Tese - Lorivaldo

8/6/2019 Tese - Lorivaldo

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JLIO DE MESQUITA FILHOFACULDADE DE CINCIAS AGRRIAS E VETERINRIAS

CMPUS DE JABOTICABAL

CLULAS BINUCLEADAS TROFOBLSTICAS: EFEITODOS SEUS PRODUTOS DE SECREO NA PRODUO

DE PROSTAGLANDINA F2 E AVALIAO DAEXPRESSO GNICA RELATIVA DE LACTOGNIOPLACENTRIO E FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTLIO

VASCULAR EM PLACENTAS BOVINAS

Lorivaldo Paz Landim Junior

Oientador: Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia

Tese apresentada Faculdade de CinciasAgrrias e Veterinrias Unesp, Cmpus deJaboticabal, como parte das exigncias paraa obteno do ttulo de Doutor em Medicina

Veterinria (Reproduo Animal).

JABOTICABAL SO PAULO BRASIL2006


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Landim Jr., Lorivaldo PazL257c Clulas Binucleadas Trofoblsticas: efeito dos seus produtos de

secreo na produo de Prostaglandina F2 e avaliao daexpresso gnica relativa de Lactognio Placentrio e Fator deCrescimento Endotlio Vascular em placentas bovinas / Lorivaldo PazLandim Junior. Jaboticabal, 2006

xix, 80 f. ; 28 cm

Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade deCincias Agrrias e Veterinrias, 2006

Orientador: Joaquim Mansano GarciaBanca examinadora: Maria Anglica Miglino, Paula de Carvalho

Papa, Csar Roberto Esper, Vera Fernanda M. Hossepian de LimaBibliografia

1. Reproduo Animal. 2. Placenta. 3. Clulas Binucleadas. I.Ttulo. II. Jaboticabal-Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias.

CDU 619:612.6:636.2Ficha catalogrfica elaborada pela Seo Tcnica de Aquisio e Tratamento daInformao Servio Tcnico de Biblioteca e Documentao - UNESP, Cmpus deJaboticabal.


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DDDAAADDDOOOSSS CCCUUURRRRRRIIICCCUUULLLAAARRREEESSS

LORIVALDO PAZ LANDIM JUNIOR - nascido em Jales SP, aos 10 dias

do ms de Julho de 1976; ingressou no curso de graduao em MedicinaVeterinria na Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias, da Universidade

Estadual Paulista UNESP, Cmpus de Jaboticabal, em fevereiro de 1994;

participou do Programa Especial de Treinamento Grupo PET/CAPES, de agosto

de 1995 a maro de 1998; concluiu o curso superior em Medicina Veterinria em

janeiro de 1999; trabalhou como mdico veterinrio residente na Faz. Cravinhos

(Cravinhos SP) no perodo de dezembro 1998 a maro de 1999; trabalhou como

agente de desenvolvimento junto ao projeto SAI (Sistema Agroindustrial Integrado)

convnio SEBRAE-SP e CATI - no perodo de maio de 1999 a janeiro de 2000,

na regio de So Jos do Rio Preto - SP; Adquiriu o ttulo de Mestre em Medicina

Veterinria, rea de Concentrao em Reproduo Animal, na Faculdade de

Cincias Agrrias e Veterinrias Cmpus de Jaboticabal da Universidade Estadual

Paulista - UNESP, em fevereiro de 2002. Ingressou o curso de doutorado em

maro de 2002, junto ao programa de ps-graduao em Medicina Veterinria,

rea de concentrao Reproduo Animal, na Faculdade de Cincias Agrrias e

Veterinrias, da Universidade Estadual Paulista UNESP, Cmpus deJaboticabal.


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EPGRAFE

O valor das coisas no est no tempo em que

elas duram, mas na intensidade com que acontecem.

Por isso, existem momentos inesquecveis, coisas

inexplicveis e pessoas incomparveis

(Fernando Pessoa)


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DEDICATRIA

Trilhar caminhos, criar jornadas, traduzir uma vida ...

Assim comea, apenas, parte de uma histria.

Aos responsveis pelo incio desta histria, meus pais

Lorivaldo e Maria Jos, que hoje e sempre sero os guias deste

caminho, desta jornada, desta vida...

Aos meus irmos, Manoel e Christina, co-autores de

tantas histrias e tantos exemplos.

Aos meus sobrinhos Felipe, Luza e Beatriz, os novos

personagens, fonte para novas histrias, quem quero ser tambm

um exemplo em suas vidas.

minha namorada Rubia, que j parte desta histria e

trilha um caminho, jornada e vida em comum...

Dedico...


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AGRADECIMENTOS

A razo fundamental da vida pode ser resumida ao agradecimento, por

isso, inicialmente agradeo a Deus por esta oportunidade, uma grande ddiva...Como poderei traduzir todos os meus sentimentos em palavras? Mesmo

assim ainda seriam insuficientes para expressar minha gratido, meu amor e a

tudo que meus pais, Lorivaldo e Maria Jos, proporcionaram para nos

orgulharmos desta conquista. Seria egosta mencionar que este momento

representa apenas meu mrito. Se hoje tenho conquistas porque em toda minha

vida tive vocs ao meu lado, aprendendo sempre com suas palavras e aes, por

mais simples que possam pensar... mas com um grande significado, orgulho e

honra.

Com o mesmo amor e gratido, agradeo aos meus irmos Manoel e

Christina e meus sobrinhos Felipe, Luiza e Beatriz por todo incentivo, ajuda e

esperana depositados, fazendo com que minha dedicao fosse renovada a cada

dia.

O limite das palavras tornam-se, tambm, insuficientes para revelar ou

traduzir meus sentimentos e minha gratido minha namorada Rubia, que com

pacincia, carinho, amor e cumplicidade representaram e representam a vontadeem prosseguir, viver o presente e o otimismo do futuro.

Aos meus orientadores, professores Maria Anglica e Joaquim, que ao

longo deste anos dispuseram-se a este desafio, sem limites ao conhecimento,

dedicao e companheirismo.

Ao professor Mario Binelli por dispor o laboratrio para os experimentos

com radioimuno ensaio e pelo exemplo de determinao, dinamismo e

conhecimento.

Ao professorFlvio Meirelles por dispor o laboratrio para os experimentos

em biologia molecular e por todo conhecimento oferecido.

Ao professorJoo Pizauro pela amizade e auxlio dispensados.


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A todos os professores, funcionrios e estagirios do Depto. de Medicina

Veterinria Preventiva e Reproduo Animal.

minha segunda e grande famlia de amigos de Jaboticabal; Anderson,

Maricy, Ricardo, Carol, Juan, Celina, Guilherme, Serginho, Tiago, FernandaSantiago, Fernando Garcia, Carlos Larsson Jr., Alexandre Barreto, Walt, Luciana,

Gabriela, Denise, Fernanda Velasque, Taiana, Rodrigo, Diogo e a todos que, ao

longo destes 12 anos desde a graduao, me acolheram e dividiram bons

momentos.

Aos novos e velhos amigos da Reproduo Animal, Alessandra, Alexandre

Wolf, Ana Paula, Andr Buck, Andra, Antnio, Cassiana, Christina, Danilas,

Edson, Eliana, rika, ric, Felipe, Gabriel, Gerson, Giovana, Juliana, Kleber,Letcia, Mabel, Marcelo, Max, Naiara, Sandra, Sara, Simone, Tnia, Tatiane,

Viviane.

Aos amigos de Pirassununga Cludia Bertan, Felipe Braga, Fernando

Biase, Giovana, Isabele, Lgia, Patrcia, Raquel, Sylvia e Vanessa Marques.

Aos amigos do Jud, pela amizade, companheirismo e pacincia, trazendo

o princpio de Jita-Kyoei (bem estar e benefcios mtuos). Domo Arigato!

Aos melhores amigos Tank, Tibi, Raiska e Dunga.


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APOIO FINANCEIRO

Este projeto foi financiado pela Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de

So Paulo FAPESP, processo n 02/02107-2, no perodo de Abril de 2002 aJaneiro de 2006.


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SUMRIO

Pgina

LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................... xi

LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... xv

LISTA DE TABELAS ...................................................................................... xvii

1. INTRODUO ............................................................................................ 01

2. REVISO DE LITERATURA ....................................................................... 04

2.1 Consideraes sobre a Clula Binucleada Trofoblstica (BNC) ........... 04

2.2 Consideraes sobre a Clula Endometrial Bovina (BEND) ................. 11

2.3 Falhas na manuteno da gestao ..................................................... 13

2.3.1 Consideraes gerais .................................................................. 13

2.3.2 Influncias do reconhecimento materno da gestao ................. 14

2.3.3 Influncias placentrias ................................................................ 18

2.4 Consideraes sobre vascularizao placentria e VEGF ................... 21

2.5 Consideraes sobre LP bovino ........................................................... 25

3. OBJETIVOS ................................................................................................ 30

4. MATERIAL E MTODOS ............................................................................ 31

4.1 Avaliao da expresso gnica relativa (frequncia de RNAm) de LPe VEGF em placentas ...........................................................................

31

4.1.1 Amostras ...................................................................................... 31

4.1.2 Extrao do RNA total .................................................................. 32

4.1.3 Sntese de cDNA pela reao de transcrio reversa (RT-PCR) 32

4.1.4 Caracterizao da expresso dos genes com PCR em tempo

real .............................................................................................

33

4.1.4.1 Anlise estatstica .......................................................... 34

4.2 Radioimunoensaio para dosagem de PGF2 em meio de cultura ....... 34

4.2.1 Anlise estatstica ........................................................................ 35

5. RESULTADOS ............................................................................................ 36

5.1 Determinao da reta padro e clculo das eficincias das reaes ... 36


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x

5.1.1 Reta padro e eficincia do VEGF .............................................. 36

5.1.2 Retas padro e eficincias do GAPDH e VEGF .......................... 37

5.1.3 Validao dos experimentos para clculo da expresso relativa 38

5.1.4 Apresentao dos valores de Cts das amostras analisadas ........ 395.1.5 Expresso relativa de LP e VEGF nas placentas de animais FIV

e TN ..............................................................................................

40

5.2 Dosagem de PGF2 em meio de cultura condicionado ........................ 42

6. DISCUSSO ............................................................................................... 45

6.1 Expresso gnica relativa de VEGF em placentas ............................... 45

6.2 Expresso gnica relativa de LP em placentas .................................... 46

6.3 Efeito dos produtos secretados pelas BNCs na produo de PGF2pelas clulas BEND...............................................................................

49

7. CONCLUSES ........................................................................................... 52

8. REFERNCIAS ........................................................................................... 53

9. APNDICES ................................................................................................ 74

Apndice 1 Extrao de RNA total de tecidos .............................................. 74

Apndice 2 Tcnica de radioimunoensaio para dosagem de PGF2 em

meio de cultura .........................................................................

76

Apndice 3 Descrio dos primers e sondas utilizados para estudo da

expresso gnica relativa pelo sistema TaqMan de deteco

79


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xi

LISTA DE ABREVIATURAS

ATCCAmerican Type Culture Colection

BNC clulas binucleadas trofoblsticas (binucleate trophoblast cells)

bp pares de base

BENDclula endometrial bovina (bovine endometrial cells)

CL corpo lteo

CN controle negativo

COX-2cicloxigenase-2

Ct Ponto de cruzamento na curva de amplificao pela linha de threshold (linha

arbitrria situada na fase exponencial de amplificao)

DAG diacil glicerol

DEPC dietilpirocarbonato

DNA cido desoxirribonuclico

DPM desintegraes por minutocDNA DNA complementar

E2 estradiol

FIV fecundao in vitro

FGFB-2fator B-2 de crescimento de fibroblastos (Fibroblast Growth Factor B-2)

Flt-1 Tirosina quinase 1 semelhante ao Fms (Fms-like tyrosine kinase-1)

GAPDH gliceraldedo fosfato desidrogenase

GHhormnio somatotrpico (Growth Hormone)

GHRreceptor de somatotropina (Growth hormone Receptor)


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xii

rbGHhormnio somatotrpico bovino recombinante (recombinant bovine Growth

Hormone)

H2O gua

IAInseminao Artificial

IFN - Interferon-taubIFN - Interferon-tau bovinoIGF-1fator de crescimento semelhante insulina-1 (Insulin-like Growth Factor-1)

kDa kilo Dalton

KDR receptor contendo domnio de kinase inserido (Kinase insert Domaincontaining Receptor)

LP lactognio placentrio

bLPlactognio placentrio bovino

oLPlactognio placentrio ovino

mg miligrama

ng nanograma

g microgramapg picograma

mL mililitro

L - microlitromM milimolar

M micromolarmmicrmetroMCSS Meio Completo Sem Soro


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MHC-1 complexo maior de histocompatibilidade-1 (Major Histocompability

Complex)

MN monta natural

P4 progesterona

PAG glicoprotenas associadas gestao (pregnancy-associated

glycoproteins)

bPAGPAG bovina

PCR reao em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction)

RIEradioimunoensaio

RT-PCR Transcrio reversa da reao em cadeia da polimerase (Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)

PDBuforbol 12,13 dibutirato

PGE2prostaglandina E2

PGF2 - prostaglandina F2 alfaPIV produo in vitro

PPAR - Receptor-gama do proliferador ativado de peroxissoma (peroxisomeprolifierator-activated receptor-gama)

PRLprolactina

PRLR receptor de prolactina (Prolactin receptor)

PRPprotena relacionada prolactina (Prolactin-related protein)

q.s.p quantidade suficiente para

RNAcido ribonuclico

RNAm RNA mensageiro

TETransferncia de Embries


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xiv

TN transferncia nuclear

VEGF fator de crescimento endotlio vascular (vascular endothelial growth factor)

VEGFRreceptor de VEGF


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xv

LISTA DE FIGURAS

Pgina

Figura 1. Esquema da migrao da clula binucleada trofoblstica em

direo ao epitlio uterino e respectiva fuso ..................................

07

Figura 2. Esquema da diviso nuclear da clula binucleada trofoblstica e

sua migrao em direo ao epitlio uterino ....................................

09

Figura 3. Disposio dos tratamentos na placa de cultivo de clulas BEND . 35

Figura 4. Curva de amplificao em PCR tempo real correspondente ao

gene codificador de VEGF em trs diferentes diluies ...................

36

Figura 5. Curva de regresso correspondente amplificao do VEGF em

trs diferentes diluies (1; 0,1 e 0,01), apresentando uma

inclinao absoluta de 3,23 ..............................................................

37

Figura 6. Curva de amplificao em PCR tempo real correspondente ao

gene codificador de GAPDH (curva azul) e LP (curva verde) em

trs diferentes diluies ....................................................................

37

Figura 7. Curva de regresso correspondente amplificao do GAPDH

(azul) e LP (verde) em trs diferentes diluies (1; 0,1 e 0,01),

apresentando as inclinaes absolutas de 3,58 e 3,45,

respectivamente para GAPDH e LP .................................................

38

Figura 8 A e B. Representao esquemtica das regresses logartmicas

das diferenas entre CtLP CtGAPDH (Ct LP) e CtVEGF CtGAPDH

(Ct VEGF) em funo da diluio da amostra, indicando osvalores absolutos de inclinao da reta


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Figura 9. Expresso de VEGF nas placentas de animais TN (1,415;

1,03) e FIV (0.720; 1,28), em relao s placentas de animais

MN (p>0,05) ......................................................................................

41

Figura 10. Expresso de LP nas placentas de animais FIV (-3,182; 0,20) e

TN (0,111; 0,50), em relao s placentas de animais MN

(p>0,05) ............................................................................................

41

Figura 11. Representao esquemtica da produo de PGF2 de acordo

com os diferentes meios de cultura (condicionado ou puro), sob a

presena ou ausncia de PDBu, em trs diferentes diluies (1:25,

1:50 e 1:100) .....................................................................................

44


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xvii

LISTA DE TABELAS

Pgina

Tabela 1. Apresentao dos valores de Cts para cada um dos genes em

suas diferentes diluies, bem como a diferena entre gene-alvo e

controle endgeno (Ct) ...................................................................

38

Tabela 2. Valores mdios de Cts correspondentes das amostras oriundas

de placentas de MN (grupo controle)............................................... 40


de placentas de FIV ..........................................................................

40


de placentas de TN ...........................................................................

40

Tabela 5. Produo mdia de PGF2 (pg/mL) pelas clulas BEND

mediante a presena de meio de cultura exposto s BNCs

(condicionado) durante 15 dias de cultivo, em diferentes diluies,

ou somente meio de cultura (DMEM 10%SFB, no condicionado),

na presena de estimulador (PDBu) ou ausncia () ......................

43


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CLULAS BINUCLEADAS TROFOBLSTICAS: EFEITO DOS SEUS

PRODUTOS DE SECREO NA PRODUO DE PROSTAGLANDINA F2 EAVALIAO DA EXPRESSO GNICA RELATIVA DE LACTOGNIO

PLACENTRIO E FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTLIO VASCULAR EMPLACENTAS BOVINAS

RESUMO - Devido s elevadas perdas gestacionais verificadas nas fases

embrionria e fetal, principalmente em animais produzidos in vitro (TN e/ou FIV), o

presente trabalho avaliou, por RIE, a participao dos produtos secretados pelas

BNCs na sntese in vitro de PGF2 pelas clulas BEND e constatou que o meio

condicionado, na presena de PDBu, determinou o aumento da produo dePGF2 (de 435,84a para 1323,94b pg/mL; p


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TROPHOBLAST BINUCLEATE CELLS: EFFECT OF THEIR SECRETION

PRODUCTS ON PGF2 PRODUCTION AND RELATIVE GENE EXPRESSIONOF PLACENTAL LACTOGEN AND VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH

FACTOR FROM BOVINE PLACENTOMES

SUMARY - Due to the high pregnancy failures during foetal and embryo

stages, mainly in in vitro produced-animals (by NT and/or IVF), this work evaluated

the BNCs products on in vitro PGF2 synthesis, by RIA, from BEND cells and

showed that the conditioned medium, with PDBu, increased the PGF2 synthesis

(from 435.84a to 1323.94bpg/mL, p


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1. INTRODUO

As estatsticas confirmam um crescimento da populao mundial, e comisso, uma maior necessidade de aquisio de nutrientes (FAO, 2003). Neste

aspecto, os bovinos ainda so mundialmente considerados como a maior fonte de

protena animal populao. Baseando-se nestas informaes, estudos contnuos

so elaborados com objetivo de melhoria dos ndices reprodutivos, e

consequentemente, produtivos.

O estudo reprodutivo apresenta ferramentas de avaliao dos processos

modulados na interao concepto e organismo materno, influenciado tanto porfatores externos, como internos (ambiente uterino, fatores endcrinos,

comunicao materno-fetal).

Para manuteno da gestao, considerando-se desde o momento da

fecundao, alguns requisitos so necessrios como competncia da unidade

uterina, competncia da unidade embrionria e sincronia entre estas unidades.

sabido que uma grande porcentagem de embries perdida entre os dias 8 e 16

da gestao, representado pelo perodo de elongao do concepto e

reconhecimento materno da gestao, associado manuteno do Corpo Lteo

(CL) (DISKIN & SREENAN, 1980).

Entende-se por reconhecimento materno da gestao como a interao

endcrina, bioqumica e molecular entre o concepto e o tecido uterino levando

manuteno do CL, garantindo concentraes timas de progesterona na

circulao sangunea para manuteno da gestao (mecanismos que inibem a

lutelise para garantia das concentraes plasmticas de progesterona at a

complementao da placenta como fonte produtora adicional deste hormnio)(HANSEN, 1991).

Em ruminantes, o dilogo materno-fetal realizado pelo Interferon-tau

(IFN), produzido pelas clulas do trofoblasto, que interage com as clulas

endometriais bloqueando a sntese e liberao de Prostaglandina F2 (PGF2)


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2

que atua no evento da lutelise. Falhas de uma comunicao apropriada entre

concepto e tero podem levar interrupo da gestao (THATCHER et al.,

1997).

Os mecanismos de atuao do IFN sobre as clulas endometriais e a

inibio da sntese e liberao de PGF2 so amplamente descritos, bem como

as interaes enzimticas e respostas celulares do processo de antilutelise,

regidas pelo IFN. No incio da gestao, ao redor dos dias 15 a 18, clulas do

epitlio trofoblstico secretam IFN que se liga a receptores de clulas

endometriais e promovem um mecanismo de inibio de produo de PGF2

(BINELLI et al.,2000b; THATCHER et al., 2002) . Aps este curto perodo de

atuao do IFN, os mecanismos que promovem a manuteno do CL e inibioda sntese de PGF2 at a complementao da placenta como fonte produtora de

progesterona ainda no esto totalmente elucidados, havendo portanto, a

necessidade de maiores estudos para compreenso destes fenmenos.

A partir do conceito sobre dilogo materno-fetal, as clulas trofoblsticas

representam a principal unidade de interao com o organismo materno. Dentre

as linhagens de clulas trofoblsticas, destaca-se em ruminantes a Clula

Binucleada Trofoblstica (BNC) que se origina a partir de uma clula uninucleadapelo mecanismo de endoduplicao, ou seja, realiza uma cariocinese, sem a

ocorrncia de uma citocinese (KLISCH, 1999; 2000). A Clula Binucleada, que

pode ser observada a partir do 17 dia da gestao, migra em direo ao epitlio

uterino (endomtrio) e se funde formando clulas trinucleadas, conferindo

placenta dos ruminantes a classificao de sinepitliocorial (WOODING, 1992).

Dentre as funes da BNC, destaca-se a produo de lactognio

placentrio, glicoprotenas associadas gestao (PAGs), progesterona,

estrgeno e modulao na sntese de prostanides (prostaglandinas e

prostaciclinas); amplificados devido condio binucleada desta clula. Por estar

em ntimo contato com o estroma uterino, seus produtos de secreo so

facilmente liberados prximos aos vasos sanguneos maternos.


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3

Devido s caractersticas fisiolgicas e morfolgicas da Clula Binucleada

Trofoblstica, o presente trabalho tem como objetivo geral avaliar a participao

dos seus produtos de secreo, obtidos em culturas enriquecidas com BNCs, para

compreenso dos fenmenos de antilutelise aps o perodo de atuao do IFN.


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2. REVISO DE LITERATURA

2.1 Consideraes sobre a Clula Binucleada Trofoblstica (BNC)As Clulas Binucleadas Trofoblsticas (BNCs) so encontradas no

trofoblasto da placenta de ruminantes desde o perodo de adeso do concepto ao

epitlio uterino at os momentos que precedem o parto (GREENSTEIN et al.,

1958; BJRKMAN, 1968; WOODING, 1982) possuindo como precursores as

clulas trofoblsticas uninucleadas (BJRKMAN, 1982; WOODING, 1982) que

realizam um mecanismo de endoduplicao, ou seja, realiza cariocinese sem a

ocorrncia de citocinese (BJRKMAN, 1982), sendo que o acrscimo no nmerodestas clulas ocorre, provavelmente, pelo contnuo recrutamento e transformao

de clulas trofoblsticas uninucleadas (WINSATT et al.,1980). A significncia

funcional desta multiplicao de genomas est ligada a um aumento da

capacidade de sntese, causada por um adicional nmero de genes copiados,

disponveis para transcrio (KLISCH et al., 1999; 2000).

Em bovinos, as clulas binucleadas surgem no epitlio corinico aos 17

dias de gestao e permanecem at o final (GREENSTEIN et al., 1958,

BJRKMAN, 1968), circundadas por clulas uninucleadas, sem haver unio

membrana basal, com um nmero aparentemente estvel ao longo da gestao,

representando cerca de 15 a 20% do total de clulas do epitlio corinico

(WOODING & WATHES, 1980; WOODING, 1992).

Segundo Flood (1991) as clulas binucleadas constituem, em bovinos,

aproximadamente 10% das clulas trofoblsticas nos dias 18-20 da gestao e

20% no restante da gestao. Somente 20% destas clulas possuem capacidade

de migrao. Aps a migrao, estas clulas podem ser observadas no epitliouterino, onde realizam fuses com as clulas epiteliais, formando as clulas

multinucleadas gigantes que correspondem a 50% da rea do epitlio materno, no

24dia da gestao. Estes eventos so similares nas ovelhas, mas, nas vacas, a

atividade mittica e o produto residual das clulas maternas so menores,


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ocorrendo total reconstituio do epitlio uterino, na migrao deixado pela clula

trofoblstica.

Winsatt (1980) descreveu a formao das clulas binucleadas a partir das

clulas do trofoblasto no 17 dia de gestao. As clulas binucleadas jovens estohabitualmente situadas intimamente no trofoblasto. A diviso nuclear ocorre sem a

necessidade de diviso do citoplasma, o que determina a condio binucleada

(diplocaricito) ou multinucleada. Esta diviso nuclear finalizada por mitose. A

diviso citoplasmtica nunca ocorre nas clulas gigantes, mostrando sua

incapacidade de proliferao.

Em vrias espcies de ruminantes, tais como ovinos, caprinos, bovinos e

cervdeos, as clulas binucleadas so encontradas e a sua origem se procede apartir de clulas uninucleadas do trofoectoderma fetal. Inicialmente esto

presentes em nmero reduzido, no entanto, detm um denso volume

citoplasmtico, um pequeno nmero de mitocndrias, muitos polirribossomos e um

extenso sistema de cisternas de retculo endoplasmtico, algumas vezes

apresentam grande nmero de aparelhos de Golgi, sendo, este ltimo,

responsvel pela grande quantidade de grnulos caractersticos que variam de

densidade quando observadas aps fixao e colorao convencionais, cada qual

contendo microvesculas. As clulas binucleadas maduras apresentam-se

completamente granuladas e aumentam o seu volume citoplasmtico,

encontrando-se prximas da superfcie do epitlio uninuclear trofoectodrmico,

embora no faam parte desta juno compacta do epitlio. Muitas vezes esta a

primeira barreira de migrao para as clulas binucleadas. A segunda barreira o

tecido de interdigitao com o epitlio trofoectodrmico que forma a juno

microvilar. Este tecido , inicialmente, o epitlio uterino materno, mas

consideravelmente modificado, incluindo a transformao para sinccio durante aimplantao e desenvolvimento placentrio em todos os ruminantes (WOODING,

1982).

Assim como Winsatt (1980), Dantzer (1989) tambm descreveu a

ocorrncia das clulas binucleadas a partir do 17 dia de gestao, na qual estas


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clulas representam cerca de 20% das clulas trofoblsticas, havendo um

decrscimo nas semanas que precedem o parto. Apresentam-se de forma

diferenciada, volumosas, com 2 ncleos esfricos e nuclolos bem evidentes. O

aparelho de Golgi e o retculo endoplasmtico rugoso esto bem desenvolvidos euma agregao regional de grnulos caracterstico. Os hormnios sintetizados

pelas clulas binucleadas so secretados nos capilares maternos. Os hormnios

identificados incluem lactognio placentrio, estrgeno (MATAMOROS et al.,

1994), progesterona e prostanides, como prostaciclinas e prostaglandinas

(REIMERS et al.1985; GROSS & WILLIAMS, 1988).

Estimativas de frequncia das clulas binucleadas e sua migrao

indicaram que muitas, se no todas, migram e estas evidncias foram confirmadasusando tcnicas de auto-radiografia e imunocitoqumica. O resultado desta

migrao a fuso de uma clula binucleada com uma clula do epitlio uterino

ou da parede sincicial. Esta fuso libera os grnulos caractersticos das clulas

binucleadas prximas circulao materna, enquanto mantm a barreira

trofoblstica de troca materno-fetal. As clulas binucleadas de ruminantes

parecem representar um papel central, formando estruturas e secretando produtos

na interface materno-fetal que pode ser crucial no estabelecimento e manuteno

da gestao (MORAIS-PINTO, 2000).

Estudos com a incluso nuclear de timidina tritiada demonstram

claramente que a maioria dos ncleos do sinccio derivada da migrao das

clulas binucleadas do trofoectoderma. A uniformidade e extenso da produo e

migrao das clulas binucleadas, indicam um papel central no desenvolvimento e

funo da placenta dos ruminantes. O nmero de clulas binucleadas comea a

diminuir somente nas ltimas semanas da gestao (WOODING et al., 1993).

A formao e migrao das clulas binucleadas foi descrita por Wooding &Wathes (1980), na qual a clula binucleada formada no crion e sintetiza

grnulos; em seguida move-se e entra em contato com a juno microvilar e altera

as junes laterais do epitlio uterino at alcanar a membrana basal do epitlio

uterino (Figura 1). A maioria das clulas binucleadas encontrada no epitlio


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uterino, os grnulos so liberados no espao intercelular, junto aos vasos

maternos ou diretamente no interior de clulas uterinas adjacentes. Em uma fase

posterior ocorre a reduo do citoplasma da clula binucleada, apresentao de

ncleos densos e diminuio do nmero de grnulos. Em uma progresso, osncleos tornam-se altamente densos ou picnticos e a clula desprende-se,

retornando novamente juno microvilar.

Figura 1. Esquema da migrao da clula binucleadatrofoblstica em direo ao epitlio uterino erespectiva fuso; 1. epitlio trofoblstico, 2.epitlio uterino. (Adaptado de MORAIS-PINTO,2000).

Visto que as clulas binucleadas no aparecem no epitlio uterino at o

perodo tardio de pr-implantao (ao redor do 17 dia de gestao), torna-se

evidente que elas sejam originadas inicialmente da transformao direta de

clulas trofoblsticas colunares ordinrias. Novas clulas gigantes continuam a se

formar desta maneira por toda a gestao. As clulas binucleadas se diferenciam

dentro do trofoectoderma fetal, iniciam com um pequeno volume citoplasmtico,

poucas mitocndrias, muitos polirribossomos e um extenso sistema de cisternasde retculo endoplasmtico desenvolvendo-se junto com o aparelho de Golgi,

produzindo grnulos caractersticos com densidade variada. As clulas

binucleadas maduras e totalmente repletas de granulaes chegam a um tamanho

considervel e permanecem muito prximas ao topo do epitlio trofoectodrmico

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uninucleado, normalmente no fazendo parte da juno apical que mantm estas

clulas unidas (MORAIS-PINTO, 2000).

Com respeito caracterizao morfolgica e cintica da clula binucleada

trofoblstica, estudos realizados por Winsat et al. (1980) verificaram a polarizaodas clulas, observando figuras de mitose, embora o verdadeiro significado da

multiplicao nuclear em relao sua fisiologia, no tenha sido ainda

convincentemente analisada. Neste processo parece haver a diviso nuclear sem

a diviso citoplasmtica, tornando a clula bi ou multinucleada. O acrscimo no

nmero destas clulas ocorre provavelmente pela contnua transformao do

trofoblasto em clulas gigantes. O aparelho de Golgi, nas clulas binucleadas

trofoblsticas, est situado em regies adjacentes dos ncleos, estando semprerodeado por vacolos que parecem conter material precipitado em seu interior que

se cora tanto por corantes cidos, quanto por bsicos. No entanto, devido a

basofilia ser neutralizada pela ribonuclease, acredita-se que contenha cido

ribonuclico. O material destes grnulos tambm se cora pelo cido peridico e

apresenta evidncias de atividade fosfatase alcalina. As mitocndrias apresentam-

se uniformemente granulares, geralmente segregadas no citoplasma supranuclear

(CARVALHO, 2000).

A determinao do nvel de ploidia por hibridizao in situcom uma prova

de DNA especfico utilizando-se um cromossomo Y, mostrou que a maioria dos

ncleos das clulas fetais (bovinas) so tetraplides. Geralmente os dois ncleos

tetraplides esto sempre juntos. Estes achados indicam que a poliploidizao

um aspecto normal no desenvolvimento da maioria das clulas binucleadas. Um

novo modelo para o desenvolvimento destas clulas foi proposto: primeiramente

ocorre uma mitose acitocintica que origina as clulas binucleadas com dois

ncleos diplides; esta clula entra em uma segunda mitose acitocintica na qualos cromossomos dos dois ncleos formam uma figura de mitose comum. O

resultado uma clula com dois ncleos tetraplides, que passam por uma fase

S adicional, mas no entram em uma nova mitose (KLISCH et al., 1999, 2000)

(Figura 2).


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Figura 2. Esquema da diviso nuclear da clula binucleada trofoblstica e sua migrao em

direo ao epitlio uterino. 1.epitlio trofoblstico, 2. epitlio uterino, 3 fuso da clulabinucleada com clula do epitlio uterino (Adaptado de KLISCH et al., 1999).

As clulas binucleadas de ruminantes so secretoras, tendo a capcidade de

produzir e transportar protenas para o organismo materno. Uma de suas maiores

expresses, as glicoprotenas associadas gestao, resultado da multiplicao

de genes, com aproximadamente 100 cpias de genes. (KLISCH et al.,2000). Apresena da glicoprotena associada gestao de bovinos (bPAG) nos grnulos

das clulas binucleadas do trofoblasto foi relatada por Zoli et al. (1992) por

mtodos imunocitoqumicos. Alm de protenas associadas gestao, o LP

tambm produzido pelas clulas binucleadas (WOODING & FLINT, 1994), bem

como a produo de esterides e metabolismo de prostaglandinas (KLISCH et al.,

2000). Utilizando mtodos imunocitoqumicos, Morgan et al. (1989) demonstraram

que o lactognio placentrio bovino (bLP) estava presente nas clulas

binucleadas, encontradas no trofoectoderma aos 21 dias de gestao. Uma

segunda protena, o antgeno SBU-3, que est ausente nos estgios iniciais da

gestao, aparece de forma abrupta nos grnulos das clulas binucleadas aos 30

dias de gestao, coincidente com o incio do desenvolvimento dos vilos.

Subsequentemente, os grnulos contm tanto bLP quanto o antgeno SBU-3. Esta

produo sequencial de protenas indicam que as clulas binucleadas possuem

diferentes funes de acordo com o estgio da gestao e tm um importante

papel durante a implantao e o desenvolvimento dos vilos.Com a utilizao de tcnicas imunohistoqumicas, Duello et al. (1986)

conseguiram localizar o bLP nas clulas binucleadas do placentnio bovino.

Clulas binucleadas marcadas foram demonstradas em toda a camada do

trofoblasto. Os processos celulares das BNCs que se estendem em direo ao

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epitlio uterino foram reativas, assim como as clulas inseridas na camada do

epitlio uterino, com ntima aproximao ou aposio membrana basal materna.

Acerca deste perodo de adeso, Milosavlejevic et al.(1989) analisando

RNAm das BNCs da placenta de bovinos, concluram que estas clulastranscreviam dois membros da famlia dos genes PRL (Post-transcriptional

Regulation of Prolactin) que influenciavam no desenvolvimento fetal e adaptao

materna gestao, em bovinos.

Muitas espcies secretam um hormnio protico de origem placentria que

possuem homologia estrutural e funcional com o hormnio do crescimento e a

prolactina. Inicialmente foi denominado como somatotropina corinica, mas

comumente denominado de lactognio placentrio. Dentre suas funes, observa-se sua influncia na mamognese, lactognese, esteroidognese (ovariana e

placentria) e alterao no metabolismo materno para acomodar o crescimento e

desenvolvimento do feto (PATEL et al., 1996; SPENCER et al.,1999).

Wooding et al. (1996) demonstraram que as clulas trofoblsticas

binucleadas na placenta de ruminantes apresentavam caractersticas especficas

durante seu desenvolvimento, maturao e capacidade migratria, e estavam

situadas tanto nas regies cotiledonrias, como nas intercotiledonrias. No

entanto, estas clulas apresentavam expresses proticas diferentes dependendo

da sua localizao. O lactognio placentrio ovino (oLP) expresso em todas as

clulas binucleadas, enquanto o SBU-3, somente no cotildone.

Uma caracterstica observada por Winsatt (1980), a partir de provas

histofisiolgicas, demonstra a capacidade fagocitria da clula binucleada.

Sobre a atividade fagocitria das clulas trofoblsticas, existem

consideraes de que os hematomas encontrados em placentas de ovinos sirvam

como fonte adicional de ferro para o desenvolvimento embrionrio, na medida emque as hemcias so fagocitadas e digeridas pelo trofoblasto (PEREIRA, 2000).

Uma considervel perda embrionria precoce em ruminantes ocorre nos

perodos iniciais da implantao. Uma melhor compreenso das interaes

celulares materno-fetais requerida para o desenvolvimento placentrio, bem


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como o conhecimento de aspectos sobre a fisiologia das perdas embrionrias.

Nos ruminantes, uma populao de clulas binucleadas aparece no correto

estgio de desenvolvimento, com importante papel nas modificaes do epitlio

uterino e a formao de estruturas placentrias definidas (WOODING, 1984). Aoanalisar o RNAm das clulas binucleadas da placenta de bovinos, Milosavlejevic

et al. (1989) concluram que estas clulas transcreviam 2 membros da famlia dos

genes PRL que influenciavam no desenvolvimento fetal e adaptao materna

gestao.

No que se refere ao estudo de reteno de placentas, Santos et al (1996)

mencionaram que as clulas binucleadas presentes no placentnio, em bovinos

leiteiros, durante diferentes fases da gestao, estavam correlacionadas com areteno placentria quando seu nmero no diminua no final da gestao.

Mtodos so descritos para preparo e manuteno de trofoblasto ovino em

monocamadas de cultivo celular. Steven et al. (1980) sugeriram que as clulas

binucleadas, que surgem na 2 semana de incubao na cultura de trofoblasto,

eram formadas por diviso nuclear das clulas uninucleadas e possuam

correlao com a taxa de produo de lactognio placentrio ovino.

Quanto produo de hormnios, Matamoros et al. (1994) avaliaram a

produo de estrgeno pelas clulas binucleadas trofoblsticas in vitro e seus

efeitos sobre o cortisol, progesterona, pregnenolona, testosterona e

androstenediona.

2.2 Consideraes sobre a Clula Endometrial Bovina (BEND)

As clulas endometriais bovinas BEND constituem uma linhagem de clulas

endometriais obtidas no 14 dia do ciclo estral de fmeas bovinas, que adquiriram

espontaneamente a capacidade de replicao in vitro. Esta linhagem celular foicaracterizada e registrada na American Type Culture Colection (ATCC n CRL-

2398), onde se encontra descrita toda a metodologia para seu cultivo, a qual pode

ser utilizada por at 25 repiques, sem apresentar qualquer alterao fenotpica

(BINELLI et al., 2000).


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Alm de se apresentarem morfologicamente semelhantes s clulas

endometriais epiteliais, as clulas BEND so capazes de responder a

estimuladores e inibidores da produo de Prostaglandina F2 (PGF2) e tm

sido utilizadas em estudos para entendimento dos mecanismos celulares emoleculares na manuteno da prenhez em bovinos (BERTAN, 2004).

As clulas BEND so especificamente indicadas para estudos relacionados

regulao da produo de PGF2 no endomtrio no final da fase lutenica, pois

so oriundas de animais no 14 dia do ciclo estral, sendo portanto, previamente

expostas progesterona, necessria para o desencadeamento da produo de

PGF2, bem como ser bioquimicamente apta para sua produo frente a

estimuladores diversos (BERTAN, 2004).Binelli et al. (2000) verificaram que as clulas BEND so estimuladas

quanto produo de PGF2 pela ao do forbol 12,13 dibutirato (PDBu,

estimulador da enzima fosfoquinase-C) e, simultaneamente inibidas, quando

adicionado Interferon-tau (IFN) ao meio de cultivo, mesmo na presena do

estimulador PDBu. O pr-tratamento das clulas BEND com somatotropina bovina

recombinante (rbGH) ou com fator de crescimento semelhante insulina-1 (IGF-1)

foi capaz de potencializar os efeitos do PDBu na produo de PGF2 e de RNAm

de cicloxigenase-2 (COX-2), enquanto o pr-tratamento com cidos graxos

poliinsaturados resultou na diminuio na produo de PGF2, induzida pelo

PDBu, demonstrando que estas clulas guardam importantes semelhanas com a

fisiologia e endocrinologia dos eventos observados in vivo (BERTAN, 2004).

2.3 Falhas na manuteno da gestao

2.3.1 Consideraes gerais

bem estabelecido que a incidncia de falhas na gestao, em populaes

bovinas, maior durante o perodo embrionrio (entre os dias 1 e 42 da prenhez)

do que no perodo fetal (42 a 280 dias) ou neonatal (at 28 dias aps o parto). A

perda embrionria, associada falha no reconhecimento materno anterior ao 18


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dia da gestao, representa aproximadamente 40% de todas as perdas em

bovinos (FARIN et al., 2004a).

Uma variedade de mtodos tem sido utilizada na produo in vitro (PIV) e

clonagem de embries bovinos. Muitos laboratrios demonstraram que estesembries PIV possuem diferenas distintas na morfologia, competncia no

desenvolvimento e, mais recentemente, expresso gnica, comparada aos

embries produzidos in vivo (FARIN, 2004a, 2004b, NIEMANN et al., 2002).

Embries PIV possuem maiores taxas de perda embrionria precoce e

abortamentos quando comparados aos produzidos por meio de inseminao

artificial (IA) ou transferncia de embries (TE) (KRUIP & DEN DAAS, 1997).

Fatores envolvidos nas falhas de manuteno da prenhez de embries PIVincluem o sistema de cultivo embrionrio, qualidade embrionria, nmero de

embries transferidos por receptora, sincronia entre desenvolvimento embrionrio

e dia do estro da receptora, embries congelados versus in natura, estresse

trmico sobre o embrio e/ou receptora. As perdas verificadas entre a metade e o

final da prenhez ocorrem mais freqentemente em receptoras de embries PIV (7

a 20% superiores) do que embries produzidos in vivo , sendo os motivos

atribudos ao desenvolvimento e/ou funo placentria insuficientes (FARIN et al.,

2004a).

As perdas de prenhez resultantes de transferncia de embries clonados

so superiores quando comparados aos embries PIV, na qual apenas 10% das

receptoras conseguem levar um feto clonado a termo (HEYMANN et al., 2002,

HILL et. al., 2000). As perdas so comuns durante os primeiros dois meses de

prenhez, e novamente, durante os perodos fetal tardio e perinatal (HEYMANN,

2002). Hill et al. (2000) relataram que as taxas de prenhez no dia 30 foram

similares para receptoras gestando embries clonados (45%) e embries controle(58%). No entanto, entre os dias 30 e 90 da gestao, 82% dos fetos clonados

morreram, enquanto todos os fetos do grupo controle sobreviveram. Estes autores

atribuem a baixa viabilidade dos clones entre os dias 35 e 60 ao inadequado

desenvolvimento da membrana crioalantide. Estas perdas tm sido atribudas


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ao elevado decrscimo na vascularizao placentria, ocorrncia de completa

avascularizao da membrana corioalantde, decrscimo no nmero de

placentnios e aumento no tamanho dos mesmos (LEE et al., 2004; CHAVATTE-

PALMER et al., 2002). Outros fatores que podem ser responsveis, em parte, pelaperda embrionria precoce de embries clonados, incluem modificaes do

imprinting genmico e rejeio imunolgica do concepto (Mc EVOY, 2003).

Durante o perodo final da prenhez, anormalidades associadas com a funo

placentria, incluindo volume excessivo de lquido alantico (hidroalantide) e

gestao prolongada, tambm contribuem para perdas significativas na prenhez

de fetos clonados (TAVERNE et al., 2002; HEYMANN et al., 2002).

2.3.2 Influncias do reconhecimento materno da gestao

O reconhecimento materno da gestao reflete, de vrias formas, como o

organismo materno responde presena do concepto em seu trato reprodutivo.

Uma parte das informaes bioqumicas pode ser considerada irrelevante

gestao, mas alguns reflexos promovidos pela ao do concepto tornam-se

essenciais nos controles da funo do corpo lteo, suprimento sanguneo uterino,

sistema imunolgico materno e outros aspectos da fisiologia materna. Muito

provavelmente ocorra um conflito gentico entre me e concepto, mas existe um

comum interesse no sucesso da manuteno da gestao, promovido por

mecanismos sinalizadores entre o trofoblasto e organismo materno (ROBERTS,

1996). Portanto, o processo de implantao e sucesso na manuteno da

gestao possuem como fator limitante a ao das clulas trofoblsticas

(HERRLER et al., 2003).

O crescimento e desenvolvimento do concepto em mamferos

inequivocamente requer ao da progesterona e hormnios placentrios sobre otero, que regulam a funo e diferenciao do endomtrio, sinalizao do

reconhecimento materno, receptividade uterina para a implantao do blastocisto

e interao concepto-tero. Hormnios do concepto atuam sobre o tero de forma

parcrina para estabelecer e manter a gestao (SPENCER, 2004).


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Considerando-se esta importncia, surpreendente como pouco destes

processos fisiolgicos so compreendidos. Em poucas espcies, um coerente

modelo de como o embrio intervm sobre a extenso da vida til do corpo lteo

emerge, porm as bases para a sua manuteno ao longo da gestao,permanecem incertas (ROBERTS, 1996). Em muitas espcies, a produo de

progesterona ovariana requerida ao longo da gestao e no simplesmente uma

fonte nica at complementao da progesterona placentria. Existe pouco

conhecimento sobre como o embrio interfere no suprimento sanguneo e

estrutura endometrial nos estgios iniciais da gestao, possivelmente pela

atuao de fatores de crescimento, que no entanto, tambm no atuam de forma

nica (AULETTA & FLINT, 1998).O sucesso da manuteno da gestao depende de uma perfeita interao

entre a unidade embrionria e o organismo materno (DUC-GOIRAN et al., 1999).

Aps a fecundao do ocito pelo espermatozide e o desenvolvimento do zigoto

na tuba uterina, o embrio alcana o lmen uterino onde promove o processo

denominado reconhecimento materno da gestao.

O termo reconhecimento da gestao foi primeiramente empregado por

Roger Short em 1969, definido como o processo fisiolgico pelo qual os sinais do

concepto, na presena do sistema materno, prolongam a vida til do corpo lteo

(SPENCER, 2004). Adicionalmente, Hansen (1991) incluiu ainda como a

sinalizao endcrina, bioqumica e molecular entre o concepto (embrio e

anexos) na presena da unidade materna, refletida na inibio da lutelise.

Durante o perodo inicial da gestao, a comunicao materno-embrionria

mediada pelo trofoblasto. A janela de adeso representa o perodo de mxima

receptividade uterina para adeso do embrio no tero. Em resposta aos sinais do

embrio, protenas especficas da gestao so liberadas no sangue materno euma srie de alteraes morfolgicas, bioqumicas e imunolgicas ocorrem no

ambiente uterino para receptividade do embrio (DUC-GOIRAN et al.,1999).

Em mamferos eutrios, a implantao marca um estgio de transio no

processo de gestao, na qual o blastocisto assume uma posio fixa e inicia um


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relacionamento de alteraes fisiolgicas com o tero. A primeira associao

frequentemente denominada de adeso, que pode ser subdividida em dois

estgios, o primeiro aposicional, e o subsequente, de adeso (SCHLAFKE &

ENDERS, 1975). O termo implantao se usa habitualmente para indicar a uniodo trofoblasto com a parede uterina, formando-se a placenta, mas este grau de

unio varia notadamente entre as espcies. Em bovinos, a implantao inicia-se

entre os dias 28-32 e finaliza-se entre os dias 40-45 aps a ovulao (BOWEN &

BURGHARDT, 2000; NODEN & DE LAHUNTA, 1985).

Em cada ciclo estral o ambiente uterino modificado morfo-funcionalmente

para perfeita adequao a uma provvel gestao. Durante o ciclo estral, o tero

regula a funo ovariana quanto ao perodo de permanncia do corpo lteo (CL),modulado pela ao da PGF2.

Durante a gestao, as funes do tero incluem o transporte,

armazenamento e maturao do espermatozide, reconhecimento e recepo dos

embries, garantia de um ambiente favorvel ao concepto durante a gestao e

expulso do feto e placenta no momento do parto (BARTOL, 1999). Neste status

fisiolgico, a funo uterina regulada por esterides de origem ovariana e

molculas embrionrias bioativas. Durante a gestao, um desequilbrio na funo

uterina pode levar mortalidade embrionria (BINELLI, 1999)

Binelli (2000a) definiu como perodo crtico o perodo compreendido entre

os dias 15 e 17 do ciclo estral, no qual a vaca deve ajustar sua fisiologia

apropriadamente, dependendo de estar ou no prenhe. A mudana do estado

cclico para o estado prenhe depende de um mecanismo efetivo de bloqueio da

lutelise. O bloqueio da lutelise, e consequentemente a prenhez, somente

estabelecer-se- caso o concepto seja competente para enviar os sinais

antiluteolticos apropriados e o endomtrio tiver a capacidade de responder a taissinais, bloqueando a produo de PGF2. Tal comunicao entre as unidades do

concepto e maternal frequentemente no so bem sucedidas, resultando na

ocorrncia da lutelise e, consequente, perda embrionria.


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O principal hormnio implicado na manuteno da gestao a

progesterona, responsvel pela estimulao de uma variedade de secrees

endometriais, necessrias para o sucesso da manuteno do embrio (MANN &

LAMMING, 2001; GEISERT et al., 1992). Adicionalmente, muitos estudos revelamque a concentrao de progesterona no plasma so menores em vacas

inseminadas e no prenhes, quando comparadas s vacas prenhes (MANN &

LAMMING, 2001).

O ambiente uterino deve estar previamente primed (sinalizado) pela

progesterona, fornecendo as condies mais favorveis para o desenvolvimento

do concepto (BINELLI, 2000a). A ao da progesterona tem sua importncia no

apenas durante a gestao, mas tambm nos momentos que precedem afecundao, preparando o ambiente uterino para o concepto.

Mann et al. (1998) constataram que embries mal desenvolvidos,

recuperados aos 16 dias aps a inseminao, esto correlacionados s baixas

concentraes plasmticas de progesterona durante a fase lutenica do ciclo

estral.

A maioria das mortes embrionrias nos animais domsticos ocorre durante

as primeiras semanas aps a concepo e pode ser atribuda desde

anormalidades no perodo inicial da embriognese, que inclui a implantao,

reconhecimento materno da gestao, at a completa formao da placenta

(CROSS, 2001).

O mecanismo de reconhecimento materno da gestao em vacas

mediado pelo IFN, produzido pelas clulas trofoblsticas do embrio ao redor do

15 - 18 dia da gestao (THATCHER et al., 1995, 1997; BINELLI, 1999, 2000a).

Os efeitos antiluteolticos do IFN tm sido examinados in vitro e in vivo. Infuses

intrauterinas enriquecidas com bINF (HELMER et al., 1989) ou bIFNrecombinante (MEYER et al., 1995) aumentaram a permanncia do CL,

comparado aos grupos controle. A secreo de PGF2 em resposta injeo de

ocitocina foi suprimida no dia 17 quando vacas receberam infuso com bIFN,

quando comparado aos grupos controle (MEYER et al., 1995).


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A liberao de PGF2 pelas clulas endometriais requer a presena de um

sinal estimulatrio e um tero responsivo. Em bovinos, a natureza deste sinal para

produo de pulsos de PGF2 permanece incerta, j que existe a possibilidade de

atuao do estradiol disponibilizando os receptores de ocitocina (BINELLI, 1999).

Em ovinos, um mecanismo fechado de retroalimentao positiva estimula a

secreo pulstil de PGF2, e a ocitocina desempenha um papel central neste

processo (McCRAKEN et al.,1984). A ocitocina proveniente da neurohipfise

estimula a secreo de PGF2. A PGF2 estimula a secreo de ocitocina do CL,

que por sua vez, estimula ainda mais a produo de PGF2 pelo tero, num

sistema fechado. Os pulsos de PGF2 coincidem em 96% com os pulsos de

ocitocina (HOOPER et al., 1986).

2.3.3 Influncia placentria

A eficincia placentria tem sido descrita em diversas espcies animais

como simplesmente a relao entre o peso do componente fetal, dividido pelo

peso do componente placentrio (KURZ et al., 1999). No entanto, este conceito

no leva em considerao, ou faz justia, complexidade e diversidade

envolvidos na troca de nutrientes, gases e metablitos entre o concepto e osistema materno (WILSON, 2002). Talvez, o melhor exemplo de diminuio de

funo placentria em animais domsticos visto em guas com gestao

gemelar, na qual a rea total da superfcie placentria freqentemente muito

pequena para um ou ambos os gmeos sobreviverem a termo (JONKER, 2004).

Em animais clonados, uma das principais causas de perda gestacional a

deficincia placentria, na qual 82% dos bovinos clonados por transferncia

nuclear (TN) no sobrevivem entre o trigsimo e nonagsimo dia da gestao.

Essa viabilidade ineficiente atribuda ao desenvolvimento rudimentar da

membrana crioalantide, bem como problemas associados aos fatores que

promovem o crescimento placentrio e vascular, e suas interaes materno-fetais,

tais como conexes placentrias e formao dos vilos corinicos. A deficincia do


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desenvolvimento vascular placentrio pode ser evidenciada em bovinos por

estruturas cotiledonares reduzidas ou ausentes (MIGLINO, 2004). Daniels et al.

(2000) atriburam a baixa eficincia de produo animal pela utilizao da

clonagem por transferncia nuclear uma incompleta reprogramao da cluladoadora de ncleo, que leva a uma diminuio, ou expresso anormal de genes

importantes para o desenvolvimento, ou ainda, uma irregular expresso de

genes marcados (imprinting) (YOUNG & FAIRBURN, 2000; JAENISCH &

WILMUT, 2001). Adicionalmente, a comparao de blastocistos PIV, TN ou

produzidos in vivo, por anlises de diferential display, revelaram que a maioria,

mas no todos os RNAm dos embries TN foram reprogramados (De SOUZA,

1999).Para o sucesso do desenvolvimento de um embrio reconstitudo, o ncleo

transferido deve estar reprogramado para estabelecer um padro de expresso

temporal, espacial e quantitativo normal com relao ao desenvolvimento, pois a

reprogramao nuclear est associada s alteraes da atividade genmica, no

entanto, o(s) mecanismo(s) acerca desta reprogramao permanece(m)

desconhecido(s) at o presente momento, incluindo-se as modificaes

epigenticas do DNA, configurao da cromatina e o imprinting genmico

(WRENZYCKI et al., 2001). Neste contexto, Wilmut et al. (2002) afirmaram que a

clonagem por transferncia nuclear a partir de clulas somticas adultas uma

incrvel demonstrao de plasticidade, desempenhado pelo ncleo transferido ao

citoplasma do ocito, que deve reger todas as alteraes desde o controle do

desenvolvimento at o momento do parto.

Patel et al.(2003), ao analisarem a expresso dos genes codificadores de

protena relacionada prolactina-1(PRP-1), lactognio placentrio (LP) e

glicoprotena associada gestao-1 e 9 (PAG-1 e PAG-9) em embries bovinosproduzidos por IA ou NT, no primeiro trimestre da gestao, constataram que os

transcritos para LP e PAG-1 eram menores nas membranas fetais de animais TN,

porm, sem haver diferena significativa na expresso de PRP-1, LP e PAG-1 no


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placentnio e tecidos intercotiledonrios, sugerindo haver um desbalano na

transcrio gnica especfica nas clulas binucleadas de animais TN.

Miles et al. (2004), ao avaliarem a quantificao de RNAm e protena do

fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e do ativador-proliferador doreceptor gama da peroxisoma (PPAR - peroxisome proliferator-activated receptor-

gama) em placentas bovinas, seja de animais produzidos in vivo ou por fertilizao

in vitro, no verificaram diferena na expresso nos cotildones para estas duas

protenas, porm, as carnculas dos animais PIV tiveram aumento da expresso

de PPAR. Relataram ainda uma menor rea da superfcie endometrial,

diminuio das vilosidades fetais e clulas binucleadas com menor volume,

somados a um aumento na razo entre o volume de vasos sanguneos e a reada superfcie dos placentnios dos animais PIV, inferindo haver uma srie de

mecanismos compensatrios no leito vascular destes embries.

De acordo com os diferentes sistemas de produo in vitro de embries

bovinos, Miles et al. (2005) no verificaram alterao na densidade volumtrica de

vilos ou endomtrio com placentnios, no entanto, houve uma maior concentrao

de clulas picnticas nos placentnios de embries produzidos com meio

semidefinido, quando comparado aos grupos que utilizaram soro ou produzidos in

vivo, afirmando que estes embries exibem um maior potencial para

desenvolvimento de formas anormais de placenta, nos estgios iniciais da

gestao.

Relacionando os aspectos imunolgicos e as perdas gestacionais, Hill et al.

(2002) afirmaram que as elevadas perdas embrionrias precoces, envolvendo a

gestao de embries TN, representavam o maior impedimento ao aumento da

eficincia da produo de clones, uma vez que existia uma expresso anormal do

complexo maior de histocompatibilidade do tipo I (MHC-I) no trofoblasto, e ummaior acmulo de linfcitos T no endomtrio, sugerindo haver uma rejeio

imunolgica.

Dentre as mais comuns alteraes placentrias em clones bovinos,

MIGLINO (2004) relatou um nmero reduzido de placentnios (39 versus 120 em


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21

gestaes normais), maior dimetro destas estruturas (21cm versus 11cm),

ocorrncia de reas hemorrgicas aparentes sobre a superfcie edemaciada,

desorganizao das rvores vilosas fetais (inseridas nas criptas endometriais),

menor densidade de vilos nos chamados megacotildones, deficiente ramificaovascular sobre as superfcies das rvores vilosas, bem como dilataes

anormais das criptas endometriais onde esses vilos se inserem, capilares fetais

com menor calibre (5-10m versus 7-12m, em gestaes normais), a interface

materno-fetal apresenta-se desorganizada e as clulas binucleadas trofoblsticas

com alteraes nucleares significativas.

2.4 Consideraes sobre vascularizao placentria e VEGFOs estudos na rea reprodutiva avanam para a era da clonagem e

transgnese. O sucesso da progresso na fase de pr-implantao, durante o

desenvolvimento embrionrio essencial para o estabelecimento da gestao

(WATSON et al.,2000). A biologia comparativa revela muitas similaridades entre

diferentes grupos de mamferos. Com relao a estas diferenas, o propsito

comum da funo placentria facilitar um aumento na quantidade de trocas entre

as circulaes materna e fetal. Em todos os tipos de placenta existe um

crescimento de vasos sanguneos de forma considervel, garantindo uma

arquitetura de vasos capazes de promover uma potencializao nas trocas entre

os organismos materno e fetal. Um dos mais potentes estimuladores da

angiognese o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) (CHARNOCK-

JONES et al.,2001).

Mossman (1937) postulou que a placenta normal de mamferos a

aposio ou fuso das membranas fetais mucosa uterina para as trocas

fisiolgicas. Esta definio compreende trs pontos cruciais: 1) aposio ou fusoindica ntimo contato da placenta; 2) este contato ocorre entre as membranas

fetais (crioalantide) e a mucosa uterina (endomtrio) e 3) a troca fisiolgica o

primeiro papel efetuado entre os tecidos materno e fetal (REYNOLDS & REDMER,

1995). Desta forma, a troca transplacentria supre a demanda metablica para o


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crescimento e desenvolvimento fetal, na qual a taxa de troca depende

primariamente do fluxo sanguneo uterino (placenta materna) e umbilical (placenta

fetal). As taxas de fluxo sanguneo placentrio, por sua vez, so dependentes da

taxa de vascularizao placentria e, a angiognese , portanto, crtica para odesenvolvimento de fetos saudveis e viveis (REYNOLDS & REDMER, 2001).

De fato, a reduo da vascularizao placentria tem sido associada

mortalidade embrionria precoce (HILL et al., 2000; CHARNOCK-JONES &

BURTON, 2000).

Ao longo da gestao, a angiognese placentria est relacionada com o

aumento do fluxo sanguneo placentrio, garantindo a disponibilizao de

nutrientes para o feto em desenvolvimento, regulao das trocas gasosas emetablicas, regulados molecularmente por fatores angiognicos como o VEGF

(fator de crescimento vascular-endotelial), fator-2 de crescimento de fibroblastos

(FGFB-2) e angiopoetinas, que atuam sobre clulas endoteliais, de forma

diferenciada, conforme o desenvolvimento placentrio (MILES et al., 2005;

REYNOLDS et al., 2005).

A angiognese da placenta fetal durante o desenvolvimento caracterizada

pela formao de uma rede neovascular anastomosada. Este processo de

crescimento de vasos sanguneos altamente regulado pelo contnuo crescimento

do leito capilar placentrio, seguido pelo aumento da necessidade de fluxo

sanguneo feto-placentrio para sustentar o crescimento do feto (CHEUNG et al.,

1995).

Em ruminantes, ao contrrio de primatas, existe uma intensa

vascularizao do crion e do mnion, e o aumento do crescimento destes vasos

concomitante ao desenvolvimento dos capilares cotiledonrios.

Embriologicamente, estes microvasos sobre as membranas fetais surgem a partirda vescula amnitica e a artria umbilical supre, no somente a placenta

cotiledonria, mas tambm as membranas fetais (BRACE et al., 1992).

Recentes estudos com anlise morfomtrica tm descrito uma extensa rede

de vasos microscpicos no mnion e crion de ruminantes. Esta rede, juntamente


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com os vasos que perfundem a superfcie da placenta fetal, constitui o maior

componente de padro de troca intramembranoso, envolvendo fluidos e solutos

entre o compartimento amnitico e sangue fetal, representando, portanto o

mecanismo primrio de regulao do volume e composio do lquido amnitico.Desta forma, o crescimento e diferenciao dos microvasos do crion e mnion

podem ser essenciais para o desenvolvimento e funo do padro

intramembranoso de troca. O estmulo para formao de novos vasos sanguneos

nas membranas fetais e placenta, ao longo da gestao, ainda pouco descrito

(CHEUNG et al., 1995). Um possvel mediador para angiognese o VEGF, um

potente fator mitognico de clulas endoteliais, na promoo de crescimento de

vasos sanguneos (FERRARAet al.

, 1992).Alm da funo angiognica primria, o VEGF pode desempenhar outras

funes biolgicas como a regulao das funes das clulas trofoblsticas

durante a gestao (BOJIC et al. 2000). Hill et al. (2000) analisando as falhas na

gestao de bovinos clonados sugeriram que as pesquisas futuras devem focar os

fatores que promovem o crescimento placentrio e vascular, bem como nas

interaes materno-fetais que promovem a adeso placentria e a formao de

vilosidades.

O VEGF um regulador fundamental tanto na angiognese normal quanto

em condies patolgicas. Recentes evidncias indicam que esta protena

essencial na angiognese e vasculognese embrionria, bem como na

proliferao cclica dos vasos sanguneos do trato reprodutivo de fmeas

(FERRARA, 1999). A vasculognese consiste no processo de diferenciao in situ

de clulas mesenquimais em hemangioblastos, precursores das clulas

endoteliais. Por outro lado, angiognese a formao de novos vasos sanguneos

a partir de um endotlio pr-existente (ONG et al., 2000).Em clulas epiteliais, o VEGF um fator altamente mitognico (KAMAT et

al., 1995), capaz de promover o aumento da vasodilatao e da permeabilidade

vascular (FAVIER & CORVOL, 2001). No ser humano, j foram identificadas cinco

isoformas independentes, resultantes de um nico gene, que diferem entre si pelo


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peso molecular (STACKER & ACHEN, 1999). O VEGF capaz de induzir a

angiognese, bem como a permeabilizao dos vasos sanguneos, controlando a

vasculognese, e a sua expresso anormal contribui para a formao de tumores,

devido o estmulo da angiognese, alm de vrias doenas caracterizadas poruma angiognese anormal. Desta forma, sua inibio compromete o

desenvolvimento de uma variedade de tumores (NEUFELD, 1999).

A ao do VEGF regulada por dois receptores tirosina-quinase: receptor 1

para VEGF (VEGFR-1 ou Flt-1-Fms-like-tyrosine kinase receptor 1) e receptor 2

para VEGF (VEGFR-2 ou KDR- Kinase insert Domain containing Receptor). O

VEGFR-3 descrito em clulas endoteliais de vasos linfticos (STACKER &

ACHEN, 1999) e em clulas do sincciotrofoblasto (HELSKEet al

., 2001). Aexpresso do receptor Flt-1 foi descrita em clulas endoteliais, clulas

trofoblsticas, moncitos e clulas mesangiais renais, enquanto o receptor KDR,

em clulas endoteliais, clulas tronco hematopoiticas, megacaricitos e clulas

retinais progenitoras (NEUFELD, 1999).

A interao do VEGF com seus receptores ocorre por meio de dois

domnios distintos da molcula de VEGF, localizados em terminaes opostas do

monmero de VEGF, fazendo com que esse arranjo espacial no permita que

molculas mutantes do stio de ligao do VEGFR-1 liguem-se aos stios de

ligao do VEGFR-2 e vice-versa (KEYT et al., 1996). A ativao do KDR pelo

VEGF em clulas desprovidas de VEGFR-1 resulta em resposta mitognica,

enquanto a ativao do VEGFR-1 em clulas desprovidas de KDR no induz a

proliferao celular. Porm, a ativao de VEGFR-1 pelo VEGF induz migrao

celular, resposta tambm verificada na ativao do KDR (ZIMMERMANN et al.,

2001).

Em bovinos, a expresso do sistema VEGF segue uma distribuio espao-temporal ao longo da gestao. Nos estgios iniciais, existe uma maior expresso

de receptores KDR, enquanto nos estgios finais h uma maior evidncia de

receptores Flt-1. Adicionalmente, clulas mesenquimais, precursoras de clulas

endoteliais nas membranas fetais, so imuno-marcadas para KDR, mas no para


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Flt-1, sugerindo, portanto, que a interao VEGF-KDR o principal sinal durante a

angiognese placentria inicial, enquanto a interao VEGF-Flt-1 mostra-se mais

importante na regulao e manuteno da integridade dos vasos, durante os

estgios inicias da gestao (DANTZER et al., 2000).Acerca da expresso do VEGF em placentas ovinas, Cheung et al. (1995)

verificaram que o seu cDNA altamente homlogo sequncia bovina, diferindo

em apenas um aminocido com relao sequncia humana. Cheung & Brace

(1999) e Bogic et al. (2000; 2001) ao analisarem a expresso do VEGF e seus

receptores na placenta ovina, crion e mnion, ao longo da gestao e os

correlacionarem com o padro de vascularizao e permeabilidade

intramembranosa, verificaram que os nveis de RNAm do VEGF aumentaramsignificativamente a partir do 60 dia at o 140 dia da gestao, tendo o VEGF164

como sendo a molcula mais expressa. Quanto aos receptores, estes autores

relataram que o KDR foi primariamente expresso no mnion e no crion, e o Flt-1

em menor nvel, sugerindo que a expresso do VEGF e seus receptores,

conforme o avano da gestao, so importantes na vascularidade e

permeabilidade e, desta forma, na capacidade de troca intramembranosa.

2.5 Consideraes sobre o Lactognio Placentrio Bovino (bLP)

Muitas espcies secretam um hormnio protico de origem placentria que

possui homologia estrutural e funcional com o hormnio do crescimento e a

prolactina. Inicialmente, foi denominado como somatotrofina corinica, mas

comumente denominado de lactognio placentrio. Dentre suas funes, observa-

se sua influncia na mamognese, lactognese, esteroidognese (ovariana e

placentria) e alterao no metabolismo materno para acomodar o crescimento e

desenvolvimento do feto (PATEL et al., 1996; SPENCER et al.,1999).A secreo de promotores de crescimento pela placenta regulada

diferentemente a partir da produo de componentes similares, regulados pela

interao materno-fetal. A duplicao gnica um dos mecanismos que

facilitaram a atividade endcrina placentria. A duplicao do gene codificador de


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prolactina em ruminantes resultado da formao de genes placentrios

especficos, relacionados prolactina, incluindo o gene codificador de LP

(GOOTWINE, 2004). Outros mecanismos que suportam a atividade endcrina

especfica da placenta so rearranjos alternativos (splices) do RNAm, levando produo de elementos placentrios regulatrios (CROSS et al., 2002), bem como

o silenciamento de alelos maternos ou paternos, por meio de imprinting

genmico (TILGHMAN, 1999).

Patel et al. (2004) verificaram que a expresso do gene codificador de LP

apresentou-se de forma diferenciada conforme o estgio da gestao,

demonstrando maior nvel nas membranas fetais do que em regies uterinas. Em

ovinos, Kappes (1992) ao estudar a expresso, quantificao e localizao celulardo RNAm do LP durante a metade e final da gestao, observou um aumento no

tecido cotiledonrio de 15,4 pg/g total de RNAm, no 60 dia, para 73 pg/g, no

120 dia de gestao.

Durante o perodo de pr-implantao e implantao, vrias alteraes

celulares e moleculares, promovidas geneticamente, garantem o alongamento da

vescula embrionria, contato clula-clula entre tero-embrio e placentao.

Neste perodo, Ushizawa et al. (2004), analisando 1773 genes, informaram que a

maioria dos genes possui uma maior expresso neste perodo, enfatizando que

molculas produzidas por clulas trofoblsticas, como LP, Interferon-tau (IFN) e

molculas de adeso, desempenham um papel fundamental na placentao, uma

vez que suas expresses estejam intensificadas.

O LP, em ruminantes, pertence ao grupo das somatotropinas, transcritos

por genes da famlia da prolactina, sintetizados e secretados pelas clulas

binucleadas trofoblsticas no tecido materno. Sua estrutura possui maior

identidade com a molcula de prolactina do que a somatotropina, embora tenhaafinidade tanto por receptores lactognios, quanto somatognicos. O peso

molecular do LP ovino e caprino de aproximadamente 23 kDa, enquanto o

bovino de 31kDa a 34kDa, devido a glicosilao, e sua concentrao na

circulao fetal diminui conforme o avano da gestao, com seu pico mximo na


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circulao materna no ltimo tero, alcanando uma fase de plat (BYATT et al.,

1992).

A molcula de LP caracterizada por mltiplas isoformas, contendo

nitrognio e oxignio ligados aos oligossacardeos (BECKERS, et al., 1998). Emestudos envolvendo a estrutura do gene codificador de LP, e os rearranjos

alternativos dos transcritos, constatou-se substituies de nucleotdeos em onze

posies diferentes. Dentre os cinco xons que compem o RNAm do LP, a

deleo do xon III no afetou a leitura da fita de RNA, mas gerou um novo grupo

carboxila junto terminao 5 do xon IV, oferecendo placenta bovina a

capacidade de expressar mais de um tipo de LP, aumentando a possibilidade de

hormnios com propriedades biolgicas distintas (KESSLER & SCHULER, 1991).A sntese do LP ocorre a partir de um pr-pr-hormnio de 236

aminocidos, tendo como produto final uma molcula diferente dos hormnios

pituitrios, bem como o LP de primatas e roedores, apresentando 51% de

similaridade com a sequncia de aminocidos da prolactina bovina e 2% com o LP

humano (SCHULER et al., 1988). Com relao ao seu modo de interao, as

molculas de LP atuam pela ativao de receptores de prolactina (PRLR) ou pela

heterodimerizao dos receptores do hormnio somatotrfico (GHR) e PRLR, sem

perda do seu efeito biolgico, pois a existncia transitria do complexo

heterodmero suficiente para iniciar a transduo do sinal, de acordo com a sua

meia-vida e o tempo de interao com o receptor (GERTLER & DJIANE, 2002).

A deteco do lactognio placentrio em ovinos foi verificada aos 16 dias

de gestao, coincidindo com o aparecimento das clulas binucleadas

trofoblsticas (confirmando a produo do LP pelas BNCs) e o incio do processo

de implantao. Em bovinos, a deteco do LP tambm coincide com o

aparecimento das BNCs, no entanto, antes do incio do processo de implantao,sugerindo pois, sua participao no somente no processo luteotrpico, mas

tambm durante o incio da implantao embrionria (FLINT et al., 1979).

Em bovinos, a concentrao plasmtica do LP varia significativamente

conforme os estgios da gestao, apresentando-se baixa nos dois primeiros


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trimestres (0,2 0,1 ng/mL), aumentando rapidamente (1,2 0,2 ng/mL), atingindo

seu pico entre os dias 200-220 da gestao, independentemente da fmea possuir

um ou dois bezerros (BYATT et al., 1987; PATEL et al., 1996).

O lactognio placentrio pode ser crtico na manuteno da gestao, poisinfluencia na esteroidognese do CL, transporte de gua pelas membranas

placentrias, proliferao endometrial, expresso gnica do receptor de

progesterona, sntese protica e secreo pelo epitlio endometrial (SPENCER et

al., 1999).

Embora a ao biolgica especfica do LP seja incerta, supe-se que esteja

envolvido na regulao de processos fisiolgicos maternos (funo do corpo lteo,

esteroidognese ovariana, desenvolvimento da glndula mamria e regulao dometabolismo intermedirio) e fetais (crescimento e metabolismo fetal, modulao

do metabolismo intermedirio), contribuindo para os ajustes ao longo da gestao,

facilitando o transporte de nutrientes e utilizao pelo feto, pois ao ligar-se nos

receptores de clulas do epitlio glandular uterino, promove o aumento das

secrees constituintes do leite uterino, uma vez que o tero tenha sido

previamente exposto s aes da progesterona e IFN (GALOSY et al., 1991;

PATEL, 1996; SOARES, 2004). Adicionalmente, Anthony et al. (1995) informaram

a importncia do LP na modificao do metabolismo intermedirio no somente

materno, mas tambm fetal, garantindo energia suficiente para o desenvolvimento

fetal em ovinos, bem como, em bovinos, desempenhar uma ao luteotrpica e

estmulo mamognese e lactognese.

A expresso gnica e concentrao protica do LP mostra-se diferenciada

em animais produzidos in vitro (PIV) ou por transferncia nuclear (TN), em

diferentes estruturas placentrias e estgios da gestao, quando comparados a

animais produzidos in vivo (IA). A concentrao do LP no plasma fetal e fluidoalantico apresenta-se elevada nos animais FIV (23,4 12,8ng/mL) e TN (17,9

3,2ng/mL) do que animais IA (2,03 1,5ng/mL), principalmente nos estgios de

pr-implantao e implantao, sugerindo que a manipulao in vitro acarreta em

alteraes na reprogramao gnica, padro de expresso e migrao celular


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(principalmente nas BNCs), causando disfunes no metabolismo placentrio e

transferncia de nutrientes ao feto, o que explica, em parte, a macrossomia

placentria e fetal destes animais (BERTOLINI et al., 2004; PATEL et al., 2004a,

2004b; RAVELICH et al., 2004).Gregoraszczuk et al. (2000) avaliaram a atividade luteotrpica do LP ovino

(oLP) em diferentes dias da gestao e verificaram um efeito direto do oLP entre

os dias 45 e 70 da gestao, sinergismo entre o LP e prostaglandina E2 (PGE2)

na produo de progesterona e um efeito luteoprotetor do oLP contra a ao

luteoltica da PGF2 entre os dias 70 e 95 da gestao.

Os efeitos do lactognio placentrio recombinante bovino (bLPr) sobre o

desenvolvimento de folculos ovarianos e CL foram testados em novilhas, e osresultados demonstraram a ocorrncia de CLs maiores, bem como elevadas

concentraes plasmticas de progesterona, quando comparados aos animais do

grupo controle (LUCY et al.,1994). Desta forma, a avaliao dos principais

produtos de secreo e a dinmica das BNCs direcionam nossas hipteses ao

estudo do mecanismo de manuteno do CL, e portanto da progesterona, aps a

breve atuao do IFN(entre os dias 15 e 18), nos perodos iniciais dagestao.


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3. OBJETIVOS

- Avaliar a participao dos produtos de secreo de culturas enriquecidas com

BNCs sobre a produo de prostaglandina F2 pelas clulas endometriais.

- Avaliar a expresso relativa dos genes codificadores de lactognio placentrio

e VEGF em placentas de animais oriundos de fecundao in vitro, monta

natural ou clonagem por transferncia nuclear.


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4. MATERIAL E MTODOS

4.1. Avaliao da expresso relativa (freqncia de RNAm) dos genescodificadores de LP e VEGF em placentas.

4.1.1 Amostras

O presente trabalho foi composto por 3 grupos (MN-monta natural/controle,

n=9; FIV-fecundao in vitro, n=5; TN-clonagem por transferncia nuclear, n=6).

No tero final da gestao ou imediatamente aps o parto, 3 placentnios de cada

indivduo, de cada grupo, foram assepticamente removidos, preservando-se a

interface materno-fetal, acondicionados em criotubos previamente esterilizados eidentificados, e mergulhados diretamente em recipiente contendo nitrognio

lquido, sendo posteriormente armazenados em freezer 80C, at o momento da

extrao do RNA.

As amostras das placentas oriundas de animais clonados pela tcnica de

TN foram gentilmente cedidas pelos Prof. Drs. Joaquim Mansano Garcia (FCAV

UNESP, Cmpus de Jaboticabal - SP), Jos Antnio Visintin (FMVZ USP,

Cmpus So Paulo - SP) e Flvio Vieira Meirelles (FZEA USP, Cmpus de

Pirassununga - SP).

As amostras das placentas de animais FIV foram obtidas a partir de

gestaes oriundas de embries produzidos no laboratrio de FIV do Depto. de

Medicina Veterinria Preventiva e Reproduo Animal FCAV UNESP.

As amostras das placentas provenientes de animais produzidos in vivo

foram obtidas em Frigorfico, situado no municpio de Taquaritinga-SP.

A avaliao da expresso gnica foi realizada pelo mtodo de PCR em

tempo real, uma vez que a transcrio reversa seguida pela reao em cadeia dapolimerase representa uma poderosa ferramenta para deteco e quantificao de

RNAm (PFAFFL et al., 2002). O mtodo empregado para determinao da

expresso relativa foi baseado na razo entre a expresso do gene-alvo (LP e/ou


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VEGF) e o gene de referncia, ou controle endgeno (GAPDH), expresso pela

seguinte equao, descrita por Pfaffl et al. (2001):

Equao 1: )(

)(

)(

)(

)( amostracontroleCtref

amostracontroleCt

alvo

ref

alvo

E

E

RRazo

= ,

onde E= eficincia da reao; Ct= ponto de cruzamento na curva de

amplificao pela linha de threshold (linha arbitrria situada na fase exponencial);

= diferena entre amostra desconhecida versus o controle.

4.1.2 Extrao do RNA total (Apndice 1)

A extrao do RNA foi desenvolvida a partir do mtodo fenol-clorofrmio,

utilizando-se o reagente Trizol (Invitrogen, USA), seguindo o protocolo

recomendado pelo fabricante. Aps a extrao, o RNA obtido foi ressuspendido

em 50L de gua tratada com DEPC, encubado a 60C por 5 minutos e

quantificado em biofotmetro (Eppendorf Biophotometer 6231, Germany) -

absorbncia a 260nm/280nm, anterior reao da transcrio reversa.

4.1.3 Sntese de cDNA pela reao de transcrio reversa (RT-PCR)

Uma alquota de 3L de RNA total foi utilizada na sntese do DNA

complementar (cDNA). A sntese foi promovida pela enzima transcriptase reversa

ImProm II (Promega, USA), utilizando-se como primer um oligonucleotdeo poli-T

(Oligo dT primer, Invitrogen, USA).

Em tubos plsticos de 200L, uma mistura contendo 3L de RNA total, 1L

de gua-DEPC e 1L de oligo dT (0,5 g/L) foram incubadas a 70C por 5

minutos. Em seguida foi adicionado o segundo mix da reao contendo 4L de

tampo 5X, 2,4L de MgCl2 (1,2mM), 1L (40 U/L) de inibidor de RNAse (RNAse

OUT, Invitrogen, USA), 1L de dNTPs (25mM), 1L (200 U/L) de enzima

transcriptase reversa. As amostras foram ento transferidas ao termociclador (MJ

PTC-100, MJ Research Inc, USA) permanecendo por 4C / 5 minutos; 25C / 5


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minutos; 42C / 60 minutos e 70C / 15 minutos. Ao final, as amostras de cDNA

foram armazenadas em congelador a 20C, anterior reao de PCR, especfica

para cada gene.

4.1.4 Caracterizao da expresso dos genes com PCR em tempo real

As anlises de PCR em tempo real foram performadas utilizando o sistema

de deteco ABI Prism 7500 e tecnologia TaqMan (Applied Biosystems). O

desenho dos primers e das sondas utilizados (Apndice 3) foram gentilmente

fornecidos pelo Prof. Dr. Marcelo Bertolini (Universidade da Califrnia, Davis,

EUA) (Apndice 3). Para quantificao do VEGF, procedeu-se uma reao do tipo

singleplex, enquanto para o LP e GAPDH, otimizou-se em uma reao do tipomultiplex. Todas as reaes foram preparadas utilizando-se TaqMan PCR

Universal Master Mix (Applied Biosystems), contendo 10mM Tris-HCl (pH 8,3),

50mM KCl, 5mM MgCl2, 2,5mM dNTPs, 0,625U AmpliTaq Gold DNA polymerase

por reao, 0,25U AmpErase UNG por reao, 1,8M de cada primer, 0,5M de

cada sonda e 1L de cDNA diludo (equivalente a 600ng/L de cDNA) e gua

q.s.p. 10L. As condies de amplificao foram: estgio 1 50C/2min. (1 ciclo);

estgio 2 95C/10min. (1 ciclo); estgio 3 95C/15seg. e 60C/1min. (45

ciclos). A quantificao final foi realizada utilizando o mtodo de comparao de

Ct, baseando-se na equao 1, descrita por Pfaffl et al. (2001), que considera as

diferentes eficincias de reao para cada gene. A eficincia (E) das reaes para

cada um dos genes foi calculada mediante a reao de triplicatas para cada uma

das diluies do cDNA (1; 1:10 e 1:100), utilizando-se a equao 2:

Equao 2:1)(10= sE , onde s= inclinao da reta.

Para confirmao da amplificao, o produto de PCR foi submetido eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etdio.


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4.1.4.1 Anlise estatstica

As diferenas entre os grupos foram comparadas a partir de um teste no

paramtrico de modo pareado fixo de relocao ao acaso (Pair Wise FixedReallocation Randomisation Test), descrito por Pfaffl et al.(2002), considerando-

se p< 0,05 como nvel de significncia.

4.2. Radioimunoensaio para dosagem de PGF2 em meio de cultura.Baseado na metodologia descrita por BERTAN (2004), clulas BEND foram

mantidas em cultivo em meio completo HAM F-12 (40%) e 40% de Minimum

Essential Medium (MEM, Sigma M0643), suplementado com 10% v/v de SoroFetal Bovino (FBS, Gibco Life, 10270-106); 10% v/v de Soro Eqino (Nutricel); 1%

v/v de soluo antibitica e antimictica (Sigma A7292) e 200UI de insulina/L

(I5500), mantidas em incubadoras contendo 5% de CO2 em ar, a 38C e umidade

saturada.

Uma suspenso de 2 x 105 clulas foi semeada em poos de placas de

poliestireno at a atingirem confluncia de 90%. Em seguida as clulas foram

mantidas em meio sem soro por 24 horas, lavadas no mesmo meio duas vezes e

incubadas por 6 horas em 1mL de meio condicionado, obtido a partir de culturas

de clulas BNCs, mantidas em cultivo por 15 dias, conforme protocolo descrito por

Landim Jr. (2002).

Para anular o efeito de uma provvel interao entre os diferentes meios de

cultura utilizados (DMEM 10%SFB BNCs e HAM F-12 suplementado BEND)

procedeu-se uma centrifugao tanto do meio condicionado quanto do meio no

condicionado em um aparato de Centricom 20 a 3000 x g durante 45 minutos a

4C e, novamente, a 1500 x g durante 2 minutos a 4C para recuperao domaterial retido na membrana, o qual foi ressuspendido em mesmo volume inicial

com meio HAM F-12 completo, sem soro (MCSS).


55/100

35

Em cada poo da placa de cultivo de clulas BEND os tratamentos foram

dispostos aleatoriamente, na presena ou ausncia de estimulador de sntese de

PGF2, PDBu, para cada uma das diluies do meio condicionado.

A

B

C

D

Figura 3. Disposio dos tratamentos na placa de cultivo de clulasBEND (Linha A: meio de cultura sem soro, com e sem

estimulador PDBu X; Linha

Tese - Lorivaldo

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