. roreri...........................................................................................................................32

3.1.1 Caracterización cultural de M. roreri ..................................................................... 32

3.1.2 Caracterización morfológica de M. roreri .............................................................. 34

3.1.3. Caracterización fisiológica de M. roreri ................................................................. 34

3.1.4. Identificación molecular de aislados de M. roreri .................................................. 37

3.1.5. Caracterización patogénica y agresividad de los aislados de M. roreri .................. 39

3.2 Respuesta de genotipos de cacao frente a M. roreri en un ensayo monocíclico.........41

3.3 Caracterización cultural y molecular de Trichoderma spp. procedentes de

plantaciones de cacao orgánico............................................................................................. 42

3.4 Evaluación de la actividad antagónica in vitro de Trichoderma spp. frente a

M. roreri................................................................................................................................44

3.5. Evaluación de la eficacia de aislados nativos de Trichoderma spp. y biopreparados

comerciales en el control de la Moniliasis del cacao en condiciones de campo..................48

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................ 51

4.1. Caracterización cultural, morfológica, fisiológica, molecular y patogénica de aislados

de M. roreri........................................................................................................................... 56

4.1.1. Caracterización cultural de M. roreri ....................................................................... 56

4.1.2. Caracterización morfológica de M. roreri ................................................................ 60

4.1.3. Caracterización fisiológica de M. roreri ................................................................... 63

4.1.4. Identificación molecular de aislados de M. roreri .................................................... 67

4.1.5. Caracterización patogénica y agresividad de los aislados de M. roreri .................... 69

4.2. Respuesta de genotipos de cacao frente a M. roreri en un ensayo monocíclico...........73

4.3. Caracterización cultural y molecular de Trichoderma spp. procedentes de plantaciones

de cacao orgánico..................................................................................................................82

4.4. Evaluación de la actividad antagónica in vitro de Trichoderma spp. frente a

M. roreri............................................................................................................................... 86


comerciales en el control de la Moniliasis del cacao en condiciones de campo...................92

5. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 98

6. RECOMENDACIONES ............................................................................................... 99

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANEXOS

Introducción

Introducción

1

1. INTRODUCCIÓN

El cacao (Theobroma cacao L.) es una planta oriunda de los trópicos húmedos de América

del Sur, cuyo centro de origen se ubica en el noroeste, en la zona alta amazónica (Enríquez,

2010).

Desde 1830 Ecuador produce cacao fino de aroma, con el uso del cultivar Nacional, que

ocupa aproximadamente 243 146 ha, de las cuales solo se manejan 2 294 ha. Ecuador

exporta anualmente entre 250 000 y 300 000 t, por lo que este cultivo constituye una de las

principales fuentes generadoras de divisas y trabajo. El año 2015 cerró las exportaciones

con 260 000 t en productos semielaborados equivalentes a su peso en gramos de cacao, de

esta cifra el 87% corresponde a granos, 12% a productos semielaborados y 1% a productos

terminados de cacao. Según el Servicio Mensual de Estadísticas de Exportación de cacao en

Ecuador, en la última década se ha incrementado en un 110% la exportación y producción

de cacao. Para 2016 se piensa cerrar con 300 000 t de granos elaborados de cacao

(ANECACAO, 2015a; ANECACAO, 2015b).

En Ecuador se produce cacao en 16 provincias de las 24 que posee, la mayor producción se

encuentra localizada en la región Litoral, Amazonía y en aquellas ubicadas en las

estribaciones de la Cordillera de los Andes (INIAP, 2012). De la superficie nacional, el

8,86% corresponde a la región norte de la Amazonía con 44 300 ha, de las cuales el 83% de

la superficie corresponde a cacao cultivar Nacional y el restante 17% a otros tipos de

cacaos trinitarios (Moreno y Flores, 2011).

El cacao constituye uno de los principales rubros desde el inicio de la colonia en la Región

Amazónica Ecuatoriana (RAE) por su importancia en la generación de ingresos para las

familias de los productores; sin embargo, el cultivo no está exento de problemas

fitosanitarios como: Moniliasis (Moniliophthora roreri Evans et al.), Mazorca negra

(Phytophthora palmivora (E.J. Butler)) y Escoba de bruja (Moniliophthora perniciosa

Aime & Phillis-Mora), los cuales constituyen los principales factores limitantes de la

producción y donde el manejo integrado del cultivo es la estrategia más exitosa

(INIAP, 2012).

Introducción

2

La Moniliasis es una de las enfermedades más destructivas del cacao, registrada en 11

países latinoamericanos (Phillips-Mora, 2006a). La severidad del ataque del hongo

patógeno varía según la zona y época del año, de acuerdo con las condiciones climáticas

que prevalezcan (PROAMAZONÍA, 2003). Sánchez-Mora et al. (2011) informaron que en

Ecuador las pérdidas pueden llegar hasta un 60%.

Frente a este panorama, se han llevado a cabo varios estudios sobre el organismo patógeno

con el fin de identificar su origen, formas de diseminación, diversidad genética y

caracterización de la Moniliasis. Evans et al. (1978), realizaron estudios de la taxonomía de

M. roreri, y describieron los caracteres morfológicos de este hongo fitopatógeno, lo cual

constituyó la base fundamental para su estudio y clasificación.

Phillips-Mora (2003), en su trabajo Origen, biogeografía, diversidad genética y taxonomía

de M. roreri, realizó una descripción de aislados procedentes de Centroamérica, Venezuela,

Colombia, Ecuador y Perú, cultivó el hongo fitopatógeno en medio V8 modificado a 20 ºC

durante 20 días, y determinó que la velocidad de crecimiento entre los aislados de los

distintos países fue diferente. Las esporas variaron respecto a su forma (globosa,

subglobosa y elipsoidal).

Villavicencio (2010), por vez primera en Ecuador, caracterizó morfológica, fisiológica y

patogénicamente aislados de M. roreri en cinco provincias de la costa ecuatoriana, donde

determinó que no se encontraron diferencias en cuanto al borde y la textura de las colonias.

El color de las colonias varió en dependencia de la edad del cultivo. Se presentaron formas

de esporas globosas, subglobosas y elipsoidales. No existió relación entre el crecimiento de

las colonias y la patogenicidad para la mayoría de los aislados, aunque en algunos de ellos

se observó relación entre esas variables.

Según INIAP (2012), el Manejo Integrado de las Enfermedades de Cacao comienza con la

aplicación combinada de varias prácticas: resistencia genética del material de siembra,

prácticas culturales (adecuado balance nutricional, control oportuno de malezas, podas de

mantenimiento y sanitarias, remoción de frutos enfermos, deschuponado), control biológico

Introducción

3

con el uso de agentes antagonistas (Trichoderma spp.), y control químico con productos de

baja toxicidad.

En los últimos años existe un cambio de hábito en los consumidores de cacao, quienes

prefieren alimentos sanos, seguros, orgánicos, étnicos y productos de especialidad, y debido

a esto cada vez es más creciente la demanda de cacao de un sabor y origen determinados.

En Ecuador, y en particular en la Amazonía, el cacao posee un aroma y gusto especiales,

una historia, una organización social específica, lo que ha puesto en altos sitiales la

producción de cacao orgánico amazónico (Isla y Andrade, 2009; FAO, 2010; INIAP,

2011).

La Región Amazónica Ecuatoriana (RAE) comprende las provincias de Orellana, Pastaza,

Napo, Sucumbíos, Morona Santiago y Zamora Chinchipe. En ellas la temperatura media

anual es de 24 y 25 °C. Las lluvias se distribuyen uniformemente durante todo el año, por

lo cual se considera una de las zonas más lluviosas con totales anuales que fluctúan entre

los 3 000 a 4 000 mm y 88% de humedad relativa (INAMHI, 2014).

Según Matamoros (2007), el ecosistema amazónico, en especial el bosque tropical lluvioso,

se extiende sobre un área de 123 000 km² de exuberante vegetación, propia de los bosques

húmedo-tropicales, lo que representa el 45% del territorio nacional. La RAE contiene una

importante variedad de ecosistemas, por lo cual se considera como uno de los hábitats

vegetales y animales más ricos y complejos del mundo, donde alberga aproximadamente el

80% de la biodiversidad del país.

Pérez (2013) señaló que las comunidades indígenas amazónicas manejan sus cultivos

mediante el sistema de chakra, sistema que asegura el sustento familiar, genera excedentes

y rescata valores del Sumak Kawsay (Buen Vivir). Asimismo, es fuente de valores sociales,

económicos, culturales y ambientales. El valor de las tradiciones, de la medicina ancestral,

de las artesanías, el entorno, que no explota a la gente. Las prácticas agrícolas en las

comunidades son sustentables y amigables con el medio ambiente. Preparan el suelo,

cultivan, cosechan y mantienen el suelo rotando e intercalando con especies que incorporan

http://es.wikipedia.org/wiki/Orellana_%28provincia%29

http://es.wikipedia.org/wiki/Pastaza

http://es.wikipedia.org/wiki/Napo_%28provincia%29

http://es.wikipedia.org/wiki/Sucumb%C3%ADos

http://es.wikipedia.org/wiki/Morona_Santiago

http://es.wikipedia.org/wiki/Zamora_Chinchipe

http://es.wikipedia.org/wiki/Bosque_tropical

Introducción

4

elementos nitrogenados al suelo aumentando su fertilidad. En el proceso de cultivo utilizan

solo sus manos y machetes, y así evitan dañar la superficie cultivable.

Las plantas cultivadas en su área incluyen: maíz, plátano, papaya, frijol, piña, papa,

malanga, café, cacao, palmas, árboles frutales, madera dura y plantas de uso medicinal y

artesanal. Estas prácticas se han visto afectadas por plagas y enfermedades lo que reduce

significativamente la economía de los productores, debido a las pérdidas que ocasionan,

especialmente la Moniliasis (INIAP, 2011).

La Amazonía del Ecuador reviste gran importancia en la producción de cacao orgánico, sin

embargo no se ha caracterizado la Moniliasis, enfermedad responsable de las pérdidas

económicas para los productores, ni se dispone de alternativas de control biológico de la

misma con aislados nativos de antagonistas para el cultivar Nacional.

Con todas las consideraciones, el presente trabajo se propone la siguiente hipótesis:

La caracterización de aislados de Moniliophthora roreri procedentes de la Amazonía

ecuatoriana, la evaluación de los niveles de resistencia de los diferentes genotipos al

patógeno y la caracterización de aislados nativos de antagonistas, posibilitará disponer de

nuevas alternativas de control biológico de la Moniliasis en plantaciones orgánicas de

cacao. Para comprobar esta hipótesis, se plantean como objetivos los siguientes:

Objetivo general

Determinar las características de los aislados de Moniliophthora roreri, la respuesta de

genotipos de cacao y la eficacia del control biológico contra la Moniliasis en plantaciones

orgánicas de cacao en la Amazonía ecuatoriana.

Objetivos específicos

1. Caracterizar cultural, morfológica, fisiológica, molecular y patogénicamente

aislados de M. roreri.

2. Evaluar la respuesta de genotipos de cacao frente a la inoculación artificial de

M. roreri, en un ensayo monocíclico.

Introducción

5

3. Caracterizar cultural y molecularmente aislados de Trichoderma spp. procedentes

de plantaciones de cacao orgánico.

4. Evaluar la actividad antagónica in vitro de Trichoderma spp. frente a M. roreri.

5. Evaluar la eficacia de aislados nativos de Trichoderma spp. y biopreparados

comerciales en el control de la Moniliasis del cacao en condiciones de campo.

Este estudio presenta NOVEDAD CIENTÍFICA, puesto que por primera vez en Ecuador se

cuenta con un banco de 20 aislados de M. roreri, de la Amazonía ecuatoriana, debidamente

caracterizados. Asimismo, se logró a través de un ensayo monocíclico utilizar el Área Bajo

la Curva del Progreso de la Enfermedad (ABCPE) para determinar la respuesta diferencial

de aislados de M. roreri, al usar como unidad experimental mazorcas de cacao cultivar

Nacional. Se caracterizó por vez primera a Trichoderma harzianum Rifai y Trichoderma

viride Pers ex S.F Gray. en condiciones amazónicas vinculadas a cacao, y se demostró su

efectividad in vitro y en campo, frente a este hongo fitopatógeno.

Desde el punto de vista PRÁCTICO se pone a disposición de la comunidad científica una

colección de cultivo de M. roreri, así como tres cepas nativas de Trichoderma

adecuadamente identificadas y caracterizadas. Asimismo, se logró demostrar la efectividad

de T. harzianum y T. viride sobre M. roreri, lo cual ayudará a reducir en campo las pérdidas

ocasionadas por este hongo fitopatógeno.

Este trabajo además tiene IMPORTANCIA TEÓRICA puesto que contribuye a un mejor

entendimiento de la interacción M. roreri-Trichoderma spp. en condiciones in vitro y

campo, y debido a su valor metodológico, podrá usarse para futuras investigaciones con

hongos fitopatógenos y sus interacciones.

2

Revisión Bibliográfica


6

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. Origen, importancia y clasificación del cacao

Algunos autores indican que el cultivo del cacao se inició en México y América Central y

señalan al mismo tiempo que los españoles no lo vieron cultivado en América del Sur

cuando arribaron al continente, aunque lo encontraron en forma natural en muchos bosques

a lo largo de los ríos Amazonas, Orinoco y sus afluentes, donde aún hoy existen tipos

genéticos de mucho valor (Batista, 2009).

En México se encontró que los aztecas usaban las almendras del cacao no sólo para la

preparación de bebidas sino también como moneda. Creían que el árbol del cacao era de

origen divino y que su bebida confería discreción y sabiduría. Por eso Linneo asignó a la

especie el nombre de Theobroma, que significa alimento de los dioses. En los tiempos de

Cristóbal Colón, los mayas eran los verdaderos cultivadores de cacao; perfeccionaron su

cultivo, aprendieron a curar y conservar las semillas y a hacer una bebida agradable. Ricos

y pobres consumían la bebida en su dieta diaria y comerciaban el producto con los aztecas,

quienes muy pronto llegaron a apreciar sus cualidades (Batista, 2009; Jaimes y Aranzazu,

2010).

El cultivo del cacao tiene su origen en el noreste de América del Sur (Alto Amazonas)

luego se dispersó hacia el norte por la costa pacífica que comprende países como Colombia,

Ecuador, Perú y Brasil, donde se ha encontrado una alta variabilidad genética. Desde este

lugar de origen, las especies se fueron difundiendo y evolucionando en dos grupos de cacao

con características fenotípicas y genotípicas bien definidas, las cuales corresponden a los

cacaos Criollo y Forastero (Enríquez, 2010).

Desde la colonización española, el cultivo se ha extendido a otros países, que hoy son

líderes en la producción mundial; se cultiva principalmente en 13 países, como Costa de

Marfil, Ghana, Nigeria y Camerún en el continente africano, con cerca del 60% de la

cosecha mundial, que significa 1,6 millones t. En el continente americano, el mayor


7

productor es Brasil con el 18%; le siguen Ecuador con el 6%, Colombia y México

contribuyen con el 1% de la producción mundial. Se estima que más de 20 millones de

personas dependen directamente de este cultivo para subsistir y que el 90% de la

producción se cosecha en minifundios con menos de 5 ha (Ramírez, 2008).

Ecuador es el primer productor de cacao fino de aroma a nivel mundial, con

aproximadamente el 62% del volumen global; por lo tanto, es esencial preservar este legado

cultural, social y económico. Además, se considera como el producto de exportación con

mayor historia en la economía de Ecuador, que involucra alrededor de 100 000 familias de

pequeños y medianos productores. Se le reconoce a nivel mundial por sus marcadas

características de aroma y color, sumamente apreciadas en la preparación de chocolates

finos (ACEPROCACAO, 2012).

La región amazónica constituye uno de los principales centros de origen del cacao. Se

encuentra de manera silvestre en varias zonas de las seis provincias amazónicas de

Ecuador, donde las precipitaciones fluctúan entre 2 000 y 4 000 mm/año, en altitudes de

200 a 1 100 msnm, temperaturas entre 19 a 25 °C y luminosidad entre 1 050 a 1 350

horas/luz. En suelos de los tipos Inseptisoles, Ultisoles y Entisoles, cuya producción está

vinculada a especies maderables y frutales que aportan sombra necesaria para el sistema

agroforestal (chakra), lo cual constituye un valor agregado en los mercados que valoran las

contribuciones ambientales que genera la producción de cacao (ECORAE, 2001; Moreno y

Flores, 2011; Ordoñez et al., 2011; Pérez, 2013).

Con el propósito de conocer el lugar de origen del cacao Nacional se han realizado

investigaciones a través de la comparación de huellas genéticas de ADN del material nativo

con los representantes de la variedad nativa Nacional, lo cual demostró el gran parentesco

existente con algunos árboles colectados hace más de 30 años en la región amazónica de

Zamora Chinchipe, en el sur de Ecuador. A pesar de que en la actualidad su cultivo se

encuentra más desarrollado en la región costera del Pacífico, la región oriental de Zamora

Chinchipe resulta ser el centro de origen de la domesticación probable del cultivar Nacional

(ANECACAO, 2015a).


8

En Ecuador existen 500 000 ha de cacao, la mayoría asociadas con otras especies,

establecidas en más de 100 000 fincas, principalmente de pequeños productores de diversas

culturas de las nacionalidades indígenas de la Amazonía, siendo el tercer rubro agrícola

más importante del país (ANECACAO, 2015c).

El valor de la producción de cacao en el año 2008 aumentó de USD (dólares americanos)

94,3 millones a 229 millones en el año 2013, es decir existió un alza de USD 205 millones

en la producción global, casi el equivalente al valor de la producción anual de Brasil; la

“pepa de oro” obedece también a los buenos precios que se pagan en el mercado

internacional. Durante el año 2012 el precio promedio por tonelada fue de USD 2 392, en el

2013 fue de USD 2 439 y en el 2014 este precio subió a USD 3 126, según datos de Inside

Future, y para el segundo semestre de 2015 fue de USD 3 165 (ANECACAO, 2015c).

El cacao básicamente se produce en las regiones Costa y Amazonía de Ecuador,

principalmente en las provincias de Los Ríos, Guayas, Manabí y Sucumbíos, donde se

cultivan dos tipos de cacao: cacao Nacional y cacao CCN-51 (Colección Castro Naranjal,

este último producto de un injerto de varios clones, realizado por el ecuatoriano Homero

Castro en el año 1965 con el objetivo de combatir plagas), aproximadamente 500 000 ha,

de las cuales 110 000 ha se encuentran en manos de pequeños agricultores, con parcelas no

mayores a 5 ha. Este producto representó el 7% del Producto Interno Bruto (PIB) del país,

lo que benefició a pequeños y medianos productores agrícolas (ANECACAO, 2015b).

La clasificación botánica más aceptada para el cacao según Ayala (2008) es:

Reino: Plantae

Subreino: Tracheobionta

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Subclase: Dilleniidae

Orden: Malvales

Familia: Sterculiaceae

Subfamilia: Byttnerioideae


9

Género: Theobroma

Especie: T. cacao L.

2.2 Descripción botánica del cacao

El cacao es una especie diploide (2n=20 cromosomas). Es alógama, ya que su polinización

es cruzada, ubicándose por encima del 95%. Crece y se desarrolla usualmente bajo sombra

en los bosques tropicales húmedos de América del Sur (Enríquez, 2010). Normalmente

alcanza alturas de 6 a 8 m, con excepción del cacao Nacional de Ecuador y el amelonado

de África Occidental que alcanzan alturas de hasta 12 m (Batista, 2009).

Según Enríquez (2010) en la primera fase de crecimiento es ortotrópico (vertical), que

perdura por 12-15 meses. Luego este crecimiento se interrumpe para dar lugar a la

formación de 4-5 ramas secundarias (“horqueta”), que son de crecimiento plagiotrópico

(horizontal), el cual puede variar su ángulo de desarrollo. Este tipo de árbol alcanza hasta

4 m de altura.

Raíz: Tiene una raíz principal pivotante, la cual sirve de medio de anclaje; especialmente

en los primeros meses de vida de la planta puede crecer hasta 200 cm, el sistema de raíces

secundarias absorbe los nutrientes y agua disponibles en el suelo. Su longitud y forma

varían mucho de acuerdo principalmente con la estructura, textura y consistencia del suelo

(Hardy, 1961).

Hojas: Las hojas adultas son simples y enteras, membranosas de tamaño medio, base

obtuso-atenuada, margen entero, ápice largamente acuminado, coriáceas de color verde.

Cuando jóvenes su coloración es variable de verde pálido a café claro, hasta rojizas. Las

hojas son caducas, cada dos o tres meses se presentan picos de brotación de nuevas hojas,

que reemplazan a las que se caen (Rondón y Cumana, 2005).

Flores: Las flores de cacao son órganos complejos ya que poseen características que las

hacen únicas, los órganos de reproducción son realmente importantes el momento de


10

estimar la diferenciación genotípica de los clones (Bartley, 2005). Estas producen y

desarrollan cojinetes florales, de color rosado, hermafroditas, de 10-20 mm de largo,

pentámeras; es decir que están constituidas de cinco sépalos, pétalos, estaminodios,

estambres, y lóculos por ovario, que crecen en simetría radiada. Ovario 2-3 mm de largo,

oblongo-ovoide, pentagonal, pubescente. Las flores tienen una viabilidad de hasta dos días;

luego de lo cual si no son fecundadas caen (Rondón y Cumana, 2005; Enríquez, 2010).

Frutos: Los frutos más conocidos como mazorcas, son drupas bastante grandes que pueden

variar ampliamente de forma, espesor, rugosidad, color y tamaño, según el origen genético,

el medio ambiente donde crece y se desarrolla el árbol, así como el manejo de la

plantación. Se observa toda una gama de colores, que en estado inmaduro va de tonos

verdes, rojizos y cafés; con surcos y lomos pigmentados, mientras que en estado maduro

varían de amarillo, café amarillento a rojizo anaranjados. Las mazorcas de cacao por su

forma están clasificadas como: amelonado, calabacillo, angoleta y cundeamor, variando

según el genotipo (Batista, 2009).

Según Enríquez (2010), las semillas presentan una forma oblonga y varían mucho de

tamaño según el tipo de cacao, tal es el caso del cacao Criollo y Nacional de Ecuador;

otros son aplanados en el caso de los Forasteros. La cantidad de semillas en cada mazorca

depende del número de óvulos en cada ovario. Tienen un recubrimiento o cutícula que

protege los cotiledones. En la parte exterior se encuentra el mucílago, que es la pulpa dulce

de la semilla, lo que permite diferenciar algunos genotipos de cacao. El color de la semilla

también varía de acuerdo con el genotipo, desde blanco ceniciento, blanco puro, hasta un

morado oscuro y todas las tonalidades intermedias. El color interno de las almendras es

violeta pálido o lila, aunque en algunas ocasiones se observan semillas blancas.

La semilla está constituida por dos cotiledones que contienen grasa, alcaloides, taninos y

otras sustancias que al alterarse dan origen al sabor y olor del chocolate manufacturado.

Las semillas de cacao no requieren de reposo para germinar, mueren al poco tiempo


11

cuando sufren deshidratación. El tiempo desde la fecundación hasta la madurez fisiológica

de una mazorca es de alrededor de 180 días (Hardy, 1961).

2.3 Variedades de cacao

Ecuador es uno de los países donde existe la mayor diversidad genética de T. cacao. Por su

origen y características genéticas, en cada zona específica se desarrollaron cultivares

diferentes de cacao (Ayala, 2008; Paredes, 2009).

Según Paredes (2009), el cacao está clasificado en cuatro variedades:

Criollo. Son árboles bajos y poco robustos, su copa es de color verde, gruesa, redonda con

hojas pequeñas, y sus almendras son de color blanco marfil con sabor a nuez y fruta. La

principal característica de este tipo de cacao está en la mazorca que es alargada, de colores

verde y rojizo en estado inmaduro, y amarillo y anaranjado al alcanzar la madurez (Figura

1a). El cacao Criollo ha sido domesticado y adaptado a diferentes regiones del planeta, lo

que hace que sea más delicado y de poca productividad, y por ende más susceptible a

enfermedades.

Forastero amazónico. Se les conoce como amazónicos al encontrarse distribuidos en la

cuenca del río Amazonas y sus afluentes. Las mazorcas en estado inmaduro son de colores

verde y amarillo cuando han alcanzado su madurez, presentan forma de cuello de botella,

las almendras son aplanadas con cotiledones de color morado (Figura 1b). De este tipo de

cacao se obtiene chocolate con sabor básico de cacao que proporciona el 80% de la

producción mundial.

Trinitario. Es un resultado del cruce entre cacao Criollo de Trinidad (de ahí deriva su

nombre) y Forastero multiplicado en la cuenca del río Orinoco. Este tipo de cacao abastece

del 10 al 15% de la producción mundial. Es más resistente a enfermedades y ha podido

adaptarse mejor a muchos ambientes, presenta sabor a cacao de medio a alto, usualmente

asociado además con sabor a frutas y nueces. Este tipo de cacao es el que más se cultiva en


12

Ámérica, presenta diversas formas intermedias de mazorcas al igual que su coloración

desde tonos verdes y rojizos, e incluso una mezcla de ambos (Figura 1c).

Cacao Nacional de Ecuador. Es el único grupo natural de cacao que se cultiva en el

occidente de Ecuador. Por su fina calidad de almendra, este grupo está más relacionado con

el grupo Criollo que con el grupo Forastero. Las mazorcas son amelonadas, presentan

estrangulaciones en el ápice y la base, con surcos y lomos poco profundos, el color interno

de las almendras es violeta pálido o lila, aunque también se pueden observar semillas

blancas (Figura 1d). De este tipo de cacao se obtienen los mejores chocolates del mundo

por su sabor y aroma floral.

Figura 1. Tipos de cacao a) Criollo, b) Forastero, c) Trinitario y d) Nacional. Fuente:

Paredes, 2009

Entre los principales clones que se producen en Ecuador según INIAP (2000) y García

(2010), se encuentran:

CCN-51. Pertenece al Grupo genético (IMc-67 x ICS-95) x forastero desconocido; este

tipo de cacao actualmente cubre parte de las plantaciones de la Amazonía ecuatoriana. Las

mazorcas en estado inmaduro son de color rojizo-morado y maduras son rojizo-anaranjado.

Moderadamente susceptible a la Moniliasis. Tienen sabor a cacao de medio a bajo, el

potencial de esta variedad es la manteca de cacao, con rendimiento de semilla de 2 760 kg

ha-1 (Figura 2a).

EET-95. Pertenece al Grupo genético Nacional x desconocido, cacao que se desarrolla en

suelos franco-arcilloso-limosos con buen drenaje y ricos en materia orgánica.

a

b

c

d


13

Moderadamente susceptible a la Moniliasis. Las mazorcas se caracterizan por tener forma

de cuello de botella, en estado inmaduro son de color verde y en la madurez de color

amarillo. De calidad arriba. El rendimiento de semilla es de 1 564 kg ha-1 (Figura 2b).

EET-96. Grupo genético Nacional x Venezolano amarillo, se adapta a una temperatura de

21 a 28 °C con poca variación entre el día y la noche, suelo franco-arcilloso-limoso con

buen drenaje. Susceptible a Moniliasis. Las mazorcas presentan una base ancha, surcos

profundos, superficie rugosa, en estado inmaduro son de color verde y maduro verde

amarillento, semillas cilíndricas. El rendimiento de semilla es de 1 656 kg ha-1 (Figura 2c).

EET-103. Grupo genético Nacional x venezolano amarillo, adaptable a una temperatura de

21 a 28 °C con poca variación entre el día y la noche, suelo franco-arcilloso-limoso con

buen drenaje. Sus frutos son amelonados; en estado inmaduro son de color verde y en la

madurez amarillo. Moderadamente susceptible a la Moniliasis. El rendimiento de semilla

es de 1 518 kg ha-1 (Figura 2d).

Figura 2. Características de las mazorcas de los clones de cacao a) CCN-51, b) EET-95,

c) EET-96 y d) EET-103. Fuente: El productor 2012

2.4 Principales enfermedades fúngicas del cultivo

El cacao es atacado por microorganismos que afectan su producción y calidad, lo cual

constituye un ambiente favorable para el desarrollo de enfermedades fúngicas, y por

consiguiente se incrementan los costos de producción (Fulton, 1989; Porras y Sánchez,

1991). En Ecuador las enfermedades del cacao causan más pérdidas al agricultor que los

insectos, hasta en un 80% (Phillips-Mora y Wilkinson, 2007). Según Jaimes y Aranzazu

a b d c


14

(2010), las principales enfermedades en los cacaotales del Ecuador son Escoba de bruja,

Mal de machete, Mazorca negra y Moniliasis.

2.4.1 Escoba de bruja

La Escoba de bruja es causada por el hongo basidiomicete Moniliophthora perniciosa

(Aime & Phillis-Mora), (Aime y Phillips-Mora, 2005) puede ocasionar pérdidas del 50 al

90% (Meinhardt et al., 2008). Se caracteriza por la proliferación de yemas apicales y

axilares en ramas de cacao a modo de escobas de bruja. El hongo afecta todos los órganos

en crecimiento activo, principalmente los brotes nuevos, cojinetes florales, flores y frutos,

en los cuales producen hipertrofias y crecimientos anormales. Según con el órgano y la

edad de la planta, cuando el hongo infecta, se manifiesta una amplia diversidad de síntomas

a los cuales se les asigna una denominación particular, lo que genera hipertrofias de los

brotes vegetativos y reproductivos que ocasionan un continuo debilitamiento del árbol. Los

rebrotes jóvenes son los más susceptibles, pues cuando son afectados, abortan (Esquivel

et al., 2012).

2.4.2 Mal de machete

Según Suárez (2008), el Mal de machete es una enfermedad que se presenta en el tronco y

las ramas de cacao, producida por el hongo Ceratocystis cacaofunesta (Engelbrecht &

Harrington), la cual es transmitida por un insecto del género Xileborus spp., que es un

coleóptero perforador del tronco, y por las herramientas sin desinfectar. Los síntomas de la

enfermedad consisten en perforaciones y la presencia de aserrín en los sitios donde hizo las

perforaciones el insecto, los cuales, por lo general, se encuentran en el tronco y las ramas

primarias del árbol. El síntoma inicial de la enfermedad es un amarillamiento de las hojas

que mueren rápidamente y quedan adheridas a las ramas, aun después de muerto el árbol.

Esta enfermedad produce una muerte súbita del árbol. Para el control, lo mejor es la

prevención, por lo que se recomienda no utilizar las herramientas que hayan sido utilizadas

en labores realizadas a plantas enfermas (Alarcón et al., 2012).


15

2.4.3 Mazorca negra

La enfermedad Mazorca negra es producida por Phytophthora sp., y se encuentra con más

frecuencia en la región de Centroamérica. Sin embargo, en otras regiones del mundo la

enfermedad la producen otras especies como Phytophthora capsici (Leonian), Phytopthora

citrophthora (R.E. Sm. & E.H. Sm.), que se presentan mayormente en algunas regiones de

América del Sur y el Caribe, y P. megakarya (Brasier & Griffin), que solo está presente en

ciertos países de África. Avances sobre el estudio de esta enfermedad en Ecuador la asocian

con Phytophthora palmivora (E.J. Butler), (Mfegue, 2012; Akrofi, 2015). Diferentes

especies de este Oomicete han sido reportadas dando lugar a daños en el cacaotero. Atacan

los frutos principalmente, y producen daños de importancia económica, ya que reducen la

producción de semillas, sin embargo, también puede afectar otras partes de los árboles

como brotes tiernos, tronco, cojinetes florales, raíces y plántulas de cacao en vivero

(Urdaneta y Delgado, 2007; Pérez, 2009).

2.4.4 Moniliasis

2.4.4.1 Origen de la Moniliasis

Durante muchos años se dijo que la Moniliasis se detectó en el año de 1916 en Ecuador

(Rorer, 1918; Ampuero, 1967; Najar y Thomas, 2001). Estudios posteriores mencionan a

Colombia como el centro de origen de esta grave enfermedad, en el año 1800. Desde

entonces se ha dispersado a 12 países de Sur y Centroamérica productores de cacao

(Colombia, Ecuador, Perú, Bolivia, Venezuela, Panamá, Costa Rica, Honduras, Guatemala,

Belice, México y El Salvador), y ha ocasionado pérdidas superiores al 90% de la

producción, y el abandono de los cultivos a lo largo del continente americano. Esta

situación ha causado efectos negativos en los cacaoteros, sus comunidades, y en los

agroecosistemas en que se produce cacao (Phillips-Mora, 2006a; Phillips-Mora et al.,

2015).


16

La Moniliasis constituye un factor muy importante de infección en las plantaciones de

cacao, debido a que el hombre es el agente más efectivo en la dispersión a largas distancias,

dado que el hongo está muy bien adaptado a este método indirecto de diseminación (Evans,

1986). Sobre las plantaciones afectadas, existe una presencia permanente de esporas de

M. roreri, suspendidas en el aire, debido al alto nivel de adaptación a diferentes ambientes,

por lo que la infección del fruto puede ocurrir en cualquier ambiente favorable (Schmitz,

1985). La regulación del microclima ha sido una de las prácticas más recomendables para

el combate de la Moniliasis (Meléndez y Somarriba, 1999).

2.4.4.2 Clasificación taxonómica, según Bioscience (2004)

Reino: Fungi

Phylum: Basidiomycota

Subclase: Agaricomycetidae

Orden: Agaricales

Familia: Marasmiaceae

Género: Moniliophthora

Especies: M. roreri

Los nombres comunes de la enfermedad, según el Instituto Dominicano de Investigaciones

Agropecuarias y Forestales (IDIAF), son: Moniliasis del cacao, Pudrición de fruto,

Pudrición acuosa del fruto, Helada, Mancha ceniza y Enfermedad de Quevedo

(IDIAF, 2012).

2.4.4.3. Etiología

El agente causal fue inicialmente llamado Monilla roreri por Ciferri y Parodi (1933) y

clasificado dentro del Phylum Ascomicota, describiéndolo como un hongo anamorfo

debido a la aparente ausencia de un estado meiótico o de estructuras sexuales, y a sus

similitudes morfológicas con otros fitopatógenos del género (Evans et al., 2003a). Sin

embargo, Evans et al. (1978), mediante estudios de microscopia electrónica, encontraron la


17

presencia de septo dolíporo (característico de hongos basidiomicetos) y un evento único de

esporogénesis basipetal, resultado que motivó la creación del nuevo género

Moniliophthora. Phillips-Mora (2003), mediante el uso de técnicas moleculares confirmó

que el hongo es un Basidiomycete. Posteriormente, Aime y Phillips-Mora (2005)

reafirmaron la ubicación de M. roreri dentro de la familia Tricholomataceae.

2.4.4.4 Ubicación de los grupos genéticos

A nivel internacional se han identificado cinco grupos genéticos principales del hongo, tres

son endémicos y están localizados en las cordilleras central y oriental de Colombia, y en

Ecuador. Los otros dos están ampliamente distribuidos y se encuentran en una fase

invasiva, uno de ellos se localiza en el Oriente de Colombia, en la periferia de Ecuador,

Venezuela y Perú; y el otro en el Occidente de Colombia, Centro de Ecuador y América

Central (Phillips-Mora et al., 2007).

Las investigaciones han permitido establecer que los síntomas varían con la edad del fruto,

pero la velocidad de desarrollo depende de las condiciones ambientales, básicamente de la

temperatura, humedad relativa, susceptibilidad del clon o variedad de cacao y agresividad

de los aislados (Porras y Sánchez, 1991).

2.4.4.5. Diseminación

Las esporas de M. roreri son los únicos propágulos infectivos que se diseminan fácilmente

por acción del viento y de la lluvia (Campuzano, 1976; Barros, 1977; Oliveira y Luz,

2005). Phillips-Mora (2006b) señaló que la época crítica para la infección de M. roreri son

los cuatro primeros meses desde la floración a la formación de frutos.

2.4.4.6. Hospedantes

M. roreri ha sido reportado solamente en especies de los géneros Theobroma y Herrania

(Jaimes y Aranzazu, 2010). Rorer (1918) reportó en Ecuador el ataque a frutos de


18

T. bicolor Humb. & Bonpl. y H. balaensis P. Preuss. Además, Evans (1981) identificó

infecciones de M. roreri en T. mammosum Cuatrec. & J. León, T. simiarum Donn. Sm.,

T. sylvestre Mart., T. angustifolium K. Schum., H. nítida (Poepp.) R.E. Schult.,

H. pulcherrima Goudot. Posteriormente se identificó el hongo patógeno en T. grandiflorum

(Willd. ex Spreng.) K. Schum. y H. purpurea (Pittier) R.E. Schult. (Cuhna, 2006).

2.4.4.7. Epifitiología

Esta enfermedad ha sido descrita en un amplio rango altitudinal entre 0 y 1 520 msnm,

donde existen precipitaciones con fluctuaciones que van desde 780-5 500 mm por año y

una temperatura de 18 a 28 °C (Phillips-Mora, 2006a). En sitios donde la pluviometría es

igual o mayor a 2 500 mm/año y la humedad relativa está sobre el 80%, la incidencia de

Moniliasis puede superar el 90% (Desrosiers et al., 1955; Evans, 1981; Porras, 1983).

Meléndez (1993) encontró que existe una estrecha relación entre la humedad relativa y el

movimiento de esporas del hongo, lo que indica que la liberación es realizada entre el 71 y

74% de humedad relativa y en un horario que va desde las 08:00-14:00 h

aproximadamente.

Según Torres (2010), las esporas permanecen en el aire durante todo el año. Las

condiciones secas, humedad relativa baja y temperatura mayor de 26 °C, favorecen su

liberación y dispersión; y las lluvias intensas y frecuentes ayudan a la presencia de agua

libre, lo que permite la penetración y germinación de las esporas en los frutos (Phillips-

Mora, 2006b).

La gran diversidad y adaptabilidad que ha demostrado el hongo patógeno, combinado con

la longevidad de sus esporas y las condiciones agroclimáticas que ofrecen los países

productores convierten a Moniliasis en un invasor formidable aun en ecosistemas donde no

se encuentre (Phillips-Mora et al., 2005).


19

2.4.4.8. Ciclo de vida del hongo patógeno

De acuerdo con Evans et al. (1978), M. roreri representó el estado mitótico (anaformo) de

un basidiomycete desconocido. Posteriormente, Evans (1981) especuló que el teleomorfo

podría ser una especie de Crinipellis, dado el inusual ciclo vital pleomórfico

hemibiotrófico, que presenta M. roreri, el cual también es observado en otro de los hongos

patógenos importantes del cacao: C. perniciosa.

Evans et al. (2002) encontraron evidencias de que la meiosis ocurre dentro de los conidios,

un fenómeno que tiene coherencia con el contenido nuclear variable de estos; por lo que

proponen que la fase reproductiva observada en M. roreri es sexual, y que este hongo

patógeno corresponde a un teleomorfo modificado.

Durante la esporogénesis y germinación ocurre la meiosis, la cual da lugar a la formación

de hifas infectivas monocarióticas. La fase parasítica haploide se da solo en el tejido vivo

(biotrófico), y en ella el hongo crece y se alimenta intercelularmente sin activar los

mecanismos de defensa del hospedante. Una señal no identificada (asociada con la edad del

fruto) estimula la transición a la fase diploide necrotrófica, la cual induce los síntomas

característicos de la Moniliasis. De acuerdo con Griffith et al. (2003), lo anterior parece

indicar que un antepasado de M. roreri perdió la capacidad de formar basidiocarpos, pero

no la capacidad de experimentar división nuclear meiótica.

La sobrevivencia del hongo patógeno empieza en los residuos de cosecha (mazorcas

contaminadas). Luego, las esporas son diseminadas por el viento y la lluvia, lo que produce

contaminación de frutos o mazorcas con Moniliasis de una plantación a otra (Navarro y

Mendoza, 2009). Oliveira y Luz (2005), plantean que la diseminación de las esporas se

realiza por el viento, y que el agua de lluvia tiene un papel importante en las infecciones a

corta distancia en la copa del cacao. Además, debido al movimiento producido por las

labores de cosecha, las esporas se dispersan en el aire, y bajo condiciones propicias de


20

humedad y temperatura, infectan los frutos que recién están formándose (Amores et al.,

2009).

Según Meléndez (1993), en su investigación sobre microambiente, la mayor cantidad de

esporas de M. roreri se encuentran a 1 m de altura en las plantas de cacao. Las esporas se

depositan sobre el fruto, germinan si hay agua, o mueren por la radiación/desecación; estos

al germinar pueden penetrar directamente en la epidermis del fruto a través de los estomas,

donde crecen entre las células del córtex, lo que produce esporas dentro y en la superficie

de los frutos. Existen dos formas de germinación: a través del tubo germinativo o

directamente por su epidermis (Oliveira y Luz, 2005).

El tiempo de infección puede ser de tres a ocho semanas, que varía según la edad del fruto,

severidad del patógeno, susceptibilidad del hospedante y condiciones del clima,

principalmente la presencia de lluvias, mientras que en frutos tiernos, en días lluviosos y

calurosos, el período de incubación se acorta a 21 días (Fundación Hondureña para

Investigación Agrícola, 2003); sin embargo, Cruz (1993) reportó que el período de

incubación fluctúa entre 30 y 70 días.

2.4.4.9. Descripción morfológica del cultivo de M. roreri in vivo

Las esporas en germinación, son capaces de penetrar la epidermis de las mazorcas de cacao

en alguna etapa del desarrollo. Estas hifas invaden el tejido intercelularmente, y crecen

entre las células del parénquima cortical en forma de características hifas hinchadas de

4-7 µm de diámetro enroscadas o grumosas. Las mazorcas jóvenes pueden desarrollar

hinchamientos pronunciados, pero los síntomas pueden estar totalmente ausentes hasta la

formación de la lesión, que va de 45 a 90 días después de la penetración. Esta puede ser

considerada como la fase biotrófica (Evans et al., 1977).

La fase necrotrófica (la cual puede ser precedida por maduración organoléptica prematura e

irregular), desarrolla rápidamente lesiones irregulares de apariencia chocolate a café

oscuro, las que se unen gradualmente hasta cubrir la superficie entera de las mazorcas


21

infectadas. En una etapa tardía, predominan hundimientos limitados y lesiones de color

café oscuro. Un pseudostroma de color blanco a crema, crece sobre la superficie de la

mazorca de 3 a 8 días después del inicio de la lesión y pronto se cubre con una densa capa

polvorienta de esporas florecientes, que gradualmente cambian a gris, canela o café

(Evans et al., 1978). El cambio de coloración, al parecer se asocia con el engrosamiento de

la pared conidial, lo que habilita a la espora para sobrevivir a la desecación y retener la

infectividad por períodos prolongados (Evans et al., 1977).

2.4.4.10. Signos y síntomas de la enfermedad

Una de las características del hongo M. roreri es su largo período de incubación, el cual

puede ser de tres a ocho semanas, según la edad de la mazorca, severidad del ataque,

susceptibilidad del genotipo de cacao, y las condiciones del clima, principalmente la

presencia de lluvias (Hernández et al., 1991; Johnson et al., 2008; Villavicencio, 2010).

Los frutos son los únicos órganos que pueden ser infectados naturalmente por M. roreri. La

infección, normalmente ocurre cuando estos son jóvenes, ya que cuando maduran son más

resistentes. Las esporas se depositan sobre el fruto, germinan si hay agua, o mueren por la

radiación/desecación. El período de incubación es largo, generalmente mayor a un mes. El

daño se extiende internamente conforme los frutos crecen, y posteriormente el organismo

emerge a la superficie para esporular. El hongo patógeno se desarrolla intracelularmente e

invade las células del parénquima cortical. Algunos frutos que están muy dañados

internamente, a veces no muestran evidencias externas de la enfermedad (infecciones

ocultas), pero pueden ser reconocidos porque pesan más, debido a que están llenos de agua

por la descomposición interna que sufren (Phillips-Mora, 2004; Correa et al., 2014).

Los síntomas externos de la enfermedad, inician con la aparición de pequeños puntos

aceitosos sobre los frutos de 30-45 días de edad. Estos usualmente no son detectados hasta

que incrementan su tamaño, formando manchas necróticas (manchas de color chocolate)

aproximadamente a los 75 días después de la infección. Otros síntomas iniciales son la

deformación o muerte de frutos pequeños, lo cual en algunos casos se puede confundir con


22

la muerte fisiológica de los mismos. También es frecuente que algunas mazorcas en

diferentes estados de desarrollo, presenten una maduración prematura en toda o en una

parte de su superficie (Phillips-Mora, 2004). Luego de 4 a 5 días después de la aparición de

las manchas chocolate, aparece micelio blancuzco que se va tornando un poco más oscuro,

a medida que las esporas maduran. En las semanas posteriores, los frutos se deshidratan y

van momificándose gradualmente (Phillips-Mora, 2004; Correa et al., 2014).

En el caso de los síntomas internos, el hongo produce una necrosis progresiva de los tejidos

internos. En los estados avanzados de la enfermedad, el interior de los frutos (los tejidos

centrales, la pulpa, las semillas), forma una sola masa compacta acuosa en la que es difícil

distinguir sus partes originales. Sin embargo, en dependencia del momento en que los

frutos fueron infectados, las semillas podrían presentar un mayor o menor nivel de

deterioro (Evans et al., 1978; Phillips-Mora, 2004) (Figura 3).

Figura 3. a) Mazorca con pequeños abultamientos o gibas; b) fruto con manchas chocolate

a café oscuro, con bordes irregulares c) mazorca con capa polvorienta de color blanco

d) fruto con infecciones ocultas, almendras, cáscara, tejidos centrales formando una

pudrición acuosa. Fuente: Propiedad del autor

2.4.4.11. Descripción del cultivo de M. roreri in vitro

M. roreri, crece lentamente sobre agar extracto de malta. Las colonias alcanzan un diámetro

de 8-15 mm después de dos semanas, y muestran un borde levemente levantado. El

crecimiento en forma de tapete de aspecto lanoso a fieltro, de color salmón pálido a rosa

beige, finalmente se vuelve de color beige canela a arcilla, o localmente café lanoso a

chabacano pálido. Ocasionalmente el tapete es de inicio suave a farináceo, de color blanco

a b c d


23

a crema con matices ocráceos. No produce olor. En la zona avanzada, la hifa es hialina, de

pared delgada, septada y algunas veces es levemente irregular con hinchamientos de

1,5-5,0 µm de ancho. La hifa aérea es de dos tipos: a) como en la zona avanzada, pero con

paredes levemente engrosadas, y b) hialina densa de color pardusco pálido, no septado de

1-1,5 y 2-3 µm de ancho y el esqueleto raramente ramificado (Evans et al., 1978; Phillips-

Mora, 2003).

Los conidióforos ramificados dan lugar a cadenas maduras de esporas. Las esporas son

fácilmente separables, de paredes gruesas, de color amarillo pálido y de color café en masa,

típicamente globosa o subglobosa, de 6,5-8,0 y de 15-25 µm de diámetro, algunas veces

elipsoidales de 8-20 x 5-14 µm, paredes de 2 µm de grosor. Las esporas cilíndricas de

paredes delgadas también están presentes y probablemente se derivan de cadenas

inmaduras (Evans et al., 1978; Evans, 1986 y Phillips-Mora, 2003) (Figura 4).

Figura 4. Estructuras morfológicas de M. roreri que muestran esporas con paredes gruesas

y micelio septado. Fuente: Evans et al. (1978)

Las hifas se sumergen como en la zona avanzada pero con hinchamientos más frecuentes.

El hongo crece y esporula bien sobre tallos leñosos de cacao esterilizados con pérdidas

significativas de peso del sustrato; grumos de color crema compactos, de micelio estéril con

gotitas de exudado amarillo que se forman frecuentemente y los parches rojo púrpura

compuestos de hifas rojas pesadamente incrustadas que están presentes en los cultivos

viejos. Las temperaturas de crecimiento óptimo son de 25 a 26 °C y máximo 33 °C

(Evans et al., 1978; Phillips-Mora, 2003).


24

2.4.4.12. Medidas de control

Control cultural. Evitar el excesivo crecimiento del árbol de cacao, ya que el autosombreo

reduce su actividad fotosintética, y crea un microclima interno que estimula la infección y

el desarrollo de la enfermedad en los frutos (Amores et al., 2009), lo que también ayuda a

una adecuada recolección de frutos en el momento de la cosecha. Las podas sanitarias en la

cosecha constituyen otra buena práctica cultural para eliminar las partes afectadas por

insectos o enfermedades (Enríquez, 2010).

La poda frecuente, regulación del estrato superior, buen drenaje, densidades de plantación

apropiadas, control de malezas y correcto programa de fertilización, ayudan al óptimo

desarrollo del árbol pues hace que los patógenos que incidan en las plantaciones tengan

pocas probabilidades de establecerse y desarrollarse; en caso de que la enfermedad llegue a

establecerse, con un manejo cultural adecuado puede ser controlada económicamente y se

convivir con ella (IICA, 2006; Johnson et al., 2008). También es importante realizar

semanalmente la recolección y destrucción de frutos con signos del hongo fitopatógeno: se

deben remover en las primeras horas de la mañana o en la tarde después de las 16:00 h,

para evitar que la humedad propicie el desprendimiento de las esporas, y por último, en

dependencia de la cantidad de frutos enfermos, pueden enterrarse o trasladarse a otro sitio

(Krauss et al., 2003; Sánchez et al., 2003; FEDECACAO, 2004).

Control biológico. Se define como la reducción de la densidad de inóculo o sus

estructuras reproductoras de un hongo patógeno o parásito en estado activo o de

dormancia, por uno o más organismos obtenidos naturalmente (Uquillas, 2004). Aunque

con menor aplicación a nivel de campo, el manejo biológico surge como una alternativa

promisoria para el control del fitopatógeno, con resultados exitosos contra un amplio

rango de ellos. En los últimos años se ha demostrado el gran potencial de hongos y

bacterias endófitos para el control de la Moniliasis. Entre los microorganismos más

importantes se encuentran las bacterias de los géneros Pseudomonas y Bacillus, así como

hongos de los géneros Clonostachys y Trichoderma (Evans et al., 2003a; Suárez y

Rangel, 2014; Sun et al., 2015).


25

Trichoderma

El género Trichoderma, se presenta en forma natural en diversas condiciones ambientales y

sistemas agrícolas, principalmente en aquellos que contienen materia orgánica o desechos

en descomposición (Harman, 2006; Martínez et al., 2013).

Según Infante et al. (2009), las colonias del género Trichoderma presentan color blanco en

un inicio de su desarrollo, que se torna verde oscuro o amarillento, con esporulación densa.

El micelio se halla disperso, fino al microscopio, los conidióforos son ramificados, similar

a un árbol pequeño. Estos terminan en fiálides donde se forman las esporas asexuales o

conidios, aspecto importante en la identificación taxonómica a nivel de especies. Son

haploides y su pared está compuesta por quitina y glucanos.

Mecanismos de acción directos de Trichoderma

Trichoderma ha mostrado efecto sobre hongos patógenos a través de mecanismos de

acción, los que no son mutuamente excluyentes y pueden variar según el patógeno y la cepa

a utilizar (Martínez et al., 2013). Se han descrito diferentes mecanismos de acción para

controlar hongos patógenos, entre los cuales se encuentran competencia (por espacio y

nutrientes), antibiosis, micoparasitismo, y desactivación de enzimas de los patógenos

(Harman, 2000).

La competencia se define como el comportamiento desigual de dos o más organismos ante

un mismo requerimiento, siempre y cuando la utilización de este por uno de los organismos

reduzca la cantidad o espacio disponible para los demás (Infante et al., 2009). Según

Hernández et al. (2011), se da principalmente por nutrientes y espacio; de esta forma la

manera más común de muerte de un microorganismo es por inanición, debido a que

requiere de nutrientes exógenos como carbono y hierro para germinar, penetrar e infectar el

tejido, así si los sitios de infección están ocupados por el organismo benéfico el hongo

fitopatógeno tendrá dificultades para prosperar.


26

La antibiosis es considerada como el mecanismo de acción directa de antibióticos o

metabolitos tóxicos producidos por un microorganismo con acción sobre otro. Los

metabolitos de acción antifúngica secretados por Trichoderma constituyen un grupo de

compuestos volátiles y no volátiles muy diversos en cuanto a su estructura y función.

Trichoderma produce metabolitos secundarios, los que inhiben el crecimiento de otros

microorganismos con los cuales no llegan a establecer contacto físico (Martínez et al.,

2013). Las especies de Trichoderma secretan enzimas hidrolíticas como glucanasas,

quitinasas y proteasas que hidrolizan componentes de la pared celular de hongos como

Sclerotium rolfsii Sacc, Rhizoctonia solani Kühn y Pythium sp. (González et al., 2011).

El micoparasitismo se define como la interacción antagónica (directa) entre dos hongos, es

decir el parasitismo de un hongo (hospedante) por otro hongo (micoparásito) (Lecuona,

1996). Según Martínez et al. (2013) el proceso complejo del micoparasitismo ocurre en

cuatro etapas:

Crecimiento quimiotrófico: donde Trichoderma puede detectar a distancia a sus

posibles hospedantes.

Reconocimiento: Se considera que existe una alta especificidad del antagonista por

su sustrato.

Adhesión y enrollamiento: Ocurre por la asociación de un azúcar de la pared del

antagonista con una lectina presente en la pared del patógeno.

Actividad lítica: Producción de enzimas líticas extracelulares, fundamentalmente

quitinasas, glucanasas y proteasas, que degradan las paredes celulares del patógeno

y posibilitan la penetración de las hifas de Trichoderma.

El micoparasitismo concluye con la pérdida del contenido citoplasmático de la célula

hospedante, que muestra síntomas de disgregación.

Diferentes interacciones hifales están involucradas en el micoparasitismo, tales como:

enrollamiento, penetración, vacuolización, granulación, coagulación, desintegración y lisis.

A nivel microscópico no todas esas interacciones son siempre observadas, pues al parecer


27

dependen del aislado de Trichoderma, del patógeno y de las condiciones del ambiente

(Chet et al., 1981).

Mecanismos de acción indirectos de Trichoderma spp. como agente de biocontrol

Harman (2000, 2006); Harman y Shoresh (2007) y Vinale et al. (2008) refirieron varios

mecanismos indirectos de Trichoderma sobre los patógenos, ya que su acción es elicitar o

impulsar mecanismos de defensa fisiológicos o bioquímicos en la planta, como son:

Aceleración del desarrollo del sistema radical que posibilita la tolerancia al estrés

por parte de la planta.

Solubilización y absorción de nutrientes inorgánicos.

Estimulación del crecimiento vegetal.

Inducción de resistencia.

Trichoderma spp. es un microorganismo con capacidad de solubilizar nutrientes y

minerales del suelo no disponibles para las plantas. La forma en que lo hace es mediante

tres mecanismos: acidificación del medio mediante la liberación de ácidos orgánicos que

secuestran cationes y acidifican el medio alrededor de las raíces, producción de metabolitos

quelantes (sideróforos) que quelatizan Fe, Fe3+ y Cu2+, y actividad redox (Olivera Costa y

Rodríguez, 2014).

El género Trichoderma además de controlar enfermedades producidas por diferentes

patógenos, tiene la capacidad de promover el crecimiento de las plantas inoculadas con él

(Negrone et al., 2008).

Según Agrios (2005), la resistencia se define como la capacidad de un organismo para

excluir o superar, por completo o en algún grado, el efecto de un agente patógeno o factor

perjudicial de otro tipo. Las plantas presentan mecanismos de defensa, uno de ellos es

denominado constitutivo, que es el que actúa de forma pasiva, ya que la resistencia la

otorga mediante deposición de cera y cutícula sobre células de la epidermis, modificación

de la estructura de las paredes celulares por la acumulación de lignina, calosa, suberina,


28

gomas, cutina, glicósidos fenólicos, fenoles, quinonas, esteroides, glicoalcaloides,

terpenoides y tioninas, paredes celulares más gruesas, tamaño, localización y forma de

estomas, y presencia de tricomas, conocidos como mecanismos físicos; los bioquímicos son

fitoanticipinas, lectinas, proteínas inhibidoras de poligalacturonasas, quitinasas y

glucanasas. En cambio, la inducción de mecanismos de resistencia a enfermedades, se

activa por la mediación de sistemas de reconocimiento específicos mediante los cuales la

planta reconoce el ataque de un patógeno (Rossi, 2010).

Bacterias como Pseudomona aeruginosa (Schroeter, Migula), Leuconostoc mesenteroides

(Tsenkovkii, Van Tieghem), Bacillus subtilis (Conh), y Burkholderia cepacia (Burkholder),

han sido evaluadas ampliamente en el control de Moniliasis (Jiménez 1986; Sandoval et al.,

1987; Jiménez et al., 1988; Macagman et al., 2005; Solís y Suárez-Capello, 2006; Peralvo y

Saavedra, 2006).

Bacillus subtilis (Conh) pertenece a la familia Bacillaceae, género Bacillus, y sus

características son: Gram positivo, catalasa positiva, aerobia estricta (aunque puede crecer

en vía anaerobia), productor de esporas, antibióticos y matriz extracelular que comúnmente

se encuentra en el suelo. El potencial de B. subtilis se basa en la capacidad de producir una

amplia gama de moléculas bioactivas, que muestran fuertes propiedades antifúngicas, junto

con una baja toxicidad, alta biodegradabilidad, y características amigables con el medio

ambiente, en comparación con plaguicidas químicos. Adicionalmente la capacidad de

formar endoesporas, que le proporciona un nivel alto de resistencia a condiciones

ambientales extremas, hace que estas bacterias sean buenas candidatas para el desarrollo de

bioproductos. Debido a su eficiente control de Moniliasis en cacao, existen productos

registrados a base de esta bacteria (Errington, 2003; Ongena et al., 2009; Bettiol et al.,

2014).

Control químico. Control que trata básicamente de evitar la entrada del hongo patógeno a

la plantación y si está presente impedir que encuentre las condiciones favorables de

infección, multiplicación y diseminación (Sánchez y Garcés, 2012).


29

Para el control químico de M. roreri se emplean tradicionalmente fungicidas protectantes,

aunque con cuestionable eficacia. Sin embargo, el uso de cobre y protectantes orgánicos ha

permitido reducir la incidencia y severidad de la enfermedad. Aunque los sistemas de

aplicación mejorados con fungicidas sistémicos benefician la eficiencia en el control del

hongo patógeno, existe una baja adopción por el incremento en los costos de producción

(Flood y Murphy, 2004).

En Colombia, el control químico de M. roreri ha sido, después del método cultural, el más

investigado. Los resultados en plantaciones híbridas han sido erráticos o contradictorios y

en algunos de ellos antieconómicos, por lo que los fungicidas a base de cobre, son los

únicos productos o ingredientes activos con mejor respuesta. Después de varios ensayos, en

Santander, Argüello (2000) concluyó que el mejor control se obtiene con óxido cuproso

(Oxicloruro de cobre al 35%). Sin embargo, con el fin de minimizar los efectos adversos

que presentan sobre los agroecosistemas y sus pobladores, es necesario desarrollar

productos nuevos y aceptables para el control de fitopatógenos. Uno de los efectos que se

presenta es la emergencia de fitopatógenos resistentes a los fungicidas usados, otro es la

intoxicación aguda y general de humanos y otros organismos (Barrera-Necha et al., 2008).

Con la aplicación de productos químicos se consigue controlar la enfermedad de manera

significativa, lo que demuestra los beneficios de los fungicidas en la protección de los

frutos; los fungicidas sistémicos muestran un mejor control de M. roreri en comparación

con los de contacto, lo cual implica reducir el número y los costos de aplicaciones; al

combinar las labores culturales con los controles químicos, se logran incrementos de cacao

sano en alrededor del 20% (Ayala, 2008).

Control genético. Entre los cultivares de la especie T. cacao hay diferencias en la

susceptibilidad a M. roreri, lo cual muestra que en esta especie existen fuentes de

resistencia al hongo. Aún no se ha descubierto un material inmune a M. roreri, pero de las

pruebas en Ecuador, Colombia, Costa Rica y Honduras, se conoce que hay cultivares

(clones o híbridos) que consistentemente muestran menor número de mazorcas infectadas.


30

Ejemplo de esos materiales son: UF-273, EET-75, EET- 233, UF-296, CC-210, IMC-67 y

el CC-266. (González y Roble, 2014).

2.5. Área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE)

Van der Plank (1963) propuso una modificación al modelo epifitiológico de puntos

múltiples, donde se usó el ABCPE como descriptor de la epifitia, basada en la

determinación de las pérdidas de diferentes cultivos afectados por agentes fitopatógenos.

Esta variable relaciona las pérdidas de los cultivos con las sumas de enfermedades, durante

un período de tiempo dado en un período específico del crecimiento del cultivo. Shaner y

Finney (1977), a su vez lograron definir matemáticamente la fórmula que actualmente se

utiliza para su cálculo.

Para determinar el ABCPE, se puede utilizar el método del punto medio o el método de

integración trapezoidal en dos intervalos de tiempo dados (Campbell y Madden, 1990).

Generalmente se utiliza en epifitias de corta duración, que se presentan de forma tardía

durante el crecimiento del cultivo. A medida que los intervalos de tiempo en los cuales se

evalúa la epifitia son menores, se logra mayor exactitud del ABCPE. Esta variable asume

que el daño al hospedante es proporcional a la cantidad de tejido enfermo, y a la duración

de la enfermedad.

Materiales y Métodos


31

3. MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se desarrolló en la Universidad Estatal Amazónica, cantón Pastaza,

parroquia Puyo, provincia de Pastaza, Ecuador; en el período comprendido de enero de

2013 a enero de 2016.

Recolección de mazorcas con síntomas de Moniliasis

La recolección de mazorcas del cultivar Nacional que presentaban síntomas de Moniliasis

se realizó en pequeñas fincas de producción orgánica en Napo, Pastaza y Morona Santiago

(Anexos 1, 2 y 3), provincias de la Región Amazónica Ecuatoriana, mediante un muestreo

sistemático, de acuerdo con los criterios de Sánchez et al. (2003) (Anexo 4).

Se recolectaron 50 mazorcas por finca y se colocaron en bolsas de papel, que fueron

trasladadas al laboratorio; se tomaron fotos con la cámara digital (Nikon AF-S NIKKOR).

Dichas mazorcas se separaron según sus síntomas y fueron codificadas de acuerdo con la

finca de procedencia con vistas a su fácil manejo e identificación.

Aislamiento y obtención de cultivos puros de M. roreri

El trabajo experimental se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad

Estatal Amazónica. Con un sacabocado de 5 mm de diámetro, se tomaron segmentos de

mazorca con partes de tejido enfermo, y sano, estos se colocaron en un Erlenmeyer de

500 mL y se lavaron con agua corriente durante 5 min con el uso de un tamiz metálico. Los

fragmentos se desinfectaron en agitación continua con alcohol al 70% durante 3 min y

nuevamente se agitaron en Erlenmeyer con agua estéril durante 2 min. Finalmente se

colocaron en cámara húmeda.

Asimismo, se tomaron segmentos de mazorca que presentaban crecimiento micelial de

color blanco y esporulación de color crema, los cuales se ubicaron directamente en la

cámara húmeda sin ser previamente desinfectados.


32

Los segmentos desinfectados se colocaron en placas de Petri (90 mm Ø) Marca Senna

Modelo 3-61015; conformadas las cámaras húmedas se incubaron a 26±2 °C en

condiciones de luz alterna (12 h luz más 12 h oscuridad) durante 48 h. Transcurrido este

tiempo se aislaron los hongos filamentosos por medio del examen bajo el microscopio

óptico (MEIJI, aumento 800 X) y la ayuda de un asa previamente esterilizada. Bajo el

microscopio estereoscopio binocular (Kruss, aumento 200X), se realizó la siembra directa

en placas de Petri (90 mm Ø), que contenían 16 mL de medio de cultivo V8 modificado

(Anexo 5). Una vez realizada la siembra se incubaron los cultivos a 26±2 °C durante 15

días. La identificación se realizó teniendo en cuenta los criterios morfológicos (esporas y

conidióforos) acorde a lo referido por Johnson (1946). La observación de las estructuras

morfológicas se hizo con la ayuda del microscopio óptico (MEIJI, aumento 800 X).

Reaislamiento de M. roreri

Para el reaislamiento, se tomaron esporas individuales, las cuales fueron colocadas en

placas de Petri (90 mm Ø) que contenían 10 mL del medio de cultivo V8 modificado y se

incubaron a 26±2 °C durante 15 días; transcurrido este tiempo se seleccionaron las

colonias típicas de M. roreri.

Registro y conservación de M. roreri

Los aislados monospóricos de M. roreri fueron conservados en glicerol al 15% y en agua

estéril a una temperatura de -4±2 °C en refrigerador (Indurama), y en el ultra congelador

(Daihan Scientific) a una temperatura de -80±2 °C hasta su empleo.

3.1 Caracterización cultural, morfológica, fisiológica, molecular y patogénica de

aislados de M. roreri

3.1.1 Caracterización cultural de M. roreri

Cada aislado monospórico de M. roreri se subcultivó en placas de Petri (90 mm Ø)

contentivas de 10 mL de V8 modificado, y se incubaron a 26±2 °C en condiciones de

oscuridad durante dos semanas.


33

La caracterización cultural se realizó por medio de análisis cualitativo y cuantitativo. Se

utilizó un diseño completamente aleatorizado donde los aislados fueron los tratamientos

con 10 repeticiones (placas de Petri).

Se evaluó el crecimiento micelial (Ø de la colonia mm), color del anverso y reverso de la

colonia, bordes y textura de la colonia, presencia o no de líquidos de transpiración,

presencia de cristales, presencia de pigmentos difusibles en los medios de cultivo y

presencia de sectores. El crecimiento de los aislados de M. roreri se determinó con la

ayuda del calibrador digital Truper®; mediante observación visual se definió el color del

anverso y reverso de las colonias según lo especificado en trabajos realizados por Villamil

et al. (2012), borde y textura, presencia o no de líquidos de transpiración, presencia de

cristales, presencia de pigmentos difusibles en los medios de cultivo, presencia de sectores

de las colonias por cada aislado, bajo el microscopio estereoscopio.

Para ello se usaron placas de Petri (90 mm Ø) contentivas de 10 mL de medio de cultivo

V8 modificado (Evans et al., 1978 y Phillips et al., 2006), las cuales se inocularon en el

centro con un disco de micelio de 5 mm de cada uno de los aislados. Las condiciones de

incubación fueron a 26±2 °C en condiciones de oscuridad. Las mediciones fueron

registradas diariamente, hasta que la placa de Petri estuvo completamente cubierta.

Para procesar la información de las variables color del anverso y reverso de la colonia,

bordes, textura, presencia de líquido de transpiración, cristales, presencia de pigmentos

difusibles en el medio de cultivo y sectores se utilizó la estadística descriptiva, y se

realizaron gráficos de distribución de frecuencia.

La variable crecimiento micelial de las colonias (mm), se comparó entre los tratamientos

mediante una prueba no paramétrica de Kruskal Wallis complementada con la prueba de

Mann Whitney (P≤0,05), previa comprobación de los supuestos de normalidad de los datos

y homogeneidad de varianzas. Para todos los análisis se utilizó el paquete estadístico IBM

SPSS Statistic versión 21,0 para Windows.


34

3.1.2 Caracterización morfológica de M. roreri

Previamente se realizó la inducción de formación de esporas en los cultivos monospóricos

en medio V8 modificado, según lo recomendado por Phillips et al. (2006) y Villavicencio

(2010).

Para la caracterización morfológica de los aislados se realizaron microcultivos (Riddel,

1950) y se midió el largo y ancho (µm) de las esporas por la zona más gruesa, en 100

estructuras tomadas al azar de cada uno de los aislados.

Se consideró un diseño completamente aleatorizado para los aislados (tratamientos) y las

100 esporas como repeticiones.

La observación se realizó con la ayuda del microscopio óptico (aumento 400 X). Se

tomaron imágenes digitales con la cámara acoplada (DINOLITE). Además se describió la

forma de las esporas según los criterios descritos por Evans et al. (1978).

Para el análisis de los datos correspondientes al ancho y largo de las esporas se utilizó la

prueba de C de Dunnett (P≤0,05), previa comprobación de los supuestos de normalidad de

los datos y homogeneidad de las varianzas. Las variables fueron evaluadas con el paquete

estadístico IBM SPSS Statistic versión 21,0 para Windows.

3.1.3. Caracterización fisiológica de M. roreri

Para la caracterización fisiológica se utilizó el aislado que presentó mayor crecimiento

micelial en el acápite 3.1.1.

3.1.3.1. Influencia del pH en el crecimiento micelial

Se utilizó el medio de cultivo Caldo papa dextrosa (PDB Difco ®), y esterilizó en

autoclave a 121 °C y 1 atm por 15 min; el medio fue vertido en Erlenmeyer de 100 mL de

capacidad, bajo la cámara de flujo laminar. En este medio se inocularon cuatro discos de

micelio con la ayuda de un sacabocado de 5 mm de diámetro y una aguja de inoculación, el


35

ajuste del pH se realizó antes de esterilizarlo: se ajustó con NaOH con una concentración

de 0,001 M, en un intervalo de pH desde 6 a 7,5 con una escala de 0,5 entre pH, y se

mantuvieron en la incubadora a temperatura de 26±2 °C durante 21 días.

Transcurrido este tiempo el micelio se separó del medio de cultivo mediante filtración con

filtros de papel (Whatman de 125 mm Ø), luego se desecó en estufa (Memmert) a 60 °C

hasta mantener el peso constante y se determinó su masa seca (g) en una balanza analítica

digital (22 ADAM ).

Los diferentes tratamientos de pH (6, 6,5, 7 y 7,5) se dispusieron en un diseño

completamente aleatorizado con 10 repeticiones (placas de Petri).

La masa del micelio de los distintos tratamientos se comparó por medio de una prueba no

paramétrica de Kruskal Wallis complementada con la prueba de Mann Whitney (P≤0,05),

previa comprobación de los supuestos de normalidad de los datos y homogeneidad de

varianza. Las variables fueron evaluadas con el paquete estadístico IBM SPSS Statistic

versión 21,0 para Windows.

3.1.3.2 Influencia de la temperatura en el crecimiento micelial

El rango de temperaturas se ensayó desde 15±2 °C hasta 35±2 °C a intervalos térmicos de

5 °C. La inoculación del hongo patógeno se realizó en medio V8 modificado, donde se

colocó un disco de micelio de 5 mm Ø de M. roreri en el centro de la placa de Petri

(90 mm Ø). La incubación fue realizada en ausencia de luz a las temperaturas en estudio.

La temperatura de 15±2 °C se aseguró en un refrigerador, mientras que el intervalo térmico

de 20, 25, 30, 35±2 °C fue logrado en incubadora.

Las temperaturas determinadas en cada equipo fueron monitoreadas por un período de 15 a

20 días, con la utilización de termómetro de mercurio (Scientific). Se evaluó el crecimiento

micelial mediante la observación diaria hasta los 12 días.


36

Los diferentes tratamientos de temperatura (15, 20, 25, 30 y 35 °C) se dispusieron en un

diseño completamente aleatorizado con 10 repeticiones (placas de Petri).

La variable crecimiento micelial (mm), se comparó mediante la prueba no paramétrica de

Kruskal Wallis complementada con la prueba de Mann Whitney (P≤0,05), previa

comparación de los supuestos de distribución normal y homogeneidad de las varianzas.

Las variables fueron evaluadas con el paquete estadístico IBM SPSS Statistic versión 21,0

para Windows.

3.1.3.3 Influencia de diferentes regímenes de luz en el crecimiento micelial

Se evaluaron cuatro tratamientos (regímenes de luz): luz alterna (12 h luz y 12 h

oscuridad), luz blanca, luz ultravioleta (longitud de onda 404 nm) y oscuridad continua,

con diez repeticiones (placas de Petri). Se empleó un diseño completamente aleatorizado.

La variante de luz alterna fue provocada en condiciones naturales de laboratorio. En el

caso de la variante de luz blanca se logró en una caja de madera estéril con una lámpara de

200 W colocada a 50 cm de distancia de las superficies de las placas de Petri. La variante

de luz ultravioleta fue provocada en un aparato de inducción de esporulación en el cual se

colocaron dos lámparas negras (BLB40W 120 V con 173.88 lx) separadas a una distancia

de 50 cm de los cultivos de los hongos. Finalmente, la variante de oscuridad continua se

aseguró en una estufa (Memmert).

La inoculación de M. roreri se realizó en medio V8 modificado de la misma forma en que

fue descrita en el experimento anterior. La incubación se hizo a temperatura de 26±2 °C.

Las evaluaciones y los procesamientos estadísticos se realizaron del mismo modo que los

descritos en el acápite 3.1.3.2.


37

3.1.4. Identificación molecular de aislados de M. roreri

La extracción de ADN de aislados de M. roreri se realizó a partir de cultivos monospóricos

de cada uno de los aislados objeto de estudio. Cultivos esporulados de cada uno de los

aislados se sembraron en Erlenmeyer de 250 mL, que contenían medio caldo de papa

dextrosa. Para la siembra, se depositaron dos discos de 5 mm de diámetro por cada

Erlenmeyer, los cuales se incubaron en agitación (Thermo Scientific, EE.UU.) a 250 rpm y

26±2 °C durante 15 días. Posterior al período de crecimiento, los aislados se filtraron

usando papel de filtro (Whatman #1, EE.UU.), y los micelios se depositaron en placas de

Petri (90 mm Ø) durante 2 h en cabina de flujo laminar para garantizar el secado total.

La extracción de ADN genómico se llevó a cabo mediante el uso del sistema comercial

Purelink Plant Extraction Kit (Invitrogen, EE.UU.), según las instrucciones del fabricante.

El producto de la extracción se analizó por espectrofotometría UV/VIS en un Nanodrop

2000 (Thermo Scientific, EE.UU.) y por electroforesis en gel de agarosa al 1% en tampón

TBE 1 x (890 mM Tris-borato, 890 mM Ácido bórico y 20 mM EDTA), con una intensidad

de 100 V durante 45 min. Los productos fueron teñidos con bromuro de etidio (Sigma-

Aldrich, EE.UU.) y visualizados en luz ultravioleta (Sambrook y Rusell, 2001).

La amplificación de la subregión 18S ADNr se realizó mediante la Reacción en cadena de

la polimerasa (PCR), con la utilización de los cebadores universales NS1

(5´-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3´) y NS8 (5´-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3´)

(White et al., 1990). En la Figura 5 se observa la posición de los oligonucleótidos NS1 y

NS8 en el gen que codifica para los ARNr en hongos.

Figura 5. Posición de los cebadores NS1 y NS8 en el gen que codifica para los ARNr en los hongos


38

La amplificación por PCR se llevó a cabo en el termociclador Veriti 9902 (Applied

Biosystems, EE.UU.), en un volumen final de 50 µL, que contenía: 37 µL de agua MiliQ,

5 µL de dNTPs 2mM, 5 µL de tampón Platinum 10 x, 1 µL de cada uno de los cebadores

(NS1 y NS8), 1,8 µL de MgCl2, 0,2 µL de Taq ADN polimerasa Platinum (Thermo

Scientific, EE.UU.) y 1 µL de ADN. En la reacción se adicionó un control para determinar

si existió contaminación o no en las muestras de ADN.

Las condiciones para las reacciones de PCR consistieron en una desnaturalización inicial de

94 °C durante 85 s, seguido de 35 ciclos de amplificación con una desnaturalización a

95 °C durante 35 s, hibridación a 55 °C por 55 s, y extensión a 72 °C por 45 s.

Adicionalmente, una extensión final a 72 °C durante 10 min. Los productos de PCR se

verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, según se describió

anteriormente. La observación de los productos de PCR se realizó en un fotodocumentador

ENDUROTM GDS TOUCH (Labnet, EE.UU.).

La secuenciación de los aislados se realizó en las instalaciones de Macrogen (EE.UU.), en

un secuenciador automático ABI 3730xl (Applied Biosystems, EE.UU.), para lo cual se

envió el ADN genómico, extraído con concentraciones y purezas adecuadas, en lugar del

producto de PCR para garantizar la re-secuenciación de las muestras en caso de fallos en el

proceso.

Las secuencias nucleotídicas obtenidas se limpiaron con la utilización del programa DNA

Baser Sequence Assembler v.4 (2013) y la herramienta Convertix. Para la búsqueda de

homología en las bases de datos GenBank se utilizó el programa Blastn

(Altschul et al., 1990), disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. El

alineamiento múltiple de los nucleótidos se generó en MUSCLE (Edgar, 2004) en el

programa MEGA v.6 (Tamura et al., 2013).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/


39

3.1.5. Caracterización patogénica y agresividad de los aislados de M. roreri

El estudio se realizó con el fin de determinar la capacidad infectiva de los aislados de

M. roreri sobre mazorcas sanas del cultivar Nacional de cacao, así como para comprobar

los síntomas, y su correspondencia con lo observado en condiciones naturales (Phillips

et al., 2006).

Las mazorcas fueron colectadas en el Centro de Investigación, Posgrado y Conservación

Amazónica (CIPCA) de la Universidad Estatal Amazónica, procedentes de un sistema

agroforestal con manejo orgánico. Las mismas fueron envueltas con papel kraft

humedecido, y colocadas en un recipiente plástico, para su transportación. En el

laboratorio las mazorcas fueron lavadas con agua corriente durante 5 min, luego se

desinfectaron con alcohol al 70% durante 3 min, y posteriormente fueron enjuagadas con

agua destilada estéril por 2 min.

Para el crecimiento micelial de M. roreri, se empleó medio de cultivo PDB, y se procedió a

sembrar un disco de micelio con la ayuda de un sacabocado de 5,0 mm de diámetro. Los

Erlenmeyers se colocaron en una incubadora a 26±2 °C y se mantuvieron durante 12 días.

Se colectó el micelio dentro de la cámara de flujo laminar. Se juntó el micelio colectado de

cada aislado y se batió el contenido en una licuadora marca Oster®, durante 2 min. El

homogeneizado micelial, se filtró por cuatro capas en gasa estéril. Posteriormente se

determinó la concentración del filtrado de micelio en la cámara de Neubauer (Celeromics),

que fue ajustada a una concentración aproximada de 1,2 x 105 ufc mL-1.

La inoculación de las mazorcas de dos meses de edad (aproximadamente 10 cm de largo)

se realizó en la parte media, dentro de la cámara de flujo laminar, con la ayuda de una

micropipeta (SOCOREX SWISS 10-100 µl) con 0,5 mL de suspensión micelial. Una vez

secas, las mazorcas fueron colocadas en bolsas transparentes de polietileno herméticas

(16,5 cm x 14,9 cm) con papel filtro (Macherey Nagel) humedecido con 25 mL de agua

destilada estéril. Las bolsas fueron colocadas en la incubadora a 26±2 ºC durante tres


40

semanas. El papel de filtro se retiró 48 h después de la inoculación, con la ayuda de una

pinza (Phillips, 1986; Phillips-Mora et al., 2005).

Para evaluar la patogenicidad y agresividad de los aislados de M. roreri se determinó la

presencia o ausencia de síntomas sobre las mazorcas inoculadas, así como la magnitud

del daño para cada aislado. Se utilizaron diez mazorcas sanas de cacao del cultivar

Nacional por aislado e igual número sin inocular como control. Se evaluaron las

variables:

Severidad externa: basada en la apariencia externa del fruto, los síntomas y signos

inducidos por la incubación de los aislados sobre las mazorcas de cacao; para la evaluación

se utilizó la escala propuesta por Brenes (1983) (Anexo 6).

Severidad interna: basada en el porcentaje de necrosis interna observada en un corte

longitudinal del fruto y medido en relación con la escala desarrollada por Sánchez et al.

(1987) (Anexo 7).

Índice de infección: Ii= 1001 TNnb (Townsend y Heuberger, 1943), donde

n= número de porciones de cada mazorca en cada nivel; b= valor de severidad acorde con

la escala evaluativa, N= número de niveles de la escala, T= número total de porciones

(parte basal, parte media y parte distal de la mazorca) por cada mazorca inoculada.

Área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE): Se calculó mediante la

fórmula propuesta por Shaner y Finney (1977):

Donde yi representa el índice de infección (severidad), en diferentes momentos de

evaluación (ti).


41

Los tratamientos (aislados) se dispusieron en un diseño completamente aleatorizado. Se

utilizaron diez repeticiones por cada aislado. Las evaluaciones se realizaron diariamente,

hasta los 12 días.

Los datos del ABCPE se analizaron estadísticamente previa comprobación de los supuestos

de normalidad de los datos y homogeneidad de varianza. Las comparaciones de las medias

se realizaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis complementada con la

prueba de Mann Whitney (P≤0,05). Las variables fueron evaluadas con el paquete

estadístico IBM SPSS Statistic versión 21.0 para Windows.

3.2 Respuesta de genotipos de cacao frente a M. roreri en un ensayo monocíclico

El experimento se realizó con la finalidad de determinar la respuesta de genotipos de cacao

ante la mezcla microbiana de los aislados de M. roreri de mayor agresividad en el acápite

3.1.5. Para ello se utilizaron mazorcas sanas de dos meses de edad de aproximadamente

10 cm, de cinco genotipos (cultivar Nacional y los clones CCN-51, EET-95, EET-96 y

EET-103), los cuales constituyeron los tratamientos.

La preparación del inóculo de la mezcla microbiana de M. roreri y la metodología de

inoculación empleada fueron similares a las referidas en el acápite 3.1.5.

Se inocularon con la mezcla microbiana 10 mazorcas por cada genotipo de cacao.

Se evaluó la respuesta de los genotipos de cacao frente a la mezcla microbiana de M. roreri

a través de las variables Severidad Externa, Severidad Interna, Índice de infección y

ABCPE, de la misma forma que fue descrito en el acápite 3.1.5. Las evaluaciones se

realizaron diariamente.

Para la clasificación de la respuesta de los genotipos, se empleó lo referido por Phillips-

Mora et al. (2005), quienes utilizan los valores de media de Severidad Interna (Sánchez

et al., 1987) donde:


42

0 – 1,25 Resistente

1,26 – 2,50 Moderadamente resistente

2,51 – 3,75 Moderadamente susceptible

3,76 – 5,0 Susceptible

El experimento se dispuso bajo un diseño completamente aleatorizado con cinco

tratamientos (genotipos) y 10 repeticiones (mazorcas).

Los datos del ABCPE se analizaron estadísticamente, previa comprobación de los

supuestos de normalidad de los datos y homogeneidad de las varianzas. Las comparaciones

de las medias se realizaron mediante la prueba de Kruskal Wallis complementada con la

prueba de Mann Whitney (P≤0,05). Se utilizó el paquete estadístico IBM SPSS Statistic

versión 21,0 para Windows.

3.3 Caracterización cultural y molecular de Trichoderma spp. procedentes de

plantaciones de cacao orgánico

El aislamiento de Trichoderma spp. se realizó a partir de muestras de suelo procedentes de

tres sistemas agroforestales (cacao orgánico) de la provincia de Napo.

Se colectaron muestras de suelo de los siguientes sectores:

1. Borja, ubicado en el Valle de los Quijos-Napo, Latitud: 0°18’49,046’’ (m),

Longitud: 77°47’0,458’’ (m). Altura: 1 455 (msnm). Sistema agroforestal que

incluyó cacao.

2. Ahuano, Napo. Latitud: 1°3’42,302’’ (m), Longitud: 77°32’52,433’’ (m). Altura:

355 (msnm). Sistema agroforestal que incluye cacao, de siete años de edad.

3. Centro de Investigación, Posgrados y Conservación Amazónica (CIPCA) que se

encuentra ubicado en el km 42 vía Puyo-Tena, Latitud: 1°15’39,708’’ (m),

Longitud: 77°53’23,490’’ (m). Altura: 575 (msnm). Plantación de cacao de cinco

años de edad.


43

Para la toma de muestras cada finca se dividió en cinco transeptos, donde se tomaron

veinte muestras de suelo rizosférico, a 20 cm de profundidad con un muestreador manual.

Las muestras se combinaron y homogeneizaron en un recipiente para obtener una muestra

única de 500 g de suelo por plantación. Se envasaron en bolsas plásticas codificadas, se

colocaron en nevera portátil para su traslado al laboratorio de Microbiología de la

Universidad Estatal Amazónica, y se secaron 24 h a temperatura ambiente.

Para aislar Trichoderma de las muestras de suelo, se realizó una dilución al 10% p/v de 1 g

de muestra de suelo en 10 mL de agua destilada, se dejó reposar durante 5 min, y se tomó

una alícuota de 200 µL de solución con la que se inoculó en placas de Petri (90 mm Ø) con

medio V8 modificado y se incubaron a 28±2 °C en oscuridad. Las colonias de

Trichoderma se identificaron según su morfología con la ayuda de un microscopio

trilocular óptico con cámara acoplada.

Para la purificación del cultivo se extrajo cuidadosamente el micelio en pequeñas

proporciones de Agar de cada colonia identificada como Trichoderma, y se sembraron en

medio V8 modificado.

La caracterización cultural de los aislados de Trichoderma spp. se realizó según la forma,

color y tipo de micelio, color de esporas, olor, presencia de fiálides y crecimiento de las

colonias teniendo en cuenta los criterios establecidos por Samuels et al. (2006b) y Samuels

et al. (2012a). Se sembraron discos de 5 mm en el centro de las placas de Petri (90 mm Ø),

contentivas con medio V8 modificado. Las placas se incubaron durante 72 h a 28±2 ºC.

Se determinó el crecimiento de los aislados de Trichoderma spp., con la ayuda del

calibrador digital; mediante observación visual se definió forma, color y tipo de micelio,

color de esporas, olor, presencia de fiálides de las colonias por cada aislado, bajo el

microscopio estereoscopio. Las mediciones se realizaron diariamente, hasta que la placa de

Petri (90 mm Ø) estuvo completamente cubierta.


44

El experimento se dispuso en un diseño completamente aleatorizado con tres tratamientos

(aislados) y 10 repeticiones (placas de Petri).

Se utilizó un diseño completamente aleatorizado. Para procesar la información de las

variables forma, color y tipo de micelio, color de esporas, olor, presencia de fiálides de las

colonias se hizo uso de la estadística descriptiva, mediante gráficos de distribución de

frecuencia.

La variable velocidad del crecimiento micelial (mm), se analizó estadísticamente aplicando

un análisis de varianza simple. Las medias se compararon según la prueba de rangos

múltiples de Duncan (P≤0,05). Se utilizó el paquete estadístico IBM SPSS Statistic versión

21,0 para Windows.

La identificación molecular de los aislados se realizó según el acápite 3.1.4.

3.4 Evaluación de la actividad antagónica in vitro de Trichoderma spp. frente a

M. roreri

Se evaluó el antagonismo in vitro del aislado de M. roreri que presentó mayor velocidad de

crecimiento en el acápite 3.1.1, frente a los aislados de Trichoderma spp. obtenidos en cada

uno de los sectores (acápite 3.3), cuyo código aparece debajo y que fueron considerados

como tratamientos :

UEA-T1: Aislado Trichoderma spp. (Borja)

UEA-T2: Aislado Trichoderma spp. (CIPCA)

UEA-T3: Aislado Trichoderma spp. (Ahuano)

Se sembraron discos del patógeno de 5,0 a 20 mm del extremo de la placa de Petri

(90 mm Ø) con medio de cultivo V8 modificado, y fueron incubados a 26±2 °C. El

antagonista Trichoderma se obtuvo con 72 h de crecimiento en medio de cultivo V8

modificado.


45

Cuando M. roreri alcanzó un desarrollo de 30 mm de diámetro en la placa de Petri (5 días

después de la siembra) (Solís, 1999), los aislados de Trichoderma se enfrentaron a

M. roreri mediante cultivo dual, para lo cual se colocó en el extremo opuesto de la placa de

Petri (90 mm Ø), un disco de 4,3 mm de diámetro de micelio del antagonista (de 6 días de

edad) con 50 mm de separación entre ellos (Howell, 2003). Los cultivos se incubaron a 26

±2 °C y oscuridad, y cada 24 h se midió el crecimiento radial del micelio de los hongos

hasta los siete días de inoculados.

El experimento se condujo en un diseño completamente aleatorizado con diez repeticiones

de cada tratamiento de Trichoderma spp. y diez placas de Petri (90 mm Ø) inoculadas con

Trichoderma spp. y M. roreri como controles.

Los mecanismos de acción de competencia se evaluaron teniendo en cuenta espacio,

micoparasitismo, antibiosis ejercidos por Trichoderma spp. sobre M. roreri.

La competencia por espacio se realizó mediante la comparación de la velocidad del

crecimiento. Se hicieron las siguientes evaluaciones 1. Interacción Trichoderma-hongo

patógeno y 2. Control (hongo patógeno), se midieron los radios de crecimiento del

patógeno (RCP) y del antagonista (RCA) con la ayuda de un calibrador digital, a partir de

las 24 horas, hasta que uno de los microorganismos en estudio cubriera la placa totalmente.

Conjuntamente, se calculó el porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR), con el

empleo de la fórmula de Samaniego et al. (1989), donde R1 y R2 son los radios mayor y

menor de crecimiento radial del hongo patógeno, respectivamente.

De las 24 a 72 h se evaluó la tasa de crecimiento micelial en los aislados de Trichoderma

spp. según la fórmula de Lilly y Barnet (1951), donde CL1 y CL2 son los crecimientos en la


46

primera y segunda mediciones, y T1 y T2 son los momentos de la primera y segunda

mediciones.

A los días cuarto y quinto se determinó la capacidad antagónica del Trichoderma spp.,

frente a M. roreri de acuerdo con las clases de antagonismo descritas en la escala de

Bell et al. (1982):

Clase 1. Trichoderma sobrecrece completamente al patógeno y cubre totalmente la

superficie del medio de cultivo.

Clase 2. Trichoderma sobrecrece las dos terceras partes de la superficie del medio de

cultivo.

Clase 3. Trichoderma y el patógeno colonizan cada uno aproximadamente la mitad de la

superficie del medio de cultivo y ningún organismo parece dominar al otro.

Clase 4. El patógeno coloniza las dos terceras partes de la superficie del medio de cultivo y

parece resistir a la invasión por Trichoderma.

Clase 5. El patógeno sobrecrece completamente a Trichoderma y ocupa la superficie total

del medio de cultivo.

A su vez la zona de antagonismo se evaluó con la escala propuesta por Punja y Grogan

(1983), que consta de los niveles siguientes.

0. No hay zona de antagonismo.

1. Aversión ligera (Zona de antagonismo de +/- 1 mm de ancho).

2. Aversión moderada (Zona de antagonismo de 2 a 4 mm de ancho).

3. Aversión fuerte (Zona de antagonismo de más de 4 mm de ancho).

Para el mecanismo de acción micoparasitismo, se evaluaron cinco muestras tomando

fragmentos de micelio de la zona de interacción a partir de que existiera contacto entre las

hifas de M. roreri y el antagonista desde las 24 hasta las 240 h y se observó al microscopio


47

óptico con aumento de 400X el tipo de interacción hifal (enrollamiento, penetración,

vacuolización y/o lisis).

La antibiosis de Trichoderma se evaluó a través del efecto de metabolitos volátiles; se

realizó la prueba según el protocolo propuesto por Dennis y Webster (1971). En una tapa

de placa de Petri (90 mm Ø) que contenía medio de cultivo V8 modificado, se inoculó

micelio de M. roreri de 5,0 mm de diámetro y se dejó incubar a 26±2 °C hasta alcanzar un

diámetro de 30 mm (cuatro días después de la siembra). En la tapa de otra placa de Petri

(90 mm Ø) se añadió medio de cultivo V8 modificado con un disco de micelio de

Trichoderma spp. de 5,0 mm de diámetro (de seis días de edad). Se colocaron las dos tapas

una frente a la otra y se sellaron con parafilm. Las placas se incubaron a 26±2 ºC durante

siete días. Pasado el tiempo de incubación se observó el proceso de inhibición de M. roreri

y se comparó con el control en ausencia del antagonista. Se emplearon diez repeticiones

por cada tratamiento.

Al finalizar la prueba, a los 12 días, se cuantificó la esporulación de M. roreri, en cada uno

de los tratamientos. Para el efecto, sobre cada uno de los ejes horizontal y vertical, a 1 mm

del centro de la placa de Petri (90 mm Ø) se cortó un disco en el medio de cultivo, con la

ayuda de un sacabocados de 5,0 mm de diámetro. Los cuatro discos obtenidos por placa,

fueron suspendidos en un tubo de ensayo que contenía 10 mL de agua destilada estéril, con

una gota de Tween 20 (0,05%) y se agitó vigorosamente durante 10 min, para facilitar el

desprendimiento de las esporas del micelio. El conteo de las esporas se realizó en un

microscopio trinocular óptico, utilizando una cámara de Neubauer. Se calculó el porcentaje

de inhibición de esporulación (% I.E.) (Vásquez, et al., 2014) de la siguiente manera:

Los datos del potencial antagónico in vitro de Trichoderma spp. y el porcentaje de

inhibición de esporulación de M. roreri, fueron sometidos al análisis de varianza. Las


48

medias se compararon mediante la prueba Duncan (P≤0,05), utilizando el paquete

estadístico IBM SPSS Statistic versión 21,0 para Windows.


comerciales en el control de la Moniliasis del cacao en condiciones de campo

La evaluación de la eficacia de aislados nativos de Trichoderma spp. sobre M. roreri se

realizó en el CIPCA, en áreas experimentales de cacao, cultivar Nacional de seis años de

edad, al inicio de la producción del árbol de cacao en el período comprendido de

septiembre de 2015 a enero de 2016, sobre suelo Inseptisol.

Los biopreparados a base de los aislados nativos de Trichoderma spp., se realizaron

artesanalmente en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Estatal Amazónica, a

partir de un sustrato sólido de cabecilla de arroz, al que se le añadió agua destilada estéril;

se distribuyó homogéneamente en frascos Roux, posteriormente se esterilizó en autoclave a

121 ºC durante 30 min, después de 2 h de reposo se inoculó el sustrato con una suspensión

obtenida de cultivos puros esporulados de siete días, a la concentración de

108 conidios mL-1, seguidamente se incubó a 28 ± 2ºC en posición horizontal hasta

colonizar y esporular todo el sustrato, y finalmente se llevó al área de secado. Se calculó la

concentración por gramo y se realizaron los cálculos correspondientes para determinar la

dosis de aplicación en campo. Respecto al control de la calidad se tuvieron en cuenta

aspectos referidos por Suárez-Castellá et al. (2009) para sistemas de control de la calidad

de laboratorios en la producción de plantas in vitro, aplicables en este caso.

Las suspensiones de Trichoderma spp. se mantuvieron por separado en botellas plásticas de

8 L a 5 ºC, desde su preparación hasta el momento de ser transportadas al campo dentro de

una caja térmica. La germinación de las esporas fue confirmada con siembras de las

suspensiones finales en medio V8 modificado, para de esta forma garantizar la viabilidad

de las esporas que fueron llevadas al campo.


49

El experimento de campo se desarrolló bajo un diseño de bloques completos al azar, con

seis tratamientos: los dos mejores aislados en condiciones de laboratorio, dos biopreparados

comerciales (Trichotic líquido y Rhapsody), un tratamiento químico y un testigo sin

tratamiento con tres réplicas (Tabla 1). Cada réplica estuvo conformada por una parcela de

cuatro árboles plantados a 4 x 4 m. Se dejó un área de cuatro hileras de plantas para evitar

el efecto de borde entre parcelas, tanto entre los tratamientos como entre los bloques. Antes

de las aplicaciones de los tratamientos, se realizó una poda sanitaria de los árboles para

reducción de la copa, junto con una eliminación de chupones y malezas.

Las aspersiones de los tratamientos se realizaron con atomizadores manuales (Magic,

500 mL), para asegurar la descarga exacta por árbol. Para cada tratamiento se utilizaron

equipos y materiales diferentes, con la finalidad de evitar la contaminación entre especies

de Trichoderma. Las aplicaciones se dirigieron a todo el árbol. Se hicieron cuatro

aplicaciones con una frecuencia mensual.

Tabla 1. Concentración de las suspensiones de aislados de Trichoderma, biopreparados

comerciales y fungicida (Óxido cuproso)

TRATAMIENTO CONCENTRACIÓN

DE LA SUSPENSIÓN

1. UEA T3 10⁸ esp mL-1

2. UEA T2 + UEA T3 10⁸ esp mL-1

3. Trichotic (Trichoderma Comercial ) 0,15 mL P.C árbol

4. Rhapsody 1.34 SC (B. subtillis) 1 mL P.C árbol

5. Óxido cuproso (Cobre Nordox 50) 3,0 g i.a árbol

6. Control Sin aplicación Se calculó un gasto de 200 mL de agua por árbol

Trichotic líquido (Trichoderma comercial, cuyo ingrediente activo son esporas de los hongos

Trichoderma harzianum,T. viride y T. koningii) con una concentración de 5 x 1010 esporas g-1,

200 g por 4 000 mL de agua.

Rhapsody (Bacillus subtilis cepa QST 713 con una concentración de 13,4 g L-1)

Quincenalmente se registró el número de mazorcas sanas y mazorcas con síntomas de

Moniliasis. Las mazorcas muertas que presentaron una longitud de hasta diez cm se

consideraron como Cherelle Wilt (marchitamiento prematuro); todas las mazorcas enfermas


50

se eliminaron en cada fecha de evaluación. Toda esta información fue registrada para cada

árbol de la parcela útil.

La eficacia técnica para cada uno de los tratamientos se calculó mediante la fórmula de

Abbott (1925), donde:

Los datos de porcentaje de infección y eficacia técnica fueron transformados mediante

2arcosen según Lerch (1977). Estas variables se analizaron estadísticamente, previa

comprobación de los supuestos de normalidad de los datos y la homogeneidad de las

varianzas. La prueba de comparación entre medias se realizó por la prueba de rangos

múltiples de Duncan (P≤0,05). Se empleó el paquete estadístico IBM SPSS Statistic versión

21,0 para Windows.

Resultados y Discusión


51

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se obtuvieron veinte aislados de M. roreri procedentes de fincas de las provincias Napo,

Pastaza y Morona Santiago de la Región Amazónica Ecuatoriana (Tabla 2).

Tabla 2. Aislados de M. roreri obtenidos en los diferentes sitios de muestreo

Finca Provincia Cantón Sector Código del

aislado

Finca 1 Napo Tena Colonia Bolívar UEA-Mr1.6

UEA-Mr1.16

UEA-Mr1.29

Finca 2 Napo Tena Ahuano UEA-Mr2.7

UEA-Mr2.12

UEA-Mr2.15

Finca 5 Napo Arosemena Tola Arosemena Tola UEA-Mr5.3

UEA-Mr5.16

UEA-Mr5.17

Finca 6 Napo Tena Misahualli UEA-Mr6.10

Finca 7 Pastaza Arajuno Las peñas del Pozo UEA-Mr7.13

UEA-Mr7.16

UEA-Mr7.17

UEA-Mr7.20

UEA-Mr7.28

Finca 8 Morona

Santiago Palora La Comanche UEA-Mr8.9

UEA-Mr8.10

UEA-Mr8.11

UEA-Mr8.19

UEA-Mr8.20

Los aislados de mayor aparición a partir de mazorcas afectadas fueron M. roreri, los que

estuvieron presentes en todas las fincas objeto de estudio. Además, se pudo identificar que

las colonias de estos aislados presentaron coloraciones que variaron desde blanco, salmón

hasta café. Las mismas presentaron bordes regulares y textura polvosa, afelpada y estriada,

con presencia de cristales; no se observaron sectores. Las hifas fueron hialinas, con paredes


52

delgadas, septadas y algunas veces levemente irregulares, raramente ramificadas. Se

observaron conidióforos ramificados, dando lugar a cadenas maduras de esporas (Figura 6).

Las esporas fueron fácilmente separables y con paredes gruesas, de forma globosa,

subglobosas y algunas elipsoidales, con un largo de 8,76 µm y un ancho promedio de

8,18 µm. Los aislados de M. roreri cumplieron los postulados de Koch, lo que evidenció su

identidad.

Figura 6. Cadenas de esporas de M. roreri

Durante el aislamiento de M. roreri, se identificó cuatro géneros de hongos anamorfos,

asociados a mazorcas enfermas con síntomas de Moniliasis, correspondientes a los géneros:

Cylindrocladium, Dichobotrys, Colletotrichum y Phytophthora, procedentes de la provincia

de Napo (Anexo 8).

Se identificó al género Cylindrocladium asociado a mazorcas enfermas con síntomas de

Moniliasis. Se observaron conidióforos erectos, penicilados, con ramificaciones primarias,

vesícula terminal, y la presencia de masas de conidios monocelulares cilíndricos en sus

extremos. No se observó la producción de clamidosporas. Los conidióforos tuvieron un

largo promedio de 160 µm y 7 µm de ancho. Las ramas primarias, secundarias y terciarias

mostraron una longitud promedio de 14,01 µm, 18,24 µm y 10,4 µm, respectivamente. Las

fiálides tuvieron un largo promedio de 13,4 µm y 3,2 µm de ancho. Los conidios mostraron

un largo promedio de 40,5 µm y 3,5 µm de ancho (Figura 7).


53

Figura 7. Cylindrocladium sp. asociado a mazorcas de cacao

En relación con estos resultados Feitosa et al. (1986), demostraron que Cylindrocladium

floridanus (Sober et Seymour), fue patogénico en cacao, sin embargo estos autores no

describieron las dimensiones de las estructura asexuales. Por otra parte, Bastos y Bezerra

(2010) refirieron la presencia de Cylindrocladium scoparium Morg., lo que provocó la

pudrición de frutos de cacao, pero no efectuaron una caracterización morfológica de este

agente causal.

Asimismo, Evans et al. (2003b) informaron la presencia de aislados presuntamente

micoparasíticos pertenecientes al género Cylindrocladium que afectaba mazorcas de

Theobroma gileri Cuatrec. infectadas con Crinipellis roreri (Ciferri), sin embargo, no

describieron la morfología ni las dimensiones de las estructuras asexuales. Disponer de una

correcta caracterización morfológica de esta especie, aislada a partir de frutos de cacao con

síntomas de Moniliasis, permitirá discriminarla del resto de la micobiota existente en frutos

de cacao y evaluar en un futuro su papel ecológico en ese nicho.

Se aislaron hongos del género Dichobotrys asociados a mazorcas de cacao con síntomas de

Moniliasis. Se observó la presencia de conidióforos largos, ramificaciones dicotómicas

regulares, delgadas, presencia de células fértiles algo infladas, globosas, productoras de

conidios simultáneamente, con la presencia de conidios del tipo botryoblastosporas casi

globosos, hialinos, monocelulares unidos a dentículos cortos (Figura 8). Los conidióforos

tuvieron un largo promedio de 4,8 µm, sin embargo no se determinaron las dimensiones de

los conidios ni de sus hifas. Este es el primer informe de este género en cacao.


54

Figura 8. Dichobotrys sp. asociado a mazorcas de cacao

En la micobiota asociada a mazorcas de cacao se pudo observar la presencia de

Colletotrichum, pues se identificaron acérvulos similares a puntos negros incluidos en el

medio de cultivo PDA, en las placas de Petri. En los microcultivos se observó la presencia

de esporodoquios no bien diferenciados.

Los conidióforos fueron hialinos, simples, erectos, sustentando un conidio en cada ápice de

la fiálides. Se determinó la presencia de conidios hialinos, cilíndricos, ovoides y

monocelulares (Figura 9). En los cultivos realizados en medios sintéticos no se observaron

setas, sin embargo en lesiones ocasionadas en frutos sí se pudieron apreciar. Las hifas

tuvieron un ancho promedio de 2,47 µm, los conidióforos mostraron un largo promedio de

9,56 µm y ancho de 3,82 µm. El largo promedio de los conidios fue de 7,07 µm y un ancho

de 2,37 µm. En la descripción de las características del género, estas fueron similares a las

referidas por Rojas et al. (2010), a pesar de que en el presente trabajo las dimensiones de

los conidios y conidióforos fueron menores.

Figura 9. Colletotrichum sp. asociado a mazorcas de cacao


55

Se observó la presencia de P. palmivora, con micelio cenocítico, sin la formación de

estructuras reproductivas sexuales, presencia de esporangios diferenciados que contenían

zoosporas. Se observaron abundantes esporangios papilados de forma ovoide que tenían

como promedio 40,65 µm de largo y 23,62 µm de ancho (Figura 10). Estas dimensiones

fueron similares a las encontradas por Stamps (1985), quien denotó que dichas estructuras

se forman fácilmente en medios de cultivo y que los esporangios presentan paredes bien

definidas prevaleciendo las formas ovoides a elipsoidales.

Figura 10. Phytophthora sp. asociado a mazorcas de cacao

Mfegue et al. (2012) determinaron que en frutos de cacao en África, la principal especie

causante de la pudrición de la mazorca de cacao fue P. megakarya en lugar de

P. palmivora que prevalece en América. Sin embargo, lo anterior sugiere la posibilidad de

la existencia de varias especies de este género, causando una misma sintomatología a nivel

de mazorcas de cacao, por lo que realizar la caracterización sobre la base de caracteres

morfológicos resulta de interés para discriminar los daños que puedan provocar estas

especies en la producción de cacao en la Amazonía ecuatoriana.

Las características de M. roreri y Colletotrichum sp. coincidieron con las descritas por

Maridueña (2011), en un estudio similar; sin embargo este autor identificó una mayor

diversidad de especies de hongos filamentosos asociados a mazorcas de cacao. Lo

informado en esta investigación se corresponde con lo descrito por Urdaneta y Delgado

(2007), quienes identificaron los géneros Moniliophthora, Cylindrocladium, Colletotrichum

y Phytophthora en la micobiota del filoplano del cacao en Venezuela.

http://www.amjbot.org/search?author1=C.+V.+Mfegue&sortspec=date&submit=Submit


56

4.1. Caracterización cultural, morfológica, fisiológica, molecular y patogénica de

aislados de M. roreri

4.1.1. Caracterización cultural de M. roreri

Todas las colonias de los aislados fueron capaces de crecer de forma radial y sus

características culturales fueron similares en medio de cultivo V8 modificado. De los 20

aislados identificados de M. roreri, UEA-Mr8.9 y UEA-Mr8.10 procedentes de Morona

Santiago, La Comanche, fueron los únicos capaces de cubrir la placa de Petri (90 mm Ø) a

los 12 días de incubación a 26±2 °C, mostrando así la mayor velocidad de crecimiento

micelial en medio de cultivo V8 modificado. A su vez los aislados UEA-Mr5.3,

UEA-Mr5.16, UEA-Mr5.17 provenientes de Arosemena Tola, Napo; UEA-Mr7.28,

UEA-Mr7.13 Palora, Morona Santiago y UEA-Mr8.11 Arajuno, Pastaza lo hicieron a los

15 días, en las mismas condiciones (Figura 11).

Figura 11. Crecimiento micelial de los aislados más destacados de M. roreri por su

velocidad de crecimiento en medio de cultivo V8 modificado a 26±2 ºC a los 12 y 15 días

de incubación. Barras con letras diferentes, indican diferencias significativas por la prueba

de Kruskal-Wallis/Mann Whitney P ≤0,05 (n=10).


57

Estos resultados están en concordancia con los de Villavicencio (2010), quien informó un

crecimiento promedio del micelio de M. roreri de 90,00 mm a los 15 días, en aislados

procedentes de la costa ecuatoriana. Por otra parte, Arbeláez (2010) obtuvo valores de

41,51 mm de rango promedio al día 13 de evaluación en aislados colombianos de

M. roreri.

Los aislados UEA-Mr7.16, UEA-Mr7.17, UEA-Mr7.20, UEA-Mr8.19 y UEA-Mr8.20

cubrieron las placas de Petri (90 mm Ø) a los 16-17 días, mientras que UEA-Mr1.6, UEA-

Mr1.16, UEA-Mr1.29, UEA-Mr2.7, UEA-Mr2.12, UEA-Mr2.15 y UEA-Mr6.10 lo

hicieron en 18 días.

La velocidad de crecimiento radial de los aislados de M. roreri fue de 7,30 mm/día. Estos

resultados son cercanos a los informados por Uquillas (2004), quien determinó que la

velocidad del crecimiento radial de M. roreri fue de 9,81 mm/día al estudiar la inducción de

la germinación para mejorar la eficacia de dos agentes antagonistas para el control de la

Moniliasis.

Se apreció una considerable diversidad en las tonalidades de los colores observados en los

aislados, los que fueron característicos de M. roreri, variando según los días de

crecimiento, detectándose colores como: blanco, salmón y café, debido a la formación

masiva de esporas con masa conidial pulverulenta.

Las tonalidades de colores del micelio de las colonias de los aislados, variaron según la

edad de las mismas; en el caso de los aislados procedentes de Napo, se apreció una

coloración blanca en todo su desarrollo. Las colonias de los aislados procedentes de las

provincias de Pastaza y Morona Santiago presentaron inicialmente una coloración blanca,

pasando por tonalidad salmón y terminaron su desarrollo con coloración café, lo cual

coincide con lo informado por Evans et al. (1978), Phillips et al. (2006) y Arbeláez (2010).

El reverso de las colonias de los aislados de M. roreri presentó diferentes tonalidades de

color, a medida que las colonias fueron creciendo, pasando por blanco, salmón y café.


58

Todas las colonias de los aislados mostraron color salmón en el reverso, excepto

UEA-Mr8.11 y UEA-Mr8.19, que presentaron coloración café, lo que coincide con lo

informado por Evans et al. (1978).

Las tonalidades de colores observados en las colonias son características de M. roreri,

según lo manifestado por Suárez (2006). Las colonias de este hongo fitopatógeno tienen

una considerable variabilidad en cuanto a tonos de coloración del micelio que varían del

blanco, salmón, hasta el café (Phillips et al., 2006), por lo que este parámetro no permite

asegurar con certeza que los fenotipos de los aislados obtenidos pertenezcan a una misma

especie (Anexo 9).

Las colonias de todos los aislados presentaron bordes regulares, similar a lo informado por

Phillips et al. (2006) y que difiere de lo referido por Arbeláez (2010), quien determinó en

Colombia que el borde más representativo fue el plumoso.

Todos los aislados presentaron crecimiento superficial y compacto; características

informadas por Phillips et al. (2006). No existió presencia de pigmentos difusibles en el

medio de cultivo. Los sectores estuvieron ausentes en la mayoría de las colonias (90%),

excepto en los aislados UEA-Mr.8.19 y UEA-Mr.1.6 (Tabla 3), siendo más notorios a

medida que envejeció el cultivo en los aislados, lo cual coincide con lo informado por

Arbeláez (2010).

En los aislados procedentes de Napo (Colonia Bolívar) se observó textura estriada 15%, en

los aislados de Napo (Ahuano, Arosemena Tola y Misahualli) textura afelpada 35%, y en

los aislados de Pastaza (Arajuno) y Morona Santiago (Palora), textura polvosa que

correspondió al 50% del total de los aislados (Tabla 3). Estos resultados difieren con lo

referido por Arbeláez (2010), quien obtuvo una textura afelpada para el 79,3% de los

aislados en un trabajo similar.

No se observó la presencia de líquido de transpiración en los aislados de M. roreri, excepto

en los aislados UEA-Mr1.6, UEA-Mr1.16 y UEA-Mr1.29, donde se presentaron en forma


59

de pequeñas gotas (muy frecuentes) y gotas de mayor tamaño (menos frecuentes)

(Tabla 3). En todos los casos los líquidos transpirados fueron incoloros.

Tabla 3. Características culturales de Moniliophthora roreri en medio de cultivo V8

modificado

Aislados Sectores Textura Líquido de

transpiración Cristales

UEA.Mr1.6 Presentes Estriada Con líquido Ausentes

UEA.Mr1.16 Ausentes Estriada Con líquido Presentes

UEA.Mr1.29 Ausentes Estriada Con líquido Presentes

UEA.Mr2.7 Ausentes Afelpada Sin líquido Presentes







UEA.Mr7.13 Ausentes Polvosa Sin líquido Ausentes








UEA.Mr8.19 Presentes Polvosa Sin líquido Ausentes


Se observó presencia de cristales en los aislados procedentes de Napo, excepto en el aislado

UEA-Mr1.6. Para los aislados procedentes de Arajuno, Pastaza y Palora, Morona Santiago,

no se observó la presencia de cristales durante su desarrollo (Tabla 3).

En relación con estas últimas variables descritas, la literatura científica consultada no

mostró informe previo donde se haya evaluado este aspecto, con vistas a caracterizar las

colonias de M. roreri.


60

M. roreri es un hongo variable respecto a sus características culturales. El predominio de

las esporas como estructuras infectivas en condiciones naturales (Evans et al., 2003b)

implica una amplia variabilidad genética debido a que dichas estructuras son el resultado

del proceso de reproducción sexual donde tienen lugar eventos recombinatorios (Tiburcio

et al., 2010; Meinhardt et al., 2014). Todos estos eventos de variación genética pueden

explicar las diferencias observadas respecto a los caracteres culturales en los aislados de la

Amazonía ecuatoriana de M. roreri.

4.1.2. Caracterización morfológica de M. roreri

Todos los aislados presentaron hifas, conidios y conidióforos que se correspondieron con

las características descritas por Evans et al. (1978) para el estado asexual de M. roreri.

Las características morfológicas de los aislados de M. roreri en medio V8 modificado

fueron similares. En este medio de cultivo se desarrollaron tanto micelio como esporas para

todos los aislados; similar a lo reportado por otros autores que han usado este medio de

cultivo; el crecimiento fue en forma de tapete de aspecto lanoso (Evans et al., 1978;

Phillips et al., 2006; García, 2007; Arbeláez, 2010; Villavicencio, 2010; Cuervo-Parra

et al., 2011). Las hifas tuvieron paredes delgadas, septadas y levemente irregulares,

ramificadas ocasionalmente, con hinchamientos, hialinas. Los conidióforos fueron

ramificados dando lugar a cadenas maduras de esporas (Figura 12).

Figura 12. Cadenas maduras de esporas pertenecientes al aislado UEA-Mr8.9.

Microfotografía con un aumento de 400X


61

Las esporas presentaron coloración amarillo pálido y en masa color café oscuro, fácilmente

separables de las colonias, heteromórficas y con paredes gruesas (Figura 13).

Figura 13. Estructuras basipetalas conoidiales pertenecientes al aislado UEA-Mr8.9.

Microfotografía con un aumento de 400X

Las formas de las esporas obtenidas en medio de cultivo V8 modificado fueron globosas,

subglobosas y elipsoidales (Figura 14).

Figura 14. Esporas con formas globosas, subglobosas y elipsoidales, pertenecientes al

aislado UEA-Mr8.9. Microfotografía con un aumento de 1000X

La mayoría de los aislados produjeron esporas de formas globosas (7-9 µm de diámetro),

sin embargo se encontraron formas subglobosas (8-14 µm de diámetro) y elipsoidales

(8-20 x 6-17 µm), obtenidos a partir del medio de cultivo V8 modificado.

Resultados informados por Holliday (1970), Evans et al. (1978), Suárez (2006), Phillips-

Mora et al. (2015) describieron formas de esporas de M. roreri desde globosas,

subglobosas a elipsoidales.


62

Este planteamiento es confirmado por Evans et al. (1978), quienes describen dimensiones

cercanas en la descripción taxonómica de M. roreri. González y Roble (2014), en una

caracterización de M. roreri, en El Salvador, describieron esporas globosas (4-5 µm),

subglobosas (7-8 µm) y elípticas (9-11 µm); lo que difiere con las dimensiones de las

esporas encontradas en esta investigación.

En la Tabla 4 se muestran las dimensiones de ancho y largo promedio de las esporas de los

aislados obtenidos de M. roreri, donde se aprecia que el aislado que presentó el mayor

valor de ancho de esporas promedio fue UEA-Mr5.3 con un valor de 8,93 µm, y el aislado

que presentó el menor valor fue UEA-Mr.2.7 con 7,34 µm. El aislado que presentó un

mayor valor promedio para el largo de las esporas fue UEA-Mr8.9 con 10,78 µm; mientras

el aislado de menor valor promedio fue UEA-Mr2.7 de 7,42 µm de largo.

Tabla 4. Características morfológicas de las esporas producidas por aislados de M. roreri

Aislados Ancho de las esporas

(µm)

Largo de las esporas

(µm)

UEA-Mr1.6 7,527 ± 0,161 efg 7,771 ± 0,152 efg

UEA-Mr1.16 7,834 ± 0,133 cdefg 7,967 ± 0,133 efg

UEA-Mr1.29 7,666 ± 0,167 defg 7,679 ± 0,175 fg

UEA-Mr2.7 7,340 ± 0,137 g 7,428 ± 0,148 g

UEA-Mr2.12 7,419 ± 0,137 fg 7,537 ± 0,136 g

UEA-Mr2.15 7,342 ± 0,137 g 7,458 ± 0,128 g

UEA-Mr5.3 8,930 ± 0,206 a 9,811 ± 0,337 abc

UEA-Mr5.16 8,587 ± 0,175 abcd 9,750 ± 0,411 abc

UEA-Mr5.17 8,687 ± 0,206 abc 9,460 ± 0,331 abcd

UEA-Mr6.10 7,407 ± 0,156 fg 7,657 ± 0,169 fg

UEA-Mr7.13 7,922 ± 0,220 bcdefg 8,196 ± 0,246 defg

UEA-Mr7.16 8,477 ± 0,192 abcde 8,840 ± 0,218 cdefg

UEA-Mr7.17 8,704 ± 0,171 abc 9,027 ± 0,187 cdef

UEA-Mr7.20 8,330 ± 0,212 abcdef 8.731 ± 0,206 cdefg

UEA-Mr7.28 8,564 ± 0,235 abcd 9.453 ± 0,274 abcd

UEA-Mr8.9 8,663 ± 0,218 abc 10,781 ± 0,605 a

UEA-Mr8.10 8,786 ± 0,256 ab 10,557 ± 0,603 ab

UEA-Mr8.11 8,719 ± 0,213 abc 9,229 ± 0,266 bcde

UEA-Mr8.19 8,112 ± 0,158 abcdefg 8,803 ± 0,219 cdefg

UEA-Mr8.20 8,678 ± 0,201 abc 9,110 ± 0,185 bcdef Medias con letras diferentes en el sentido de la columna difieren para P≤0,05 por la prueba de C de

Dunnett


63

Evans et al. (2003a), obtuvieron valores medios para las esporas de M. roreri muy

próximos a los del presente trabajo, en un aislado procedente de la provincia de Napo,

Ecuador. Así mismo las características de las esporas de los aislados se correspondieron

con las descritas por Phillips-Mora et al. (2015) para la especie de M. roreri, quienes

describieron valores entre 7-10 µm de largo y 8-11 µm de µm de ancho, al informar por

primera vez la presencia de M. roreri en Bolivia.

Contrario a estos resultados Cuervo-Parra et al. (2011) en México, verificaron que las

esporas de M. roreri presentaron 8-19 x 5-11 µm en la caracterización morfológica del

hongo patógeno en Tabasco, México.

4.1.3. Caracterización fisiológica de M. roreri

El aislado UEA-Mr8.9 correspondiente a la finca 8 (Sector La Comanche) fue el que

presentó mayor crecimiento micelial en la caracterización cultural de M. roreri, y fue con el

que se realizaron todos los ensayos en esta caracterización.

4.1.3.1. Influencia del pH en el crecimiento micelial

Se observó crecimiento micelial del aislado UEA-Mr8.9 en todos los valores de pH

evaluados (desde 6,0 hasta 7,5). El pH 6,5 fue el que más favoreció el crecimiento micelial

del hongo patógeno con 8,2 mg de masa seca del micelio, a diferencia del pH 7,5 que fue

donde obtuvieron los menores valores con 0,35 mg, y que a su vez no difirió

estadísticamente del pH 6,0 con 0,42 mg. Valores intermedios se obtuvieron a pH 7,0 con

0,51 mg de masa seca del micelio (Figura 15).

En condiciones controladas M. roreri crece fácilmente en un intervalo de pH entre 4,5 a

7,5. Para el desarrollo micelial el pH está entre 5,0 y 6,5; mientras que para la formación de

esporas requiere pH 7,5 (Arbeláez, 2010).

En este sentido Villegas (1979), en un estudio desarrollado en la Estación Experimental

Tulio Ospina del ICA en Colombia, evaluó la influencia del pH en el crecimiento micelial


64

de M. roreri, en medio de cultivo sólido y líquido, y determinó que este hongo fitopatógeno

puede crecer en un intervalo de pH entre 3,5 y 8,0; sin embargo, el desarrollo micelial más

abundante lo logró a los pH 5,0 y 6,5.

Figura 15. Influencia del pH sobre el crecimiento micelial (materia seca) de M. roreri

(aislado UEA-Mr8.9) en medio de cultivo PDB. Barras con letras diferentes, indican

diferencias significativas por prueba de Kruskal-Wallis/Mann Whitney P ≤0,05 (n=10)

4.1.3.2. Influencia de la temperatura en el crecimiento micelial

De manera general, se observaron diferencias estadísticas entre el crecimiento micelial del

aislado UEA.Mr.8.9 de M. roreri para las temperaturas en estudio (Tabla 5).

Tabla 5. Influencia de la temperatura sobre el crecimiento micelial (mm) de M. roreri

(aislado UEA-Mr8.9) en medio de cultivo V8 modificado

Días

Temp.

(°C)

3 6 9 12

Med.

reales

Rangos

medios

Med.

reales

Rangos

medios

Med.

reales

Rangos

medios

Med.

reales

Rangos

medios

15±2 ºC 5,6 7,20 e 6,67 7,20 d 8,86 10,75 d 11,14 10,90 d

20±2 ºC 12,37 35,90 b 25,54 26,10 b 42,84 25,50 c 68,33 27,00 c

25±2 ºC 18,47 44,80 a 37,76 39,80 a 73,81 44,70 a 90,28 45,50 a

30±2 ºC 7,64 25,05 c 40,18 40,60 a 59,87 36,30 b 77,27 34,00 b

35±2 ºC 6,52 14,55 d 8,29 13,80 c 10,27 10,25 d 12,67 10,10 d

Rangos medios con letras diferentes en el sentido de la columna difieren por la prueba de Kruskal

Wallis/Mann-Whitney P≤0,05 (n=10)


65

La temperatura de 25±2 °C fue la que mostró los mayores valores de crecimiento micelial

del hongo patógeno en todos los tiempos de evaluación, a diferencia de las temperaturas de

15 y 35±2 °C, que fue donde se hallaron los menores valores para esta variable. Este

resultado resalta la importancia del conocimiento de la temperatura de incubación óptima

en el crecimiento micelial de M. roreri en condiciones controladas, catalogando así a este

como un patógeno psicrófilo facultativo.

Estos resultados coincidieron con los reportados por Villamil et al. (2012), quienes

obtuvieron un crecimiento micelial favorable con el empleo del medio de cultivo PDA a

25 °C, para la producción in vitro de micelio de M. roreri.

Por otra parte, Evans et al. (1978) en la descripción de las características morfológicas de

M. roreri, informaron que las temperaturas de crecimiento óptimo fueron de 25 a 26 °C

con un máximo de 33 °C.

Phillips-Mora (2003), evaluó el efecto in vitro de tres temperaturas (18, 24 y 30 °C) sobre

el crecimiento micelial de 15 aislados de M. roreri procedentes de los grupos genéticos

más importantes de este hongo fitopatógeno en América, y determinó que las temperaturas

tuvieron un efecto significante sobre el crecimiento de los aislados de M. roreri, asimismo

sitúo el valor óptimo para crecer y esporular a 24 °C.

4.1.3.3 Influencia de diferentes regímenes de luz en el crecimiento micelial

De manera general, se observaron diferencias estadísticas entre el crecimiento micelial del

aislado UEA.Mr.8.9 de M. roreri para las condiciones de iluminación en estudio

(Tabla 6). La condición de oscuridad fue la que mostró los mayores valores de

crecimiento micelial del hongo patógeno en todos los tiempos de evaluación a diferencia

de las otras variantes en estudio, en las cuales existieron variaciones en la respuesta según

el tiempo de evaluación. En condiciones de luz ultravioleta se apreció el crecimiento

micelial más lento a los 12 y 15 días de evaluación.


66

Tabla 6. Crecimiento micelial de M. roreri (aislado UEA-Mr8.9) en diferentes condiciones

de iluminación

Días

3 6 9 12 15

Tratamientos Med.

reales

Rangos

medios

Med.

reales

Rangos

medios

Med.

reales

Rangos

medios

Med.

reales

Rangos

medios

Med.

reales

Rangos

medios

Oscuridad 18,08 31,85 a 40,22 34,90 a 64,75 35,50 a 84,69 35,50 a 90,28 35,50 a

Luz blanca 12,81 18,20 b 25,54 17,00 b 44,33 21,30 b 68,33 21,10 b 85,94 23,60 b

Luz alterna 12,37 11,50 c 23,41 14,50 b 42,84 8,50 c 66,58 19,90 b 82,78 17,40 c

Luz ultravioleta 11,18 20,45 b 22,96 15,85 b 38,64 16,70 bc 52,05 5,50 c 58,86 5,50 d

Rangos medios con letras diferentes en el sentido de la columna difieren por la prueba de Kruskal

Wallis/Mann-Whitney P≤0,05 (n=10).

Este resultado coincide con los obtenidos por Rumbos et al. (2005) quienes determinaron

que M. roreri crece lento y en forma irregular en condiciones naturales (alternancia luz-

oscuridad), luz fluorescente continua y en ciclos alternos de fluorescencia y oscuridad.

De igual forma con estos resultados se ve la necesidad de considerar el factor iluminación,

pues tiene influencia sobre el crecimiento micelial en condiciones controladas.

Phillips-Mora (2003), al evaluar las características morfofisiológicas de 88 aislados

procedentes de ocho países: Venezuela, Colombia, Perú, Panamá, Ecuador, Costa Rica,

Nicaragua y Honduras, indicó que los aislados de Perú, Colombia y Venezuela presentaron

en promedio una mayor velocidad de crecimiento, esporulación y tamaño de las esporas, en

contraposición a los aislados de Centroamérica y centro de Ecuador.

Los resultados anteriores descritos por este autor, de conjunto con los del presente trabajo

confirman la diversidad cultural, morfológica y fisiológica de M. roreri, lo cual debe

tomarse en consideración a la hora de seleccionar aislados de este hongo fitopatógeno para

el cribado de germoplasma de cacao en apoyo a los programas de mejoramiento genético.


67

4.1.4. Identificación molecular de aislados de M. roreri

La implementación del método de extracción de ADN genómico utilizado demostró ser

eficiente para la obtención de adecuadas concentraciones y pureza de ADN de los aislados

objeto de estudio (Anexo 10). Aunque en algunos aislados las concentraciones fueron algo

bajas, la pureza fue adecuada, por lo que se decidió el envío del ADN para su

amplificación.

Los cebadores NS1 y NS8 demostraron que amplifican un fragmento de aproximadamente

1,8 kb dentro de la subregión 18S ARNr. Esta subregión de conjunto con las regiones

intergénicas ITS1 e ITS2 están informadas como las más conservadas dentro del genoma de

los eucariontes, y es un fragmento diana para la identificación molecular (Gardes y Bruns,

1993).

Todas las secuencias tuvieron un porcentaje de similitud con la base de datos GenBank

entre 99 y 100%, lo que demuestra lo efectivo de esta región para la identificación hasta el

nivel de especie.

Para definir una especie utilizando este marcador se aplica la regla universal descrita por

Stackebrandt y Goebel (1994). Aquellos aislados que tengan una diferencia mayor a 97%

en la secuencia de nucleótidos de este gen serán considerados como especies diferentes.

El 100% de los aislados analizados fueron identificados molecularmente como M. roreri,

resultado esperado teniendo en cuenta la caracterización morfo-cultural realizada.

No obstante, los aislados en estudio mostraron similitud por Blastn con tres cepas

diferentes de este hongo descritas con anterioridad, y predominio de las cepas MRO1

(36,4%) y MROCP (36,4%), como se describe en la Tabla 7.


68

Tabla 7. Identificación molecular de aislados de M. roreri

Código de

aislado FASTA más cercana N° Accesión

% de

identidad Referencia

UEA-Mr1.6 Moniliophthora roreri aislado MROCP KM998972.1 99 Concepción-Brindis et al. (2015)

UEA-Mr2.7 Moniliophthora roreri cepa MRO1 JF730693.1 99 Sánchez et al. (2011)



UEA-Mr6.10 Moniliophthora roreri cepa C21 AY916745.1 100 Aime y Phillips-Mora (2005)



UEA.Mr8.9 Moniliophthora roreri cepa C21 AY916745.1 100 Aime y Phillips-Mora (2005)



Existe gran diversidad de métodos moleculares usados para la identificación de M. roreri.

Aime y Phillips-Mora (2005) indican que la identificación de M. roreri se ha realizado a

través de la amplificación por PCR de la secuencia de la subregión ITS, así como el 28S

ARNr. Sánchez (2011) demuestra que los marcadores moleculares del fragmento del 18S

ARNr y la región ITS1-5,8S-ITS2 son eficaces y eficientes para la identificación molecular

de cepas del hongo M. roreri. En este sentido, Phillips-Mora et al. (2015) y Suárez (2016)

identificaron molecularmente aislados de M. roreri extraídos de T. cacao en Bolivia y

Colombia respectivamente, mediante marcadores moleculares de ITS.

Por otra parte, White et al. (1990) manifiestan que las regiones codificantes de los genes

nucleares 18S, 5,8S y 28S ARNr evolucionan lentamente y están altamente conservadas,

por lo que se utilizan para obtener información sobre las relaciones filogenéticas. No

obstante, la subregión ITS es en la actualidad la región más secuenciada del ADN del

genoma en hongos, y ha sido usada para explicar o inferir afinidades filogenéticas de

grupos relacionados (Lee y Taylor, 1992).

Mediante la secuenciación de la subregión 18S ARNr se logró la identificación de los

aislados monospóricos objetos de estudio, los cuales pertenecen a la especie M. roreri. Por

vez primera en la Amazonía ecuatoriana se usan herramientas moleculares para el

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/746589920?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=9DUJMG7H015

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/333975534?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=9DUWPS0G013










69

diagnóstico de este hongo, lo que significa un aporte metodológico para futuras

investigaciones.

4.1.5. Caracterización patogénica y agresividad de los aislados de M. roreri

Los 20 aislados de M. roreri fueron patogénicos, capaces de reproducir los síntomas

característicos de la Moniliasis, en los frutos inoculados de cacao Nacional.

Estos fueron similares a los observados en condiciones naturales de campo, donde el

período de incubación varió de tres a ocho semanas de acuerdo con la edad del fruto,

mientras que a nivel de laboratorio los síntomas se desarrollaron con mayor velocidad (en

un período de 12 días), lo cual coincide con lo informado por Ampuero (1967); Suárez

(1971); Barros (1977) y Villavicencio (2010).

La evaluación diaria de la severidad externa de las mazorcas inoculadas evidenció los

siguientes síntomas: al día dos de la inoculación se manifestó el grado 1 (puntos aceitosos),

el día cinco presentó grado 2 (tumefacciones o clorosis). En el día siete se observó grado 3

(mancha necrótica).

En la evaluación realizada al día 11 se observó el grado 4 (micelio presente en un 25% de la

mancha), y al día 12 grado 5 (micelio en más del 25% de la mancha) en la mayoría de los

aislados, excepto para UEA-Mr1.6, UEA-Mr2.7, UEA-Mr6.10, UEA-Mr7.13, quienes

manifestaron los síntomas de grado 5 a los ocho días.

Este último resultado evidenció la capacidad de agresividad de estos aislados, al reproducir

la enfermedad y síntomas más severos (necrosis más esporulación en un área mayor de la

cuarta parte de la superficie necrótica) en un menor período de tiempo, de manera similar a

Villavicencio (2010) quien informó de un período de incubación de ocho días al inocular

frutos de cacao con diez aislados virulentos de M. roreri procedentes de la costa

ecuatoriana.


70

Por otro lado, luego de los 15 días, no se observaron diferencias en los síntomas de las

mazorcas inoculadas, siendo su comportamiento uniforme en el transcurso de los días

(Figura 16).

Los primeros síntomas internos se manifestaron a los cinco días de la inoculación, cuando

se observó grado 1 (1-20% área necrosada), a los siete días se manifestó el grado 2

(21-40% área necrosada), a los nueve días se presentó el grado 3 (41-60% área necrosada),

a los 11 días se observó grado 4 (61-80% área necrosada) y a los 15 días la mazorca se

encontró infectada completamente hasta grado 5 (100% área necrosada). En relación con

esta variable en la literatura científica no se han encontrado referencias previas al uso de la

misma para determinar la severidad interna de aislados de M. roreri, lo cual implica un

aporte del presente trabajo con vistas a enriquecer la caracterización patogénica de este

hongo (Figura 17).

Figura 17. Severidad interna acorde a la escala de Sánchez et al. (1987) del daño ocasionado por

aislados de M. roreri en ensayo monocíclico a) grado 0 b) grado 1 c) grado 2 d) grado 3 e) grado 4

f) grado 5

a

b c

d e f

Figura 16. Severidad externa acorde con la escala de Brenes (1983) del daño ocasionado por

aislados de M. roreri en ensayo monocíclico a) puntos aceitosos (dos días) b) tumefacción o

clorosis (cinco días) c) mancha necrótica (siete días) d) micelio en un 25% de la mancha (once

días) e) micelio en más del 25% de la mancha (doce días)

a

b

c

d

e


71

En el caso de los aislados UEA-Mr6-10, UEA-Mr1.16, UEA-Mr1.6, UEA-Mr7.13, UEA-

Mr7.17 y UEA-Mr2.7 no se encontraron diferencias estadísticas en cuanto a su agresividad

a los seis días, a pesar del aislado UEA-Mr6-10 presentara el mayor valor de ABCPE, y

UEA-Mr7.20 el menor valor (Tabla 8).

Tabla 8. Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad en el período de 1 hasta 6 días

posteriores a la inoculación

Aislados ABCPE Rangos medios

UEA-Mr6.10 202 174,7 a

UEA-Mr1.16 132 166,7 ab

UEA-Mr1.6 134 163,5 ab

UEA-Mr7.13 196 161,1 ab

UEA-Mr7.17 128 130,5 ab

UEA-Mr2.7 132 125,7 ab

UEA-Mr8.11 114 115,1 b

UEA-Mr5.17 94 112,5 b

UEA-Mr8.19 98 112,3 b

UEA-Mr2.12 90 102,5 b

UEA-Mr8.10 96 102,5 b

UEA-Mr8.20 78 99,7 b

UEA-Mr8.9 76 95,1 b

UEA-Mr5.3 96 93,7 b

UEA-Mr7.16 128 87,9 b

UEA-Mr1.29 78 83,1 b

UEA-Mr7.28 64 82,7 bc

UEA-Mr5.16 62 75,5 bc

UEA-Mr215 58 70,9 bc

UEA-Mr7.20 36 47,3 c

Rangos medios con letras diferentes difieren por la prueba de Kruskal Wallis/Mann-Whitney

P≤0,05 (n=10).

El Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad en el intervalo continuo de 1 a 17

días permitió encontrar una respuesta diferencial en la agresividad de los aislados de

M.roreri, encontrándose en los aislados UEA-Mr6.10, UEA-Mr1.6, UEA-Mr7.13 la mejor


72

respuesta; UEA-Mr2.7 de respuesta intermedia y UEA-Mr7.20 de menor respuesta

(Figura 18).

Figura 18. Progresión ABCPE de aislados de M. roreri con agresividad diferencial

Por vez primera se logró, a través de un ensayo monocíclico, utilizar el Área Bajo la Curva

del Progreso de la Enfermedad (ABCPE) vinculada con la respuesta diferencial de aislados

de M. roreri, al usar como unidad experimental mazorcas de cacao Nacional. Igualmente en

cacao, Torres et al. (2011) utilizaron esta variable para determinar el progreso temporal de

M. roreri en plantaciones de cacao de la provincia mexicana de Tabasco, sin determinar la

carga de inóculo y bajo condiciones de inóculo natural. A diferencia del presente trabajo,

estos autores determinaron la incidencia final acumulada y la tasa aparente de infección con

el objetivo de lograr un manejo integrado de la enfermedad en condiciones de campo, pero

no determinaron la agresividad de los aislados.

Para determinar la efectividad de alternativas de control de la Escoba de bruja en cacao se

utilizó el ABCPE en el contexto del manejo integrado de M. perniciosa, un agente muy

similar a M. roreri. Los resultados de estos autores permitieron demostrar mediante los

valores del ABCPE que Trichoderma stromaticum Samuels & Pardo-Schulth., junto a


73

fungicidas cúpricos, permitieron lograr un manejo integrado eficiente de la Escoba de bruja,

así como incrementar los rendimientos agrícolas y el retorno económico del cultivo

(Medeiros et al., 2010; Samuels et al., 2012b).

En un estudio realizado en Santo Domingo, Ecuador, se utilizó el ABCPE con el fin de

mitigar la Moniliasis en cacao híbrido nacional x trinitario con el uso de biopreparados,

resultados que fueron evaluados mediante la escala propuesta por Sánchez y González

(1989). Estos valores fueron la base para calcular el Área Bajo la Curva del Progreso de la

Enfermedad, donde se demostró que el tratamiento Cepacide (Fungicida biológico cuyo

ingrediente activo es Pseudomona cepacia) presentó un área menor en relación con la

incidencia de la Moniliasis, lo que evidenció que este tratamiento fue el que mejor controló

el patógeno en el tiempo, con 1 211,0 unidades (Estrella y Cedeño, 2012).

Con los resultados del presente trabajo, se concluye que el ABCPE puede ser un descriptor

de la agresividad de aislados de M. roreri, si se tiene en cuenta que permitió determinar el

efecto cuantitativo negativo de los aislados del hongo fitopatógeno sobre los frutos de

cacao, lo cual refleja la cantidad relativa de la magnitud de los síntomas sobre las mazorcas

inoculadas.

A pesar de que en esta investigación solo se caracterizaron 20 aislados, se apreció que

existieron diferencias respecto a la agresividad de los mismos, lo cual es un aspecto

importante para la investigación, aplicada al mejoramiento genético del cacao en la

Amazonía ecuatoriana, una vez que se desee seleccionar aislados de M. roreri para realizar

evaluaciones del germoplasma de cacao en condiciones controladas y semicontroladas y

colaborar con programas de mejoramiento genético de este cultivo en la selección de

cultivares resistentes.

4.2. Respuesta de genotipos de cacao frente a M. roreri en un ensayo monocíclico

La Figura 19 muestra la respuesta del cultivar Nacional a la inoculación artificial por

M. roreri a través de un ensayo monocíclico. Los síntomas de severidad externa de las

mazorcas al tercer día de la inoculación manifestaron grado 1 (puntos aceitosos) y grado 2


74

(tumefacción o clorosis). A partir del día cuatro se observó grado 3 (mancha necrótica). En

la evaluación realizada del día nueve al día 11 se observó grado 4 (micelio hasta en un 25%

de la mancha), y al día 13 grado 5 (micelio en más del 25% de la mancha) en la mayoría de

las repeticiones.


aislados de M. roreri en ensayo monocíclico en el cultivar Nacional a) fruto sano b) puntos

aceitosos c) tumefacción o clorosis d) mancha necrótica e) micelio en un 25% de la mancha

f) micelio en más del 25% de la mancha

En el caso de las mazorcas de clon CCN-51 al día seis de la inoculación manifestaron grado

1 (puntos aceitosos), a partir del día nueve se observó grado 3 (mancha necrótica), el grado

4 (micelio hasta en un 25% de la mancha) se manifestó al día 18, y el grado 5 (micelio en

más del 25% de la mancha) se observó al día 19 en la mayoría de las repeticiones. No se

pudo evidenciar la presencia de grado 2 (tumefacción o clorosis), debido al color rojo que

presenta este tipo de clon (Figura 20).


aislados de M. roreri en ensayo monocíclico en el clon CCN-51 a) fruto sano b) puntos aceitosos

c) mancha necrótica d) micelio en un 25% de la mancha e) micelio en más del 25% de la mancha

b

c

d

e

f

a

b

c

d

e

a


75

Estos resultados coinciden con lo referido por Rodríguez (2004); García (2010) y

Avendaño et al. (2010), quienes manifestaron que el índice de severidad externa no permite

identificar infecciones ocultas; lo que hace muy difícil identificar síntomas anteriores a la

formación de la mancha sobre todo en genotipos de color rojo (Ampuero, 1967;

Evans, 1981).

En mazorcas del clon EET-95, se observó grado 1 (puntos aceitosos) a los tres días después

de la inoculación, grado 2 (tumefacción o clorosis) se manifestó al día siete. A partir del

día ocho presentó grado 3 (mancha necrótica), grado 4 (micelio hasta en un 25% de la

mancha) se evidenció al día 13 y al día 16 se observó grado 5 (micelio en más del 25% de

la mancha) (Figura 21).


aislados de M. roreri en ensayo monocíclico en el clon EET-95 a) fruto sano b) puntos aceitosos

c) tumefacción o clorosis d) mancha necrótica e) micelio en un 25% de la mancha f) micelio en

más del 25% de la mancha

Las mazorcas de clon EET-96 manifestaron grado 1 (puntos aceitosos) al día tres después

de la inoculación artificial, al día ocho se observó grado 2 (tumefacción o clorosis). A partir

del día nueve las mazorcas manifestaron grado 3 (mancha necrótica), al día 13 presentó

grado 4 (micelio hasta en un 25% de la mancha) y grado 5 (micelio en más del 25% de la

mancha) manifestó al día 16 (Figura 22). A los 17 días los síntomas expresados en las

mazorcas por la mezcla de aislados inoculados, se comportaron uniformemente en el

transcurso de los días y no se observó diferencia entre ellos.

b

c

d

e

f

a


76





Mazorcas de clon EET-103, al día tres de la inoculación artificial manifestaron grado 1

(puntos aceitosos), al día siete grado 2 (tumefacción o clorosis). A partir del día ocho se

observó grado 3 (mancha necrótica), grado 4 (micelio hasta en un 25% de la mancha) al día

14, y grado 5 (micelio en más del 25% de la mancha) al día 16 en la mayoría de las

repeticiones (Figura 23). A los 17 días los síntomas expresados en las mazorcas por la

mezcla de los aislados inoculados, se comportaron uniformemente en el transcurso de los

días y no se observaron diferencias entre ellos.





b

c

d

e

f

a

b

c

d

e

f

a


77

Al analizar la severidad interna, se observaron los siguientes síntomas en los cinco

genotipos de cacao:

Cultivar Nacional.

Figura 24. Severidad interna acorde a la escala de Sánchez et al. (1987) del daño ocasionado por la

mezcla de los cuatro aislados de M. roreri en ensayo monocíclico cultivar Nacional a) grado 0

(cero área necrosada) b) grado 1 (1-20% del área necrosada) c) grado 2 (21-40% del área necrosada)

d) grado 3 (41-60% del área necrosada) e) grado 4 (61-80% del área necrosada) f) grado 5 (100%

del área necrosada)

Clon CCN-51


mezcla de los cuatro aislados de M. roreri en ensayo monocíclico en el clon CCN-51 a) grado 0




b c

d

e f

a

a

b c

d e f


78

Clon EET-95


mezcla de los cuatro aislados de M. roreri en ensayo monocíclico en el clon EET-95 a) grado 0




Clon EET-96






a

b c

d e f

a

b c

d e f


79

Clon EET-103






En relación con esta variable en la literatura científica no se han encontrado referencias

previas del uso de la misma para determinar la severidad interna de aislados de M. roreri en

variedades de cacao en condiciones in vitro, lo cual constituye un aporte del presente

trabajo para enriquecer la determinación de la respuesta de genotipos de cacao a la

inoculación artificial de M. roreri.

A partir de este estudio se pudo concluir que el cultivar Nacional resultó susceptible

(4,0 SI) en relación con CCN-51 (3,0 SI), EET-95 (3,7 SI), EET-96 (3,6 SI), EET-103

(3,3 SI), los que según los valores de la escala de severidad interna resultaron

moderadamente susceptibles.

Los valores de SI de la investigación fueron similares a los informados por Phillips-Mora

et al. (2005) y Porras (1985) quienes obtuvieron valores de SI que oscilaron entre 0,8 a 4,6

es decir con un necrosamiento interno de 0 a 100% al evaluar diferentes genotipos de cacao

con inoculaciones de M. roreri en condiciones de campo.

a

b c

d e f


80

Estos resultados reafirman lo reportado por Saquicela (2010), quien determinó la alta

susceptibilidad que presenta el cultivar Nacional ante la Moniliasis al evaluar los

componentes de manejo integrado en campo.

García (2010) en el catálogo de cultivares de cacao del Perú manifiesta que los clones

EET-95, EET-96, EET-103 son moderadamente susceptibles frente al ataque de M. roreri,

información que coincide con los resultados obtenidos en el presente trabajo.

De la misma manera Sterling et al. (2015) al evaluar in situ 50 materiales genéticos de

T. cacao, T. bicolor y T. grandiflorum con inoculación controlada de aislados autóctonos de

M. roreri en Caquetá, Colombia, determinaron que el 44% de genotipos evaluados presentó

resistencia completa o moderada a M. roreri, y el 26% no presentó signos ni síntomas de la

enfermedad (dos materiales genéticos de T. cacao, cinco de T. bicolor y seis de

T. grandiflorum), la incidencia y severidad de la enfermedad entre materiales genéticos

estuvieron influenciados por la agresividad del aislado.

Sin embargo, Phillips-Mora et al. (2005) realizaron pruebas biológicas de resistencia en

condiciones de campo, para lo cual usaron ensayos en inoculaciones artificiales de

suspensión de esporas (1,2 x 105 esporas mL-1) de siete aislados de M. roreri en cinco

cultivares de cacao de la Finca Suiza Experimental, Colombia, y obtuvieron variaciones en

los niveles de resistencia en los diferentes genotipos.

En este mismo sentido, CATIE (2012) ha desarrollado métodos de inoculación artificial

eficientes para evaluar la respuesta de diferentes genotipos a la Moniliasis (Sánchez et al.,

1987 y Phillips-Mora y Galindo, 1988), en condiciones de campo. Estos identificaron dos

clones resistentes (CATIE-R4 y CATIE-R6), un clon moderadamente resistente

(CATIE-R1), y tres clones moderadamente susceptibles (CC-137, ICS-95 T1 y PMCT-58),

al emplear altas concentraciones de inóculo (1,2 x 105 esporas mL-1) y cámara húmeda para

favorecer la infección. Los resultados obtenidos por ese método artificial son similares a los

observados en forma natural.


81

El cultivar Nacional fue el que mostró mayor valor de ABCPE, en relación con CCN-51,

EET-95, EET-96, EET-103 (Tabla 9). Este genotipo a pesar de su susceptibilidad es el que

se recomienda para la región amazónica, por sus características productivas y

organolépticas, distintivas del cacao ecuatoriano.

Tabla 9. Respuesta in vitro de cinco genotipos de cacao según el valor del ABCPE

Genotipos ABCPE 1-10

Medias reales

Rangos

medios

Nacional 350 41,60 a

CCN-51 279 24,10 b

EET-95 279 24,40 b

EET-96 252 18,70 b

EET-103 252 18,70 b

Rangos medios con letras diferentes, difieren por la prueba de Kruskal Wallis/Mann Whitney

P ≤0,05 (n=10)

De manera general se encontró que todos los genotipos de cacao inoculados artificialmente

con M. roreri fueron capaces de reproducir los síntomas característicos de la Moniliasis en

frutos. Estos fueron similares a los observados en campo donde el período de incubación es

de tres a ocho semanas de acuerdo con la edad del fruto (Ampuero, 1967; Suárez, 1971;

Barros, 1977; Campuzano, 1980 y Villavicencio, 2010), mientras que a nivel de laboratorio

los síntomas se desarrollaron con mayor velocidad, en un período de hasta 19 días.

Si se considera que combatir a la Moniliasis con variedades resistentes aumenta la

producción y reduce el uso de productos químicos, siendo de esta forma amigable con el

medio ambiente y atractivo para los productores, se propone como una alternativa la

obtención de nuevos genotipos resistentes a la Moniliasis desde los puntos de vista técnico,

económico y de manejo para los pequeños productores de cacao en la Amazonía

ecuatoriana.


82

Por vez primera, se logró determinar la agresividad de aislados de M. roreri en un ensayo

monocíclico de cacao, lo que demostró que con ensayos de inoculación artificial de este

hongo fitopatógeno se pueden diferenciar genotipos de cacao sin tener que realizar

inoculaciones en condiciones de campo, y así evitar la liberación de inóculo que pueda

impactar negativamente sobre el agro ecosistema cacaotero de producción orgánica en la

Amazonía ecuatoriana.

4.3. Caracterización cultural y molecular de Trichoderma spp. procedentes de

plantaciones de cacao orgánico

Se obtuvieron tres aislados del género Trichoderma procedentes de la rizosfera de tres

plantaciones de cacao, que de acuerdo con las características culturales en medio de cultivo

PDA (Figura 29) y moleculares, se correspondieron a T. harzianum y T. viride, procedentes

de la provincia del Napo (Anexo 11).

Figura 29. Características culturales en medio de cultivo PDA de los aislados de

Trichoderma spp. a) UEA-Th1; b) UEA-Th2; c) UEA-Tv3.

Para los aislados UEA-Th1 y UEA-Th2, el análisis de secuencia de los nucleótidos

mediante Blastn mostró una homología de 98 y 99% respectivamente, para T. harzianum

con número de accesión KP133166 según GenBank (Pozzo et al., 2015). El análisis Blastn

indicó que la secuencia parcial del gen 18S ADNr amplificada a partir del ADN del aislado

UEA-Th3, correspondió con un 99% de similitud a T. viride (Li et al., 2002), con respecto

a la secuencia AF525230 depositada en la base de datos de GenBank de la NCBI

(Tabla 10).

a

b

c


83

Tabla 10. Identificación molecular de aislados de Trichoderma spp.

Código de

aislado FASTA más cercana N° Accesión

% de

identidad Referencia

UEA-Th1 Trichoderma harzianum

aislado BLT4A KP133166.1 98 Pozzo et al. (2015)

UEA-Th2 Trichoderma harzianum

aislado BLT4A KP133166.1 99 Pozzo et al. (2015)

UEA-Tv3 Trichoderma viride AF525230.1 99 Li et al. (2002)

Los tres aislados obtenidos difirieron en cuanto a sus características morfológicas y

culturales. Trichoderma presentó diversas formas de crecimiento en relación con el

micelio, el color de sus colonias y la esporulación (Figura 30). Se observó que de acuerdo

con sus características macroscópicas, UEA-Th1 y UEA-Th2 demostraron similitud con lo

descrito por Rifai (1969), Fernández y Suárez (2009) y Romero et al. (2015) quienes

describieron los caracteres de T. harzianum. UEA-Tv3 presentó similitud a lo descrito por

Leickfeldt et al. (1999) para los caracteres morfológicos y moleculares de T. viride.

Figura 30. Microfotografía de las características morfológicas de los aislados de

Trichoderma, a) UEA-Th1; b) UEA-Th2; c) UEA-Tv3 con un aumento de 400X.

Entre las características relevantes que se observaron en los tres aislados de

Trichoderma spp. se pudo determinar que el color del micelio fue blanco, y que este era

retorcido y plano, las fiálides estuvieron presentes y la esporulación fue de color verde

(Tabla 11). Este resultado es coincidente con lo descrito por Rifai (1969) y Olivera Costa y

Rodríguez (2014), quienes al referirse a las colonias de Trichoderma mencionan esta

coloración como la típica para este género.

a

b

c

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/767509509?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=9DUC8WD5013

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/767509509?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=9DUC8WD5013

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/21954736?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=12&RID=9DU7YS4D015


84

El aroma a coco que emanó fue claramente perceptible en el aislado UEA-Tv3 debido a su

efecto antagónico, similar a lo observado por Dennis y Wester (1971) y Lieckfeld et al.

(1999). Este resultado se corrobora con lo descrito por Samuels et al. (2006b) quien al

estudiar aislados de Trichoderma de Perú y Ecuador determinó el fuerte olor a coco que

emanan estos biocontroladores, hecho distintivo del clado "viride" debido a la presencia del

ácido nonanoico conocido por inhibir el crecimiento y la germinación de las esporas

(Garrett y Robinson, 1969).

Tabla 11. Características culturales y morfológicas de los tres aislados de Trichoderma

spp. procedentes de la rizosfera de plantaciones de cacao

Aislados Forma del

micelio

Color del

micelio

Tipo de

micelio

Color de

esporas Olor

Presencia

de Fiálides

UEA-Th1 Retorcido Blanco Plano Verde Ninguno Si

UEA-Th2 Retorcido Blanco Plano Verde Ninguno Si

UEA-Tv3 Retorcido Blanco Aéreo Verde Aroma a coco Si

En relación con la presencia de Trichoderma asociada a cacao en la Amazonía del

Ecuador, Evans et al. (2003), describieron la presencia de Trichoderma hamatum Rifai,

T. harzianum, T. virens (J.H. Mill., Giddens & A.A. Foster) y T. viride asociados a

Theobroma gileri árbol amazónico, en Esmeraldas y Pichincha, provincias de la Costa y

Sierra ecuatoriana, respectivamente.

De la misma forma Evans (1999), descrito por Samuels et al. (2006a), aisló Trichoderma

ovalisporum Samuels & Schroers aislado (DIS 70a) de una liana (Banisteropsis caapi

Mar.) procedente de la provincia de Sucumbíos, región Amazónica del Ecuador en la

ribera de los ríos Panacocha y Yanayacu.

En la literatura científica consultada no se encontró hallazgo previo de informe, de

T. harzianum y T. viride en la Amazonía ecuatoriana, asociada a cacao, por lo que este

trabajo constituye el primer reporte de estas especies antagonistas en plantaciones

orgánicas amazónicas de cacao.


85

Velocidad de crecimiento micelial de aislados de Trichoderma spp.

Se pudo evidenciar que los promedios de crecimiento micelial de Trichoderma spp. fueron

similares en los tres aislados, cubriendo la placa de Petri (90 mm Ø) a las 72 h de

inoculación, por lo tanto no presentaron diferencias significativas en cada una de las

evaluaciones (Tabla 12).

Tabla 12. Crecimiento micelial (mm) de tres aislados de Trichoderma spp. a las 24, 48 y

72 h

Aislados Crecimiento micelial (mm)

24 h 48 h 72 h

UEA-Th1 21,26 71,58 90,05

UEA-Th2 19,89 68,76 90,05

UEA-Tv3 17,22 71,90 90,05

Datos por la prueba de Duncan P<0,05 (n=10)

Dennis y Webster (1971), y Cook y Baker (1983) afirmaron que la velocidad de

crecimiento de Trichoderma sirve como guía para su utilización como antagonistas en el

control de fitopatógenos, demostrando así la variabilidad de la actividad antagónica de las

especies de Trichoderma; lo cual constituye una ventaja en el momento de colonizar el área

de crecimiento del hongo fitopatógeno.

Los resultados obtenidos coinciden con lo descrito por Párraga y Zambrano (2012),

quienes al estudiar la tasa de crecimiento de cepas de Trichoderma spp. in vitro

determinaron que las cepas C1, C10, C4 y C9 cubrieron la totalidad de las placas de Petri

(90 mm Ø) a los tres días, después de incubadas.

Estos resultados difieren de lo descrito por Arcos (2011), quien al evaluar cepas nativas de

Trichoderma spp. en el biocontrol de Botrytis cinerea Pers. en rosas, determinó que el

crecimiento del diámetro de la colonia de Trichoderma spp. fue de 89,3 mm a los cuatro

días.


86

Entre los tres aislados de Trichoderma spp. no se encontraron diferencias estadísticas en

cuanto a la tasa de crecimiento micelial, a pesar de que el aislado UEA-Tv3, mostró un

valor relativo ligeramente superior (Tabla 13).

Estos resultados difieren de los de Solís (1999), quien al evaluar organismos antagónicos

asociados a M. roreri determinó que la velocidad de crecimiento de Trichoderma spp. a las

96 h fue de 22,50 mm día.

Tabla 13. Tasa de crecimiento micelial de aislados de Trichoderma a los tres días de

incubación y al cuarto día para los biopreparados

Aislados Tasa de crecimiento micelial (mm día)

UEA-Tv3 36,42

UEA-Th2 35,08

UEA-Th1 34,40

Datos por la prueba de Duncan P<0,05 (n=10)

4.4. Evaluación de la actividad antagónica in vitro de Trichoderma spp. frente a

M. roreri

Competencia por espacio

Al evaluar el enfrentamiento en cultivo dual de Trichoderma harzianum y T. viride, frente a

M. roreri, se determinó que al primer día los aislados UEA-Th1, UEA-Th2 y UEA-Tv3,

presentaron crecimientos promedios de 18,17; 17,75 y 16,45 mm respectivamente.

M. roreri tuvo un crecimiento promedio de 29,58 mm. En el segundo día de evaluación

Trichoderma UEA-Tv3 presentó mayor crecimiento con un promedio de 48,00 mm,

UEA-Th2 y UEA-Th1 alcanzaron promedios de 44,72 y 43,36 mm respectivamente. Los

aislados de M. roreri presentaron crecimiento promedio de 36,38 mm. Al tercer día de

evaluación, el aislado UEA-Tv3 obtuvo el mayor crecimiento con un promedio de 61,79

mm, seguido de UEA-Th1 y UEA-Th2 con promedios de 56,37 y 56,13 mm


87

respectivamente. El hongo patógeno M. roreri mostró un crecimiento lento en relación con

el antagonista con un promedio de 41,38 mm.

A los cuatro días de enfrentamiento el aislado antagonista UEA-Tv3 presentó un

crecimiento de 67,18 mm, sin mostrar diferencias significativas entre sí con UEA-Th2 que

presentó 66,07 mm, seguido de UEA-Th1 quien obtuvo un crecimiento de 63,13 mm. Los

tres aislados de Trichoderma cubrieron la totalidad del medio de cultivo, y sobrecrecieron

la colonia de M. roreri, disminuyendo notablemente el crecimiento del hongo fitopatógeno

(Figura 31).

a ab

0

10

20

30

40

50

60

70

80

UEA-Tv3 UEA-Th2 UEA-Th1

Cre

cim

iento

del

mic

elio

(m

m)

Trichoderma M. roreri

Figura 31. Crecimiento al cuarto día de antagonistas frente a M. roreri. Cultivo dual en

medio V8 modificado. Barras con letras desiguales difieren, por la prueba de Duncan

P<0,05 (n=10)

Estos resultados son similares a lo descrito por Solís (1999), donde Trichoderma spp.

obtuvo un valor de 64,9 mm al quinto día de evaluación. Ello evidenció una mayor

velocidad de crecimiento, competencia por espacio y por los nutrientes del medio de

cultivo. Trichoderma spp. tiene un gran potencial para producir enzimas hidrolíticas en

presencia de un hongo patógeno (Romero-Arenas et al., 2009).


88

El comportamiento del enfrentamiento dual de los microorganismos antagonistas frente

M. roreri en medio V8 modificado, en relación con la reducción del hongo patógeno,

evidenció que al quinto día de evaluación, los aislados UEA-Tv3, UEA-Th2 y UEA-Th1

mostraron el mayor porcentaje de inhibición, sin diferencias significativas entre sí con

PICR de 47,66; 47,64 y 46,45 respectivamente.

Este planteamiento es confirmado por Samuels et al. (2006b), quienes obtuvieron 44,93%

de PICR al evaluar M. roreri en caldo extracto de malta con filtrados de T. theobromicola

Samuels & H.C. Evans procedentes de Perú.

La capacidad antagónica según la escala de Bell et al. (1982), de los aislados de

Trichoderma spp. sobre M. roreri fue de clase 2 (Tabla 14), donde a través de

observaciones macroscópicas, se evidenció que los antagonistas colonizaron las dos

terceras partes de la superficie de la placa de Petri (90 mm Ø) en la que inhibieron el

crecimiento de M. roreri.

Tabla 14. Clase y zonas de antagonismo de aislados de Trichoderma spp. en medio V8

modificado

Antagonista Clase de

antagonismo

Zonas de

antagonismo

UEA-Th1 2 3

UEA-Th2 2 3

UEA-Tv3 2 3

Estos resultados son semejantes a los obtenidos por Solís (1999), quien al evaluar a

Trichoderma spp. sobre M. roreri, determinó que se ubicó en clase 1.

Otros autores tales como Harman (2003), Bernal et al. (2004), Hernández et al. (2006),

Martinez et al. (2008), Infante et al. (2009) y Martínez et al. (2013), afirmaron que

Trichoderma spp. tiene una alta capacidad de competencia por nutrientes y espacio, dado

fundamentalmente porque su velocidad de crecimiento es superior a la del hongo patógeno.


89

De conformidad a la escala de Punja y Grogan (1983), la zona de antagonismo de los tres

aislados de Trichoderma spp. se situó en la zona 3, presentando aversión fuerte (Tabla 14).

Micoparasitismo

Los resultados de las observaciones microscópicas de las interacciones entre antagonista y

fitopatógeno dependieron del aislado. UEA-Tv3 mostró un efecto marcado sobre el micelio

y las esporas de M. roreri, en los que se evidenciaron mecanismos de control como

degradación parcial o total (lisis), ruptura y fragmentación. Se observó penetración y

formación de haustorios dentro de las hifas de M. roreri (Figura 32). Los resultados

encontrados en el presente trabajo coinciden con los mecanismos de penetración

informados por Howell (2003) en otras interacciones antagonistas-hongos fitopatógenos.

Figura 32. Micoparasitismo de Trichoderma viride aislado UEA-Tv3, en M. roreri, con

aumento de 400X.

Estos resultados se relacionan con lo encontrado por Gonzales (2001), quien al evaluar

T. viride y Trichoderma sp. cepa C-66 detectó micoparasitismo sobre aislados de

Rhizoctonia solani Kühn, en frijol (Phaseolus vulgaris L.) con reducción del crecimiento

micelial del hongo patógeno. Otros autores como Guédez et al. (2009) comprobaron el

fenómeno de micoparasitismo por enrollamiento, penetración y lisis en interacción con

hongos que afectan el cultivo de la fresa (Fragaria x ananassa Duch.), mientras que Pérez

et al. (2013), al evaluar mecanismos de interacción hifal de T. harzianum sobre Bipolaris


90

oryzae Breda de Haan, observaron enrollamiento, penetración hifal, lisis, y vacuolización

en hifas.

Además, los tres aislados del género de Trichoderma mostraron la propiedad de agrupar

esporas sobre el micelio M. roreri (Figura 33). UEA-Th1 y UEA-Th2 fueron capaces de

desarrollar estructuras de reproducción.

Figura 33. Agrupamiento de esporas de Trichoderma harzianum aislado UEA-Th2, sobre

micelio de M. roreri, con aumento de 400X

No se observó enrollamiento, lo que coincide con lo descrito por Acosta-Suárez et al.

(2013), quienes determinaron que T. harzianum no causó enrollamiento sobre

Mycosphaerella fijiensis Morelet en condiciones in vitro.

Antibiosis

En la prueba de metabolitos volátiles, el aislado UEA-Tv3 fue el que mostró la mayor

actividad en la reducción del crecimiento relativo de M. roreri a las 168 h con un promedio

de inhibición de 21,12%, pero sin diferencias significativas con UEA-Th2, UEA-Th1 que

presentaron una actividad de 15,89 y 13,65% respectivamente, así como reducción del

crecimiento sobre el fitopatógeno (Tabla 15).


91

Tabla 15. Crecimiento de M. roreri en presencia de metabolitos volátiles de antagonistas,

a los siete días de evaluación

Crecimiento radial (mm h-1) de M. roreri PICR

(%) Antagonista 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h

UEA-Th1 27,39 ab 36,62 45,68 ab 57,16 a 61,09 66,97 71,39 13.65

UEA-Th2 28,41 a 38,72 48,55 a 57,17 a 59,24 66,69 69,54 15.89

UEA-Tv3 25,46 b 35,03 43,67 b 51,61 b 56,39 63,42 65,22 21.12

EE (±) 0,70 1,15 1,21 1,59 2,71 2,27 2,45

Medias con letras diferentes, en el sentido de las columnas difieren por la prueba de Duncan

P ≤0,05 (n=10)

Los aislados UEA-Tv3 y UEA-Th2 tuvieron influencia en la reducción de la esporulación

de M. roreri. Las afectaciones de este antagonista se observaron en las características

culturales del fitopatógeno, y provocaron variaciones en los bordes y textura del micelio,

mientras el aislado UEA-Th1 inhibió la esporulación con menor eficacia (Tabla 16).

Tabla 16. Porcentaje de Inhibición de Esporulación (% I.E) de M. roreri en presencia de

antagonistas

Samuels et al. (2006b), al evaluar la actividad micoparasítica de Trichoderma

theobromicola obtenida a partir de árboles sanos de cacao de la Amazonía peruana y

T. paucisporum Samuels, C. Suarez & Solís aislada a partir de mazorcas de cacao

parcialmente infectadas con M. roreri en la provincia de Los Ríos, Ecuador, demostraron

que los dos antagonistas fueron capaces de producir antibióticos difusibles volátiles que

inhibieron el desarrollo de M. roreri in vitro y en campo.

Los resultados de esta investigación se corresponden además con lo informado por otros

autores respecto a la capacidad antagónica de Trichoderma. León et al. (2012)

Antagonista Esporulación

(conidias mL-¹) % IE

UEA-Th1 8,87 x 104 47,82

UEA-Th2 4,75 x 104 72,06

UEA-Tv3 3,70 x 104 78,24

Control 1,70 x 105


92

determinaron micoparasitismo sobre Sclerotium rolfsii Sacc., Rhizoctonia sp. y

Fusarium sp. que provoca estrangulamiento o lisis de las paredes de las hifas, y con ello la

desintegración y degradación de las paredes celulares y el debilitamiento o muerte de los

patógenos. Inhibe por competencia e hiperparasitismo el crecimiento de Macrophomina

phaseolina Tassi (Goid) (Hernández et al., 2011). Alvindia (2012) determinó inhibición del

crecimiento de M. fijensis en la cepa de T. harzianum DGA01, aislada de frutos de banano

después de 10 días de incubación.

Estos resultados corroboraron el alto potencial antagonista de Trichoderma sobre M. roreri

lo que permite seleccionar aislados que se destacan por su amplia variabilidad de

mecanismos frente a este fitopatógeno.

Es de gran importancia contar con aislados nativos que controlen M. roreri por ser

considerada la principal enfermedad del cacao en la Amazonía ecuatoriana, ocasionando

grandes pérdidas a los productores.

Los resultados obtenidos al utilizarse los aislados de T. harzianum y T. viride como agentes

de control biológico de M. roreri, constituyen los primeros informados para la Amazonía

del Ecuador.


comerciales en el control de la Moniliasis del cacao en condiciones de campo

Los aislados de Trichoderma spp. (UEA-Th2 y UEA-Tv3), seleccionados por su

comportamiento in vitro frente a M. roreri, presentaron resultados muy alentadores para los

ensayos en campo. El efecto que presentaron los biocontroladores (UEA-Tv3 y UEA-Th2 +

UEA-Tv3), en la reducción del porcentaje de mazorcas infectadas con hongos

fitopatógenos y otras enfermedades mostraron diferencias significativas con los

biopreparados comerciales Trichotic y Rhapsody, siendo estadísticamente diferentes del

control. Se determinó que los aislados UEA-Tv3 y UEA-Th2 tuvieron un efecto


93

significativo sobre las enfermedades de cacao, sin embargo UEA-Tv3 tuvo niveles muy

cercanos a Óxido cuproso (Tabla 17).

Tabla 17. Porcentaje de mazorcas enfermas (M. roreri, M. perniciosa, y otras

enfermedades) registradas cada quince días de evaluación en parcelas aplicadas con

fungicidas químicos y biológicos


P ≤0,05

Los biocontroladores ejercieron el mejor control del porcentaje de mazorcas enfermas con

respecto al control, pero fueron inferiores al tratamiento químico, sin embargo el

tratamiento con UEA-Tv3 no difirió estadísticamente del Óxido cuproso en las

evaluaciones 5, 6 y 7, lo cual no ocurrió para los demás biocontroladores.

El tratamiento con UEA-Tv3 superó al resto de los tratamientos biológicos al final de las

evaluaciones, mientras que el tratamiento UEA-Th2 + UEA-Tv3 fue superior al tratamiento

con Trichotic y Rhapsody en la última evaluación.

Esto concuerda con Solís y Suárez-Capello (2006), quienes determinaron que la reducción

de enfermedades en parcelas de cacao, tratadas con T. koningiopsis (Samuel, Súarez y

H.C. Evans) y T. stromaticum fueron similares a las obtenidas con fungicidas.

Evaluaciones

(días)

Tratamientos

Mazorcas Infectadas (%)

15 30 45 60 75 90 105

1. UEA-Tv3 47,20 b 42,9 b 35,25 b 31,5 c 29,44 cd 19,89 c 18,14 de

2. UEA-Th2 + UEA-Tv3 52,05 b 41,35 b 38,66 b 38,21 bc 35,16 bc 29,43 b 23,41 cd

3. Trichotic 52,40 b 43,90 b 40,63 b 38,9 bc 37,90 b 34,05 b 30,22 b

4. Rhapsody 50,96 b 42,58 b 42,03 b 43,10 ab 36,05 bc 30,49 b 28,16 bc

5. Óxido cuproso 50,59 b 38,74 b 34,84 b 29,86 c 25,60 d 18,9 c 15,56 e

6. Control 67,55 a 57,69 a 52,83 a 53,19 a 55,14 a 57,41 a 59,08 a

EE (±) 3,21 2,72 2,53 3,63 2,73 2,70 2,05


94

Resultados similares fueron descritos por Holmes et al. (2004); Benito et al. (2007); Bailey

et al. (2008); Osorio (2010) y Villamil et al. (2015), quienes al evaluar T. viride,

T. harzianum y T. hamatum, encontraron antagonismo sobre M. roreri in vitro e in situ.

Todos los tratamientos biológicos y el químico fueron mejores que el control en relación

con mazorcas infectadas con M. roreri (%) en las evaluaciones quincenales realizadas en el

ensayo de campo. Los tratamientos UEA-Tv3 y UEA-Th2 + UEA-Tv3 no difirieron del

tratamiento químico a los 45, 90 y 105 días. El tratamiento con el aislado del antagonista

UEA-Tv3 fue mejor que los productos comerciales Trichotic y Rhapsody en las

evaluaciones realizadas a los 75, 90 y 105 días (Tabla 18).

Tabla 18. Porcentaje de mazorcas enfermas con M. roreri a los cuatro meses de

evaluación en condiciones de campo

Evaluaciones

(días)

Tratamientos

Mazorcas infectadas con M. roreri (%)

15 30 45 60 75 90 105

1. UEA Tv3 40,30 b 38,38 b 31,52 bc 30,52 b 25,05 bc 13,04 d 10,75 c

2. UEA Th2 + UEA Tv3 44,19 ab 40,19 b 34,27 bc 33,27 b 29,75 b 16,80 cd 15,85 bc

3. Trichotic 45,94 ab 45,94 ab 39,94 b 35,94 b 31,54 b 25,85 b 23,13 b

4. Rhapsody 45,34 ab 43,34 ab 39,25 b 37,08 b 29,14 b 24,46 bc 21,78 b

5. Óxido cuproso 40,15 b 34,65 b 30,02 c 29,02 b 15,30 c 12,99 d 9,39 c

6. Control 56,63 a 53,47 a 56,51 a 56,51 a 54,18 a 51,51 a 53,18 a

EE (±) 4,16 4,17 2,87 2,84 3,80 3,03 2,49

Medias con letras diferentes, en el sentido de las columnas, difieren por la prueba de Duncan

P ≤0,05

Estos resultados coinciden con lo descrito por Osorio (2010), quien determinó la eficiencia

de T. harzianum como biocontrolador sobre M. roreri en la Costa ecuatoriana a partir de los

62 días de la primera aspersión. De la misma forma Guerrero y Arias (2006), determinaron

que T. koningiopsis resultó efectivo en el control de Moniliasis en la misma magnitud que

los fungicidas químicos. No así Robles (2008), quien al usar productos biológicos basados

en bacterias, determinó su producción por encima de los productos químicos.


95

Los resultados evidenciaron que de los tratamientos evaluados, el aislado UEA-Tv3 obtuvo

una eficacia técnica de 80,39% sobre el hongo fitopatógeno M. roreri. Los aislados

UEA-Th2 + UEA-Tv3 ejercieron un control aceptable por encima del 60% (CNSV, 2011),

lo que implica una disminución del fondo infectivo de M. roreri en condiciones de campo,

no así los biopreparados comerciales que no alcanzaron ese valor. UEA-Tv3 fue la mejor

alternativa biológica ya que nunca tuvo diferencia estadística con el control químico en

cuanto a la eficacia, mientras que en segundo lugar se ubica UEA-Th2 + UEA-Tv3,

tratamiento que fue superior a Trichotic y Rhapsody en la última evaluación (Tabla 19).

Tabla 19. Eficacia técnica de los tratamientos en el control de M. roreri evaluados después

de cada aplicación

Aplicaciones

Tratamientos

Eficacia Técnica

1 2 3 4

x Orig. x Transf. x Orig x Transf x Orig x Transf x Orig x Transf

1. UEA-Tv3 37,57 0,65 43,47 0,72 56,26 0,85 ab 80,39 1,20 a

2. UEA-Th2 + UEA-Tv3 31,58 0,57 38,72 0,67 44,19 0,72 b 69,94 0,99 bc

3. Trichotic 25,91 0,51 35,29 0,63 45,72 0,73 b 55,63 0,85 c

4. Rhapsody 29,32 0,54 34,00 0,59 45,73 0,73 b 59,10 0,89 c

5. Óxido cuproso 29,70 0,55 45,74 0,74 70,95 1,01 a 82,61 1,15 ab

EE (±) 0.07 0,05 0,06 0,06


P ≤0,05

Resultados similares han sido obtenidos por diversos autores respecto a la eficacia de

T. harzianum y T. viride sobre M. roreri, entre ellos Bastos (1998), quien determinó la

efectividad de T. viride sobre el hongo fitopatógeno en Colombia en un 98%. Resultados

similares presentó Osorio (2010), al comprobar la eficiencia de T. harzianum en campo,

como biocontrolador sobre M. roreri, al reducir la enfermedad hasta en 17%.

Estos resultados concuerdan con los de Seng et al. (2014), quienes informaron que

Trichoderma es capaz de reducir la incidencia de infección de M. roreri en 11% a los 35

días, al aplicar spray de Trichoderma spp. con tierra, ceniza y otras fuentes de carbón en

plantaciones de cacao.


96

De esta manera se confirmó que la selección y especificidad de los aislados de

Trichoderma constituyen un elemento importante a tomar en cuenta para ser utilizados

como agentes de control biológico (Acevedo y Arcia, 2006).

Ayala (2008), al determinar la efectividad técnica de fungicidas químicos en plantaciones

de cacao obtuvo valores que no sobrepasaron el 55,70% luego de seis meses de

investigación.

Algunos autores señalan la potencialidad de T. harzianum en el control de hongos

fitopatógenos como R. solani, Fusarium oxysporum f. sp. cubense (E. F. Smith) Snyd &

Hans., lo que resalta su alta capacidad antagónica; con efectividad técnica que superó el

80% (Bernal et al., 2004; García et al., 2006; Reyes et al., 2008; Pérez et al., 2009).

La producción promedio anual de los pequeños productores de cacao en sistemas

agroforestales, alcanza los 200 kg ha-1 al año. El hecho de que la aplicación de aislados

nativos de T. harzianum y T. viride reduzca la incidencia de la enfermedad hasta en un

40% con una eficacia técnica de 80,39%, demuestra la importancia de reproducir

artesanalmente los hongos antagonistas a nivel local, que además de ser económicos, se

encuentran disponibles por los productores en el momento requerido para realizar

aplicaciones en campo, e incrementan la producción de cacao orgánico.

Si se considera que el costo de producción de T. harzianum y T. viride (dosis de 1013

esporas ha-1) en condiciones de laboratorio es de USD 15,02 más el costo de aplicación de

USD 19,2 esto nos da un costo total de aplicación de USD 34,22 ha-1, lo que representa un

rubro adicional en el presupuesto del sistema productivo, pero significativamente

económico en relación con la producción que pasaría de 200 a 320 kg ha-1 de cacao seco

por año, lo que representa un incremento de la producción de USD 240 al año por hectárea.

De esta manera se comprobó la eficiencia de T. harzianum y T. viride como biocontrolador

de M. roreri al aplicarlo en campo, con eficiencias de 80,39% y 60,94%, respectivamente.


97

En este caso los resultados obtenidos permiten contar con tres aislados nativos de

Trichoderma, provenientes de plantaciones orgánicas de cacao en la Amazonía

ecuatoriana, debidamente caracterizados y evaluados in vitro y en campo, para el manejo

biológico de M. roreri en cacao, y de esta forma disminuir las pérdidas ocasionadas por

este hongo fitopatógeno en campo, lo cual resulta una alternativa de producción para los

pequeños productores, quienes no contaban con estrategias biológicas para mitigar la

Moniliasis. Así, este constituye el primer registro en el país del control de esta enfermedad

con el empleo de los antagonistas T. harzianum y T. viride.

Conclusiones

Conclusiones

98

5. CONCLUSIONES

1. Las características culturales, morfológicas, fisiológicas, moleculares y patogénicas

de los 20 aislados obtenidos con síntomas de Moniliasis correspondieron a la

especie Moniliophthora roreri.

2. Se identificaron cuatro géneros de hongos anamorfos, asociados a mazorcas de

cacao con síntomas de Moniliasis, correspondientes a Cylindrocladium,

Dichobotrys, Colletotrichum y Phytophthora.

3. El cultivar Nacional resultó más susceptible a los aislados de M. roreri, en mazorcas

de cacao, en relación a la respuesta diferencial de los genotipos CCN-51, EET-95,

EET-96, EET-103.

4. Se obtuvieron tres aislados de hongos antagonistas: UEA-Th1 y UEA-Th2 que

fueron caracterizados e identificados a nivel de especie como Trichoderma

harzianum, y UEA-Tv3 como Trichoderma viride.

5. UEA-Tv3 Trichoderma viride y UEA-Th1 Trichoderma harzianum manifestaron un

efecto marcado de los mecanismos de acción de competencia, micoparasitismo y

antibiosis sobre M. roreri.

6. Trichoderma viride, y la combinación de Trichoderma viride más Trichoderma

harzianum mostraron una eficacia técnica superior al 69,94% sin diferencias con el

control químico, en condiciones de campo.

Recomendaciones

Recomendaciones

99

6. RECOMENDACIONES

1. Demostrar la patogenicidad de los géneros de hongos anamorfos asociados a la

Moniliasis de cacao, obtenidos en el presente trabajo.

2. Emplear los aislados UEA-Mr6.10, UEA-Mr1.6, UEA-Mr1.16, UEA-Mr7.13,

UEA-Mr7.17 y UEA-Mr2.7 en programas de selección de mejoramiento genético

en la Moniliasis de cacao en condiciones amazónicas.

3. Utilizar los genotipos CCN-51, EET-95, EET-96, EET-103, los que presentaron

resistencia a Moniliasis en ensayos de campo.

4. Evaluar la posible utilización de las cepas UEA-Tv3 y UEA-Th2 para la

formulación de biopreparados en el control de M. roreri.

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Anexos

ANEXOS

Anexo 1. Fincas en las que se realizó la recolección de las mazorcas de cacao

FINCA PROPIETARIO PROVINCIA CANTÓN SECTOR EDAD DE LA

PLANTACIÓN

(años)

1 Sr. Carlos Pozo Napo Tena Colonia Bolívar 7

2 Sr. Cesar Dahua Napo Tena Ahuano 8

5 Sra. Mariana Rodríguez Napo Arosemena

Tola Arosemena Tola 7

6 Sr. Ángel Pozo Napo Tena Puerto Misahualli 7

7 Sr. Wilson Avilés Pastaza Arajuno Las peñas del pozo 8

8 Sr. Patricio Carreño Morona

Santiago Palora La Comanche 5

Anexo 2. Ubicación de los sitios donde se recolectaron las mazorcas con síntomas de

Moniliasis, A Ecuador, B cantones Napo, Pastaza y Morona Santiago, C fincas objeto de

estudio

Anexo 3. Datos climatológicos de los lugares de procedencia de los aislados de M. roreri

PROVINCIAS ALTITUD

(msnm)

TEMPERATURA

(º C)

PRECIPITACIÓN

(mm)

H.R

(%)

PASTAZA 1 100 23 ± 2 4 158.8 88

NAPO 600 24 ± 2 4 195.8 84

MORONA SANTIAGO 1 250 22 ± 2 3 119.9 92

Anexo 4. Escala de clasificación de síntomas según Sánchez et al. (2003)

Valor

Interna

(% de almendras

afectadas)

Externa

(Clasificación de síntomas)

0 0 Fruto sano

1 0 - 20 Presencia de puntos aceitosos (hidrosis)

2 21 - 40 Presencia de tumefacción y/o madurez

prematura

3 41 - 60 Presencia de mancha chocolate

4 61 - 80 Presencia de micelio que cubre hasta la cuarta

parte de la mancha parda

5 > 81 Presencia de micelio que cubre hasta la cuarta

parte de la mancha chocolate

Anexo 5. Composición del medio V8 modificado

Medio de cultivo Fórmula

V8 modificado 200 mL jugo V8, 15 g agar, 15 g de

extracto de malta (Difco), 3 g Carbonato

de calcio, esto se afora a 1 000 mL de

agua destilada.

Composición del Jugo V8: 45 mg de

sodio, 700 mg de potasio, 7 g

carbohidratos, 5 g azúcar y 1 g proteína.

Anexo 6. Escala de valoración de severidad externa propuesta por Brenes (1983)

Escala Características Correspondencia visual

Grado 0 Fruto sano

Grado 1 Puntos aceitosos

Grado 2 Tumefacción o clorosis

Grado 3 Mancha (necrosis)

Grado 4 Micelio hasta un 25% de

la mancha

Grado 5 Micelio en más del 25%

de la mancha

Anexo 7. Escala de valoración de severidad interna propuesta por Sánchez et al. (1987)

Escala Características Correspondencia visual

Grado 0 Cero área necrosada

Grado 1 1-20% del área necrosada

Grado 2 21-40% área necrosada



Grado 5 100% área necrosada

Anexo 8. Identificación de hongos anamorfos asociados a frutos de cacao con síntomas de

Moniliasis en la provincia del Napo

Finca Parroquia Sector Géneros de hongos

anamorfos

Finca 1 Ahuano Colonia Bolívar Cylindrocladium sp.

Finca 2 Ahuano Ahuano Colletotrichum sp.

Finca 3 Archidona San Pablo Dichobotrys sp.

Finca 4 Archidona Centro Shiguango Cylindrocladium sp.

Finca 5 Arosemena Tola Arosemena Tola Phytophthora sp.

UEA.Mr1.6 UEA.Mr.2.15

UEA.Mr1.16 UEA.Mr.5.3

UEA.Mr.1.29

UEA.Mr.5.16

UEA.Mr.2.7

UEA.Mr.2.12

UEA.Mr.5.17

UEA.Mr.6.10

Anexo 9. Color del anverso y reverso del micelio de las colonias de aislados de M. roreri, en medio de cultivo V8 modificado a 26±2 °C incubados

durante 18 días.

UEA.Mr.7.13

UEA.Mr.7.16

UEA.Mr.8.9

UEA.Mr.8.10

Mr

UEA.Mr.8.11 UEA.Mr.7.17

UEA.Mr7.20 UEA Mr 8.19

UEA.Mr.7.28 UEA.Mr 8.20

Color del anverso y reverso del micelio de las colonias de aislados de M. roreri, en medio de cultivo V8 modificado a 26±2 °C incubados durante 18

días.

Anexo 10. Cuantificación del ADN de los hongos fitopatógenos

#

Sample

ID User name Date and Time

Nucleic

Acid Conc. Unit A260 A280 260/280 260/230

Sample

Type Factor

1 1 Usuario 25/12/2015 12:14:19 234.3 ng/B5l 8.686 3.921 2.22 2.25 DNA 50

2 2 Usuario 25/12/2015 12:14:57 50.6 ng/B5l 1.011 0.487 2.08 1.25 DNA 50

3 3 Usuario 25/12/2015 12:15:22 34.3 ng/B5l 0.686 0.341 2.01 2.26 DNA 50

4 4 Usuario 25/12/2015 12:15:48 44.2 ng/B5l 0.884 0.441 2 2.01 DNA 50

5 5 Usuario 25/12/2015 12:16:10 243.4 ng/B5l 6.871 3.091 2.22 2.43 DNA 50

6 6 Usuario 25/12/2015 12:16:38 27.1 ng/B5l 0.341 0.181 1.88 1.98 DNA 50

7 7 Usuario 25/12/2015 12:17:10 365 ng/B5l 9.299 4.117 2.26 2.43 DNA 50

8 8 Usuario 25/12/2015 12:17:34 20.1 ng/B5l 0.203 0.105 1.93 1.29 DNA 50

9 9 Usuario 25/12/2015 12:18:00 26.1 ng/B5l 0.322 0.161 2.01 1.92 DNA 50

10 10 Usuario 25/12/2015 12:18:25 26.2 ng/B5l 0.324 0.168 1.92 0.92 DNA 50

Anexo 11. Ubicación del sitio donde se recolectaron las muestras de suelo para la

identificación de Trichoderma spp. A Ecuador, B cantón Napo, C fincas objeto de estudio.

Tesis Dr. Karina M. E. Carrera Sánchez.pdf

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