ESTUDIO DE PROTEINAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA Dr. EDGAR VLADIMIR CABRERA BERNAL UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA – DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA UNIDAD DE ONCOHEMATOLOGIA PEDIATRICA BOGOTÁ 2008
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Tesis de Grado +3 - ACHOP...Una de las pruebas confirmatorias es la electroforesis de proteínas de membrana del glóbulo rojo en gel de poliacrilamida solubilizada en sodio dodecil
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ESTUDIO DE PROTEINAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA
FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA
Dr. EDGAR VLADIMIR CABRERA BERNAL
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA – DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA
UNIDAD DE ONCOHEMATOLOGIA PEDIATRICA BOGOTÁ
2008
ESTUDIO DE PROTEINAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA
FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA
Autor: Dr. EDGAR VLADIMIR CABRERA BERNAL
Código 597928
Tesis de grado para optar por el titulo de: ESPECIALISTA EN ONCOHEMATOLOGÍA PEDIÁTRICA
Director de Tesis: Dr. EDUARDO BELTRÁN DUSSAN
Profesor Titular Departamento de Pediatría Coordinador Académico División de Oncohematología Pediátrica Coordinador de la Especialidad en Oncohematología Pediátrica
Codirector de Tesis:
Dr. JORGE EDUARDO CAMINOS PINZÓN Profesor de la Facultad de Medicina
División de Bioquímica
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA – DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA
UNIDAD DE ONCOHEMATOLOGIA PEDIATRICA BOGOTÁ
2008
A mi compañera Adriana, impulsora incansable de todas mis
batallas y a quien pertenece también este triunfo
A mis hijas: Laura, Juliana y Camilita: a quienes debo el amor
a la vida
A mis padres Zoila y William, ejemplo de lucha, lealtad,
rectitud y bondad
A mis maestros
A mis pacientes
A todos mis colaboradores
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Susana Bravo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago
de Compostela, España
Al Dr. Justo Castaño de la Universidad de Córdoba, España
A la Universidad Nacional de Colombia
A la Fundación Hospital de la Misericordia
Al Departamento de Pediatría de la Universidad Nacional de Colombia
Al Servicio de Oncohematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la
Misericordia
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCION 10
1. JUSTIFICACIÓN 13
2. OBJETIVOS 15
2.1 OBJETIVO GENERAL 15
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 15
3. MARCO TEORICO 16
3.1 ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA 16
3.2 ETIOLOGIA Y FISIOPATOLOGIA 23
3.3 MANIFESTACIONES CLINICAS Y PARACLINICAS 28
3.4 DIAGNOSTICO 30
3.5 TRATAMIENTO 37
4. METODOLOGIA 38
4.1 TIPO DE ESTUDIO 38
4.2 CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION 38
4.3 RECURSOS INSTITUCIONALES 39
4.4 RECURSO HUMANO 39
4.5 CONSIDERACIONES ETICAS Y DISPOSICIONES VIGENTES 39
4.6 TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS 41
5. RESULTADOS 47
5.1 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS 47
5.2 HALLAZGOS DE LABORATORIO 49
5.3 CURVA DE FRAGILIDAD OSMÓTICA 50
5.4 RESULTADOS DE ELECTROFORESIS 1D 50
5.5 RESULTADOS DE 2D-PAGE Y ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF 51
6. DISCUSION 53
7. CONCLUSIONES 56
BIBLIOGRAFIA 57
ANEXOS 60
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Principales proteínas de la membrana del eritrocito 24
Tabla 2. Clasificación de esferocitosis e indicación de esplenectomía 29
Tabla 3. Características epidemiológicas de los pacientes 47
Tabla 4. Antecedentes personales y familiares 49
Tabla 5. Características de laboratorios 50
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Malla del citoesqueleto. Modificado de William’s Hematology 7ª edición. 18
Figura 2. Organización de la membrana del eritrocito. 21
Figura 3. Principales métodos proteómicos. 35
Figura 4. Diferencia de expresión de los pacientes con EH versus los controles 52
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo A. Consentimiento informado 61
Anexo B. Curvas de fragilidad osmótica 62
Anexo C. Gel de Coomasie donde se observan las proteínas similares(cuadros verdes) y diferentes(cuadros rojos) de los pacientes versus los controles 70
Anexo D. Electroforesis en 2D-PAGE, donde se observa las proteínas que se expresan en los pacientes con respecto a los controles. 71
Anexo E. Geles en 2D-PAGE: se observan las diferencias entre los controles y el paciente 3 (subrayado por un cuadro rojo) 72
Anexo F. Resultados de espectrometría de masas de algunas de las proteínas identificadas en los geles de los paciente 73
10
INTRODUCCION
La esferocitosis hereditaria (EH) es la causa de anemia hemolítica más frecuente
en todo el mundo y es secundaria a alteraciones o deficiencias en las proteínas
del citoesqueleto del eritrocito principalmente la espectrina, la ankirina, banda 3 y
banda 4.2, entre otras. Esta patología ocurre en todos los grupos étnicos y
raciales, con mayor prevalencia en la raza blanca. Tiene una incidencia que varía
entre 1 por cada 2.000 a 5.000 nacidos vivos dependiendo del sitio geográfico;
lamentablemente no hay estudios en Colombia donde se establezcan la incidencia
y la prevalencia de esta enfermedad.
Las manifestaciones clínicas son muy variadas por su comportamiento genético
que es también heterogéneo. Es autosómica dominante aproximadamente en el
75% de los casos y en el restante es: autosómica recesiva, autosómica dominante
con penetrancia variable o por mutaciones de novo.
El estudio y diagnóstico de la EH en nuestro medio es relativamente sencillo en
aquellos pacientes con antecedentes familiares y con un cuadro clínico y examen
físico clásico, el cual se complementa con los estudios de laboratorio que de
manera indirecta nos ayudan al diagnóstico. Pero el problema son los pacientes
con enfermedades leves o portadores (con rasgo) porque pueden cursar con
síntomas mínimos o incluso asintomáticos y las pruebas diagnósticas de rutina
pueden no revelar el diagnóstico por su baja sensibilidad en estos casos. Los
estudios de laboratorio generales son: cuadro hemático con evaluación de la
Por otro lado en la dinámica del atrapamiento esplénico, aún no está claro cuál es
el mecanismo de la hemólisis. Se sabe que los esferocitos son selectivamente
atrapados por el bazo, produciendo una pérdida de la membrana y la eventual
hemólisis. El tiempo de tránsito en el bazo se correlaciona inversamente con la
supervivencia del glóbulo rojo, pero también hay evidencia que el bazo genera
cambios metabólicos y de pH en el esferocito lo que acelera su autohemólisis
(8,11).
3.2.1 Defectos de las proteínas de membrana. El estudio de la membrana del
eritrocito ha revelado varios defectos cualitativos y cuantitativos en la EH. En
frecuencia, las alteraciones son:
• Deficiencia de ankirina combinada con deficiencia de espectrina
• Deficiencia de banda 3
• Deficiencia aislada de espectrina
• Deficiencia aislada de banda 4.2 (3,12)
• Ankirina. La deficiencia de ankirina junto con espectrina es la más frecuente
en EH y se han incluído varios mecanismos desde disminución en la síntesis de
ankirina, disminución en el ensamble o un ensamble anormal lo cual lleva a que la
espectrina no se una a la membrana. Tiene un patrón hereditario autosómico
dominante (AD) pero no es infrecuente que también sean debidas a mutaciones
de novo dentro de una familia (5). La mayoría son mutaciones nonsense o de
cambio en el marco de lectura lo que genera una ankirina defectuosa y/o
deficiente (3). Con una excepción, todas las mutaciones descritas en el gen ANK-1
son individuales y no se repiten en otras familias. El cuadro clínico puede ser
moderado, pero generalmente no requieren de trasfusión al menos durante el
primer año de vida (8). En pacientes con herencia autosómica recesiva (AR) han
sido descritas variantes genéticas en el promotor del gen de ANK-1, pero no se ha
revelado la importancia funcional de esta mutación.
26
No se han reportado casos homocigotos en humanos, sin poder aclarar si esta
condición es incompatible con la vida (8). Se han descrito pacientes con EH por
deficiencia de ankirina, con dismorfismo, retardo psicomotor e hipogonadismo.
Estos pacientes sufren de un síndrome de “gen contiguo” que incluye el locus del
gen ANK-1, 8p11.2.
• Banda 3. Las mutaciones en el gen de banda 3 (SLC4A1) tienen un patrón de
herencia AD. En los heterocigotos todas las mutaciones son en los dominios
transmembrana y citoplasmático con un cuadro clínico de hemólisis moderado (8).
Un subgrupo de pacientes tienen disminución del 20 al 30% de banda 3
concomitante con proteína 4.2, con un cuadro leve a moderado y esferocitos
“pincered” en el frotis de sangre periférica (3,13). Hay una gran variabilidad en la
expresión de la mutación lo cual hace que el cuadro clínico no sea siempre
severo.
Se han descrito 3 grupos de homocigotos para mutaciones de banda 3 en
humanos dentro de familias consanguíneas: Banda 3 Coimbra, Neapolis y
Algerian. Excepto por un grupo, las demás tiene algunas proteínas banda 3 en las
membranas celulares. En su mayoría se asocian a acidosis tubular renal distal. Lo
que es importante resaltar es que a pesar de la ausencia de la proteína banda 3,
pueden ser compatibles con la vida con determinados tratamientos a diferencia de
la ausencia de ankirina o espectrina las cuales como se ha visto no son viables
(8,13).
• Espectrina. Los esferocitos de muchos pacientes son en su mayoría
deficientes de espectrina. El grado de deficiencia de espectrina se correlaciona
bien con la esferocidad del eritrocito, la habilidad para soportar las fuerzas de
cizallamiento, el grado de hemolisis y la respuesta a la esplenectomía (3,8,12,13)
27
Las mutaciones de α-espectrina son AR mientras que las de β-espectrina son AD,
esto es debido a que la cadena α de la espectrina se sintetiza en exceso
comparada con la de la β espectrina, haciendo que una reducción en la síntesis de
esta última tenga una mayor efecto en la configuración del citoesqueleto en los
pacientes heterocigotos (autosómica dominante), (12,14). Al final el grado de
deficiencia de espectrina y de la cadena α o β, se asocia con la severidad de la
hemólisis (13,14).
• Proteína 4.2. La variedad de EH por mutación en el gen EPB42 es rara y
tiene una herencia AR. El cuadro clínico usualmente es de sintomatología
moderada (8). Se han descrito 9 mutaciones hasta ahora y la mayoría en el Japón.
La deficiencia de proteína 4.2 también se ha asociado a mutaciones en el dominio
citoplasmático de banda 3 por compromiso de los sitios de interacción entre estas
proteínas.
3.2.2 Herencia. Los genes implicados son los de α y β espectrina, banda 3,
ankirina y proteína 4.2. Entre el 50 y 75% de los casos, la EH es AD. En los
restantes pacientes puede ser AR o mutaciones de novo. Los casos de herencia
AR resultan en defectos de α-espectrina o proteína 4.2. Unos pocos casos de EH
resultado de mutaciones homocigotos o heterocigotos compuestos en banda 3 o
espectrina dan como resultado anemias hemolíticas severas en el periodo
neonatal o muertes fetales por hidrops (3). Un estudio realizado en Italia con 80
niños con diagnóstico de EH de diferente severidad pero con padres normales,
demostró que las mutaciones de novo dominante son 6 veces más frecuentes que
las mutaciones recesivas, lo cual debe ser tenido en cuenta para consejería
genética de una pareja normal con un hijo con EH (15).
28
3.3 MANIFESTACIONES CLINICAS Y PARACLINICAS
Las manifestaciones clínicas son muy heterogéneas. El cuadro clínico típico
combina manifestaciones de hemólisis (ictericia, esplenomegalia y anemia con
reticulocitos elevados) con extendido de sangre periférica con esferocitosis y
antecedentes familiares positivos (3). La severidad del cuadro es variable, desde
asintomático en los casos de portadores hasta severo con todo el cuadro clínico
evidente. Se puede clasificar como: portador (rasgo), leve, moderada (también
denominada típica) y severa, dependiendo del valor de Hb, bilirrubinas,
reticulocitos y de la concentración de espectrina en el glóbulo rojo (esta última se
correlaciona con la severidad de la hemolisis) (Tabla 2).
Portadores asintomáticos: corresponden a menos del 2% de los pacientes.
Presentan mínimos síntomas o generalmente asintomáticos. Pueden ser un
miembro de una familia con herencia AR con laboratorios ligeramente alterados,
elevación leve de reticulocitos, aproximadamente 2%, escasos esferocitos y
fragilidad osmótica incubada alterada. También pueden ser mutaciones nuevas
dentro de una familia, lo que aparentaría una herencia AR, por lo que siempre es
importante el estudio de la familia (3,8,16).
Los casos de esferocitosis leve son aproximadamente entre el 20 y 30%.
Presentan una hemólisis ligera compensada con valores de Hb normales. La
sintomatología es mínima, cursan con esplenomegalia e ictericia muy leves lo que
hace difícil el diagnóstico y generalmente se encuentran en estudios de rutina de
EH familiar. También se pueden manifestar durante una infección viral por ejemplo
Parvovirosis, con anemia, esplenomegalia e ictericia (3; 8).
La esferocitosis típica se presenta en la mayoría de los pacientes con EH AD y
pueden ser entre el 50 y el 60% de los casos. Se presenta con una hemólisis
descompensada y anemia moderada. Se puede manifestar con ictericia en niños,
pero también en adultos y asociado a esplenomegalia leve entre 2 a 6 cm de su
29
tamaño, generalmente después de una infección viral por la estimulación que
produce del sistema reticuloendotelial. Los requerimientos trasfusionales son
ocasionales y generalmente son después del primer año de vida (3,8).
Tabla 2. Clasificación de esferocitosis e indicación de esplenectomía
CLASIFICACIÓN RASGO LEVE MODERADA SEVERA
Hb (g/dl) >15 11-15 8-12 6-8
Conteo de reticulocitos
Normal (<3%)
3-6% > 6 % > 10 %
Bilirrubina T. (mg/dl)
< 1 1-2 2-3 > 3
Espectrina por eritrocito (% del normal)
100 80-100 50-80 40-60
Esplenectomía No requerida
Usualmente no necesaria
Necesaria antes de la pubertad
Necesaria, en lo posible > 6
años
Modificado de: Bolton-Maggs PHB. The diagnosis and management of hereditary spherocytosis. Baillère’s Clinical Haematology. 2000; 13: 327-42.
Fuente: Autor
La esferocitosis severa, se presenta en el 5 al 10% de los casos, con ictericia y
anemia severa que requiere múltiples trasfusiones. Se manifiesta generalmente
desde recién nacido con ictericia intensa que requiere incluso
exsanguinotransfusión. Se presenta en la EH tanto AD como AR, generalmente
por mutaciones en el gen de la α-espectrina.
Dentro de las complicaciones más frecuentes esta el retardo en el crecimiento,
retardo en la maduración sexual y anemias aplásicas transitorias. El tratamiento
de elección es la esplenectomía. (3,8):
30
3.4 DIAGNOSTICO
La esferocitosis hereditaria generalmente es fácilmente sospechada por el cuadro
clínico, los laboratorios de rutina y cuando existen antecedentes familiares, pero
hay varias situaciones que pueden hacer difícil el diagnóstico como la anemia
hemolítica neonatal o durante una crisis hemolítica aguda, o cuando no hay
antecedentes familiares y es una mutación de novo o cuando uno de los padres es
un portador asintomático o en otras patologías que también aumentan la relación
superficie-volumen de los glóbulos rojos como en la ictericia obstructiva, la
deficiencia de hierro, las talasemias, la deficiencia de vitamina B12 o folato y las
hemoglobinopatías SC que pueden mimetizar una EH.
El diagnóstico por laboratorios se basa fundamentalmente en el hemograma en
donde se puede encontrar la Hb baja, el volumen corpuscular medio (VCM) normal
o levemente disminuída, la concentración de hemoglobina corpuscular media
(CHCM) alta (entre 35 y 38%) y el aumento en el conteo de los reticulocitos.
En el extendido de sangre periférica típico se debe encontrar un número variable
de esferocitos (eritrocitos de menor tamaño y sin el halo claro central), estando
presentes en un 3 al 5% en las formas leves y en un 25 al 30% en las formas
moderadas. Con menor frecuencia se encuentran esferocitos pequeños y densos,
eritrocitos con formas bizarras y anisocitosis y poiquilocitosis. Se han descrito
características morfológicas específicas de ciertos déficits como los esferocitos
pincered (por déficit de banda 3) y esfero-acantocitos (por déficit de β-espectrina).
También se analizan los niveles de bilirrubinas total y diferencial y se realiza
ecografía de abdomen superior para evaluar tamaño del bazo y presencia de
colelitiasis.
Dentro de los estudios de laboratorio para completar el diagnóstico se encuentran:
31
• Test de fragilidad osmótica: se basa en la fragilidad aumentada que
tienen los esferocitos a la solución salina hipotónica en comparación con las
células normales (22). Este test tiene como desventajas en primer lugar la baja
sensibilidad, en donde los casos leves hasta el 20% pueden ser omitidos después
de la prueba con incubación. No es fiable en pacientes con escaso número de
esferocitos incluyendo los transfundidos y finalmente no diferencia la esferocitosis
causada por trastornos inmunológicos, deficiencia de hierro o ictericia obstructiva.
La fragilidad osmótica se encuentra incrementada en el 66% de los pacientes con
EH no esplenectomizados.
Se considera que la prueba de resistencia osmótica está disminuída cuando existe
evidencia de hemólisis en concentraciones de solución salina ≥0,55g/dl. Según la
clasificación de Dacie, la curva de resistencia osmótica se divide en tipo I si había
desplazamiento de la curva hacia la derecha con hemólisis que inicia en
concentraciones de solución salina de 0,55g/dl. Curva de resistencia osmótica
disminuída tipo II cuando hay desplazamiento de la curva hacia la derecha con
inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,6 g/dl y curva de
resistencia osmótica disminuída tipo III si hay desplazamiento de la curva hacia la
derecha con inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,85 g/dl
(1,17)
• Test de lisis con glicerol: útil en neonatos porque la cantidad de muestra
requerida es mínima. Se realiza colocando una mezcla de solución salina de
glicerol hipotónica a la muestra de sangre con anticoagulante y tomando el tiempo
en que la densidad óptica medida por espectrofotometría cae al 50% de la inicial
(50%de lisis); los eritrocitos normales toman más de 30 minutos y los esferocitos
tiene un rango de 25 a 150 segundos. Tiene igual sensibilidad que el test de
fragilidad osmótica (16,18). No disponible en Colombia como prueba de rutina.
32
• Gradiente osmótico ektacitométrico: es un examen muy sensible, pero
de alto costo, que requiere de experiencia por parte del operador. Mide con un
láser los cambios de forma del glóbulo rojo al ser expuesto a fuerzas de
cizallamiento. Ventaja: distingue curvas entre EH, Eliptocitosis hereditaria y
drepanocitosis (16,18). No se dispone de esta prueba en Colombia.
• Citometría de flujo: se emplea una sonda fluorescente que reacciona con
la banda 3. Pacientes con esferocitosis hereditaria que tengan defecto en la
espectrina, banda 3 o proteína 4.2 tienen disminución en la señal de fluorescencia,
comparado con los controles, con neonatos o con pacientes con otras anemias.
Tiene la ventaja de requerir un volumen muy pequeño de sangre y que los
resultados se obtienen en pocas horas. Sensibilidad de 92.7% y especificidad de
99.1% (16,18). No se dispone de esta prueba estandarizada en Colombia
(3,16,18).
• Análisis bioquímico de las proteínas de membrana de los glóbulos rojos: se realiza mediante separación por electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE-SDS polyacrylamide gel electrophoresis in the presencia sodium
dodecylsulate).que detecta defectos en las proteínas de membrana. Es una
prueba especializada, tiene alto costo, es útil en los pacientes con diagnóstico
poco claro y es una prueba confirmatoria de EH. No se hace de rutina en
Colombia (3,16,18).
• Análisis genético molecular: está disponible en unos pocos laboratorios
especializados. Busca identificar alteraciones en la expresión de las proteínas de
membrana por mutaciones en los genes que las codifican. Varias técnicas han
sido utilizadas como secuenciación de nucleótidos y amplificación del gen mutado
con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (16,18).
• Técnicas de mapeo en 2D y espectrometría de masas: es una
herramienta invaluable en la exploración de patologías relacionadas con defectos
genéticos y alteraciones en las proteínas (19). Se realiza mediante el análisis de
33
mezcla de proteínas y la posterior identificación por espectrometría de masas. Es
un método muy preciso, sensible y específico, con alta resolución y
automatización, la desventaja es su alto costo y que se realiza a nivel de
investigación en pocos centros especializados. No está disponible en Colombia y
no hay estudios de proteínas de membranas en EH.
3.4.1 Proteómica. Actualmente los avances científicos y tecnológicos en Biología
Molecular permiten la evaluación simultánea de las características genéticas y
proteicas de una muestra y han sido ampliamente empleados en diferentes
campos de la medicina con un futuro prometedor. Dentro de estos avances están
las llamadas técnicas “omic”: Genómica, Transcriptómica y Proteómica. Los genes
(analizados por la genómica) se transcriben a ARN (estudiados por la
transcriptómica). En este nivel existe cierto grado de variabilidad generado por
inicios, transcripción y procesamientos de intrones alternativos (splicing
alternativo). La mayoría del ARN es traducido para generar proteínas (evaluadas
por la proteómica). En este último proceso existe un alto nivel de heterogeneidad
ya que la proteína recién sintetizada puede experimentar multitud de
modificaciones postraduccionales, muchas de ellas con relevante significado
funcional y patológico (2,20). Alteraciones cuantitativas o cualitativas (estructura,
localización y función) de una proteína, que son aspectos que son valorados
mediante técnicas de proteómica, pueden ser biomarcadores de anomalías
patológicas previas al desarrollo de manifestaciones clínicas, útiles marcadores
diagnósticos o pronósticos. Es por estas características de la proteómica que está
superando a la genómica como herramienta de análisis más amplio de los
elementos relacionados con procesos fisiopatológicos y en la búsqueda de nuevos
blancos terapéuticos. La proteómica que en un inicio tenía el objetivo de identificar
las proteínas que se modifican como causa de diferentes factores (genéticos o
no), ahora permite conocer aspectos más profundos de la estructura, función,
interacciones, las modificaciones postraduccionales e incluso la localización
celular de las proteínas identificadas (2,20).
34
La técnica que se ha desarrollado para analizar mezclas de proteínas y que ha
permitido que la proteómica evolucione se llama espectrometría de masas. Se
trata de un método muy avanzado con alta precisión, sensibilidad (a nivel de
fentomoles), especificidad, resolución y automatización.
Existen diferentes equipos para preparar y cargar las proteínas en estos sistemas
de espectrometría de masas, el más usado es el matrix assited laser desorption/Ionization (MALDI). La muestra ionizada posteriormente se pasa a
analizadores de masas, el más empleado es el time of flight (TOF).
Primero se deben separar las proteínas de la muestra y hay dos aproximaciones:
• Empleando el sistema de electroforesis en 2 dimensiones (2D) que separa las
proteínas por cargas y peso molecular y luego, sobre el gel, se hace la
identificación y aislamiento de ”spots” diferentes, identificación de la proteína
mediante digestión enzimática con tripsina y determinación del patrón de masas
peptídico empleando espectrometría de masas. Este patrón se compara con la
masa esperada de las proteínas incluídas en potentes bases de datos (como
DMSR, SWISS-PROT y TrEMBL), generando un listado de posibles candidatos.
También se puede separar por cromatografía líquida, un sistema
multidimensional que separa proteínas usando cromatografía de intercambio
iónico y de fases reversas, acoplado directamente a sistemas de espectrometría
de masas o por trampa iónica, en este caso la ionización es distinta a la
empleada en la espectroscopia de masas por MALDI-TOF, puesto que aquí la
ionización es en fase líquida al aplicar un alto voltaje a la salida de la
cromatografía líquida. El tipo de ionización se conoce como ESI. El empleo de
uno u otro método depende de la proteína y de por cuál de los dos métodos se
obtenga una mejor ionización de sus péptidos. En general este método detecta
proteínas que no entran o no se separan fácilmente en geles 2-DE.
• Mediante el estudio sistemático y a gran escala de muestras sin separación
electroforética de las proteínas para la identificación de perfiles proteicos.
35
Emplea como sistema el SELDI-TOF (surface enhaced laser/desorption ionization) de alta resolución tras capturar las proteínas de una muestra con
diferentes chips analíticos (diferentes tipos de matrices que unen las proteínas
de una muestra empleando distintas características físico químicas) Figura 3.
Figura 3. Principales métodos proteómicos.
a
Las proteínas de una muestra se pueden separar 1) en geles 2D, 2) en cromatografía líquida y 3) por utilización de chips. LC: cromatografía líquida, MS: espectrometría de masas. Fuente: Corral J, González-Conejero R, Hernández-Espinosa D, Martínez C, Vicente V. Genómica y proteómica en hemostasia. Haematologica 2005;90: 65-70.
36
La principal limitación de las técnicas proteómicas es la incapacidad de amplificar
las proteínas, a diferencia de los ácidos nucleicos. También la gran
heterogeneidad proteica de un tejido o plasma puede hacer que dos muestras de
un mismo paciente sean ligeramente diferentes, lo que exige al menos repetir 3
veces la prueba para obtener resultados fiables (20).
También se ha avanzado significativamente en el proteoma de las células,
especialmente del eritrocito (21). Los trabajos realizados en estas células
muestran un proteoma complejo, mayor del que se podía esperar (teniendo en
cuenta que el 98% del citoplasma del eritrocito es Hb y que no tiene núcleo ni
organelas) mostrando nuevamente las diferencias entre genómica y proteómica.
Además de la Hb, el eritrocito tiene otras proteínas importantes para su
metabolismo y su conformación estructural, e incluso otras funciones como las
oxidativas e inflamatorias. Hasta el momento los estudios realizados en eritrocitos
han detectado más de 1500 proteínas (22,23) que abarcan múltiples funciones
(citoesqueleto, señalización, receptores de membrana, metabolismo
intermediario), aunque el número real de proteínas es mucho mayor. En un
estudio de proteómica del eritrocito (21) se identificaron 340 proteínas de
membrana discriminadas así: 105 proteínas integrales, 54 unidas a la membrana,
5 como GPI, 40 del citoesqueleto, 21 como organelos, 41 del citoplasma (8 de las
cuales tiene actividad en la glucolisis), 20 extracelulares y para 54 proteínas su
localización subcelular no fue posible. Estos estudios de proteómica además
permiten describir las proteínas y sus modificaciones implicadas en procesos
específicos de la función del eritrocito.
37
3.5 TRATAMIENTO
El tratamiento es médico en los casos de esferocitosis leve con aportes de ácido
fólico y seguimientos clínicos y de laboratorio cada año. Ecografías de abdomen
superior pueden realizar desde los 5 años y controles posteriores cada 3 a 5 años
en casos en que permanezcan estables y sin síntomas (16). Los controles se
hacen más frecuentes en las épocas del año en que se presentan más infecciones
virales.
La esplenectomía es el tratamiento de elección para los pacientes con EH severa
por ser más efectivo en el control de la anemia aunque la sobrevida de los
esferocitos permanece acortada. Está indicada en pacientes con anemia
hemolítica severa o en los casos de esferocitosis moderada con complicaciones
como cálculos en la vesícula biliar y esplenomegalia importante. En los casos
leves y moderados sin complicaciones, la decisión de esplenectomía está muy
discutida porque no tiene un claro beneficio y aumenta el riesgo de infecciones
graves. La decisión de esplenectomía en estos pacientes se debe evaluar
individualmente. La esplenectomía se intentar posponer hasta los 5 a 6 años para
reducir el riesgo de complicaciones como infecciones por gérmenes encapsulados
y por lo cual previo al procedimiento quirúrgico se indica la vacunación contra
neumococo con 23 serotipos y profilaxis antibiótica con fenoximetilpenicilina
durante 5 años después de la esplenectomía (8,16,18).
Diferentes estudios han demostrado que el grado de respuesta a la esplenectomía
está relacionado directamente con el grado de deficiencia de espectrina,
especialmente en la forma severa (la forma AR), por lo que los pacientes mejoran
adecuadamente posterior a la esplenectomía (8,16).
La complicación más grave es la sepsis que puede ocurrir en 3 al 5% de los
pacientes esplenectomizados de los cuales puede ser fatal hasta el 60%. Por esta
razón se han empleado métodos quirúrgicos más conservadores como la
esplenectomía parcial o embolización esplénica parcial con éxito aceptable (8).
38
4. METODOLOGIA
4.1 TIPO DE ESTUDIO
Es un estudio descriptivo de los resultados obtenidos de una prueba de
electroforesis en 2D-PAGE y espectrometría de masas MALDI-TOF realizada a
proteínas de membrana de eritrocitos y el análisis de características clínicas y de
laboratorios de una serie de pacientes con diagnóstico de EH que asisten a la
consulta de Hematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la Misericordia.
4.2 CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION
Se hizo una selección preliminar de los pacientes que asisten a la consulta de
Hematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la Misericordia con
diagnóstico de esferocitosis hereditaria. Se revisaron las historias clínicas y los
laboratorios los cuales deben incluír: hemograma (de IV nivel con índices), conteo
de reticulocitos, extendido de sangre periférica, prueba de fragilidad osmótica,
bilirrubinas totales y diferenciales, prueba de Coombs directo y ecografía de
abdomen superior. Posteriormente, se realizó una base de datos.
Se tuvieron en cuenta los siguientes criterios de inclusión:
• Pacientes con anemia hemolítica no inmunológica (con prueba de Coombs
directo negativo), con sospecha de esferocitosis hereditaria.
• Pacientes con manifestaciones clínicas y criterios paraclínicos compatibles
con esferocitosis hereditaria como se menciona en el numeral 4.3 y 4.4 del
marco teórico.
• Consentimiento informado firmado por los padres o representante legal
aceptando participar en el estudio. Ver anexo A.
39
Criterios de exclusión:
• Haber sido trasfundido en los últimos 4 meses previos a la toma de la muestra
para estudio de proteínas de membrana.
• La no aceptación a participar en el estudio.
4.3 RECURSOS INSTITUCIONALES
Se contó con la colaboración de la Fundación Hospital de la Misericordia, de
donde se obtuvieron los pacientes y sus registros clínicos; la Universidad Nacional
de Colombia, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica donde se
tomaron y procesaron las muestras para realizar la extracción de membranas; la
Universidad de Santiago de Compostela, Facultad de Medicina, Departamento de
Fisiología donde se realizó la electroforesis 2D-PAGE y análisis de los resultados
y la Universidad de Córdoba donde se realizó la espectrometría de masas.
4.4 RECURSO HUMANO
Se contó con la colaboración del personal docente y de laboratorio de la
Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina, Departamentos de
Pediatría y Bioquímica y del personal de enfermería y administrativo de la
Fundación Hospital de la Misericordia en Colombia y con el personal del
laboratorio de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago
de Compostela y de la Universidad de Córdoba.
4.5 CONSIDERACIONES ETICAS Y DISPOSICIONES VIGENTES
El desarrollo de la presente propuesta se realizará de acuerdo a la legislación
vigente y otras normas reguladoras en materia de ética, experimentación humana,
animal o de bioseguridad. El proyecto de investigación será sometido a la
evaluación del Comité de Ética de la Fundación Hospital de la Misericordia, de
40
acuerdo a las disposiciones previstas en la Resolución No. 008430 de 1993 del
Ministerio de Salud y en la Ley 84 de 1989.
En cuanto a las implicaciones éticas o de bioseguridad del presente proyecto de
investigación, se puede afirmar que:
• Este proyecto está clasificado como Investigación con riesgo mínimo, según
las características establecidas en el artículo 11 de la Resolución 008430 de
1993, del Ministerio de Salud.
• El proyecto se desarrollará en los servicios de consulta externa del Hospital de
la Misericordia, en el Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Medicina de
la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá y el Departamento de
Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de
Compostela, en España, las cuales cuentan con comité de ética. En el
proyecto se detallan las muestras biológicas obtenidas de los diferentes
ensayos y el uso que éstas recibirán.
• La Facultad de Medicina, así como el Hospital de la Misericordia, disponen de
instalaciones apropiadas y con personal idóneo en el procedimiento de toma
de muestras sanguíneas a pacientes pediátricos.
• La Unidad de Recursos Físicos de la Universidad Nacional a través del
programa UN Ambiente se hará cargo de la disposición definitiva de los
desechos orgánicos y químicos producidos por el presente proyecto.
• Para la participación en la investigación se solicitará el consentimiento
informado por escrito a los padres o acudientes del menor, explicándole los
objetivos de la investigación y los riesgos de la toma de muestra de sangre.
• La historia clínica de los niños del grupo de estudio están custodiadas en el
archivo por el Hospital Universitario Fundación Hospital de La Misericordia,
garantizando la confidencialidad de la misma.
41
• El presente estudio no ofrecerá dilemas éticos al grupo investigativo, ya que
los pacientes se encuentran bajo tratamiento en un hospital de cuarto nivel de
complejidad y el análisis de las muestras no ofrecen ningún riesgo para la
salud de los niños.
• Se garantiza que será suspendido el estudio para las familias que así lo
manifiesten.
• En cualquier momento previo a la toma de las muestras, se diligenciará el
consentimiento informado por escrito mediante el cual, a cualquiera de los
padres o al representante legal del menor se solicita la autorización para la
participación del menor en el estudio, en el que aceptará pleno conocimiento
del procedimiento y de los riesgos que éste conlleva así como la libre elección
de participar. Se adjunta el texto completo del consentimiento informado.
Anexo 1.
• Las muestras no serán utilizadas para fines distintos del proyecto o que no
estén mencionados en el consentimiento informado.
4.6 TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS
Desde marzo a julio de 2008 se inició la revisión de historias clínicas de pacientes
con diagnóstico de EH que asisten a la consulta de Hematología Pediátrica de la
Fundación Hospital de la Misericordia; se obtuvo una base de datos de posibles
candidatos para el estudio teniendo en cuenta las características clínicas y de
laboratorio como hemograma completo, extendido de sangre periférica, prueba de
fragilidad osmótica, bilirrubinas totales y diferenciales y ecografía de abdomen
superior. Con la revisión de historia clínica se procedió a hablar con los padres o
representantes legales y después de cumplir los criterios de inclusión y exclusión,
se firmó el consentimiento informado.
42
Después de obtener firmado el consentimiento por parte de los padres y/o
acudientes, se tomó una muestra de sangre venosa entre 5 y 10 cc, en tubo con
anticoagulante (EDTA) a los pacientes seleccionados con diagnostico de
esferocitosis hereditaria y a los controles, en el Departamento de Bioquímica de la
Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia.
A continuación se explica la técnica en los siguientes pasos:
• Separación de las membranas de los eritrocitos. Una fracción de la
muestra de sangre se centrifuga a 1500g y se lava el pellet de glóbulos rojos en
buffer salino de fosfato (PBS-pH 7.4) tres veces. Aproximadamente cien millones
de hematíes se tratan con buffer de lisis (buffer, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2mM
dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM EDTA, 0.25 M sucrose)
durante 10 minutos a 4ºC. Las membranas se centrifugan a 14.000 g durante 10
minutos a 4ºC y luego se lavan tres veces con tampón de lisis. Las muestras se
lisan por frío, se dejan 20 min a temperatura ambiente en buffer de lisis y se
centrifugan a 14.000 g durante 20 minutos. Posteriormente se resuspenden en un
buffer específico para 2D con elevado contenido de Urea (7M de Urea, 2M de
Tiourea, 5% de CHAPS y 2mM de TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine
hydrochloride)) y se almacena a -70ºC (24) hasta que se corra la electroforesis en
2D.
• Electroforesis en 2D. La cuantificación de la concentración de proteína se
realizó utilizando kits comerciales en los que no influye la urea de la muestra, kit
RC DC protein Assay (BIO-RAD); además se confirmó el resultado corriendo un
gel 1D y realizando una tinción con Coomasie, con lo cual se consigue ver si las
proteínas se encuentran en buen estado (no degradadas). Es muy importante que
las muestras destinadas a un análisis por espectrometría de masas sean
preparadas en un ambiente lo más limpio posible, libre de queratinas y suciedad
(los cristales en los que se corran los geles, cualquier recipiente utilizado y el
material fungible) y que cualquiera de estas sean manipuladas con guantes libres
43
de talco y nunca con las manos desnudas. A continuación se procede a su
fraccionamiento mediante geles 2D-PAGE (SDS-PAGE) de diferentes rango de pH
permitiendonos separar las distintas proteínas presentes en las muestras con base
en la diferente masa y punto isoeléctrico. Estudios previos realizados en otros
tipos de tejidos muestran que el mayor número de proteínas se encuentra en el
rango de pH de 4 a 7. Las muestras se solubilizan, durante más de 4 horas en un
buffer de rehidratación (7M de Urea, 2M de Tiourea, 5% de CHAPS) usando como
reductor 50mM de DTT y 4% de anfolitos del mismo rango de pH en el que se
corren los geles para facilitar la migración de las proteínas. La primera dimensión,
en la que las proteínas se separan en función del pI (punto isoeléctrico), se lleva a
cabo en un equipo IPGphor III (Ge Healthcare); se corre en tiras de 11 cm y se
somete a un enfoque de 12000V totales siguiendo el protocolo:
-. 30V 5h
-. 60V 5h
-. 120V 1h
-. 250V 1h
-. 500V 1h
-. 1000V 30 min
-. gradiente 1000V a 8000V 30 min
-. enfoque a 12000
Antes de realizar la segunda dimensión, las tiras se equilibran en buffer de
equilibrado con 1% de DTT durante 30 minutos (para reducir las proteínas) y 30
minutos en buffer de equilibrado con 4% de iodoacetamida (para alquilar las
proteínas). A continuación se cargan las tiras en geles de acrilamida-bisacrilamida
al 12% (segunda dimensión) para separar las proteínas en función del peso
molecular mediante un sistema de electroforesis vertical Hoefer (Bio-Rad). El
patrón de expresión proteico se visualiza utilizando métodos de tinción con plata
44
mediante el uso del kit comercial PlusOne Silver Staining Kit, Protein (Ge
Healtcare).
Una vez obtenidos los geles de las distintas muestras controles vs pacientes y un
mínimo de triplicado por muestra se realiza un análisis exhaustivo de todas las
proteínas observadas en los geles. Para ello, los geles se escanean y se analizan
las imágenes del patrón de expresión de proteínas mediante el uso de programas
informáticos como, “PDQuest” disponibles en la unidad de Proteómica de la
Universidad de Córdoba, España (en colaboración permanente con el grupo del Dr
Justo Castaño) que facilita la comparación entre las proteínas observadas en los
distintos geles. Además estos geles pueden compararse con bases de datos de
geles de 2D existentes en el dominio público de la red de Internet lo que nos daría
una idea de la proteína que puede ser de interés. El análisis mediante los
programas informáticos nos da datos de interés como el porcentaje en el que las
proteínas están sobreexpresadas o disminuídas.
• Identificación de la(s) proteína(s) expresada(s) de forma diferencial mediante MALDI-TOF. Una vez analizados los geles, en caso de encontrar
algunas proteínas diferenciales se cortan los “spots” y se procede a la digestión
tríptica “in-gel” de las proteínas de interés mediante la utilización del robot digestor
automático Proteineer DP (Bruker-Daltonics). Esta muestra se resuspende en 10
microlitros de 0.2% de TFA y se purifica mediante la utilización de puntas de
pipetas Zip-Tipc18 que disponen en su extremo de una pequeña columna
cromatográfica en fase reversa. A continuación se seca en un speed-back, se
mezcla con la matriz adecuada (ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico) y se procede a
plaquearla en un anchorChip para la obtención de la huella peptídica (fingerprint)
usando un espectrómetro de masas MALDI-TOF Bruker Reflex IV, dotado con un
software específico adecuado para el análisis exhaustivo de los datos recogidos.
El tratamiento y análisis realizados con distintos programas informáticos de los
picos observados nos permite enviar las masas de los péptidos trípticos medidos,
45
a una base de datos (NCBInr, MSDB, SwissProt, MASCOT) mediante un software
específico en que se concretan varios parámetros críticos a la hora de la
identificación de cada proteína.
4.6.1 Evaluación de las características clínicas y de laboratorio de los pacientes. Para la clasificación de severidad de los pacientes con EH, se tuvo en
cuenta los exámenes paraclínicos disponibles en la historia clínica y los criterios
descritos en la tabla 2 del marco teórico.
Se consideró que la prueba de resistencia osmótica estaba disminuída cuando
existía evidencia de hemólisis en concentraciones de solución salina ≥0,55g/dl.
Según la clasificación de Dacie, la curva de resistencia osmótica se dividió en tipo
I: si había desplazamiento de la curva hacia la derecha, con hemólisis que inició
en concentraciones de solución salina de 0,55g/dl; curva de resistencia osmótica
disminuída tipo II, cuando hubo desplazamiento de la curva hacia la derecha con
inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,6 g/dl, y curva de
resistencia osmótica disminuída tipo III si había desplazamiento de la curva hacia
la derecha con inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,85
g/dl (1,17).
Con el fin de establecer los rangos normales de las proteínas de membrana de los
eritrocitos y de tener un grupo control, se estudiaron paralelamente un grupo de 8
individuos normales sanos a quienes se les realizó electroforesis de proteínas de
membrana en 1D y 2D. Este grupo tiene un hemograma normal, bilirrubinas
normales, prueba de Coombs negativa y fragilidad osmótica normal.
Para este estudio se estableció que la cantidad de espectrina más ankirina, banda
4.1 más banda 4.2, fueron expresadas en relación con la banda 3. Estas se
cuantificaron por densitometría de los geles teñidos en Coomasie a 540nM
46
(BioRAD) y el área bajo los picos se determinó por el programa de computadora
Molecular Analist (BioRAD). Los resultados fueron basados en 3 electroforesis del
mismo paciente.
Se catalogó como déficit de espectrina más ankirina cuando la relación entre la
banda electroforética correspondiente a espectrina más ankirina y la banda
electroforética correspondiente a banda 3 fue menor que la misma relación medida
en los individuos normales. El diagnóstico de déficit de proteína 4.1 mas proteína
4.2 fue hecho cuando la relación entre la banda electroforética correspondiente a
banda 4.1 mas banda 4.2 y la banda 3 fue menor que la misma relación medida en
el grupo de individuos normales. El diagnóstico de déficit de de banda 3 fue
realizado cuando la relación entre la banda electroforética correspondiente a
espectrina más ankirina y la banda 3 fue mayor que la misma relación en los
individuos normales.
47
5. RESULTADOS
Se realizó el estudio en 8 pacientes y 8 controles. Los pacientes son niños que
asisten a la consulta de Hematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la
Misericordia con diagnóstico de esferocitosis hereditaria (EH) a quienes se les hizo
seguimiento desde marzo hasta agosto de 2008 y cumplieron los criterios de
inclusión.
El promedio de edad fue de 7,1 años, con rango de 1,8 a 13,75 años. El 62,5%
correspondió al sexo femenino y 37,5% al masculino.
Las características epidemiológicas de los 8 pacientes se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Características epidemiológicas de los pacientes
PACIENTE SEXO EDAD (años)
PESO (Kg)
TALLA (cm)
1 F 1,81 10,3 77 2 M 13,75 48,5 159 3 F 8,51 28,7 128,5 4 M 5,52 22,3 113 5 F 13,1 57 161 6 F 2,66 11,7 84 7 F 5,41 18 106 8 M 6,25 28,7 123
Fuente: Autor
5.1 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
Los antecedentes personales de los pacientes estudiados se muestran en la
Tabla 4.
48
Cinco pacientes tenían antecedente de ictericia neonatal manejada
hospitalariamente con fototerapia, 3 de los cuales también requirieron trasfusión
de glóbulos rojos en la misma hospitalización por anemia pero no para
exsanguinotrasfusión indicando que la ictericia fue moderada con adecuada
respuesta a fototerapia. De estos 5 pacientes, 4 tenían antecedentes familiares de
EH: dos son hermanos y la madre tiene diagnóstico de EH y los otros dos tienen
antecedentes de padre con EH.
Hay cinco pacientes con antecedentes familiares de EH, cuatro descritos en el
párrafo anterior y el quinto con antecedente de padre con EH y esplenectomía.
En total 4 pacientes han requerido trasfusión de glóbulos rojos por anemias
consideradas como importantes; 3 en edad de recién nacido y uno, posterior a un
procedimiento quirúrgico osteoarticular programado. Ninguno ha sido trasfundido
en los últimos 6 meses.
Hay una paciente a quien durante el estudio y seguimiento de EH con ecografía
abdominal, se le encontró colelitiasis, la cual está en control clínico y radiológico
estrecho.
Al examen físico el paciente número 8 se encontraba ictérico y con
esplenomegalia de 4 cm por debajo del reborde costal derecho (PDRCD); el
paciente número 6 presentaba bazo palpable a 2 cm PDRCD, sin ictericia. La
paciente número 5 fue esplenectomizada en marzo de 2008 por la severidad del
cuadro clínico y los otros 5 pacientes se encontraron asintomáticos y sin ictericia ni
bazo palpable.
Según la gravedad del cuadro clínico, teniendo en cuenta los criterios descritos en
el marco teórico, los pacientes se pueden clasificar como: rasgo en un caso
(paciente Nº 2) (12,5%), leve en 4 casos (pacientes Nº1,3, 6 y 8)(50%), moderada
49
en 2 casos (pacientes Nº 4 y 11) (25%) y severa en un caso (paciente Nº
5)(12,5%), esta última es la paciente que se esplenectomizó en marzo de 2008.
Tabla 4. Antecedentes personales y familiares
ANTECEDENTES PACIENTES(%) n=8
Ictericia 7 (87,5%)
Ictericia Neonatal 5 (62,5%)
Familiares 5 (62,5%)
Anemia 4 (50,0%)
Trasfusiones 4 (50,0%)
Colelitiasis 1 (12,5%)
Esplenectomía 1 (12,5%)
Fuente: Autor
5.2 HALLAZGOS DE LABORATORIO
La tabla número 5 describe las características del hemograma y niveles de
bilirrubinas más significativos reportados en la historia clínica de los 8 pacientes
estudiados.
En el cuadro hemático, el promedio de la concentración de hemoglobina
corpuscular media estuvo en valores normales (33.7 g/dl), pero los pacientes 4, 6
y 8 tuvieron valores elevados ≥ de 35 g/dl.
El ancho de distribución está elevado en todos los pacientes por encima del rango
normal de 15%.
El valor promedio de bilirrubina total estuvo elevado, en 4.9 mg/dl (rangos de 0,9 a
14,7mg/dl). Sólo el paciente Nº1 tenía valores dentro de límites normales y está
clasificado como rasgo por los otros parámetros de laboratorio.
SCALONI A, LANCIOTTI M, RIGHETTI M, CANDIANO G. Proteomic analysis
of erythrocyte membranes by soft immobiline gels combined with differential
protein extraction. Journal of Proteome Research. 2005; 4: 1304-09.
20. CRISTEA I, GASKELL S, WHETTON A. Proteomics techniques and their
application to hematology. Blood. 2004; 103: 3624-34.
21. PASINI E, KIRKEGAARD M, MORTENSEN P, LUTZ H, THOMAS A, MANN
M. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood.
Blood. 2006; 108: 791-801.
22. ROUX-DALVAI F. GONZALEZ DE PEREDO A, SIMÓ C, et al., Extensive
analysis of the cytoplasmic proteome of human erythrocytes using the peptide
ligand library technology and advanced mass spectrometry. Molecular &
cellular proteomics. 2008, 1-37. Papper in press
23. DELAUNAY J. Genetic disorders in the red cell membrane. Critical Review
Oncology Hematology. 1995;19: 79-110.
24. DUPUY AD, ENGELMAN DM. Protein area occupancy at the center of the red
blood cell membrane. PNAS. 2008; 105: 2848-2852.
60
ANEXOS
ANEXOS
61
Anexo A. Consentimiento informado
“ESTUDIO DE PROTEINAS DE MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA
FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA Y BIOQUIMICA
Bogotá, Fecha: ________________ Yo,_____________________________, identificado con cédula de ciudadanía Nº______________________, padre y/o acudiente de____________________________, con identificación No._______________, con capacidad de libre elección y sin coacción alguna, autorizo que participe en el “ESTUDIO DE PROTEINAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA”. Declaro que se me ha informado sobre la metodología del estudio, las posibles consecuencias derivadas de él y que se resolvieron de manera satisfactoria mis dudas. Además se me garantizó confidencialidad, libertad de retiro del estudio en cualquier momento y que se me podrá dar información durante el desarrollo del mismo. ______________________ _________________________ CC CC Teléfono Teléfono Acudiente Médico Investigador ______________________ _________________________ CC CC Teléfono Teléfono Testigo Testigo