Terapeutilised humaniseeritud antikehad CD45 isovormide vastu · abistajarakkudest võivad toimida otse või kaudselt, s.o assisteerides efektori 20 tsütotoksilisi T-rakke või B-rakke,

EE - EP1664122 B1

Terapeutilised humaniseeritud antikehad CD45 isovormide vastu

TEHNIKAVALDKOND

Antud leiutises käsitletakse orgaanilisi ühendeid, et siduda molekule CD45

antigeeni isovormide vastu, näiteks monokloonsete antikehade vastu, ning nende

ühendite kasutamist. 5

TEHNIKA TASE

Leiutise teostusnäidetes käsitletakse muuhulgas erinevate haiguste ravi, mille

eesmärk on kõrvaldada või inaktiveerida patogeensed leukotsüüdid, ja võimalusel

indutseerida tolerantsus, et inaktiveerida patoloogilised immuunvastused.

Elundi, rakkude ja koe siirdamisele järgnev organismipoolne äratõukereaktsioon ja 10

mitmed autoimmuunhaigused on arvatavalt peaasjalikult tingitud T-raku

vahendatud immuunvastusest, mille käivitavad T-abistajarakud, mis tunnevad ära

spetsiifilised antigeenid, mis seejärel kinni püütakse, töödeldakse ja esitatakse T-

abistajarakkudele antigeeni esitava rakkude (APC), näiteks makrofaagide ja

dendriitrakkude poolt antigeen-MHC kompleksi kujul, s.o T-abistajarakku, kui see 15

tunneb ära spetsiifilised antigeenid, stimuleeritakse tootma tsütokiine, näiteks IL-2,

ja ekspresseerima või üles reguleerima tsütokiini retseptoreid ja muid

aktiveerimise molekule, ning seeläbi prolifereeruma. Mõned neist aktiveeritud T-

abistajarakkudest võivad toimida otse või kaudselt, s.o assisteerides efektori

tsütotoksilisi T-rakke või B-rakke, et hävitada rakke või kudesid, mis 20

ekspresseerivad valitud antigeeni. Pärast immuunvastuste lõppemist võivad teatud

küpsed klooniliselt valitud rakud jääda mälu aitavateks ja mälu tsütotoksilisteks T-

rakkudeks, mis ringlevad kehas ja tunnevad kiiresti ära vastava antigeeni, kui see

peaks taas ilmuma. Kui seda vastust käivitav antigeen on ohutu antigeen, on

tulemuseks allergia, kui antigeen ei ole aga võõrantigeen, vaid oma-antigeen, võib 25

tulemuseks olla autoimmuunhaigus; kui antigeeniks on siirdatud elundist pärinev

antigeen, võib tulemuseks olla transplantaadi äratõukereaktsioon.

Immuunsüsteem on arenenud selliselt, et on võimeline eristama oma ja mitte-oma.

See omadus võimaldab organismil jääda ellu keskkonnas, kus puututakse

EE - EP1664122 B1 2

igapäevaselt kokku patogeenidega. Selline spetsiifilisus mitte-oma suhtes ja

tolerants oma suhtes tekib T-rakkude välja kujunemisel harkelundis positiivse ja

negatiivse valiku protsesside kaudu, mis hõlmab samuti autoreaktiivsete T-

rakkude ära tundmist ja kõrvaldamist. Sellist tolerantsi tüüpi nimetatakse

tsentraalseks tolerantsiks. Ent mõned neist autoreaktiivsetest rakkudest pääsevad 5

sellest selektiivsest mehhanismist ja kujutavad endast potentsiaalset ohtu

autoimmuunhaiguste välja kujunemisel. Et kontrollida autoreaktiivseid T-rakke, mis

on pääsenud perifeeriasse, on immuunsüsteemil perifeersed reguleerivad

mehhanismid, mis kaitsevad organismi autoimmuunsuse eest. Need mehhanismid

on perifeerse tolerantsi aluseks. 10

Rakupinna antigeenid, mille tunnevad ära spetsiifilised monokloonsed antikehad,

on märgitud üldise CD (diferentseerumisklastri) numbriga, mis on määratud

järjestikustes rahvusvahelistes leukotsüüdialastes töötubades, ning käesolevas

kasutatud termin CD45 tähendab rakupinna leukotsüüti tavalist antigeeni CD45;

ning selle antigeeni monokloonne antikeha kannab vastavalt nimetust „anti-CD45“. 15

Antikehad, mis on suunatud leukotsüüdi tavalise antigeeni (LCA) või CD45 vastu,

on anti-lümfotsüüdi globuliini (ALG) põhikomponendiks. CD45 kuulub

transmembraansete türosiinfosfataaside perekonda ja on raku aktiveerimise

seisukohalt nii positiivne kui ka negatiivne reguleerija, sõltuvalt retseptori

vastastoimest. CD45 fosfataasi aktiivsust on tarvis, et aktiveerida Src perekonna 20

kinaasid, mis seostatakse B ja T lümfotsüütide antigeeni retseptoritega

(Trowbridge IS et al, Annu Rev Immunol. 1994; 12:85-116). See on CD45 T-raku

aktiveerimisel hädavajalik signaali 1 suhtes ning CD45-puudulikel rakkudel

ilmnevad tõsised puudused TCR-vahendatud aktiveerimistel.

CD45 antigeen esineb erinevates isovormides, hõlmates transmembraansete 25

glükoproteiinide perekonda. CD45 mitmed isovormid erinevad oma rakuvälise

domääni struktuuri poolest, mis on tingitud kolme varieeruva eksoni alternatiivsest

splaissimisest, mis kodeerivad osa CD45 rakuvälisest piirkonnast (Streuli MF. et

al, J. Exp. Med. 1987; 166: 1548-1566). CD45 erinevatel isovormidel on erinevad

rakuvälised domäänid, aga samad transmembraansed ja tsütoplasma segmendid, 30

millel on kaks homoloogset, äärmiselt konserveerunud fosfataasi domääni, mis

koosnevad ligikaudu 300 jäägist. Erinevaid isovormi kombinatsioone

EE - EP1664122 B1 3

ekspresseeritakse T- ja B-lümfotsüütide alampopulatsioonides (Thomas ML. et al,

Immunol. Today 1988; 9:320-325). Teatud monokloonsed antikehad tunnevad ära

epitoobi, mis on ühine kõigile neile erinevatele isovormidele, samal ajal kui teistel

monokloonsetel antikehadel on piiratud (CD45R) spetsiifilisus, mis sõltub sellest,

millist alternatiivselt splaissitud eksonitest (A, B või C) nad ära tunnevad. Näiteks 5

kannavad monokloonsed antikehad, mis tunnevad ära ekson A saaduse,

märgistust CD45RA, ning need, mis tunnevad ära erinevad ekson B sisaldavad

isovormid, kannavad märgistust CD45RB (Beverley PCL et al, Immunol. Supp.

1988; I:3-5). Antikehad, näiteks UCHL1, mis seostuvad selektiivselt 180 kDa

isovormiga CD45RO (ilma varieeruvate eksoniteta A, B või C), mis näib piirduvat 10

aktiveeritud T-rakkude allrühmaga, mälurakkudega ja kortikaalsete

tümotsüütidega, ja mida ei deleteerita B-rakkudel (Terry LA et al, Immunol. 1988;

64:331-336).

WO 2002/072832 käsitleb monokloonseid antikehi (mAbs), mis on spetsiifilised

epitoobi suhtes nii CD45RB kui ka CD45RO antikehadel, nende kasutamist ravis 15

autoimmuunhaiguste ja transplantaatide äratõukereaktsioonide korral.

Inimese antikeha varieeruv raske domään võib olla N-glükosüülitud (Dunn-Walters

D. et al, Molecular Immunology 2000; 37:107-113). Somaatilise

hüpermutatsiooniga kaasneb valdavalt ühe nukleotiidi asendus varieeruva

piirkonna geenides, et tõsta immuunglobuliini varieeruvust. 20

On teada, et N-glükosilatsioon varieeruvas piirkonnas mõjutab antigeeni sidumist.

Siiski on teada, et aglükosüülitud monokloonsed antikehad kaotavad bioloogilist

funktsiooni säilitades igal glükosüülimisel oma negatiivseid kõrvaltoimeid (Friends

P. et al, Transplantation 1999, 68; 1632-1687)

JOONISTE LOETELU 25

Joonisel fig. 1 on kujutatud, et primaarse MLR inhibeerimine „kandidaat

monokloonse antikeha poolt on doosist sõltuv vahemikus 0,001 kuni 10 µg/ml.

„Kontsentratsioon“ on „kandidaat monokloonse antikeha“ kontsentratsioon.

EE - EP1664122 B1 4

Joonisel fig. 2 on kujutatud ekspressioonivektori HCMV-G1 HuA6-VHQ plasmiidi

plaani, mis hõlmab rasket ahela nukleotiidijärjestusega SEQ ID nr: 12 (3921-4274)

täieliku ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 15.

Joonisel fig. 3 on kujutatud ekspressioonivektori HCMV-G1 HuA6-VHE plasmiidi

plaani, mis hõlmab rasket ahelat, millel on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 11 5

(3921-4274) täieliku ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 16.

Joonisel fig. 4 on kujutatud ekspressioonivektori HCMV-K HuAb-VL1 humV1

plasmiidi plaani nukleotiidijärjestusega SEQ ID nr: 14 (3964-4284) täieliku

ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 17.

Joonisel fig. 5 on kujutatud ekspressioonivektori HCMV-K HuAb-VL1 humV2 10

plasmiidi plaani nukleotiidijärjestusega SEQ ID nr: 13 (3926-4246) täieliku

ekspressioonivektori nukleotiidjärjestuses SEQ ID nr: 18.

Joonisel fig. 6 on kujutatud ekspressioonivektori LCVL1SP20 plasmiidi plaani,

mille kergel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 33 täieliku

ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 36. 15

Joonisel fig. 7 on kujutatud ekspressioonivektori LCVL2SP20 plasmiidi plaani,

mille kergel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 13 täieliku

ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 39.

Joonisel fig. 8 on kujutatud ekspressioonivektori HCVHEN73D Sp20 plasmiidi

plaani, mille raskel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 34 täieliku 20

ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 37.

Joonisel fig. 9 on kujutatud ekspressioonivektori HCVHQN73D Sp20 plasmiidi

plaani, mille raskel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 35 täieliku

ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 38.

Joonisel fig. 10 on kujutatud ekspressioonivektori HCVHESp20 plasmiidi plaani, 25

mille raskel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 11 täieliku

ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 40.

EE - EP1664122 B1 5

Joonisel fig. 11 on kujutatud ekspressioonivektori HCVHQSp20 plasmiidi plaani,

mille raskel ahelal on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 12 täieliku

ekspressioonivektori nukleotiidijärjestuses SEQ ID nr: 41.

Joonisel fig. 12 on kujutatud VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja

VHQ/humV2 ning VHE/humV1 koos VHE-N73D/humV1 suurus-5

eksklusioonkromatograafiat.

Joonisel fig. 13 on kujutatud VHE/humV2, VHE/humV1, VHQ/humV2, VHQ/humV1

ning VHE/humV2 koos VHE-N73D/humV1 katioonvahetuse kromatograafiat.

Joonisel fig. 14 on kujutatud VHE/humV2 ja VHE-N73D/humV1 pöördfaasilist

kromatograafiat. 10

LEIUTISE OLEMUS

Oleme nüüd leidnud humaniseeritud antikeha, millel on sidumise spetsiifilisus nii

CD45RO kui ka CD45 RB suhtes, mis sisaldavad raske ahela varieeruvat

piirkonda SEQ ID nr: 31 või 32 ning kerge ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr:

7 või SEQ ID nr: 8. 15

Teises leiutise teostusnäites käsitletakse humaniseeritud antikeha, millel on

sidumise spetsiifilisus nii CD45RO kui ka CD45RB suhtes ning mis sisaldab:

- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 31 ja kerge ahela varieeruvat

piirkonda SEQ ID nr: 7,

- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 31 ja kerge ahela varieeruvat 20

piirkonda SEQ ID nr: 8,

- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 32 ja kerge ahela varieeruvat

piirkonda SEQ ID nr: 7

- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 32 ja kerge ahela varieeruvat

piirkonda SEQ ID nr: 8. 25

CD45RB/RO humaniseeritud antikeha võib samuti pärssida põletikulist protsessi,

mis vahendab inimese naha äratõukereaktsiooni. Lisaks on leitud, et CD45RO/RB

humaniseeritud antikeha võib pärssida põletikulist protsessi, mis vahendab

inimese naha transplantaadi äratõukereaktsiooni, suutes nimelt suruda maha

EE - EP1664122 B1 6

sellise põletikulise protsessi, mis vahendab inimese naha transplantaadi

äratõukereaktsiooni in vivo SCID hiirtel, kellele on siirdatud inimnahka ja poogitud

mononukleaarseid splenotsüüte.

Ühtlasi on leitud, et CD45RB/RO humaniseeritud antikeha võib tingida

pikemaajalise inimese saarerakkude transplantaadi elumuse, ennetades 5

transplantaadi infiltratsiooni ja inhibeerides leukotsüüdi vahendatud

äratõukereaktsiooni in vivo.

Leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikehad suudavad spetsiifiliselt siduda

CD45 antigeeni CD45RB ja CD45RO isovorme üksi või kombineerituna teiste

molekulidega. Vastav sidestamise reaktsioon on võimalik standardsetel meetoditel 10

(kvalitatiivne test), kaasa arvatud näiteks igasugused sidumistestid, näiteks

kaudne või otsene immunofluorestsents koos fluorestsents-mikroskoopia või

tsütofluoromeetriline (FACS) analüüs, ensüüm-immuunsorbtsioonmeetod (ELISA)

või radioimmuuntest, kus on võimalik visualiseerida molekuli seostumisega

rakkudega, mis ekspresseerivad teatud CD45 isovormi. Lisaks võib selle molekuli 15

sidumine tingida muutuse rakkude funktsioonis, mis neid isovorme

ekspresseerivad. Näiteks võidakse määrata primaarse või sekundaarse

kombineeritud lümfotsüüdi vastuse (MLR) inhibeerimine, kasutades selleks näiteks

in vitro testi või biotesti, et määrata primaarse või sekundaarse MLR inhibeerimine

CD45RO/RB siduva molekuli kohalolekul või puudumisel, ning tuvastades 20

erinevused primaarse MLR inhibeerimisel.

Samuti on in vitro funktsionaalseid moduleerivaid toimeid võimalik mõõta PBMC

või T-rakkude või CD4+ T-rakkude proliferatsiooni, tsütokiinide tootmise meetodil,

muutustega rakupinna molekulide ekspressioonis, näiteks pärast raku

aktiveerimist MLRis, või pärast stimuleerimist spetsiifilise antigeeniga, näiteks 25

teetanus-toksoidi või muude antigeenidega, või polükloonsete stimulaatoritega,

näiteks fütohemaglutiniiniga (PHA) või anti-CD3 ja anti-CD28 antikehadega või

forboolestritega ja Ca2+ jonofooridega. Neid söötmed valmistatakse sarnaselt

meetodiga, mida on kirjeldatud MLR puhul, välja arvatud, et allogeensete rakkude

asemel kasutatakse stimulaatoritena lahustuvaid antigeene või polükloonseid 30

stimulaatoreid, näiteks neid, mida on nimetatud eelnevas. T-rakkude

EE - EP1664122 B1 7

proliferatsiooni mõõdetakse eelistatavalt, nagu kirjeldatud eelnevas, 3H-tümidiini

abil.

Tsütokiini tootmist mõõdetakse eelistatavalt kihilises ELISA analüüsis, kus

tsütokiine haarav antikeha kaetakse pinnal 96-augulisel plaadil, lisatakse

supernatandid rakukultuuridest, ning inkubeeritakse 1 tund toatemperatuuril. 5

Seejärel lisatakse tuvastav antikeha, mis on spetsiifiline teatud tsütokiini suhtes,

ning teise etapi antikeha, mis on konjugeeritud ensüümiga, näiteks mädarõika

peroksidaas, seejärel vastav substraat, ning plaadi lugejas mõõdetakse siinkohal

vastav absorptsioon. Muutuseid rakupinna molekulides mõõdetakse eelistatavalt

otsese või kaudse immunofluorestsentsiga pärast sihtrakkude määrimist 10

antikehadega, mis on spetsiifilised teatud rakupinna molekuli suhtes. Kasutada

võidakse antikeha, mis on kas otseselt fluorokroomiga või fluorestsentsiliselt teise

etapi antikehaga märgistatud, kusjuures viimane on spetsiifiline esimese antikeha

suhtes, ning rakke analüüsitakse tsütofluorimeetriga.

Leiutise humaniseeritud antikehal on sidumise spetsiifilisus nii CD45RO kui ka 15

CD45RB („CD45RB/RO siduv molekul“) suhtes.

Eelistatavalt seob humaniseeritud antikeha CD45RO isovorme

dissotsiatsioonikonstandi (Kd) <20nM juures, eelistatavalt Kd<15nM või <10nM,

veelgi eelistatumalt Kd<5nM juures. Eelistatavalt seob humaniseeritud antikeha

CD45RB isovorme Kd<50nM juures, eelistatavalt Kd<15nM või <10nM, veelgi 20

eelistatavalt Kd<5nM juures.

Samuti käsitletakse leiutises humaniseeritud antikeha, mis seob neid CD45

isovorme, mis

1) sisaldavad CD45 molekuli A ja B epitoope, aga mitte C epitoopi; ja/või

2) sisaldavad CD45 molekuli B epitoopi, aga mitte C epitoopi; ja/või 25

3) ei sisalda CD45 molekuli A, B ega C epitoopi.

Samuti käsitletakse eelistatud teostusnäites ka sellist leiutise molekuli, mis ei seo

CD45 isovorme, milleks on

1) CD45 molekuli kõik A, B ja C epitoobid; ja/või

EE - EP1664122 B1 8

2) CD45 molekuli B ja C epitoobid, aga mitte A epitoop.

Täiendavates eelistatud teostusnäidetes suudab leiutise siduv molekul järgnevat:

1) tunneb ära mälu ja in vivo alloaktiveeritud T-rakud; ja/või

2) seob oma sihtmärgi inimese T-rakkudel, näiteks PEER rakkudel; kus nimetatud

sidumine toimub eelistatavalt Kd<15 nM juures, veelgi eelistatavamalt Kd<10 nM 5

ja kõige eelistatavamalt Kd<5 nM juures; ja/või

3) inhibeerib in vitro alloreaktiivset T-raku funktsiooni, eelistatavalt ligikaudse IC50

väärtuse juures, mis on väiksem kui 100 nM, eelistatavalt väiksem kui 50 nM või

30 nM, veelgi eelistatumalt on ligikaudne IC50 10 või 5 nM, veelgi eelistatumalt 0,5

nM või 10

isegi 0,1 nM; ja/või

4) indutseerib rakusurma apoptoosi kaudu inimese T-lümfotsüütides; ja/või

5) indutseerib alloantigeeni spetsiifilist T-raku tolerantsi in vitro; ja/või

6) ennetab letaalset ksenogeneetilist transplantaat-peremehe-vastu (GvHD)

haigust, mis on indutseeritud SCID hiirtes, süstides neile inimese PBMC, mida 15

manustatakse efektiivses koguses; ja/või

7) seob T-lümfotsüüte, monotsüüte, tüvirakke, loomulikke tapjarakke ja/või

granulotsüüte, aga mitte vereliistakuid ega B-lümfotsüüte; ja/või

8) toetav T-rakkude eristumist iseloomuliku T-regulatoorraku (Treg) fenotüübiga;

ja/või 20

9) indutseerib T-regulatoorrakke, mis suudavad pärssida looduslikku T-raku

aktivatsiooni; ja/või

10) pärsib põletikulist protsessi, mis vahendab inimese naha transplantaadi

äratõukereaktsiooni, pärssides nimelt põletikulist protsessi, mis vahendab inimese

naha transplantaadi äratõukereaktsiooni in vivo SCID hiirtel, kellele on siirdatud 25

inimese nahka ja poogitud mononukleaarseid splenotsüüte; ja/või

11) pikendab inimese saarerakkude transplantaadi elumust hu-PBL-NOD/SCID

hiirte mudelis.

Täiendavas eelistatud teostusnäites seob leiutise humaniseeritud antikeha sama

epitoopi kui mononukleaarne antikeha „A6", nagu kirjeldanud Aversa et al., 30

Cellular Immunology 158, 314-328 (1994).

EE - EP1664122 B1 9

Eelnevalt kirjeldatud sidumisomaduste ja bioloogiliste aktiivsuste tõttu on leiutise

humaniseeritud antikeha eriti kasulik meditsiinis, ravis ja/või profülaktikas.

Haigusteks, mille puhul leiutise humaniseeritud antikeha on eriti kasulik, on

muuhulgas autoimmuunhaigused, transplantaadi äratõukereaktsioon, dermatiit,

põletikuline soolehaigus ja/või allergiad, nagu on kirjeldatud alljärgnevas. 5

Humaniseeritud antikehad võidakse näiteks derivatiseerida antikehadest, mis

saadakse B-rakkude või hübridoomide või nende fragmentide abil, nt F(ab’)2 ja

Fab fragmendid, samuti üksiku ahela või üksiku domääni antikehad. Üksiku ahela

antikeha koosneb raskete ja kergete ahelate varieeruvatest piirkondadest, mis on

kovalentselt seotud peptiidi siduva linkeriga, koosnedes tavaliselt 10 kuni 30 10

aminohappest, eelistatavalt 15 kuni 25 aminohappest. Seega ei hõlma selline

struktuur raskete ja kergete ahelate konstantset osa, ning arvatakse, et väikese

peptiidi speisser peaks olema vähem antigeenne kui terve konstantne osa.

Humaniseeritud antikeha all mõistetakse antikeha, milles hüpervarieeruvad

piirkonnad (CDRid) on mitte-inimese (nt hiire) päritolu, ehkki kogu või sisuliselt 15

kogu muu osa, s.o konstantsed piirkonnad ja varieeruvate piirkondade äärmiselt

konserveerunud osad, on inimpäritolu. Humaniseeritud antikeha võib aga säilitada

mõned hiire järjestuse aminohapped varieeruvate piirkondade osades, mis

külgnevad hüpervarieeruvate piirkondadega.

Hüpervarieeruvad piirkonnad, s.o CDRid vastavalt antud leiutisele, võivad olla 20

seotud raamistiku piirkondadega, näiteks inimpäritolu kergete ja raskete ahelate

konstantsete osadega. Sobivaid raamistiku piirkondi on kirjeldatud näiteks:

„Sequences of proteins of immunological interest", Kabat, E.A. et al, US

Department of Health and Human services, Public Health Service, National

Institute of Health. Eelistatavalt võib inimese raske ahela konstante osa olla IgG1 25

tüüpi, kaasa arvatud alltüübid, eelistatavalt võib inimese kerge ahela konstantne

osa olla k või l tüüpi, veelgi eelistatumalt k tüüpi. Eelistatavalt hõlmab nimetatud

raske ahel mitte enam kui üht glükosüülimise saiti, kõige eelistatumalt on

glükosüülimise saidiks N-glükosüülimise sait ning kõige eelistatumalt paikneb üks

glükosüülimise sait raske ahela konstantses osas. Kõige eelistatumalt ei sisaldu 30

varieeruvas piirkonnas ühtegi glükosüülimise saiti ning eelistatavalt ei sisaldu

glükosüülimise saiti ka raamistiku piirkonnas.

EE - EP1664122 B1 10

Teises aspektis käsitletakse antud leiutises humaniseeritud antikeha, mis hõlmab

- polüpeptiidi SEQ ID nr: 31 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 (näiteks

VHEN73D/humV2),

- polüpeptiidi SEQ ID nr: 31 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 (näiteks

VHEN73D/humV1), 5

- polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 (näiteks

VHQN73D/humV2), või

- polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 (näiteks

VHQN73D/humV1).

„Polüpeptiid“, kui käesolevas pole täpsustatud teisiti, tähendab peptiidi või valku, 10

mis sisaldab aminohappeid, mis on üksteisega ühendatud peptiidsidemetega,

mille aminohappe järjestus algab kaugeimas N-otsas lõpeb kaugeimas C-otsas.

Leiutise polüpeptiid on monokloonne antikeha. Eelistatavalt on see

humaniseeritud (CDR-siirdatud) monokloonne antikeha. Humaniseeritud (CDR-

siirdatud) monokloonne antikeha võib, aga ei pruugi, hõlmata täiendavaid 15

mutatsioone, mis on viidud sisse aktseptori antikeha raamistikku (FR)

järjestustesse. Eelistatavalt sisaldab humaniseeritud antikeha vaid üht

glükosüülimise saiti. Kõige eelistatumalt on nimetatud üheks glükosüülimise

saidiks N-glükosüülimise sait. Kõige eelistatumalt ei sisaldu varieeruvas piirkonnas

ühtegi glükosüülimise saiti ning veelgi eelistatumalt ei sisaldu raske ahela 20

varieeruvas piirkonnas ühtegi glükosüülimise saiti, kõige eelistatumalt ei sisaldu

raamistiku piirkondades (FRid) ühtegi glükosüülimise saiti.

Termin „kovalentne modifikatsioon“ hõlmab leiutise polüpeptiidi modifikatsioone, nt

spetsiifilise järjestuse või selle fragmendi modifikatsioone orgaaniliste valkude või

mitte-valguliste derivatiseerivate ainetega, fusioone heteroloogilistes polüpeptiidi 25

järjestuses ja post-translatsioonilisi modifikatsioone. Kovalentselt modifitseeritud

polüpeptiididel, nt spetsiifilise järjestuse omadel, on endiselt võime siduda

CD45RO ja CD45RB rist-sidestades. Kovalentsed modifikatsioonid viiakse

traditsiooniliselt sisse, reageerides vastavad aminohappe jäägid orgaanilise

derivatiseeriva ainega, mis suudab reageerida valitud saitide või terminali 30

jääkidega, või rakendades post-translatsiooniliste modifikatsioonide mehhanisme,

mis funktsioneerivad valitud rekombinantsetes peremeesrakkudes. Reatud post-

EE - EP1664122 B1 11

translatsioonilised modifikatsioonid on tingitud rekombinantsete peremeesrakkude

toimest ekspresseeritud polüpeptiidile. Glutaminüüli ja asparaginüüli jäägid on

sageli post-translatsionaalselt deamideeritud vastavateks glutamüüli ja aspartüüli

jääkideks. Samuti võidakse neid jääke deamineerida kergelt happelistel

tingimustel. Teisteks post-translatsioonilisteks modifikatsioonideks on muuhulgas 5

proliini ja lüsiini hüdroksüülimine, serüüli, türosiini või treonüüli jääkide hüdroksüüli

rühmade fosforüülimine, lüsiini, arginiini ja histidiini külgahelate α-amino rühmade

metüülimine, vaat nt T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties,

W. H. Freeman & Co., San Francisco, lk 79-86 (1983). Kovalentseteks

modifikatsioonideks on näiteks fusioonproteiinid, mis sisaldavad leiutise 10

polüpeptiidi, näiteks spetsiifilise järjestusega, ja nende aminohappelise järjestuse

variante, näiteks immunoadhesiinid ja N-otsa fusioonid heteroloogilistes

signaaljärjestuses.

„Aminohapped“ tähendab kõiki looduses esinevaid L-α-aminohappeid, näiteks D-

aminohapped. Aminohapped on identifitseeritud kas hästi teada ühetäheliste või 15

kolmetäheliste märgistustega.

Termin „aminohappelise järjestuse variant“ tähistab molekule, mis erinevad oma

aminohappelise järjestuse poolest teistest leiutise polüpeptiididest, nt spetsiifilise

järjestuse poolest. Leiutise polüpeptiidi aminohappelise järjestuse variantidel,

näiteks spetsiifilise järjestusega variantidel, on siiski võime siduda CD45RO ja 20

CD45RB. Asenduslikud variandid on need, mille polüpeptiidist on vähemalt üks

aminohappe jääk eemaldatud ja selle asemele sisestatud teine aminohape, nt

spetsiifilise järjestusega aminohape. Need asendused võivad olla üksikud, kus

vaid üks aminohape on molekulis asendatud, või mitmed, kus kaks või mitu

aminohapet on samas molekulis välja vahetatud. Sisendatavad variandid on 25

sellised, milles on üks või mitu aminohapet sisestatud vahetult aminohappega

külgnevalt teatud asendisse leiutise polüpeptiidis, näiteks spetsiifilises järjestuses.

Aminohappega külgnemine tähendab liitmist kas aminohappe α-karboksü või α-

amino funktsionaalse rühma kaudu. Kustutustega variandid on need, kus leiutise

polüpeptiidis, näiteks spetsiifilise järjestusega peptiidis, on üks või mitu 30

aminohapet eemaldatud. Tavaliselt on kustutustega variantidel üks või kaks

aminohapet eemaldatud molekuli teatud piirkonnast.

EE - EP1664122 B1 12

Antud leiutises käsitletakse ka isoleeritud polünukleotiide, mis kodeerivad leiutise

humaniseeritud antikeha.

Polünukleotiidid hõlmavad polünukleotiide, mis kodeerivad polüpeptiidi SEQ ID nr:

31 või SEQ ID nr: 32 ja/või eelistatavalt polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 või SEQ ID nr: 8;

kodeerides näiteks 5

- polüpeptiidi SEQ ID nr: 31 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 7,

- polüpeptiidi SEQ ID nr: 31 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 8,

- polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 või

- polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 8.

„Polünukleotiid“, kui käesolevas pole märgitud teisiti, tähendab polüribonukleotiidi 10

või polüdeoksüribonukleotiidi, mis võib olla modifitseerimata RNA või DNA või

modifitseeritud RNA või DNA, kaasa arvatud muuhulgas ühe- või kaheahelaline

RNA ja RNA, mis on ühe- ja kaheahelaliste piirkondade segu.

CD45RO/RB humaniseeritud antikeha, mis on kimäärne või humaniseeritud

antikeha, on võimalik toota rekombinantsetel DNA meetoditel. Seega võidakse 15

konstrueerida üks või mitu DNA molekuli, mis kodeerivad CD45RO/RB, asetada

sobivatesse kontrolljärjestustesse ja sisestada sobivasse peremeesorganismi, et

neid ekspresseerida sobiva vektori abil.

Samuti käsitletakse antud leiutises polünukleotiidi, mis kodeerib leiutise

CD45RO/RB humaniseeritud antikeha üht, rasket ja/või kerget ahelat; ja leiutise 20

polünukleotiidi kasutamist, et toota leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha

rekombinantsetel tehnikatel.

CD45RO/RB siduv molekul võidakse saada vastavalt, nt analoogselt, meetodiga,

mis on konventsionaalne, rakendades käesolevas toodud informatsiooni, nt teavet

hüpervarieeruvate või varieeruvate piirkondade aminohappe järjestustest ja neid 25

piirkondi kodeerivatest polünukleotiidi järjestustest. Meetodit varieeruva domääni

geeni konstrueerimiseks on kirjeldatud nt EP 239 400 ning selle võib lühidalt kokku

võtta järgmiselt: Geeni, mis kodeerib mis tahes spetsiifilisusega monokloonse

antikeha varieeruvat piirkonda, on võimalik kloonida. Määratakse DNA segmendid,

mis kodeerivad raamistiku ja hüpervarieeruvaid piirkondi, ning eemaldatakse DNA 30

EE - EP1664122 B1 13

segmendid, mis kodeerivad hüpervarieeruvaid piirkondi. Kaheahelalised

sünteetilised CDR kassetid valmistatakse DNA sünteesis vastavalt CDR ja CDR’

järjestustele, nagu käesolevas täpsustatud. Neil kassettidel on kleepuvad otsad, et

neid oleks võimalik ligeerida inimpäritolu soovitud raamistiku ühendustes.

Polünukleotiide, mis kodeeriva üheahelalisi antikehi, võidakse valmistatakse 5

vastavalt, näiteks analoogselt, konventsionaalsetele meetoditele. Nii valmistatud

leiutise polünukleotiid võidakse sisestada vastavasse ekspressioonivektorisse.

Sobivaid rakuliine on võimalik leida vastavalt, näiteks analoogselt,

konventsionaalsetele meetoditele. Ekspressioonivektorid, mis sisaldavad näiteks

sobivaid promootoreid ja geene, mis kodeerivad raske ja kerge ahela konstantseid 10

osi, on teada, näiteks kaubanduslikult saadavad. Sobivad peremeesorganismid on

teada või leitavad vastavalt, näiteks analoogselt, konventsionaalsetele

meetoditele, ning hõlmavad rakukultuuri või transgeenseid loomi.

Samuti käsitletakse antud leiutises ekspressioonivektorit, mis sisaldab leiutise

polünukleotiide, kus vektor suudab toota humaniseeritud antikeha, kui nimetatud 15

vektor paikneb vastavas peremeesrakus.

Teises leiutise aspektis käsitletakse isoleeritud peremeesrakku, mis sisaldab

ekspressioonivektorit, mis suudab toota humaniseeritud antikeha. Oleme samuti

leidnud, et leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha inhibeerib

autoimmuunvastuseid doosist sõltuval moel, nagu määratud in vitro MLR. Need 20

tulemused näitavad, et rakud, mis on alloaktiveeritud leiutise CD45RO/RB

humaniseeritud antikeha kohalolekul, on puudulikud oma vastustes alloantigeeni

suhtes. See kinnitab täheldust, et leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha

võib toimida otse efektori alloreaktiivsetele T-rakkudele ja moduleerida nende

funktsiooni. Lisaks uuriti primaarsest MLR tuletatud T-rakkude funktsionaalseid 25

omadusi veel restimuleerimise katsetes sekundaarses MLR, kasutades spetsiifilisi

stimuleerivaid rakke või kolmanda poole stimulaatoreid, et hinnata täheldatud

funktsionaalsete toimete spetsiifilisust. Oleme leidnud, et rakkudel, mis on

derivatiseeritud primaarsetest MLRidest, kus sisaldub leiutise CD45RO/RB

humaniseeritud antikeha, oli pärsitud võimet vastata järgnevalt optimaalsele 30

stimuleerimisele spetsiifilise stimulaatorrakkudega, ehkki sekundaarsetele

kultuuridele ei lisatud ühtegi antikeha. Järgneva inhibeerimise spetsiifilisust

EE - EP1664122 B1 14

demonstreeriti leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikehaga töödeldud rakkude

võimega vastata normaalselt stimulaatorrakkudele mitte-seotud kolmanda poole

doonoritelt. Restimuleerimise katsed, kasutades T-rakke, mis on derivatiseeritud

primaarsetest MLR kultuuridest, näitavad seega, et rakud, mis eelnevalt

alloaktiveeritakse leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikehaga, on 5

hüporeageerivad, s.o tolerantsed esialgse alloantigeeni suhtes. Täiendavaid

bioloogilisi aktiivsusi on kirjeldatud näidetes 7 ja 9 kuni 13.

Samuti oleme leidnud, et proliferatsiooni rakkudes, mida on eelnevalt töödeldud

leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikehaga, on võimalik päästa eksogeense

IL-2. See näitab, et alloreaktiivsete T-rakkude töötlemine leiutise CD45RO/RB 10

humaniseeritud antikehaga indutseerib tolerantsuse seisundi. Nimelt olid langenud

proliferatiivsed vastused, mida täheldati leiutise CD45RO/RB humaniseeritud

antikehaga töödeldud rakkudes, tingitud T-raku funktsiooni halvenemisest, ning

need rakud suutsid reageerida eksogeensele IL-2, osutades sellele, et need rakud

on anergilises, tõeliselt mittereageerivas olekus. Selle vastuse spetsiifilisust näidati 15

rakkude suutlikkusega, mida töödeldi leiutise CD45RO/RB humaniseeritud

antikehaga, vohada normaalselt mitte-seotud doonori rakkudes kontrolliga

töödeldud rakkude tasemeni.

Lisaks näitavad katsed, et leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha

seostumine CD45RO ja CD45RB võib inhibeerida perifeerse vere 20

mononukleaarsete rakkude (PBMC) mälu vastuseid, millised rakud pärinevad

spetsiifilise recall-antigeeniga immuniseeritud doonoritelt. Leiutise CD45RO/RB

humaniseeritud antikeha seostumine CD45RO ja CD45RB on seega samuti

efektiivne mälu vastuste inhibeerimisel lahustuva antigeeni osas. Leiutise

CD45RO/RB humaniseeritud antikeha võimet inhibeerida meenutus-(recall)-25

vastuseid teetanuse suhtes PBMC rakkudes, mis pärinevad immuniseeritud

doonoritelt, näitavad, et leiutise CD45RO/RB siduv molekul suudab sihtida ja

moduleerida mälu T-rakkude aktiveerimist. Need andmed näitavad muuhulgas, et

leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha suudab lisaks alloreaktiivsete ja

aktiveeritud T-rakkudele ära tundmisele moduleerida ka nende funktsiooni, mille 30

tulemusena indutseeritakse T-raku anergia. See omadus võib osutuda oluliseks

kujunevate immuunvastuste ravis, mis on tekkinud vastuseks autoantigeenidele ja

EE - EP1664122 B1 15

allergeenidele ning võimalikult ka alloantigeenidele, nagu seda on täheldatud

autoimmuunhaiguste, allergia ja krooniliste äratõukereaktsioonide ning muudegi

haiguste, näiteks psoriaasi, põletikulise soolehaiguse puhul, kus mälu vastused

etendavad rolli haigusseisundi hoidmisel. See on arvatavalt oluliseks aspektiks

haigussituatsioonis, näiteks autoimmuunhaiguse korral, kus mälu vastused 5

autoantigeenide suhtes mängivad olulist rolli haiguse alal hoidmisel.

Oleme samuti leidnud, et leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha võib

moduleerida T-rakud proliferatiivseid vastuseid kombineeritud lümfotsüüdi

vastuses (MLR) in vivo, s.o leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikehal on

avastatud vastavad inhibeerivad omadused in vivo testimisel, näiteks letaalse 10

ksenogeneetilise transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haiguse ennetamine või

põletikuliste protsesside maha surumine, mis vahendavad inimese naha

transplantaadi äratõukereaktsiooni SCID hiirte mudelites, või inimese

saarerakkude transplantaadi elumuse pikendamine hu-PBL-NOD/SCID hiire

mudelis. 15

Leiutise CD5RO/RB humaniseeritud antikehal võivad seega olla

immunosupressiivsed ja tolerogeensed omadused ning see võib olla kasulik

tolerantsi in vivo ja ex vivo indutseerimiseks alloantigeenide, autoantigeenide,

allergeenide ja bakteriaalse floora antigeenide suhtes, nt võib leiutise CD45RO/RB

humaniseeritud antikeha olla kasulik, et ravida ja ennetada haigusi, sealhulgas 20

autoimmuunhaigusi, näiteks muuhulgas reumatoidartriiti, psoriaatilist artriiti,

autoimmuunset türeoidiiti, Gravesi tõbe, I ja II tüübi diabeeti, polüskleroosi, Crohni

tõbe (CD), haavandilist koliiti (UC), süsteemset erütematoosset luupust, Sjögreni

sündroomi, sklerodermiat, autoimmuunset gastriiti, glomerulonefriiti, transplantaadi

äratõukereaktsiooni, näiteks muuhulgas elundi ja koe transplantaadi 25

äratõukereaktsiooni, näiteks, et ravida transplantaadiga patsienti südant, kopsu, nii

südant kui kopsu, maksa, neeru, kõhunääret, nahka või sarvkesta, samuti

transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haigust, näiteks pärast luuüdi siirdamist

ja/või pankrease saarerakkude transplantaadi äratõukereaktsiooni ja/psoriaasi,

dermatiiti, näiteks atoopilist ja kontaktdermatiiti, kaasa arvatud allergilist 30

kontaktdermatiiti, põletikulist soolehaigust ja/või allergiaid, kaasa arvatud allergilist

astmat.

EE - EP1664122 B1 16

Samuti käsitletakse käesoleva teostusnäidetes leiutise CD45RO/RB

humaniseeritud antikeha kasutamist ravimina.

Samuti käsitletakse käesolevas leiutise humaniseeritud antikeha kasutamist, et

ravida ja/või ennetada autoimmuunhaigusi; transplantaadi äratõukereaktsiooni,

psoriaasi, dermatiiti, põletikulist soolehaigust ja/või allergiaid. 5

Samuti käsitletakse käesolevas leiutise humaniseeritud antikeha kasutamist, et

ravida ja/või ennetada transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haigust.

Samuti käsitletakse antud leiutises humaniseeritud antikeha kasutamist, et

valmistada ravimeid ravimaks pankrease saarerakkude transplantaadi

äratõukereaktsiooni. 10

Samuti käsitletakse käesolevas meetodit haiguse ravimiseks ja/või ennetamiseks,

millisteks haigusteks on muuhulgas autoimmuunhaigused, transplantaadi

äratõukereaktsioon, psoriaas, dermatiit, põletikuline soolehaigus ja/või allergiad,

mis hõlmavad sellist ravi ja/või profülaktikat vajavale patsiendile efektiivses

koguses leiutise GD45RO/RB humaniseeritud antikeha manustamist, näiteks 15

leiutise ravimkoostise kujul.

Ühes leiutise teostusnäites käsitletakse meetodit haiguse ravimiseks ja/või

ennetamiseks, milliseks haiguseks on saarerakkude transplantaadi

äratõukereaktsioon, mis hõlmab vastavat ravi ja/või profülaktikat vajavale

patsiendile efektiivses koguses leiutise humaniseeritud antikeha manustamist. 20

Eelistatud teostusnäidetes rakendatakse nimetatud CD45RO/RB humaniseeritud

antikeha ravimite tootmiseks või ravi- ja/või profülaktiliseks meetodiks selliste

haiguste jaoks nagu autoimmuunhaigused, transplantaadi äratõukereaktsioon,

psoriaas, dermatiit, põletikuline soolehaigus ja/või allergiad, hõlmates polüpeptiidi

SEQ ID nr: 31 või SEO ID nr: 32 ja/või polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 või SEQ ID nr: 8. 25

Eelistatavalt hõlmab CD45RO/RB humaniseeritud antikeha polüpeptiidi SEQ ID nr:

31 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 8.

CD45RO/RB humaniseeritud antikeha „efektiivne kogus“ on kogus, mis on piisav,

et saada kasulikud või soovitud tulemused, kaasa arvatud kliinilised tulemused,

EE - EP1664122 B1 17

leevendades näiteks üht või mitut sümptomit, mis on tingitud

autoimmuunhaigusest,

transplantaadi äratõukereaktsioonist, psoriaasist, dermatiidist, põletikulisest

soolehaigusest ja/või allergiast, tõstes vastava patsiendi elukvaliteeti, vähendades

teist ravimite doosi, mis on vajalikud, et ravida selliseid haigusi, parandades teise 5

ravimi toimet, viivitades haiguse progressiooni ja/või pikendades patsientide

elumust, kas otse või kaudselt.

Efektiivset kogust võidakse manustada ühe- või mitmekordselt ning võimalusel ka

kombineerituna teise ravimi, ühendi või ravimkoostisega. Seega võib „efektiivset

kogust“ mõista ühe või mitme raviaine manustamise kontekstis, ning üksikut ainet 10

võidakse manustada efektiivses koguses, kombineerituna ühe või mitme teise

raviainega, et saada soovitud tulemused.

Samuti käsitletakse leiutise teostusnäidetes leiutise CD45RO/RB humaniseeritud

antikeha manustamist üksiku toimeainena või kombineerituna teiste ravimitega

immuunmoduleerivates režiimides või teiste põletikuvastaste ainetega, näiteks et 15

ravida või ennetada haigusi, mis on seotud näiteks autoimmuunhaigustega,

transplantaadi äratõukereaktsiooniga, psoriaasiga, dermatiidiga, põletikulise

soolehaigusega ja/või allergiatega. Näiteks võidakse leiutise CD45RO/RB

humaniseeritud antikeha kasutada kombineerituna kaltsineuriini inhibiitoriga,

näiteks tsüklosporiin A, tsüklosporiin G, FK-506, ABT-281, ASM 981; mTOR 20

inhibiitoriga, näiteks rapamütsiiniga, 40-O-(2-hüdroksü)etüül-rapamütsiiniga,

CCI779, ABT578, AP23573, AP23464, AP23675, AP23841, TAFA-93, biolimus-7

või bioimus-9; kortikosteroidiga; tsüklofosfamiidiga; asatiopriiniga;

metotreksaadiga; S1P retseptori agonistiga, näiteks FTY 720 või vastava

analoogiga; leflunomiidiga või selle analoogidega; misoribiiniga; 25

mükofenoolhappega; mükofenolaat-mofetiiliga; 15-deoksüspergualiiniga või selle

analoogidega; immuunsupressiivsete monokloonsete antikehadega, näiteks

monokloonsete antikehadega leukotsüüdi retseptorite suhtes, näiteks MHC, CD2,

CDS, CD4, CD11a/CD18. CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137,

ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB või nende ligandite, nt CD154 suhtes; muude 30

immuunmoduleerivate ühenditega, näiteks rekombinantse siduva molekuliga,

millel on vähemalt üks CTLA4 või selle mutandi rakuvälise domääni osa, näiteks

EE - EP1664122 B1 18

vähemalt CTLA4 või selle mutandi rakuväline osa, mis on seotud mitte-CTLA4

valgu järjestusega, näiteks CTLA4lg (märgistatud nt ATCC 68629) või selle

mutandiga, nt LEA29Y, või muude adhesioonimolekuli inhibiitoritega, näiteks

monokloonse antikehaga või madala molekulmassiga inhibiitoritega, kaasa

arvatud LFA-1 antagonistidega, selektiini antagonistidega ja VLA-4 5

antagonistidega.

Leiutise CD45RO/RB humaniseeritud antikeha võidakse manustada üksi või

kombineerituna teise ravimi, ühendi või ravimkoostisega mis tahes

konventsionaalsel moel, kaasa arvatud süstimine või järk-järguline infusioon.

Selline manustamine võib olla näiteks suukaudne, intravenoosne, 10

intraperitoneaalne, intramuskulaarne, intrakavitaalne, nahaalune, paikne või

transdermaalne. „Koos manustamise“ all mõeldakse leiutise koostiste

komponentide manustamist kombineerituna või sisulisel samal ajal, kas samas

tugiaines või eraldi tugiainetes selliselt, et mõlemad ühendid satuvad

gastrointestinaaltrakti samaaegselt. Eelistavalt manustatakse neid ühendeid 15

fikseeritud kombinatsioonina.

Samuti käsitletakse antud leiutises ravimkoostist, mis sisaldab leiutise

CD45RO/RB humaniseeritud antikeha kombineerituna vähemalt ühe

farmatseutiliselt vastuvõetava tugiaine või lahjendusvedelikuga.

Käesolevas kontekstis tähendab termin „farmatseutiliselt vastuvõetav tugiaine või 20

lahjendusvedelik“ üht või mitut sobivat tahket või vedelat täiteainet,

lahjendusvedeliku või kapseldamise abiainet, mis sobivad manustamiseks

imetajatele, kaasa arvatud inimestele. Termin „tugiaine“ märgib orgaanilist või

anorgaanilist koostisosa, mis on looduslik või sünteetiline, mis kombineeritakse

toimeainega, et soodustada selle manustamist/toimimist. 25

Termin „farmatseutiliselt vastuvõetav“ tähendab mitte-toksilist materjali, mis ei

mõjuta toimeainete bioloogilise aktiivsuse efektiivsust. Sellised koostised võivad

sageli sisaldava farmatseutiliselt vastuvõetavas kontsentratsiooni sooli,

puhveraineid, säilitusaineid, sobivaid tugiaineid, täiendavaid immuunpotentsiga

ainega, näiteks adjuvante ja tsütokiine, ning valikuliselt muid raviaineid, näiteks 30

kemoterapeutilisi aineid.

EE - EP1664122 B1 19

Meditsiiniliseks kasutuseks peavad soolad olema farmatseutiliselt vastuvõetavad,

ent farmatseutiliselt mittevastuvõetavaid sooli võidakse samuti kasutada, et

valmistada farmatseutiliselt vastuvõetavaid sooli, ning ei kuuluvad selliste

vaheainetena samuti antud leiutise rakendusraamistikku.

Ravimkoostised võivad sisaldada ka sobivaid puhveraineid, kaasa arvatud 5

äädikhappe soola; boorhape soola ja fosforhape soola. Leiutise ravimkoostised

võivad samuti valikuliselt sisaldada sobivaid säilitusaineid, näiteks

bensalkooniumkloriidi, klorobutanooli, parabeene ja timerosaali.

Polüpeptiidi või nimetatud polüpeptiidi kodeeriva nukleiinhappe doosid subjektile

manustamiseks valitakse vastavalt erinevatele parameetritele, arvestades 10

muuhulgas manustamisviisi ja patsiendi üldist tervislikku seisundit. Teisteks

faktoriteks on muuhulgas soovitud raviperiood. Juhul, kui subjekti vastus on

esialgselt rakendatavate dooside järel ebapiisav, võidakse rakendada kõrgemaid

doose (või sisuliselt kõrgemaid doose lokaliseerituma manustamisviisi kaudu)

sellises ulatuses, mis on patsiendi tolerantsi tasemetega lubatud. 15

Leiutise ravimkoostised võivad olla ühikdoosi kujul ning need võidakse valmistada

farmaatsiatööstuses teada ja levinud meetodeid kasutades. Kõik rakendatavad

meetodid hõlmavad etappi, kus toimeaine kombineeritakse tugiainega, mis

koosneb ühest või mitmest lisaainest. Üldiselt valmistatakse need koostised

ühtlaselt, viies toimeaine kokkupuutesse vedela tugiainega, peenestatud 20

kuivainega, või vajadusel mõlemaga, et anda ravimkoostisele vorm.

Suukaudseks manustamiseks sobivad ravimkoostised võivad esineda diskreetsete

üksustena, näiteks kapslitena, tablettidena, pastillidena, mis sisaldavad eelnevalt

määratud koguses toimeainet. Teisteks koostiseks on muuhulgas suspensioonid

vesilahustes või veevabades lahustis, näiteks siirupites, eliksiirides või 25

emulsioonides.

Parenteraalseks manustamiseks mõeldud ravimkoostised sisaldavad tavaliselt

steriilset polüpeptiidi või seda polüpeptiidi kodeeriva nukleiinhappe vesilahust või

veevaba lahust, mis on eelistatavalt patsiendi verega isotooniline. See koostis

võidakse valmistada vastavalt teada meetoditele, kasutades dispergeerivaid või 30

EE - EP1664122 B1 20

märgavaid aineid ja suspendeerivaid aineid. Steriilne süstekoostis võib samuti olla

steriilne süstelahus või -suspensioon mitte-toksilises parenteraalselt

vastuvõetavas lahjendusvedelikus või lahustis, näiteks lahusena 1,3-butaandioolis.

Vastuvõetavateks tugiaineteks ja lahustiteks on vesi, Ringeri lahus ja isotooniline

naatriumkloriidi lahus. Lisaks võidakse konventsionaalselt lahustava või 5

suspendeeriva keskkonnana rakendada steriilseid, tahkeid rasvu rakendada. Sel

eesmärgil võidakse rakendada mis tahes tahket rasva, kaasa arvatud sünteetilisi

mono- või diglütseriide. Lisaks võidakse rasvhappeid, näiteks oleiinhapet,

kasutada süstelahuste valmistamisel. Tugiaine koostiseid, mis sobivad

suukaudseks, nahaaluseks, intravenoosseks, intramuskulaarseks jne 10

manustamiseks, on kirjeldatud: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack

Publishing Co., Easton, PA.

Leiutise ravimkoostis võib sisaldada ka täiendavaid toimeaineid, näiteks muid

immuunmoduleerivaid antikehi, näiteks muuhulgas anti-ICOS, anti-CD154, anti-

CD134L või rekombinantseid valke, näiteks muuhulgas rCTLA-4 (CD152), rOX40 15

(CD134), või põletikuvastaseid aineid või immuunmoduleerivaid ühendeid, näiteks

tsüklosporiin A, FTY720, RAD, rapamütsiini, FK506, 15-deoksüspergualiini,

steroide; nagu eelnevas kirjeldatud. Selline ravimkoostis võib sisalda leiutise

CD45RO/RB humaniseeritud antikeha ja immuunmoduleerivaid ravimeid ja/või

põletikuvastaseid aineid eraldi doseerimisvormides, eelistatavalt ühikdoosi 20

vormides, mis sobivad sisaldavate ühendite manustamiseks sünergiliselt

efektiivsetes koguses, millises komplektis sisalduvad ka kasutusjuhised valikuliselt

koos vahenditega, mis hõlbustavad nende manustamist, nt siltide või joonistega.

Leiutise koostisi võidakse manustada vaba kombinatsioonina või fikseeritud

kombinatsioonina. Ühendite absoluutdoosid varieeruvad vastavalt mitmesugustele 25

teguritele, näiteks patsiendi andmed, manustamisviis, soovitud kestus, toimeaine

vabastamise kiirus ning ravitava haigusseisundi olemus ja tõsidus.

Haigusteks, mis on võimalik ravida leiutise CD45RO/RB humaniseeritud

antikehaga üksi või kombineerituna teiste ravimitega, on muuhulgas

autoimmuunhaigused, kaasa arvatud reumatoidartriit, psoriaatiline artriit, 30

autoimmuunne türeoidiit, Gravesi tõbi, I ja II tüübi diabeet, polüskleroos, Crohni

tõbi (CD), haavandiline koliit (UC), süsteemne erütematoosne luupus, Sjögreni

EE - EP1664122 B1 21

sündroom, sklerodermia, autoimmuunne gastriit ja glomerulonefriit; transplantaadi

äratõukereaktsioon, kaasa arvatud elundi ja koe transplantaadi

äratõukereaktsioon, näiteks patsiendi südame, kopsu, nii südame kui kopsude,

neeru, pankrease, naha või sarvkesta ravimiseks transplantaatidega,

ksenogeneetilist transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haigus, näiteks pärast 5

luuüdi siirdamist, ja/või pankrease saarerakkude transplantaadi

äratõukereaktsioon; psoriaas; dermatiit, näiteks atoopiline ja kontaktdermatiit,

kaasa arvatud allergiline kontaktdermatiit; põletikuline soolehaigus ja/või allergiad,

kaasa arvatud allergiline astma.

NÄITED 10

Antud leiutise olemus saab selgemaks järgmiste võrdlusnäidete valguses. Neid

näiteks ei tuleks aga tõlgendada leiutise rakendusvaldkonda piiravatena.

Järgnevates näideteks on kõik temperatuurid toodud Celsiuse kraadides.

„Kandidaat monokloonne antikeha“ või „kimäärne antikeha“ on leiutise

CD45RO/RB siduv molekul, mis sisaldab kerget ahelat SEQ ID nr: 3 ja rasket 15

ahelat SEQ ID nr: 4.

„Humaniseeritud antikeha“ on leiutise CD45RO/RB siduv molekul, mis sisaldab

polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 9 (VHE/humV1, VHE/VL1 või

VHE/VLh), polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 10 (VHQ/humV1,

VHQ/VL1 või VHQ/VLh); polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 9 20

(VHE/humV2, VHE/VL2 või VHE/VLm); polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 ja polüpeptiidi

SEQ ID nr: 10 (VHQ/humV2, VHQ/VL2 või VHQ/VLm); polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 ja

polüpeptiidi SEQ ID nr: 31 (VHEN73D/humV1, VHEN73D/VL1 või VHEN73D/VLh);

polüpeptiidi SEQ ID nr: 8 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 (VHQN73D/humV1,

VHQN73D/VL1 või VHQN73D/VLh); polüpeptiidi SEQ ID nr: 7 ja polüpeptiidi SEQ 25

ID nr: 31 (VHEN73D/humV2, VHEN73D/VL2 või VHEN73D/VLm); või polüpeptiidi

SEQ ID nr: 7 ja polüpeptiidi SEQ ID nr: 32 (VHQN73D/humV2, VHQN73D/VL2 või

VHEN73D/VLm).

Kasutatud on järgmisi lühendeid:

APC antigeeni esitav rakk 30

EE - EP1664122 B1 22

CEX katioonvahetuse kromatograafia

c.p.m. lugemeid minutis

dhfr dihüdrofolaat-reduktaas

EDTA etüleendinitrilo tetra-äädikhape

ELISA ensüüm-immuunsorbtsioonmeetod 5

ESI-Q-TOF elektropihustuse ionisatsioon - tetrapool - lennuaeg

FACS fluorestsents-aktiveeritud läbivoolutsütomeeter

Fc kristalliseeritav fragment

F(ab’)2 antigeeni siduv fragment; bivalentne

FITC fluorestseiinisotiotsüanaat 10

FBS veiselooteseerum

GVHD transplantaat-peremehe-vastu haigus

HCMV inimese tsütomegaloviiruse promootor

HPLC kõrgrõhuvedelikkromatograafia

IFN-� interferoon-gamma 15

IgE immunoglobuliin isotüüp E

IgG immunoglobuliin isotüüp G

IL-2 interleukiin-2

IU rahvusvahelised ühikud

MALDI-TOF maatriks-assisteeritud-laser-desorptsioon-ionisatsioon - lennuaeg 20

MLR kombineeritud lümfotsüüdi reaktsioon

MLC kombineeritud lümfotsüüdi kultuur

MP1 maatriks valk 1 hemophilus influenza bakterist

MTX metotreksaat

PBS fosfaat-puhverdatud saliin 25

PBL perifeerse vere leukotsüüdid

PBMC perifeerse vere mononukleaarsed rakud

PCR polümeraasi ahelreaktsioon

RP pöördfaasiline kromatograafia

SEC suurus-eksklusioonkromatograafia 30

SCID tõsine kombineeritud immuunpuudulikkus

Treg T-regulaatorrakud

xGVHD kseno-transplantaat-peremehe-vastu haigus

EE - EP1664122 B1 23

Näide 1: Primaarse kombineeritud lümfotsüüdi vastus (MLR)

Rakud

Vereproovid võetakse tervetelt inimdoonoritelt. Perifeerse vere mononukleaarsed

rakud (PBMC) isoleeritakse tsentrifuugides Ficoll-Hypaque’il (Pharmacia LKB)

kogu perifeerse vere leukotsüütidest, leukofereesiga või teada veretüübiga raku 5

katetega, aga mitte tundmata HLA tüübiga. Teatud MLR katsetes kasutatakse

PBMC otse stimulaatorrakkudena pärast kiiritamist 40 Gy juures. Teistes katsetes

depleteeritakse T-rakud PBMCdest, kasutades CD2 või CD3 Dynabeads (Dynal,

Oslo, Norra). Pärlid ja saasterakud eemaldatakse magnetvälja rakendades.

PBMCdest depleteeritud T-rakke kasutatakse stimulaatorrakkudena pärast 10

kiiritamist.

PBMC, CD3+ T-rakke või CD4+ T-rakke kasutatakse vastaja-rakkudena MLR.

Erinevate doonorite rakkudest valmistatakse stimulaatorrakud. CD3+ T-rakud

puhastatakse negatiivse selektsiooni teel, kasutades anti-CD16 mAb (Zymed, CA),

kitse anti-hiire IgG Dynabeads, anti-CD14 Dynabeads, CD19 Dynabeads. Lisaks 15

kasutatakse anti-CD8 Dynabeads CD4+ T-rakkude puhastamiseks. Saadud rakke

analüüsitakse FACScan või FACSCalibur (Becton Dickinson & Co., CA) ning

saadud rakkude puhtuseks oli >75%. Rakud suspendeeritakse RPMI1640

söötmes, millele on lisatud 10% kuumus-inaktiveeritud FBS, penitsilliini,

streptomütsiini ja L-glutamiini. 20

Reagendid

Saadakse ka kimäärne anti-CD45R0/RB monokloonne antikeha „kandidaat

monokloonne antikeha“ ja isotüübiga sobituv kontroll kimäärne antikeha. Hiire

(inimese) kontroll IgG1 antikeha, mis on spetsiifiline KLH (keyhole limpet

hemotsüaniin), või rekombinantne inimese IL-10 soetatakse BD Pharmingen (San 25

Diego, CA). Anti-inimese CD154 monokloonne antikeha 5c8 on selline, nagu

kirjeldanud Lederman et al 1992.

Primaarse kombineeritud lümfotsüüdi vastus (MLR)

EE - EP1664122 B1 24

1 x 105 PBMC alikvoodid või 5 X 104 CD3+ või CD4+ rakud segatakse kokku 1 x

105 kiiritatud PBMCdega või 5 x 104 T-rakkudega depleteeritud kiiritatud (50 Gy)

PBMCdega, 96-auguliste söötmeplaatide igas augus (Costar, Cambridge, MA)

nimetatud monokloonne antikeha kohalolekul või antikeha puudumisel. Teatud

katsetes lisatakse kitse anti-hiire lg F(ab’)2 fragment või kitse anti-inimese lg, mis 5

on spetsiifiline Fc osa suhtes (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA),

koguses 10 µg/ml kandidaat monokloonsele antikehale, et tagada CD45

sihtmolekulide optimaalne in vitro ristsidestamine. Kombineeritud rakke

kasvatatakse 4 või 5 päeva temperatuuril 37 °C 5% CO2 atmosfääris ning

proliferatsioon määratakse, pulseerides rakke 3H-tümidiinidga viimased 16-20 10

tundi.

Teised katsed on sarnased eelnevalt kirjeldatuga, ent järgmiste eranditega: 1)

kasutatavaks söötmeks on EX-VIVO (Bio-Whittaker), mis sisaldab 10% FBS ja 1%

inimese plasmat; 2) anti-hiire kogu IgG (5 µg/ml) kasutatakse sekundaarse

ristsidestamise etapina; 3) stimulaatorrakkude kiirutuseks on 60 Gy. 15

Primaarne MLR teostatakse „kandidaat monokloonse antikeha“ või kontrollina

kasutatava kimäärse IgG1 (10 µg/ml) kohalolekul teise reagendina, kitse anti-

inimese lg F(ab’)2 fragment, mis on spetsiifiline Fc osa (10 µg/ml) suhtes.

Protsentuaalne inhibeerimine „kandidaat monokloonse antikeha“ poolt arvutatakse

võrdluses raku proliferatsiooniga kontroll IgG1 kohalolekul. Tulemused on toodud 20

alljärgnevas tabelis:

Tabel 1

Primaarse MLR inhibeerimine 10 µg/ml leiutise kandidaat monokloonse antikeha

poolt

Responder Stimulaator (kiir. PBMC) Inhibeerimise %

#211 CD4 #219 CD3 63,51

#220 CD4 #219 CD3 depl. 63,07

#227 CD4 #220 CD3 depl. 65,96

#229 CD4 #219 CD3 depl. 50,76

Keskmine ± standardhälve 60,83±6,83*

* Oluliselt erinev kontrollväärtusest (P<0,001)

EE - EP1664122 B1 25

Leiutise kandidaat monokloonne antikeha inhibeerib primaarset MLR, nagu selgub

tabelist 1. Keskmiseks inhibeerivaks toimeks on 60,83 ± 6,83% neljalt erinevalt

doonorilt derivatiseeritud CD4+ T-rakkudega ning see oli statistiliselt oluline.

Primaarse MLR inhibeerimine „kandidaat monokloonse antikehaga“ on näidatult

„kandidaat monokloonse antikeha“ doosist sõltuv vahemikus 0,001 kuni 10 µg/ml, 5

nagu kujutatud joonisel fig. 1.

Primaarse MLR „kandidaat monokloonse antikehaga“ inhibeerimise IC50

määratakse kolme MLR katsete tulemustest, kasutades ühe doonori PBMC

responder-rakke. Seega segatakse responder CD4+ T-rakud doonorilt #229 ja

#219 ja kiiritatud PBMC rakud, mis on depleteeritud T-rakkudest ja mida 10

kasutatakse stimulaatoritena, „kandidaat monokloonse antikeha“ või kontroll

kimäärse antikeha kohalolekul kitse anti-inimese Ig 10 µg/ml F(ab’)2 fragmendiga.

Katseid korratakse 3 korda ning proliferatsiooni protsent „monokloonse antikeha“

kohalolekul arvutatakse võrdluses T-raku proliferatsiooniga kontroll-antikeha

kohalolekul. IC50 väärtus määratakse, kasutades Origin (V. 6.0®) seadet. Rakulise 15

aktiivsuse IC50 väärtuseks leiti 0,87 ± 0,35 nM (0,13 ± 0,052 µg/ml).

Näide 2: Sekundaarne MLR

Et hinnata, kas „kandidaat monokloonne antikeha“ indutseerib CD4+ T-rakkude

mitte-reaktiivsust teatud alloantigeenide suhtes, teostatakse sekundaarne MLR

antikehadeta pärast primaarset MLC. CD4+ T-rakke kasvatatakse kiiritatud 20

allogeensete stimulaatorrakkudega (T-rakud - depleteeritud PBMC) nimetatud

antikeha kohalolekul 96-augulistel söötmeplaatidel 10 päeva (primaarne MLC).

Seejärel rakud kogutakse, kihitatakse Ficoll-Hypaque gradiendiga, et eemaldada

surnud rakud, pestakse kaks korda RPMI, ja restimuleeritakse sama

stimulaatoriga, kolmanda poole stimulaatorrakkudega või IL-2 (50 U/ml). Rakke 25

kasvatatakse 3 päeva ja proliferatsiooni vastus määratakse, pulseerides rakke 3H-

tümidiiniga viimased 16-20 tundi söötmes.

Nimelt kasvatatakse CD4+ T-rakke kiiritatud allogeensete stimulaatorrakkudega

(T-rakud-depleteeritud PBMC rakud, mis on võetud teistelt doonoritelt) 10 µg/ml

„kandidaat monokloonse antikeha“, kontroll IgG1 kimäärse Ab ja kitse anti-inimese 30

EE - EP1664122 B1 26

Ig F(ab’)2 fragmendi kohalolekul. Primaarne MLR proliferatsioon määratakse

viiendal päeval. Sekundaarseks MLR kasvatatakse resonder- ja stimulaatorrakke

10 päeva „kandidaat monokloonse antikeha“ kohalolekul, seejärel rakud

korjatakse, pestakse kaks korda RPMI1640 ning restimuleeritakse konkreetse

stimulaatoriga, kolmanda poole stimulaatoritega või IL-2 (50 U/ml) antikehadeta. 5

Rakkude proliferatsioon määratakse kolmandal päeval. Saadud tulemused on

toodud tabelis 1:

Tabel 2

Resonder CD4+ T-rakud doonor # Sekundaarse MLR inhibeerimise %

#211 49,90*

#220 59,33*

#227 58,68*

* Oluliselt erinev kontrollväärtusest (p=<0,001 määratud t-testis, SigmaStat

V.2.03). # p=<0,046

Selleks, et testida, kas halvenenud proliferatsioon on tingitud mitte-reaktiivsusest,

mis on kujunenud „kandidaat monokloonse antikehaga“ töötlemise tagajärjel, 10

kasvatatakse rakke, mis on derivatiseeritud primaarsest MLR, IL-2 (50 U/ml)

kohalolekul. IL-2 lisamisel pääsetakse T-rakkude proliferatiivsed vastused, mida oli

töödeldud „kandidaat monokloonse antikehaga“ primaarses MLR tasemetel, mis

on sarnased neile, mida on täheldatud IgG1 kontrollantikeha kohalolekul. Need

andmed näitavad, et halvenenud sekundaarne vastus T-rakkudes, mida on 15

töödeldud „kandidaat monokloonse antikehaga“, on tingitud T-resonder-rakkude

funktsionaalsest muutusest, muutudes mitte-reaktiivseteks teatud

stimulaatorrakkude suhtes.

Protsentuaalne inhibitsioon arvutatakse vastavalt järgmisele valemile:

. 20

Statistiline analüüs teostatakse SigmaStat (Vers. 2.03) kasutades.

EE - EP1664122 B1 27

Andmeid analüüsitakse kahetises ANOVA, millele järgneb Dunnetti meetod. Kõigis

testmeetodites loetakse tõenäosusi <0,05 oluliseks. Teatud katsetes kasutatakse

t-testi (SigmaStat V.2.03).

Näide 3: In vivo elumuse uuringud SCID hiirtel

hu-PBL pookimine SCID hiirtele 5

Inimese perifeerse vere mononukleaarseid rakke (PBMC) süstitakse

intraperitoneaalselt SCID hiirtele C.B 17/GbmsTac-Prkdcscid Lystbg mice

(Taconic, Germantown, NY) koguses, mis on piisav, et indutseerida letaalset

ksenogeneetilist transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haigust >90% hiirtel 4

nädalat pärast rakkude ülekannet. Selliselt töödeldud SCID hiired kannavad 10

seejärel nimetust hu-PBL-SCID hiired.

SCID hiirtetöötlemine hu-PBL monokloonse antikehaga

Hu-PBL-SCID hiiri töödeldakse „kandidaat monokloonse antikehaga“ või hiire või

kimäärse isotüübiga sobivate monokloonse antikeha kontrollidega päeval 0,

vahetult pärast PBMC süstimist, 3. ja 7. päeval ning nädalaste intervallidega 15

seejärel. Monokloonseid antikehi siirdatakse nahaaluselt 100 µl PBS

lõppkontsentratsioonis 5 mg kehakaalu kg kohta. Selline ravi lõpetatakse, kui kõik

kontrollhiired on surnud.

Ravitulemuste hindamine

Põhiliseks kriteeriumiks „kandidaat monokloonse antikeha“ efektiivsuse hindamisel 20

on selles uuringus hu-PBLSCID hiirte elumus. Saadud tulemuste olulisust

hinnatakse elumuse analüüsi statistilisel meetodil, kasutades Log-rank testi

(Manteli meetod) Systat v9.01 tarkvara abil. Elumuse analüüsi meetodiks on mitte-

parameetriline test, mis ei võta arvesse mitte üksnes konkreetset veel elavat hiirt,

vaid ka seda, kas see hiir ohverdati põhjustel, mis ei puutu ravisse/haigusesse, 25

näiteks nõue teostada selle elundite/rakkude in vitro analüüs. Maksa, kopsu, neeru

ja põrna biopsiad võetakse surnud hiirtelt täiendavaks hindamiseks. Lisaks

kaalutakse hu-PBL-SCID hiiri katse alguses (enne rakkude ülekannet) ja selle

jooksul (iga kahe päeva tagant), et hinnata otseselt nende tervislikku seisundit.

EE - EP1664122 B1 28

Lineaarse regressiooni jooned saadakse, kasutades kehakaalu versus PBMC

ülekandele järgnevate päevade väärtuseid iga hiire kohta, seejärel võrreldakse

vastavaid kaldeid (kontroll versus anti-CD45 töödeldud hiired), rakendades mitte-

parameetrilist Mann-Whitney testi.

Tulemused 5

Kõigil hu-PBL-SCID hiirtel, keda oli töödeldud hiire monokloonse antikeha

kontrollidega, olid infiltreerunud leukotsüüdid kopsus, maksas ja põrnas ning nad

surid (4/4) ca 2 kuni 3 nädala jooksul pärast rakkude siirdamist. Surm on xGvHD

tõenäoliseks tagajärjeks. Kontroll monokloonse antikehaga töödeldud hiired

kaotasid ka massis lineaarselt, ca 10% ja enam kui 3 nädalaga. 10

Kõik hu-PBL-SCID hiired, keda oli töödeldud „kandidaat monokloonse antikehaga“

jäid ellu (4/4) nähtava haiguse märgita enam kui 4 nädala vältel, ehkki „kandidaat

monokloonse antikehaga“ töötlemine peatati 3 nädala möödudes. „Kandidaat

monokloonse antikehaga“ töödeldud hiired võtsid kaalus juurde lineaarselt kuni ca

5% 4 nädalaga. 15

Näide 4: Leiutise antikehade ekspressioon

Humaniseeritud antikeha ekspresseerimine, milleks on SEQ ID nr:_7, SEQ ID

nr:_8, SEQ ID nr: 9, SEQ ID nr: 10, SEQ ID nr:_31 või SEQ ID nr: 32

Konstrueeritakse ekspressioonivektorid vastavalt plasmiidi plaanidele, mida on

kujutatud joonistel fig. 2 kuni 11, mis hõlmavad vastavaid nukleotiide, mis 20

kodeerivad humaniseeritud kerge ahela varieeruva piirkonna humV1

aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 8; joonised fig. 4 ja 6), humaniseeritud kerge

ahela varieeruva piirkonna humV2 aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 7;

joonised fig. 5 ja 7), humaniseeritud raske ahela varieeruva piirkonna VHE

aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 9; joonis fig. 3 ja 10) või humaniseeritud 25

raske ahela varieeruva piirkonna VHQ aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 10;

joonised fig. 2 ja 11), humaniseeritud raske ahela varieeruva piirkonna VHE-N73D

aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 31; joonis fig. 8) või humaniseeritud raske

ahela varieeruva piirkonna VHQ-N73D aminohappelist järjestust (SEQ ID nr: 32;

joonis fig. 9). Neil ekspressioonivektoritel on DNA (nukleotiidi) järjestused SEQ ID 30

EE - EP1664122 B1 29

nr: 15 ja SEQ ID nr: 41 (VHQ), SEQ ID nr: 16 ja SEQ ID nr: 40 (VHE), SEQ ID nr:

17 ja SEQ ID nr: 36 (humV1), SEQ ID nr: 18 ja SEQ ID nr: 39 (humV2) või SEQ ID

nr: 37 (VHEN73D) ja SEQ ID nr: 38 (VHQ-N73D).

Humaniseeritud antikeha raske ja kerge ahela ekspressioonivektorite

konstrueerimine ekspressiooniks COS rakkudes 5

Inimese kappa kerge ahela ekspressioonivektorid versioonideks VLh ja VLm

Et konstrueerida lõplik ekspressioonivektor kodeerimaks täielikku inimese kappa

isotüübiga humaniseeritud kerget ahelat, eemaldatakse DNA fragmendid, mis

kodeerivad täieliku kerge ahela varieeruvaid piirkondi (VLh ja VLm), VLh ja VLm

versioonidest, mis sisaldab PCR-Script kloonimisvektoreid (Stratagene) (VLm 10

piirkond), kasutades HindIII ja BgIII. Geel-puhastatud fragmendid subkloonitakse

C21-HCMV kappa ekspressioonivektori, mis loodi humaniseeritud anti-IgE

antikeha konstrueerimisel, TESC-21 HindIII ja BamHI saitideks (Kolbinger et al

1993) ja mis saadakse M. Bendig’ilt (MRC Collaborative Centre, London, UK)

(Maeda et al. 1991). Ligeerimise saadused puhastatakse fenool/kloroformi 15

ekstraheerimisel ja elektroporeeritakse elektrokoporatsioon-kompetentne

Epicurian Coli® XL1-Blue värviga (kategoorianumber #200228, Stratagene).

Pärast plaatimist LB/amp agari plaatidel üle öö temperatuuril 37 °C, korjatakse

kõik 12 kolooniat, et valmistada plasmiidne DNA 3 ml kultuurist, kasutades

BioRobot 9600 (Qiagen). Nii saadakse kerge ahela ekspressioonivektorid 20

humaniseeritud antikeha vastavateks versioonideks VLh ja VLm, nagu toodud ka

joonistel.

Inimese gamma-1 raske ahela ekspressioonivektorid VHQ

Et konstrueerida VHQ ekspressioonivektor, võidakse etapipõhine lähenemine.

Esmalt koondatakse VHQ täielik varieeruv piirkond PCR abil vastavalt 25

metoodikale, mida on kirjeldanud Kolbinger et al 1993 (Protein Eng. 1993 Nov;

6(8):971-80) ja subkloonitakse C21-HCMV-gamma-1 ekspressiooniks, millest C21

sisend oli eemaldatud, kasutades samu ensüüme. PCRScript klooni HindIII/BamHI

fragment, mis sisaldas täielikku varieeruvat piirkonda, subkloonitakse seejärel

ekspressioonivektoriks C21-HCMV-gamma-1, mis on lõhustatud samade 30

EE - EP1664122 B1 30

ensüümidega. Nii saadakse lõplik ekspressioonivektor humaniseeritud antikeha

versiooniks VHQ.

Inimese gamma-1 raske ahela ekspressioonivektorid VHE

Lõplik VHE ekspressioonivektor, mis kodeerib inimese gamma-1 isotüübi täielikku

humaniseeritud rasket ahelat, ligeerides otse Hindlll ja BamHI piiratud PCR 5

fragmendi, mis kodeerib varieeruva piirkonna C21-HCMV gamma-1

ekspressioonivektori HindIII ja BamHI saitideks, milline ekspressioonivektor

saadakse humaniseeritud anti-IgE antikeha TESC-21konstrueeriisel (Kolbinger et

al. 1993) ja mis saadi samuti M. Bendig’ilt (MRC Collaborative Centre, London,

UK) (Maeda et al. 1991). 10

Transientne ekspressioon COS rakkudes

Järgnevat transfektsiooni protokoll kohandatakse adhesiooni COS rakkudele

sobivaks 150 mm rakukultuuri anumates, kasutades SuperFect™ transfektsiooni

reagenti (kat. nr 301305, Qiagen). Neli erinevat eelnevalt kirjeldatud

ekspressioonivektorit kasutatakse rakkude transientseks transfektsiooniks. 15

Humaniseeritud antikeha ekspresseerimiseks transfekteeritakse mõlemad kaks

klooni, mis sisaldavad raske ahela sisendeid (vastavalt VHE või VHQ), rakkudesse

mõlema kahe klooniga, mis kodeerivad kergeid ahelaid (vastavalt humV1 või

humV2), saades kokku 4 erinevat raskete ja kergete ahela ekspressioonivektorite

kombinatsiooni (VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja VHQ/humV2). Enne 20

transfektsiooni lineariseeritakse plasmiidid restriktsiooni endonukleaasiga Pvul,

mis lõhustub piirkonnas, mis kodeerib resistentsuse geeni ampitsilliini suhtes.

Transfektsioonile eelneval päeval külvatakse 4 x 106 COS rakke 30 ml värskes

söötmes 150 mm rakukultuuri anumatesse. Külvamine sellel rakutihedusel annab

üldiselt 80% laatumise 24 tunni järel. Transfekteerimise päeval lahjendatakse nelja 25

erinevat lineariseeritud raske ja kerge ahela DNA ekspressioonivektorit (iga maht

15 µg) kogumahus 900 µl värske söötmega, mis ei sisalda seerumit ega

antibiootikume. 180 µl SuperFect transfektsiooni reagent segatakse seejärel

põhjalikult kokku DNA lahusega. DNA segu inkubeeritakse 10 minutit

toatemperatuuril, et saada kompleksne moodustis. Kui see keerukas 30

moodustumise aset leiab, eemaldatakse COS rakukultuurist kasvusööde ning

EE - EP1664122 B1 31

rakke pestakse üks kord fosfaat-puhverdatud saliiniga. 9 ml värsket söödet (mis

sisaldab 10% FBS ja antibiootikume) lisatakse igale reaktsioonitorule, mis sisaldab

transfektsiooni komplekse, ja on segatakse korralikult. Lõplik koostis viiakse

vahetult igasse 4 kultuuri, et need transfekteerida ja õrnalt segada. Rakukultuure

inkubeeritakse seejärel DNA kompleksidega 3 tundi temperatuuril 37 °C ja 5% 5

CO2 atmosfääris. Pärast inkubeerimist eemaldatakse sööde, mis sisaldab

transfektsiooni komplekse, ning asendatakse 30 värske söötmega. 48 tundi pärast

transfekteerimist kogutati söötme supernatandid.

Söötme supernatantide kontsentreerimine

ELISA ja FACS analüüsi tarvis kogutakse söötme supernatandid COS rakkudest, 10

mida on transfekteeritud raske ja kerge ahela plasmiididega, ning

kontsentreeritakse järgnevalt. 10 ml iga supernatanti lisatakse Centriprep YM-50

tsentrifuugi filterseadmetesse (kat. nr 4310, Millipore) vastavalt tootja juhistele.

Neid spetsiaalseid filtreid tsentrifuugitakse 10 minutit pööretel 3000 p/min

toatemperatuuril. Seejärel korratakse tsentrifuugimise etapp taas ülejäänud 20 ml 15

supernatandiga, kasutades üksnes 5 minutit tsentrifuugimist ja jälgides

kontsentreerumise protsessi. Kogutakse vahesaadusena tekkinud 500 µl

kontsentreeritud supernantanti, viiakse uutesse Microcon Centrifugal

filterseadmetesse (kat. nr 42412, Microcon) ning kontsentreeritakse seejärel

vastavalt tootja juhistele. Kontsentreeritud supernatante tsentrifuugitakse neli 20

korda 24 minutit pööretel 3000 p/min toatemperatuuril, üks kord 10 minutit 6000

p/min ja seejärel kolm korda 5 minutit, jälgides alati kontsentreerumise protsessi.

Lõplikuks kontsentreeritud söötme mahuks saadakse 100-120 µl vastavalt 250

kuni 300-kordsele originaalse söötme kontsentratsioonile ning seda säilitakse

temperatuuril 4 °C kasutamiseni. Võrdluse ja kontrollina kontsentreeritakse sööde, 25

mis saadakse transfekteerimata rakkudest, sarnaselt, kasutades sama

tsentrifuugimise protokolli, mida on kirjeldatud ülal.

Stabiilsete Sp2/0 müeloomi transfektanti genereerimine, mis eritavad

humaniseeritud anti-CD45RO/RB antikehi

Hiire müeloomi rakuliini Sp2/0 (ATCC, CRL-1581) elektroporeeritakse eelnevalt 30

kirjeldatud CHO ekspressioonivektoritega, mis kodeerivad CD45RO/RB rasket

EE - EP1664122 B1 32

(VHE või VHQ) ja kerget (humV1 või humV2) ahelat, mis seob humaniseeritud

antikehi. Transfektsiooniks kasutatakse nelja erineva raskete ja kerget ahelate

ekspressioonivektorite kombinatsiooni (VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja

VHQ/humV2) vastavalt järgnevalt protokollile: 20 µg iga plasmiidi

superkeerdudega DNAd segatakse elektroporatsiooni küvetti (0,4 cm vahemik) 8 x 5

106 elusate Sp2/0 rakkudega, mis on suspendeeritud DMEM/10% FCS söötmes.

Elektroporatsiooni seadistusteks on 1500 V, 25 PF, kasutades BioRad

GenePulser seadet. Elektroporatsiooni järel kasvatakse rakke 20 tundi söötmes

(DMEM, millele on lisatud 10% FCS penitsilliini, streptomütsiini ja L-glutamiini).

Teisel päeval lisatakse selektsiooni ravim G418 (kat. nr 10131-019, Gibco) 10

lõppkontsentratsioonis 1 mg toimeainele ning rakud jaotatakse 96-augulisele

plaadile, 200 µl igasse auku ligikaudu 105 rakku augu kohta. 10 kuni 15 päeva

hiljem jaotatakse G418 ellujäänud kloonid G418 sisaldavas söötmes.

Humaniseeritud monokloonsete antikehade eritamist nendest transfektantidest

hinnatakse ELISA analüüsis, kasutades katva antikehana kitse anti-inimese 15

IgG/Fcg (kat. nr 109-005-098, Jackson Labs) ja peroksidaasiga sidestatud inimese

kappa kerge ahela vastu (kat. nr A-7164, Sigma). Transfektandid, mis osutusid

selles testis positiivseteks, valitakse produktiivsuse võrdluseks augu kohta

igapäevaselt, kasutades taas ELISA (vaata alljärgnevat). Iga transfektandi parim

kloon valitakse vahetuks subkloonimiseks piiratud lahjendamisega, kasutades 20

külvitihedust 1 rakk augu kohta. G418 ellujäävate subkloonide produktiivsus

määratakse taas vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetodile. Subkloonid viiakse

G418 sisaldavasse söötmesse, kuni kultuuri mahuks saadakse 150 ml, millises

etapis jätkatakse kasvatamist ilma G418 kolbides, mis on mõeldud toitma

rullpudeleid. 25

Pärast esimest transfektsiooni ja valimist kasvavad transfektandid välja 96-

augulistelt plaatidelt tihedusel 20,8% VHE/humV1 suhtes, 11,5 % VHQ/humV1

suhtes, 18,8% VHE/humV2 ja 7,3 % VHQ/humV2 suhtes. Pärast kaht

subkloonimist on kaheks parimaks tootjaks kloonid 1.33.25 (3,87 pg/auk/päev) ja

1.33.26 (3,43 pg/auk/päev) VHE/humV1 ja 12.1.4 (1,19 pg/auk/päev) ja 12.1.20 30

(1,05 pg/auk/päev) VHQ/humV1 osas. Stabiilsed Sp2/0 transfektandid

VHE/humV1 ja VHQ/humV1 suhtes jagatakse seejärel antikeha tootmiseks ja

puhastamiseks.

EE - EP1664122 B1 33

Antikehad puhastatakse stabiilselt transfekteeritud SP2/0 müeloomi rakuliinide

supernatantidest, mis sisaldavad 10% FCS, kasutades afiinsus-kromatograafiat,

mis rakendab immobliseeritud anti-inimese IgGFc maatriksit, ja suurus-

eksklusioonkromatograafiat. Vajadusel eemaldatakse endotoksiin, kasutades

Acticlean Etox kolonni (Sterogene Bioseparations). 5

Humaniseeritud antikeha raske ja kerge ahela ekspressioonivektorit

konstrueerimine ekspressiooniks Sp2/0 rakkudes

Inimese kappa kerge ahela ekspressioonivektorid versioonideks VLh ja VLm:

humV1 (= VL1) või humV2 (= VL2) cDNA amplifitseeritakse PCR CHO

ekspressiooni-plasmiidist SEQ ID nr: 17 või SEQ ID nr: 18, kasutades praimereid 10

HuCD45LC-Mlu (5’-AAAACGCGTTGTGACATTCTGCTGACCCAGTCT-3’; SEQ ID

nr: 42) ja HuCD45LC-Hind (5’-AAAAAAGCTTGGTCCCCTGGCCGAACGTGAA-3’;

SEQ ID nr: 43). Iga 321 bp PCR fragment seeditakse MluI ja HindIII ning

ligeeritakse otse kerge ahela ekspressioonivektorisse chA6HCk.dhfr, mis

seeditakse samade ensüümidega. Saadud plasmiidid nimetatakse LCVL1Sp20 15

(SEQ ID nr: 36; joonis fig. 6) ja LCVL2Sp20 (SEQ ID nr: 39; joonis fig. 7).

LCVL1Sp20 kasutatakse seejärel ekspresseerimiseks humaniseeritud antikeha

VHE/humV1, VHQ/humV1 või VHE-N73D/humV1 Sp2/0 rakkudes; LCVL2Sp20

võidakse seejärel kasutada ekspressiooniks humaniseeritud antikeha

VHE/humV2, VHQ/humV2 või VHE-N73D/humV2 Sp2/0 rakkudes. 20

Inimese gamma-1 raske ahela ekspressioonivektorid VHQ ja VHE versioonideks

Kaks humaniseeritud VH cDNA piirkonda amplifitseeritakse PCR

rekombinantsetest plasmiididest HCMV-G1 HuA6-VHE (SEQ ID nr: 16; joonis fig.

3) ja HCMV-G1 HuA6-VHQ (SEQ ID nr: 15 joonis fig. 2), kasutades PCR

praimereid HuCD45HCEup (5’-CAGGCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCA-3’; 25

SEQ ID nr: 44) või HuCD45HCQup (5’-

CAGGCACAGGTGCAGCTGGTGGAGTCA-3’; SEQ ID nr: 45) ja HuCD45HClo (5’

-AAATCCTTCTAGAACTCACCTGAGGAGAC-3’; SEQ ID nr: 46). PCR

fragmentide’ 3’-otsad seeditakse BstEII. Iga PCR fragment kloonitakse seejärel

raske ahel kasseti vektorisse HCcassREAL, mis on lõigatud BstEII ja jämeda otsa 30

EE - EP1664122 B1 34

lõikajaga HincII. Saadud plasmiidid on vahesaadusteks lõplike ekspressiooni

konstruktide saamisel ning need kannavad vastavalt nimetusi HCcassHVESP20 ja

HCcassHVQSP20. Selle subkloonimise tulemusel muutub ka liiderjärjestus, mis

on seotud mõlema VH piirkonnaga esialgsetes vektorites. Kui vana liiderjärjestuse

aminohappeliseks järjestuseks on MDWTWRVFCLLAVVAPGAHS (SEQ ID nr: 5

47), asendatakse see subkloonimisel MAWVWTLPFLMAAAQSVQA vastu (SEQ

ID nr: 48).

Vahesaadused HCcassVHESP20 või HCcassVHQSP20 seeditakse Scal ja

seejärel seeditakse vastavad plasmiidid BamHI ja EcoRI. 2.9 kb fragmendid, mis

sisaldavad Ig raske ahela promootorit ja VH piirkonda, puhastatakse ja ligeeritakse 10

raske ahela ekspressiooni konstrukti BamHI- ja EcoRI-seeditud 8,7 kb

fragmendiga. Saadud plasmiidid kannavad nimetust HCVHESp20 (SEQ ID nr: 40;

joonis fig. 10) ja HCVHQSp20 (SEQ ID nr: 41; 11); ning neid kasutatakse

ekspressiooniks humaniseeritud antikeha VHE/humV1 VHQ/humV1 Sp2/0

rakkudes. 15

Inimese gamma-1 raske ahela ekspressioonivektor VHEN73D versiooniks

Ekspressioonivektoreid HCVHESp20 (SEQ ID nr: 40; joonis fig. 10) ja

HCVHQSp20 (SEQ ID nr: 41; joonis fig. 11) kasutatakse mallidena saidipõhises

mutageneesis, et saada N73D mutatsioon, (asparagiini muutmine aspartaadiks

humaniseeritud antikeha raske ahela aminohappe asendis 73). See mutatsioon 20

eemaldab arvatava N-glükosüülimise saidi. Mutagenees viiakse läbi QuikChange®

Multi-Site Directed mutageneesi komplektiga (Stratagene), kasutades praimerina

CD45H-N73D (5’-fosfo GCCACACTAACTGCAGACAAATCCATCAGCACAGC-3’;

SEQ ID nr: 49) vastavalt tootja juhistele. Kinnitatakse saadud konstruktide

HCVHEN73DSp20 ja HCVHQN73DSp20 järjestus ning see märgistatakse 25

vastavalt SEQ nr: 37 ja SEQ nr: 38, joonised fig. 8 ja fig. 9. HCVHEN73DSp20

(SEQ nr: 37) kasutatakse koos kerge ahela ekspressiooni konstruktiga LCVL1

SP20 (SEQ nr: 36), et ekspresseerida humaniseeritud antikeha VHE-

N73D/humV1 Sp2/0 rakke.

Stabiilsete Sp2/0 müeloomi transfektantide saamine, mis eriavad humaniseeritud 30

anti-CD45RO/RB antikeha VHE-N73D/humV1

EE - EP1664122 B1 35

Hiire müeloomi rakuliin Sp2/0 Ag14.10 elektroporeeritakse vektoritega, mis

kodeerivad humaniseeritud antikeha VHEN73D/humV1 rasket

(HCVHEN73DSp20; SEQ ID nr: 37) ja kerget (LCVL1SP20; SEQ ID nr: 36) ahelat.

Transfekteerimiseks kasutatakse rakke, mille elujõulisus on eksponentsiaalsel

kasvufaasis kõrgem kui 95%. Rakke pestakse kaks korda külma TF puhvriga (272 5

mM sahharoos, 1 mM MgCl2, 7 mM fosfaadi puhver pH 7,4) ning rakkude

kontsentratsiooniks reguleeritakse 2 x 107 rakku ml kohta TF puhvris. 0,8 ml

rakususpensiooni segatakse 15 µg iga raske ja kerge ahela plasmiidi konstruktiga

ning asetatakse 10 minutiks jääle. Viis transfektsiooni teostatakse

elektroporatsioonis, kasutades Biorad Gene Pulser (280V ja 25 PF). Pärast 10

elektroporatsiooni asetatakse rakud 15 minutiks jääle, misjärel viiakse need 50 ml

külma söötmesse (RPMI-põhine sööde ilma FCS) ja inkubeeritakse 2 päeva

temperatuuril 37 °C ja 5% CO2 atmosfääris.

Transfektantide valimiseks kasvatatakse rakke 1,1 mg/ml G418 kohalolekul

(Geneticin, Gibco lot 3069464) ligikaudu 2 kuni 3 nädalat. dhfr (dihüdrofolaat 15

reduktaas) amplifikatsiooni marker, mis paikneb kerge ahela konstruktil, võimaldab

amplifitseerida dhfr geeni, samuti transgeeni, foolhappe analoogi metotreksaadiga

(MTX). Geeni amplifitseerimiseks kasvatatakse G418 resistentseid rakke 200 nM

MTX kohalolekul 2-3 nädalat, misjärel tõuseb MTX kontsentratsioon täiendavalt

tasemel 1 µM, saades amplifitseeritud heterogeense rakukogumi. Antikeha 20

kontsentratsioon määratakse analüütilise proteiin-A HPLC. Parimad tootvad

kogumid valitakse kloonimiseks piiratud lahjendustega, kasutades külvitihedust 0,3

raku augu kohta, et isoleerida kõrge tootlikkusega kloonid.

Näide 5: Rekombinantsete inimese IgG ekspressiooni määramine ELISAs

VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja VHQ/humV2 iseloomustamine 25

Et määrata rekombinantse inimese antikeha IgG kontsentratsioonid, mis

ekspresseeritakse söötme supernatantides, on töötatud välja kihiline ELISA

protokoll, mida on optimeeritud inimese IgG standardina kasutades.

Lamedapõhjalistele 96 auguga mikrotiitri plaatidele (kat. nr 4-39454, Nunc

Immunoplate Maxisorp) lisatakse üle öö temperatuuril 4 °C 100 µl kitse anti-30

inimese IgG (terve molekul, kat. nr I1011, SIGMA) lõppkontsentratsioonil 0,5 µg/ml

EE - EP1664122 B1 36

fosfaat-puhverdatud saliinis. Auke pestakse 3 korda pesupuhvriga (PBS, mis

sisaldas 0,05% Tween 20) ja blokeeritakse poolteist tundi temperatuuril 37 °C

blokeerimispuhvriga (0,5% BSA PBSis). Pärast 3 pesemistsüklit valmistatakse

antikeha proovid ja standardne inimese IgG (kat. nr 14506, SIGMA), 1,5-kordset

seerialahjendust blokeerimispuhvris. 100 µl lahjendatud proove või standardit 5

viiakse kahekordselt kaetud plaadile ning inkubeeritakse 1 tund toatemperatuuril.

Inkubeerimise järgselt pestakse plaate kolm korda pesupuhvriga, inkubeeritakse

seejärel 1 tund 100 µl mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud kitse anti-inimese

IgG kappa kerge ahelaga (kat. nr A-7164, SIGMA), mida on lahjendatud 1/4000

blokeerimispuhvris. Kontrollrakud saavad 100 µl blokeerimispuhvrit või 10

kontsentreeritud tavalist söödet. Pärast segu teostatakse seotud peroksidaasi

kolorimeetriline kvantifitseerimine proovis ja standardaukudes, kasutades TMB

Peroksidaas EIA substraadi komplekti (kat. nr 172-1067, Bio-Rad) vastavalt tootja

juhistele. Peroksidaasi mikstuurile lisatakse koguses 100 µl augu kohta ja

inkubeeritakse 30 minutit toatemperatuuril pimedas. Kolorimeetriline reaktsioon 15

peatatakse 100 µl 1 M väävelhappe lisamisega ning absorptsioon igas augus

loetakse 450 nm juures, kasutades ELISA plaadi lugejat (Model 3350-UV,

BioRad).

Korrelatsioonikoefitsiendiga 0,998 IgG standardkõvera jaoks määratakse

järgnevad kontsentratsioonid nelja erineva söötme kontsentraatide osas (ca 250-20

300kordselt kontsentreeritud), mis on saadud transfekteeritud COS rakkudest:

VHE/humV1 supernatant = 8,26 µg/ml

VHE/humV2 supernatant = 6,27 µg/ml

VHQ/humV1 supernatant = 5,3 µg/ml

VHQ/humV2 supernatant = 5,56 µg/ml 25

Suurus-eksklusioonkromatograafia (SEC)

Afiinsus-puhastatud antikehi VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja

VHQ/humV2 analüüsitakse suurus-eksklusioonkromatograafias (SEC) TSKgel

Super SW3000SWXL, et määrata valgusisaldus, väikeste agregaatide protsent

(oligomeersed antikehad), samuti võimalikud kõrval- ja lagunemissaadused. 30

Kromatogrammid näitavad VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja

EE - EP1664122 B1 37

VHQ/humV2 suhtes, et peamine piik on lõhenenud ja et eraldumine on nähtavam

kogumite puhul raske ahelaga E (joonis fig. 12). Saadud tulemused näitavad, et on

vähemalt kaks molekuli retentsiooniajaga, mis on tüüpiline IgG antikehale, mis

sisaldub igas proovis.

SDS-PAGE redutseerivatel tingimustel 5

Humaniseeritud CD45RO/RB siduvate molekulide VHE/humV1, VHE/humV2,

VHQ/humV1 ja VHQ/humV2 analüüs SDS-PAGE redutseerivatel tingimustel

(gradient geel, 4 kuni 20% Tris-Glycine gel, Novex) näitab ootamatu täiendava riba

kohalolu, mis migreerub veidi riba kohal, vastates raske ahela ribale igas proovis.

Massierinevus hinnatakse olevat vahemikus 2 kuni 4 kDa. Western Blot analüüs 10

näitab, et ülemise riba tunnevad ära anti-inimese (H + L) antikehad, lubades

oletada, et täiendav riba on raske ahela variant.

Katioonvahetus-kromatograafia (CEX)

Laengu heterogeensust hinnatakse katioonvahetus-kromatograafias (CEX),

kasutades PolyCatA kolonni (PolyLC Inc). Ehkki kimäärne monokloonne antikeha 15

sisuliselt laengu heterogeensust ei sisalda, välja arvatud C-otsa lüsiini variandid,

on kõik humaniseeritud CD45RO/RB siduvad molekulid, s.o VHE/humV1,

VHE/humV2, VHQ/humV1 ja VHQ/humV2 oma laengult väga heterogeensed.

Laengu heterogeensuse tavaliseks põhjuseks antikehades on Lys

kohalolu/puudumine antikeha raske ahela C-otsas, mille tulemuseks on kolm piiki 20

CEXis. Nähtavate piikide kõrge arv igal kromatogrammil (>10; joonis fig. 13)

näitab, et vähemalt üks täiendab modifikatsioon sisaldub kõigis neljas

CD45RO/RB siduvas molekulis.

SDS-PAGE

Et hinnata molekulaarseid erinevusi kahe antikeha liigi vahel, mis sisalduvad valgu 25

kogumites VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja VHQ/humV2, valitakse

VHE/humV2 täiendavaks analüüsiks. VHE/humV2 kaks SEC piiki kogutakse pool-

ettevalmistaval moel ja analüüsitakse uuesti SECis, et kinnitada nende puhtus.

SECiga kogutud fraktsioone (fraktsioon 1 ja fraktsioon 2) analüüsitakse seejärel

EE - EP1664122 B1 38

SDS-PAGE redutseerimise tingimustel. Ootamatu lisariba proportsioon ligikaudu

49 kDa juures on kahe fraktsiooni vahel erinev. Fraktsioon 2 seda täiendavat

kõrgemat riba praktiliselt ei sisalda.

ESI-Q-TOF massispektromeetria

SEC fraktsioone F1, F2 ja VHE/humV2 valgukogumit analüüsitakse seejärel ESI-5

Q-TOF massispektromeetrias. Valgukogumi ja fraktsiooni 2 spektrogrammides

täheldatakse samu signaalide gruppe. Esimene signaalide grupp on ligikaudu 148

000 Da valgukogumis ja fraktsioonis 2, aga seda ei tuvastatud fraktsioonis 1.

Fraktsioonis 1 tuvastatakse teine signaalide grupp (ligikaudu 150 300 Da) lisaks

signaalide grupile ligikaudu 152 500 Da. Teist signaalide gruppi ligikaudsel 10

tasemel 150 320 Da ei tuleks korreleeruda tavaliselt täheldatud antikeha

vormidega. Need avastused näitavad, et SECi kaks piiki ja kaks ülemist riba

redutseeritud SDS-PAGEs vastavad kõik oodatud valgu variantidele.

Pöördfaasiline kromatograafia

Et saada massispektromeetrias vähem keerukam muster, analüüsitakse antikeha 15

ahelaid täiendavalt eraldi. Fraktsioonid redutseeritakse ja alküülitakse. Et kinnitada

reaktsioonide täielikkust order analüüsitakse redutseeritud ja alküülitud proove

pöördfaasilises (RP) kromatograafias (SORBAX, Poroshell 300SB-C8). Pärast

redutseerimist ja alküülimist on piigi kuju peaaegu sama kui vaid redutseerimise

järel. Täheldatakse nihet retentsiooniajas. Sarnased mustrid saadakse SEC 20

fraktsiooni 1 ja fraktsiooni 2 redutseeritud ja alküülitud proovide kohta.

VHE/humV2 valgukogumi proovi, SEC fraktsiooni 1 ja SEC fraktsiooni 2

(redutseeritud ja alküülitud) analüüsitakse ESI-Q-TOF massispektromeetrias. Mitu

massi piiki on võimalik määrata oodatud antikeha vormidele. Samad põhilised

piigid leiduvad kõigis kolmes proovis (valgukogum, F1 ja F2), aga nende 25

intensiivsused fraktsioonis 2 on väga madalad (joonis fig. 14).

Raske ahela variantide süsivesikute analüüs

Redutseeritud ja alküülitud antikeha süstitakse pöördfaasilise (RP) kromatograafia

kolonni ning kogutakse need kaks piiki, mis vastavad raske ahela variantidele.

Seejärel määratakse nende RP-fraktsioneeritud antikehade oligosahhariidi 30

EE - EP1664122 B1 39

profiilid. Eeldatavate G0 ja G1 oligosahhariidide jääkide seas, mis leiduvad kõigis

proovides, tuvastatakse mitugi teist piiki fraktsiooni 1 kromatogrammis (nende

piikide jäljed on samuti tuvastatavad fraktsiooni 1 ja valgukogumi

kromatogrammides).

Koos võetuna osutavad need tulemused, et suuremad antikeha liigid sisaldavad 5

täiendavat glükosülatsiooni, mida SP2/0 ekspresseeritud monokloonsete

antikehade puhul tavaliselt ei kohta tingituna massi erinevusest. Et suur, keerukas

glükosülatsioon, mis tuvastatakse süsivesinike analüüsis ja massispektromeetrias,

on väga ebatõenäoline konserveerunud saidi puhul antikeha konstantses

piirkonnas, otsitakse muid võimalike saite humaniseeritud antikehade 10

aminohappelises järjestuses. Potentsiaalne sait (N73) N-glükosüülimiseks (N-X-S)

identifitseeritakse kahe raske ahela variandi varieeruvas domäänis.

Ettevalmistav fraktsioneerimine CEXis

Täiendavad analüüsid teostatakse materjaliga, mis on puhastatud VHE/humV1

kogumist. Et vähendada materjali heterogeensust, eemaldatakse C-otsa lüsiin 15

karboksüpeptidaas-B töödeldes. VHE/humV1 antikeha fraktsioneeritakse

ettevalmistavad katioonvahetus-kromatograafias, kasutades SP sefaroosi

(Pharmacia). Kolonn tasakaalustatakse 25 mM naatriumfosfaadi puhvriga, pH 6,0

(= puhver A) ja seotud valku elueeritakse 250 mM NaCl puhvris A (= puhver B;

gradient 0-65% B-st). Fraktsioonide puhtust analüüsitakse CEX abil. Kogutud 20

fraktsioonid süstitakse taas SEC kolonni, et leida võimalik korrelatsioon kahe

tehnika abil saadud tulemuste vahel. See kromatogramm näitab, et esimene

piikide rühm, mis saadi CEX tehnikas, korreleerub eelpiigiga antikeha SEC

analüüsis, ning et piikide teine rühm, mis saadi CEX tehnikas, ühtib esimese

piigiga valgukogumi SEC analüüsis (või fraktsiooni 1 analüüsis), ning et viimane 25

piik CEX tehnikas elueerib viimase piigina SEC tehnikas (või fraktsiooniga 2).

Järeldusena võib märkida, et eelkirjeldatud tulemused (SEC fraktsioonide 1 ja 2

oligosahhariidide profiil, CEX muster, mis saadi pärast de-karboksüülimist, SEC

muster, mis saadi CEX tehnikas, massispektromeetrias kogutud fraktsioonide

kohta) osutavad tugevalt komplekssete oligosahhariididega antikeha liikide 30

kohalolule, põhjustades a) massi heterogeensust, tingides topeltpiigi SEC tehnikas

EE - EP1664122 B1 40

ja b) täheldatud kahekordse raske ahela riba redutseeritud SDS-PAGE laengu

heterogeensuses, mille tulemusel saadakse CEX muster.

CEX fraktsioonide analüütiline iseloomustamine

Et suuremad antikeha liigid elueerivad CEX tehnikas varem, osutades sellele, et

nad on vähem positiivselt laetud, mõõdetakse siaalhappe kohalolu (komplekse 5

glükosülatsiooni komponent ja negatiivselt laenguga) erinevates fraktsioonides,

mis on saadud ettevalmistavas CEX. Siaalhape sisaldub erinevatel tasemetel

kõigis 4 proovis. Leitud siaalhape on kõige tõenäolisemalt N-glükolüül-

neuramiinhappe kujul (vastavalt lühemalt retentsiooniajale N-

atsetüülneuramiinhappe standardiga võrreldes). Siaalhappe väga madal kohalolu 10

ühes CEX fraktsioonis erinevalt selle rohkusest teises CEX fraktsioonis vihjab

tugevalt asjaolule, et negatiivselt laetud suhkru komponent etendab osa

massi/laenu heterogeensuses. CEX fraktsioone analüüsitakse ESI-Q-TOF

massispektromeetrias.

SDS-PAGE 15

Samu fraktsioone analüüsitakse SDS-PAGE tehnikas redutseerivatel tingimustel.

Võib järeldada, et ülemine raske ahela riba vastab antikeha osale, millel on

kompleksne oligosahhariidi profiil, mis sisaldab siaalhapet. Madalama raske ahela

riba vastab eeldatud antikehale, millele on konventsionaalne oligosahhariidi profiil.

Papaiiniga seeditud CEX fraktsioonide eraldamine Mono-S kolonnis 20

Et kinnitada potentsiaalse glükosüülimise saidi kasutust raske ahela varieeruvas

domäänis, töödeldakse ligikaudu 1 mg iga CEX fraktsiooni papaiiniga, et eraldada

antikeha Fab ja Fc osa. Ettevalmistav kromatograafia teostatakse Mono-S

kolonnis. Kogutud allfraktsioonid süstitakse uuesti RP kolonni, et identifitseerida

selle sisu Fab ja/või Fc domäänide osas. Kogutud allfraktsioone analüüsitakse 25

ESIQ-TOF massispektromeetrias. Saadud tulemused näitavad, et a)

konserveerunud glükosüülimise saiti raske ahela Fc osas hõivavad biantennilised

oligosahhariidi vormid ühegi (G0), ühe (G1) või kahe otsa (G2) galaktoosi

üksustega; b) ning et vastupidi, ebaregulaarne glükosüülimise sait (N73) kannab

kompleksseid oligosahhariide, mis sisaldavad N-glükolüül neuramiinhapet. 30

EE - EP1664122 B1 41

Järelduseks võib nentida, et asparagiini jääk N73 raske ahela varieeruvas

piirkonnas on osaliselt N-glükosüülitud. Need suhkru liigid tingivad massi

heterogeensust, samuti laengu heterogeensust, mis on tuvastatavad SDSPAGE,

suurus-eksklusioonkromatograafia ja katioonvahetus-kromatograafia abil.

VHE-N73D/humV1 iseloomustamine 5

Et kõrvaldada humaniseeritud VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 ja

VHQ/humV2 antikehade heterogeensus, asendatakse asparagiini jääk raske ahela

varieeruva piirkonna asendis N73 asparagiinhappe jäägiga (vt näide 4). VHE-

N73D/humV1 analüüsitakse seejärel edasi:

Suurus-eksklusioonkromatograafia analüüs (SEC) 10

SEC teostatakse vastavalt ülalkirjeldatule. SEC analüüsis täheldatakse selget

erinevust VHE/humV1 ja VHE-N73D /humV1 vahel. Erinevalt topeltpiigist, mis

saadi VHE/humV1 puhul, saadakse VHE-N73D/humV1 puhul vaid üks piik (joonis

fig. 12). Ligikaudu 0,2% agregaatidest kvantifitseeritakse SEC tehnikas.

SDS-PAGE redutseerivatel tingimustel 15

VHE/humV2 ja VHE-N73D/humV1 analüüsitakse edasi SDS-PAGE tehnikas

redutseerivatel tingimustel, nagu eelnevalt kirjeldatud. VHE-N73D/humV1 puhul on

nähtav vaid üks riba eeldatavas raske ahela (HC) asendis (ligikaudu 50 kDa). HC-

riba, mida täheldatakse VHE-N73D/humV1 puhul, vastab VHE/humV2 topelt-

madalamale ribale. Kerge ahela asend on kõigi analüüsitud valkude puhul sama. 20

Katioonvahetus-kromatograafia (CEX)

Katioonvahetus-kromatograafia (CEX) teostatakse, nagu eelnevas kirjeldatud.

CEX analüüsis saadud tulemused näitavad, et VHE-N73D/humV1 laenu

heterogeensust vähendatakse C-otsa lüsiini variantides (kolm piiki), võrreldes

VHE/humV2 laengu kõrge heterogeensusega (>10; joonis fig. 13) MALDI TOF 25

analüüsis (massispektromeetria)

EE - EP1664122 B1 42

Raske ja kerge ahela MALDI TOF analüüsis (massispektromeetria) tuvastatud

mass on kooskõlas eeldatava massiga, mis on järeldatud VHE-N73D/humV1

aminohappelisest järjestusest.

Pöördfaasiline kromatograafia (RP)

Pärast redutseerimist DDT tehnikas analüüsitakse kaht humaniseeritud antikeha 5

VHE/humV2 ja VHE-N73D/humV1 pöördfaasilises kromatograafias (RP).

Tingituna osaliselt glükosüülimisest aspargiinil N73, täheldatakse „raskeid ahelaid“

VHE/humV2 (topeltpiik ligikaudu 18,5 min) puhul piikide seas, mis vastavad

kergele ahelale (ligikaudu 17,3 min). VHE-N73D/humV1 puhul täheldatakse raskel

ahelal üksnes üht piiki (joonis fig. 14). 10

Näide 6: FACS võrdlusanalüüs (sidumisafiinsus)

Inimese T-rakuliin PEER valitakse sihtrakuks FACS analüüsiks, sest see

ekspresseeris oma rakupinnal CD45 antigeeni. Et analüüsida humaniseeritud

antikeha supernatantide sidumisafiinsust, teostatakse võrdluskatsed, kasutades

FITC-märgistatud kimäärset antikeha võrdlusena ja võrreldes puhastatud hiire 15

antikeha ja kimäärse antikeha inhibitsiooniga. PEER rakukultuure tsentrifuugitakse

10 sekundit pööretel 3000 p/min ning sööde eemaldatakse. Rakud

resuspendeeritakse FACS puhvris (PBS, mis sisaldab 1% FBS ja 0,1 %

naatriumasiidi) ja külvatakse 96-augulisele ümarapõhjalisele mikrotiitri plaadile

rakutihedusel 1x105 rakku augu kohta. Plaati tsentrifuugitakse ja supernatant 20

eemaldatakse. Blokeerimise uuringuteks lisatakse esimesse auku esmalt 25 µl

kontsentreeritud transfekteerimata söödet või isotüüpi, mis sobitub

kontrollantikehaga (negatiivsed kontrollid), märgistamata hiire antikeha või

kimäärset antikeha (positiivsed kontrollid), samuti kontsentreeritud supernatanti,

mis sisaldab erinevates tekstis märgitud kogustes humaniseeritud antikeha 25

(proovid). Pärast 1 tundi inkubeerimist temperatuuril 4 °C pestakse PEER rakke

200 µl FACS puhvriga tsentrifuugides. Rakke inkubeeritakse seejärel 1 tund

temperatuuril 4 °C kimäärse antikehaga, mis on konjugeeritud FITC 25 µl FACS

puhvris lõppkontsentratsioonis 20 µg/ml. Rakke pestakse ja resuspendeeritakse

300 µl FACS puhvris, mis sisaldab 2 µg/ml propiidiumjodiidi, mis võimaldab juhtida 30

EE - EP1664122 B1 43

elujõulisi rakke. Rakukoostisi analüüsitakse voolutsütomeetris (FACSCalibur,

Becton Dickinson).

FACS analüüsid näitavad doosist sõltuvat fluorokroom-märgistatud kimäärse

antikeha blokeerimist kontsentreeritud humaniseeritud antikeha kultuuri

supernatantidega. Doosist sõltuvat kimäärset antikeha sidumise blokeerimist ei 5

täheldata sobiva isotüübiga kontrollantikeha korral, mis tõendab asjaolu, et

erinevate humaniseeritud antikeha kombinatsioonide blokeeriv toime on epitoobi-

spetsiifiline ja et epitoobi-spetsiifilisus säilib pärast humaniseerimise protsessi.

Lahjendamata supernatanti eelnevalt nimetatud SP2/0 transfektantidest või

kimäärset antikehast (positiivsed kontrollid) või sobiva isotüübiga 10

kontrollantikehast (negatiivsed kontrollid) inkubeeritakse tasemel 2 µg/ml söötmes

1,5 x 105 PEER rakkudega 100 µl 30 minutit temperatuuril 4 °C. Seejärel lisatakse

100 µl PBS, mis sisaldab FITC-märgistatud kimäärset antikeha, igale proovile ning

inkubeerimine temperatuuril 4 °C jätkub veel 30 minutit. Pärast pesemist

resuspendeeritakse rakud FACS-PBS, mis sisaldab 1 µg/ml 7-amino-aktinomütsiin 15

D, ja analüüsitakse voolutsütomeetrias, kasutades Becton Dickinson FACSCalibur

seadet ja CellQuest Pro tarkvara. Sulgemine („gating“) teostatakse elusrakkudel,

s.o 7-amino-aktinomütsiin D – negatiivsed sündmused.

FACS analüüsid näitavad, et märgistamata humaniseeritud CD45RB/RO siduvad

molekulid, nt VHE/humV1 ja VHQ/humV1, aga mitte sobiva isotüübiga 20

kontrollantikeha, konkureerivad FITC-märgistatud kimäärse antikehaga, et siduda

inimese CD45-positiivset T-rakuliini PEER.

VHE-N 73D/humV1 spetsiifilisus

Et hinnata, kas humaniseeritud CD45R0/RB siduva molekuli VHE/humV1

modifitseerimine, s.o asparagiini vahetus aspartaadi vastu CD45RO/RB siduva 25

molekuli raske ahela aminohappe asendis 73, modifitseeris reaktiivsust

samatüvelise epitoobiga, analüüsitakse VHE-N73D/humV1 reaktiivsust CD45-

ekspresseeriva inimese T-rakuliini PEER sidumise võrdluskatses.

PEER rakke inkubeeritakse VHE-N73D/humV1, selle kimäärse eellasega või

mitte-siduva isotüübi IgG1 kontrollantikehaga. Sidumata antikeha pestakse välja ja 30

EE - EP1664122 B1 44

rakke inkubeeritakse fluorestseiinisotiotsüanaat-(FITC)-märgistatud kimäärse anti-

CD45R0/RB monokloonse antikehaga või FITC-märgistatud isotüübi IgG1

kontrollantikehaga. Pärast pesemist teostatakse rakkudega voolutsütomeetria

analüüs, et määrata FITC-märgistatud antikeha kogus, mis on seotud

eelinkubeeritud PEER rakuga: PEER rakukultuure tsentrifuugitakse 10 minutit 400 5

korda standardse raskusjõuga (g) ja sööde eemaldatakse. Rakud

resuspendeeritakse FACS puhvris (PBS, mis sisaldab 1 mahu% FBS, 0,1

mass/mahu% EDTA ja 0,1 mass/mahu% naatriumasiidi) ja külvatakse 96-

augulistele V-põhjaga mikrotiiri plaatidele tihedusel 1 x 105 rakku augu kohta.

Plaati tsentrifuugitakse ja supernatant eemaldatakse. Iga rakkude proovi 10

inkubeeritakse 30 minutit temperatuuril 4 °C 50 µl FACS puhvris, mis sisaldab 20

µg/ml kimäärset anti-CD45R0/RB monokloonset antikeha, VHE-N73D/humV1 või

IgG1 kontrollantikeha. Järgmiseks pestakse PEER rakke kaks korda 150 µl FACS

puhvriga tsentrifuugides. Rakke inkubeeritakse seejärel 30 minutit temperatuuril 4

°C 50 µl FACS puhvris, mis sisaldab 20 µg/ml FITC-konjugeeritud kimäärset 15

monokloonset antikeha või FITC-konjugeeritud 3G5 kontrollantikeha. Lõpuks

pestakse rakke ja resuspendeeritakse 200 µl FACS puhvris, mis sisaldab 7-amino

aktinomütsiin D (7-AAD) tasemel 1 µg/ml, mis võimaldab identifitseerida

elujõulised rakud analüüsi käigus. Rakukoostisi analüüsitakse FACSCalibur

voolutsütomeetriga (Becton Dickinson). 20

Täheldatakse, et märgistamata VHE-N73D/humV1 ja märgistamata kimäärne anti-

CD45R0/RB monokloone antikeha, aga mitte IgG1 kontrollantikeha, takistavad

FITC-märgistatud kimäärset anti-CD45R0/RB monokloonset antikeha sidumast

CD45-ekspresseerivat PEER rakke, nagu määratud langenud fluorestsentsi

signaaliga. Järeldusena leiti, et VHE/humV1 antikeha modifitseerimine VHE-25

N73D/humV1 antikehaks ei muuda humaniseeritud anti-CD45R0/RB siduva

molekuli epitoobi-spetsiifilisust.

VHE-N73D/humV1 antikeha afiinsuse inimese või cynomolgus ahvi CD45 suhtes

Et määrata VHE-N73D/humV1 antikeha afiinsust selle epitoobi suhtes, võidakse

kvantifitseerida VHE-N73D/humV1 reaktiivsus inimese CD45-ekspresseeriva T-30

rakuliiniga PEER või cynomolgus ahvi CD45-ekspresseeriva T-rakuliiniga HSC-F

EE - EP1664122 B1 45

sidumise võrdluskatses, mis on sarnane meetodiga, mida on kirjeldanud Daley et

al., 1995; J. Mol. Biol. 253:243.

Lühidalt kasutatakse PEER või HSC-F rakkude määrimise intensiivsust FITC-

märgistatud antikehaga erinevates kontsentratsioonides märgistamata

konkureeriva antikeha kohalolekul, et arvutada märgistamata antikehade 5

afiinsused. Täpsemalt mõõdetakse esimeses etapis FITC-märgistatud hiirest

derivatiseeritud anti-inimese CD45RB/RO antikeha A6 (mA6) kontsentratsioon ja

fluorokroomi märgistuse stöhhiomeetria. Järgmiseks määratakse sihtmolekuli

CD45 kontsentratsioon PEER või HSC-F rakuliini pinnal eelnevalt nimetatud FITC-

konjugeeritud mA6 yes (hiirest derivatiseeritud anti-inimese CD45) antikeha abiga, 10

kasutades teada molekulaarse märgistusastmega fluorestsentseid pärleid.

Rakuliste CD45 retseptorite kontsentratsiooni ja selle teada FITC-konjugeeritud

ligandiga määratakse FITC-konjugeeritud mA6 afiinsus rakuliste CD45 retseptorite

suhtes FACS-põhises tasakaalu tiitrimise meetodis. Lõpuks määratakse

märgistamata antikeha VHE-N73D/humV1 afiinsus konkureerivate 15

määrimisreaktsioonide põhjal FITC-konjugeeritud mA6ga PEER või HSC-F

rakkudel, mõõtes FITC fluorestsentsi kasvu VHE-N73D/humV1

kogukontsentratsiooni funktsioonina. Kui kuupvõrrandit, mis on sidumise tasakaalu

algebraliselt eksplitsiitseks kirjelduseks kahe ühe retseptori sidumise osas

konkureeriva ligandi mikstuuris, rakendatakse programmis Origin 7.5, kasutatakse 20

selle tarkvara programmi, et arvutada VHE-N73D/humV1 dissotsiatsioonikonstandi

(Kd) väärtus korduvate kõverale paigutamise analüüsides.

Ühes katses arvutati VHE-N73D/humV1 dissotsiatsioonikonstandiks inimese

PEER rakulise sihtmärgi suhtes 2,44 ± 0,07 nM - cynomolgus HSC-F rakuliini

suhtes aga 1,67 ± 0,00 nM, eeldades divalentse antikeha seostumist CD45RO/RB 25

sihtmolekulidega.

Näide 7: CD45RB/RO siduvate molekulide bioloogilised aktiivsused

Selles uuringus vaatlesime, kas CD45RB/RO siduv kimäärne antikeha, kui see

sisaldub polükloonselt aktiveeritud primaarsetes inimese T-rakkude kultuurides, (i)

toetab T-rakkude eristumist neile omase Treg fenotüübiga, (ii) takistab või 30

EE - EP1664122 B1 46

soodustab apoptoosi pärast T-rakkude aktiveerimist, ja (iii) mõjutab alamhulga-

spetsiifiliste antigeenide ja retseptorite ekspressiooni pärast restimulatsiooni.

CD45RB/RO siduv kimäärne antikeha parendab rakusurma polükloonselt aktiveeritud T-rakkudes

Primaarsed T-rakud (CD4+ ja CD8+ T-rakkude alamhulkade segu) aktiveeriti anti-5

CD3 ning anti-CD28 monokloonse antikehaga (iga 200 ng/ml) CD45RB/RO siduva

kimäärse antikeha kohalolekul või puudumisel (=kontroll). Antikeha liiased

eemaldatakse pesuga teisel päeval. 7-amino-aktinomütsiin D (7-AAD) DNA-

määriva värvina võetakse üles apoptootiliste ja nekrootiliste rakkudega, et mõõta

aktivatsiooni järgset rakusurma. Saadud tulemused näitavad, et T-rakkude 10

aktiveerimine CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha kohalolekul suurendas 7-

AAD positiivsete rakkude fraktsioone kahekordselt teisel päeval pärast

aktiveerimist. Seitsmendal päeval oli 7-AAD positiivsete rakkude osakaal taas

sarnane nii CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud kultuurides kui ka

kontrollkultuurides. 15

CD45RB/RO siduva kimäärne antikeha, aga mitte monokloone kontrollantikeha, mida on töödeldud T-rakkudega, näitavad T-regulaatorraku (Treg) fenotüüpi

CD25 suurenenud ekspressioon ja negatiivne reguleeriv valk CTLA-4 (CD152) on

Treg rakkude markeriteks. Primaarsete ja sekundaarsete T-raku vastuste 20

funktsionaalne supressioon CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga võib olla

tingitud Treg rakkude induktsioonist. Selle uurimiseks aktiveeritakse T-rakud anti-

CD3 + CD28 monokloonsete antikehadega ja neid kasvatakse CD45RB/RO

siduva kimäärse antikeha või anti-LPS monokloonse kontrollantikeha kohalolekul.

CTLA-4 ja CD25 ekspressiooni ajaline kulg näitab olulisis erinevusi kontrollide ja 25

CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud T-rakkude vahel esimesel ja

kolmandal päeval pärast sekundaarset stimuleerimist, näidates Treg fenotüüpi.

Rakusisest CTLA-4 ekspressiooni säilitatakse CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha kohalolekul

EE - EP1664122 B1 47

On täheldatud, et rakusiseselt võib leiduda olulises koguses CTLA-4. Seega

analüüsiti paralleelselt CTLA-4 pinna värvimiseks CTLA-4 rakusisest

ekspressiooni. Mõõdukad erinevused T-raku kultuuride vahel esinesid neljandal

päeval pärast stimuleerimist. Pärast pikemaajalist kasvatamist aga püsisid kõrged

rakusisesed CTLA-4 tasemed üksnes CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga 5

töödeldud T-rakkudes, mitte aga kontroll-T-rakkudes.

CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud T-rakud muutuvad topeltpositiivseks CD4 ja CD8 suhtes

Pärast stimuleerimist indutseerivad ja üles-reguleerivad T-rakud mitmete

pinnaretseptorite, näiteks CD25, CD152 (CTLA-4), CD154 (CD40-Ligand) ja teiste 10

selliste ekspressiooni. Samas arvatakse, et CD4 või CD8 ekspressiooni tase jääb

suhteliseks konstantseks. Vaatlesime reprodutseeritavalt nii CD4 kui ka CD8

antigeenide olulist kasvu CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud T-

rakkudel, aga mitte kontrollantikehaga töödeldud T-rakkudel pärast aktiveerimist.

CD4/CD8 topeltpositiivse T-raku populatsiooni esinemine näib olevat tingitud CD4 15

ülesreguleerimisest CD8+ alamhulgas ja CD8 ülesreguleerimisest CD4+

alamhulgas. See on vastuolus topeltpositiivsete T-rakkude madala protsendiga

kontrollkultuurides.

Kõrge IL-2 retseptori aIfa-ahela, aga väga madal beeta-ahela ekspressioon CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud T-rakkudega 20

Treg on teadaolevalt püsivalt positiivsed CD25 suhtes, IL-2 retseptori alfa-ahela

suhtes. Trimeerse IL-2 retseptori muude allüksuste reguleerimine Treg rakkudel on

tundmata. Hiljuti võrdleseime IL-2 retseptori, näiteks CD122 beeta-ahela

ekspressiooni T-rakkudel, mida on aktiveeritud ja propageeritud CD45RB/RO

siduva kimäärse antikeha kohalolekul või puudumisel. Need tulemused näitavad, 25

et CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud T-rakkudel on ligikaudu

kümnekordselt madalam CD122 ekspressioon, võrreldes T-rakkudega

kontrollkultuurides. See erinevus võib näidata, et Treg rakud eeldavad vohamiseks

IL-2-st erinevaid faktoreid.

Näide 8: Leiutise järjestused (leiutise CDR järjestused on alla joonitud) 30

EE - EP1664122 B1 48

SEQ ID nr: 1 Kimäärse kerge ahela aminohappelise järjestuse osa

SEQ ID nr: 2 Kimäärse raske ahela aminohappelise järjestuse osa 5

SEQ ID nr: 3 Kimäärse kerge ahela aminohappeline järjestus

SEQ ID nr: 4 10

Kimäärse raske ahela aminohappeline järjestus

SEQ ID nr: 5 Polüpeptiidi SEQ ID nr: 1 kodeeriv nukleotiidjärjestus

15 SEQ ID nr: 6

EE - EP1664122 B1 49

Polüpeptiidi SEQ ID nr:2 kodeeriv nukleotiidjärjestus

SEQ ID nr: 7 Humaniseeritud kerge ahela humV2 (humV2 = VLm) aminohappelise järjestuse osa 5

SEQ ID nr: 8 Humaniseeritud kerge ahela humV1 (humV1 = VLh) aminohappelise järjestuse osa

10 SEQ ID nr: 9 Humaniseeritud raske ahela VHE aminohappelise järjestuse osa

SEQ ID nr: 10 Humaniseeritud raske ahela VHQ aminohappelise järjestuse osa 15

SEQ ID nr: 11 Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 9 kodeeriv nukleotiidjärjestus

EE - EP1664122 B1 50

SEQ ID nr: 12 Aminohappelist järjestus SEQ ID nr: 10 kodeeriv nukleotiidjärjestus

SEQ ID nr: 13 5

Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 7 kodeeriv nukleotiidjärjestus

SEQ ID nr: 14 Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 8 kodeeriv nukleotiidjärjestus

10

SEQ ID nr: 15

EE - EP1664122 B1 51

Ekspressioonivektori HCMV-G1 HuA6-VHQ (humaniseeritud raske ahela ekspressioonivektori täielik DNA järjestus, mis hõlmab SEQ ID nr: 12 (VHQ) 3921-4274) nukleotiidjärjestus

EE - EP1664122 B1 52

EE - EP1664122 B1 53

EE - EP1664122 B1 54

EE - EP1664122 B1 55

EE - EP1664122 B1 56

SEQ ID nr: 16 Ekspressioonivektori HCMV-G1 HuA6-VHE (humaniseeritud raske ahela ekspressioonivektori täielik DNA järjestus, mis hõlmab SEQ ID nr: 11 (VHE) 3921-4274) nukleotiidjärjestus 5

EE - EP1664122 B1 57

EE - EP1664122 B1 58

EE - EP1664122 B1 59

EE - EP1664122 B1 60

EE - EP1664122 B1 61

SEQ ID nr: 17 Ekspressioonivektori HCMV-K HuAb-VL1 hum V1 (humaniseeritud raske ahela ekspressioonivektori täielik DNA järjestus, mis hõlmab SEQ ID nr: 14 (humV1=VLh) 3964-4284) nukleotiidjärjestus 5

EE - EP1664122 B1 62

EE - EP1664122 B1 63

EE - EP1664122 B1 64

EE - EP1664122 B1 65

EE - EP1664122 B1 66

EE - EP1664122 B1 67

SEQ ID nr: 18 Ekspressioonivektori HCMV-K HuAb-VL1 hum V2 (humaniseeritud kerge ahela ekspressioonivektori täielik DNA järjestus, mis hõlmab SEQ ID nr: 13 (humV2=VLm) 3926-4246) nukleotiidjärjestus 5

EE - EP1664122 B1 68

EE - EP1664122 B1 69

EE - EP1664122 B1 70

EE - EP1664122 B1 71

EE - EP1664122 B1 72

EE - EP1664122 B1 73

SEQ ID nr: 31: Humaniseeritud raske ahela VHE-N73D aminohappelise järjestuse osa

SEQ ID nr: 32: 5

Humaniseeritud raske ahela VHQ-N73D aminohappelise järjestuse osa

SEQ ID nr: 33: Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 8 kodeeriv nukleotiidjärjestus

EE - EP1664122 B1 74

SEQ ID nr: 34: Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 31 kodeeriv nukleotiidjärjestus

SEQ ID nr: 35 5

Aminohappelist järjestust SEQ ID nr: 32 kodeeriv nukleotiidjärjestus

SEQ ID nr 36 Ekspressioonivektori LCVL1Sp20 nukleotiidjärjestus

10

EE - EP1664122 B1 75

EE - EP1664122 B1 76

EE - EP1664122 B1 77

EE - EP1664122 B1 78

EE - EP1664122 B1 79

SEQ ID nr: 37 Ekspressioonivektori HCVHEN73DSp20 nukleotiidjärjestus

EE - EP1664122 B1 80

EE - EP1664122 B1 81

EE - EP1664122 B1 82

EE - EP1664122 B1 83

EE - EP1664122 B1 84

EE - EP1664122 B1 85

SEQ ID nr: 38 Ekspressioonivektori HCVHQN73DSp20 nukleotiidjärjestus

EE - EP1664122 B1 86

EE - EP1664122 B1 87

EE - EP1664122 B1 88

EE - EP1664122 B1 89

EE - EP1664122 B1 90

SEQ ID nr: 39 Ekspressioonivektori LCVL2Sp20 nukleotiidjärjestus

EE - EP1664122 B1 91

EE - EP1664122 B1 92

EE - EP1664122 B1 93

EE - EP1664122 B1 94

SEQ ID nr: 40 Ekspressioonivektori HCVHESp20 nukleotiidjärjestus

EE - EP1664122 B1 95

EE - EP1664122 B1 96

EE - EP1664122 B1 97

EE - EP1664122 B1 98

EE - EP1664122 B1 99

EE - EP1664122 B1 100

SEQ ID nr: 41 Ekspressioonivektori HCVHQSp20 nukleotiidjärjestus

EE - EP1664122 B1 101

EE - EP1664122 B1 102

EE - EP1664122 B1 103

EE - EP1664122 B1 104

EE - EP1664122 B1 105

EE - EP1664122 B1 106

Näide 9: CD45RO/RB siduvate humaniseeritud antikehade in vitro efektiivsus

VHE/humV1 ja VHQ/humV1

Et määrata CD45R0/RB siduvate humaniseeritud antikehade VHE/humV1 ja

VHQ/humV1 efektiivsus võrdluses kimäärse antikehaga, analüüsitakse nende 5

võimet indutseerida apoptoosi inimese T-rakkudes ja ka nende võimet inhibeerida

inimese T-rakkude proliferatsiooni.

Rakud ja reagendid

Perifeerse vere mononukleaarsed rakud (PBMC) isoleeritakse teada veregrupiga,

aga tundmatu HLA tüübiga tervete inimdoonorite leukofereesi proovidest 10

tsentrifuugides Ficoll-Hypaque seadmes (Pharmacia LKB). PBMC, mida

kasutatakse stimulaatoritega, depleteeritakse esmalt T- ja NK-rakkudega,

kasutades CD3-kattega ferromagnetilisi pärleid (Miltenyi). Pärlid ja saastavad

rakud eemaldatakse magnetväljas. T-raku depleteeritud PBMC rakke kasutatakse

stimulaatorrakkudena pärast kiiritamist (50 Gy). CD4+ T-rakke kasutatakse 15

responder-rakkudena MLR tehnikas ja isoleeritakse PBMC rakkudest CD4 T-raku

negatiivse selektsiooni komplektis (Miltenyi).

EE - EP1664122 B1 107

Saadud rakke analüüsitakse FACScan või FACSCalibur (Becton Dickinson & Co.,

CA) ja nende puhtuseks on >75%. Rakud suspendeeritakse RPMI1640 söötmes,

millele on lisatud 10% kuumus-inaktiveeritud FCS, penitsilliini, streptomütsiini ja L-

glutamiini.

Apoptoosi testid 5

Kolme terve vabatahtliku inimdoonori PBMC rakke kasvatatakse söötmes

(RPMI1640+10%FCS) üle öö (<16h) CD45R0/RB siduva kimäärse monokloonse

antikeha, humaniseeritud antikehade (VHE/humV1 ja VHQ/humV1) või anti-LPS

monokloonse kontrollantikeha kohalolekul. Kui nii on märgitud, kaasatakse rist-

sidestamise reagent, kitse anti-inimese IgG F(ab’)2-fragment (kat. nr 109-006-098, 10

JacksonLab) µg/ml kontsentratsioonis, mis on kaks korda nii kõrge kui proovi anti-

CD45 antikehade kontsentratsioon. Kõigis antikeha reagente sisaldavates

aukudes hoitakse PBS kontsentratsiooni konstantsena kõigi proovide lõikes,

nimelt 20 mahu% proovide puhul, millel puudub rist-sidestaja, või 40 mahu% rist-

sidestajaga proovide puhul. Varasemad katsed näitavad, et PBS kogus ei mõjuta 15

tulemusi.

Pärast kogu öö kasvatamist antikehade kohalolekul teostatakse proovidega

voolutsütomeetria analüüsid ja neid määratakse apoptoosi markeriga AnnexinV-

FITC (Cat.No. 556419, BD/Pharmingen) ja T-raku markeriga CD2-PE (kat. nr

556609, BD/Pharmingen). Proove töödeldakse Becton Dickinson FACSCalibur 20

seadmes ja saadud andmeid analüüsitakse CellQuest Pro tarkvara kasutades.

Saadud andmete põhjal saadud kõverad koostatakse tarkvaras Origin v7.0300

Koostamiseks kasutatav valem on järgmine:

(„sigmoid-logistiline“)

A1: lõppväärtus (sobitamise seanssideks seadistustega „jagatud“ ja „voolavad“) 25

A2: algväärtus (sobitamise seanssideks seadistustega „jagatud“ ja „voolavad“)

p: võimsus

Xo: ED50; IC50 (vt alljärgnevat).

EE - EP1664122 B1 108

Rist-sidestaja puudumisel on VHE/humV1 kõige efektiivsem ED50 väärtusega 148

± 71 nM, sellele järgneb VHQ/humV1 väärtusega 377 ± 219 nM. CD45R0/RB

siduv kimäärne antikeha on vähem efektiivsem ED50 väärtusega 2440 ±1205 nM.

Rist-sidestava antiseerumi kohalolekul kalduvad ED50 väärtused dramaatiliselt

kõrgema efektiivsuse poole vähemalt kahe suurusjärgu võrra are. Lisaks 5

võimaldab rist-sidestaja kohalolu kõrgemaid apoptoosi tasemeid väga kõrgetel

antikeha kontsentratsioonidel, isegi kuni 80%, kusjuures rist-sidestaja puudumine

võimaldab üksnes kuni 50% apoptoosi. Rist-sidestaja kohalolekul on kõverad

(antikeha kontsentratsioon/apoptoosi %) bimodaalsed kahe platooga: esimene

platoo saavutatakse madalatel antikeha kontsentratsioonidel (~ 5nM), kus 10

apoptoosi tase vastab maksimaalsele tasemele, mis saadakse rist-sidestaja

puudumisel. Teine platoo saavutatakse kõrgetel antikeha kontsentratsioonidel (~

500 nM) ja apoptoosi täheldatakse 70-80% T-rakkudest.

Mõlemad CD45R0/RB siduvad humaniseeritud antikehad on võrselt efektiivsed

ning paremad või võrdsed CD45R0/RB siduva kimäärse antikehaga võrreldes, mis 15

puudutab nende võiet indutseerida apoptoosi inimese primaarsetes T-rakkudes.

Kombineeritud lümfotsüüdi reaktsiooni testid

1 x 105 PBMC või 5 x 104 CD4+ rakke segatakse 1x 105 või 5 x104 T-rakkude

depleteeritud kiiritatud (50 Gy) PBMC rakkudes igas augus 96-augulistel plaatidel

erinevatel kontsentratsioonidel monokloonse antikeha kohalolekul või puudumisel. 20

Neid segatud rakke kasvatatakse viis päeva ja proliferatsioon määratakse,

pulseerides rakke 3H-tümidiiniga kasvatamise viimase 16-20 tunni vältel. MLR

inhibeerimine väljendatakse iga antikeha kontsentratsiooni kohta protsentuaalse

inhibitsioonina, nagu kirjeldatud näites 2.

VHE/humV1 ja VHQ/humV1 tõstetud kontsentratsioonide toimet MLRile 25

hinnatakse kolmes responder:stimulaatori kombinatsioonis. Kõik antikeha

inhibeerivad MLR doosist sõltuval moel. IC50 väärtused (vt eelnevat) on sarnased

humaniseeritud antikehade VHE/humV1 (7 ± 7 nM) ja VHQ/humV1 (39 ± 54 nM)

puhul. Mõlemad humaniseeritud antikeha on inhibeerimisel MLR potentsemad kui

EE - EP1664122 B1 109

parentaalne kimäärne antikeha (IC50 347 ± 434 nM). Nagu tavaliselt MLR katsete

puhul nähtud on doonorite varieeruvus nendes katsetes kõrge.

VHE-N73D/humV1

Et uurida VHE-N73D/humV1 bioloogilist toimet apoptoosi indutseerimisel inimese

perifeerse vere mononukleaarsetes rakkudes (PBMC), inkubeeritakse PBMC 5

rakke üle öö erinevates kontsentratsioonides VHE-N73D/humV1 kohalolekul ning

seejärel analüüsitakse apoptoosi markeri AnnexinV seostumist

voolutsütomeetrias. Inimese PBMC rakke inkubeeritakse üle öö 1 ml koekultuuri

söötmes, mis sisaldab erinevates kontsnetratsioonides kas VHE-N73D/humV1 või

teist humaniseeritud CD45RO/RB siduva molekuli varianti, VHE/humV1 või 10

kimäärset anti-CD45RO/RB monokloonset antikeha või isotüüp IgG1

monokloonset kontrollantikeha. Lisatakse kitse anti-inimese Ig Fc rist-sidestavad

F(ab’)2 fragmendid iga monokloonse antikeha kahekordses massisuhtes,

kopeerides CD45RO/RB humaniseeritud antikeha ristsidestamist Fc-

retseptoritega, mis võib esineda vivo. Järgmisel päeval pestakse rakke 15

tsentrifuugides 10 minutit 400 korda standardsel raskusjõul (g) ja sööde

eemaldatakse. Rakud resuspendeeritakse FACS puhvrisse (PBS, mis sisaldab 1

mahu% FBS, 0,1 mass/maht% EDTA ja 0,1 mass/maht% naatriumasiidi) ja

külvatakse seejärel 96-augulistele V-põhjalistele mikrotiitri plaatidele rakutihedusel

1 x 105 rakku augu kohta. Iga rakkude proovi inkubeeritakse 30 minutit 20

temperatuuril 4 °C 50 µl FACS puhvris, mis sisaldab 100 µg/ml normaalse hiire

seerumit, et blokeerida mitte-spetsiifilised sidumissaidid rakkudel, ja fükoerütriiniga

(PE)-konjugeeritud CD2, et identifitseerida inimese T-rakud. Pärast kaks korda

pesemist tsentrifuugides resuspendeeritakse rakud 100 µl kaltsiumit sisaldavas

AnnexinV määrimise puhvris (Vendor BD/Pharmingen komplekt 556419), mis 25

sisaldab 1:100 (mahusuhe) FITC-märgistatud AnnexinV. Inkubeerimisel 15 minutit

toatemperatuuril lisatakse pimedas 7-amino aktinomütsiin D (7-AAD), et saada

lõppkontsentratsiooniks 1 µg/ml, ning analüüsimiseks kasutatakse FACSCalibur

voolutsütomeetrit (Becton Dickinson). ED50 väärtused, mis näitavad antikehade

efektiivsust apoptoosi indutseerimisel, arvutatakse apoptoosi hulga analüüsist 30

(=AnnexinV-FITC fluorestsentsi intensiivsus), milline apoptoos indutseeritakse

EE - EP1664122 B1 110

antikeha kontsentratsiooni funktsioonina, kasutades tarkvara Origin 7.5

sigmoid/logistilise kõvera võrrandis.

Sellistes analüüsides täheldatakse testitud CD45RO/RB humaniseeritud antikeha

kahefaasilist efekti: antikeha madalates kontsentratsioonides tuvastatakse madal,

väiksem kui 30%, T-raku apoptoos. ED50 väärtus sellele apoptoosi tasemele 5

jõudmisel arvutatakse 0,31 ± 0,13 nM VHE-N73D/humV1 kohta. Antikeha

kõrgemates kontsentratsioonides võidakse apoptoosi indutseerida kuni 70% T-

rakkudest. ED50 väärtus sellele apoptoosi tasemele jõudsel arvutatakse 352 ± 83

nM VHE-N73D/humV1 kohta. Kokkuvõttes leitakse, et VHE-N73D/humV1

indutseerib samuti apoptoosi inimese T-rakkudes, mida on võimalik soodustada 10

rist-sidestades.

Näide 10: CD45RB/RO siduva molekuli spetsiifilisus

Kimäärne CD45RB/RO siduv molekul

CD45 molekuli ekspresseeritakse kõigis leukotsüütides. Erinevad leukotüüsid

alamhulgad ekspresseerivad aga erinevaid CD45 isovorme. Et määrata 15

CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha molekuli leukotsüüdi alamhulga

reaktiivsust, viiakse läbi alamhulga-spetsiifiliste markeritega inimese leukotsüütide

immunofluorestsents-märgistamine ja samaaegne värviga konjugeeritud

CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha immunofluorestsents-märgistamine, millele

järgneb voolu tsütomeetria analüüs. 20

Lühidalt identifitseeritakse teatud inimese perifeerse vere mononukleaarsete

rakkude (PBMC) värskelt isoleeritud valmistise alamhulgad, inimese vereliistakud,

inimese perifeerse vere neutrofiilid või inimese luuüdist derivatiseeritud

hematopoeetilised tüvirakud inkubeerides fükoerütriin-sidestatud antikehadega

CD2 (T-lümfotsüütide), CD14 (monotsüütide), CD19 (B-lümfotsüütide), CD34 25

(tüvirakkude), CD42a (vereliistakute), CD56 (looduslike tapjarakkude) või CD66b

(granulotsüütide) suhtes. FITC-märgistatud kimäärse CD45RB/RO siduva molekuli

samaaegne seostumine määratakse T-lümfotsüütidel, monotsüütidel, tüvirakkudel,

looduslikel tapjarakkudel ja granulotsüütidel, aga mitte vereliistakutel või B-

lümfotsüütidel. 30

EE - EP1664122 B1 111

VHE-N73D/humV1

Et määrata VHE-N73D/humV1 leukotsüüdi alamhulga reaktiivsus, viiakse läbi

alamhulga-spetsiifiliste markeritega inimese leukotsüütide ja värviga konjugeeritud

VHEN73D samaaegne immunofluorestsents-märgistamine, millele järgneb

voolutsütomeetria analüüs. 5

Lühidalt inkubeeritakse inimese perifeerse vere mononukleaarsete rakkude

(PBMC) värskelt isoleeritud valmistise teatud alamhulgad või inimese perifeerse

vere neutrofiilid inkubeerides fükoerütriin-sidestatud antikehadega CD3, CD4, CD8

(T-lümfotsüütide), CD14 (monotsüütide), CD16 (looduslike tapjarakkude ja

monotsüütide), CD19 (B-lümfotsüütide) või CD66b (granulotsüütide) suhtes. FITC-10

märgistatud VHE-N73D/humV1 samaaegne sidestamine tuvastatakse T-

lümfotsüütidel, monotsüütidel, looduslikel tapjarakkudel ja granulotsüütidel, aga

mitte B-lümfotsüütidel. seega eri reageeri VHE-N73D/humV1 molekulid inimese B-

lümfotsüütidega.

Näide 11: T-supressorrakkude (T-regulatoorrakkude) ja funktsionaalselt 15

paralüseeritud T-rakkude in vitro induktsioon

Et näidata CD45RO/RB siduva kimäärse antikeha võimet indutseerida T-

superssorrakke, kaastatakse see antikeha erinevates kontsentratsioonides CD8+

T-rakkuliinide saamisesse, mis on reaktiivsed hemophilus influenza maatriksi

antigeeni valguga 1 (MP1). Need rakuliinid saadakse CD8+ inimese lümfotsüütide 20

korduva kasvatamisega koos CD14+ inimese monotsüütidega, mis pulseeritakse

vastava antigeeniga. Hiljem asendatakse CD14+ monotsüüdid inimese

leukotsüüdi antigeen-2 positiivse rakuliiniga kui MP1 antigeeni esitava rakuga

(APC). Kui sellised MP1-spetsiifilised CD8+ T-rakud, mis pärinevad CD45RO/RB

siduvat kimäärset antikeha sisaldavast kasvukeskkonnast, segatakse värskelt 25

isoleeritud inimese CD8+ T-rakkudega ning saadud segu stimuleeritakse MP1

antigeeniga APC-l, võib CD8+ T-rakkude lisamine, mis pärinevad

kasvukeskkonnast CD45RO/RB siduva molekuli kohalolekul, redutseerida IFN-�

tootmist antikeha doosist sõltuval moel. Selles IFN-� testsöötmes ei sisaldu

CD45RO/RB siduvat kimäärset antikeha, osutades tõigale, et eeltöötlemine 30

CD45RO/RB monokloonse antikehaga indutseeris CD8+ T-rakud, mis suudavad

EE - EP1664122 B1 112

suruda maha värskelt isoleeritud T-rakkude aktiveerimise. Selle T-

regulaatorrakkude indutseerimise tõttu CD45RO/RB siduva kimäärse antikeha

poolt, võib see antikeha olla kasulik haiguste puhul, kus düsreguleeritud ja/või

aktiveeritud T-raku populatsioon etendab arvatavalt osa patoloogias. Sääraste

haiguste näideteks on muuhulgas autoimmuunhaigused, transplantaadi 5

äratõukereaktsioon, psoriaas, dermatiit, põletikuline soolehaigus ja allergiad.

Et näidata kimäärse CD45RO/RB siduva molekuli võimet muuta T-rakud

hüporeaktiivseteks (anergiliseks) stimulatsioonile kaasa aitamiseks, s.o T-rakke

funktsionaalselt paralüseerida, kaasatakse see antikeha CD8+ T-rakuliinide

tootmisse, reageerides hemophilus influenza maatriks antigeeni valguga 1 (MP1), 10

nagu eelnevas selgitatud. Paralüüsi hinnatakse, aktiveerides T-rakud (mis on

eelnevalt puutunud kokku CD45RO/RB siduva kimäärse antikehaga) MP1

antigeeniga, mis esitab APC. Selles söötmes ei sisaldu CD45RO/RB siduvat

molekuli. CD8+ T-rakud, mis ei ole eelnevalt CD45RO/RB siduva kimäärse

antikehaga kokku puutunud, toodavad IFN-� nimetatud stiimuliga mõjutades. 15

Sellised CD8+ T-rakud, mida on aga eelnevalt töödeldud CD45RO/RB siduva

kimäärse antikehaga, näitavad oluliselt vähenenud kuni olematut sellise tsütokiini

tootmist vastuseks antigeen-stiimulile, osutades CD45RO/RB siduva kimäärse

antikeha võimele paralüseerida funktsionaalselt inimese T-rakke. Selle

CD45RO/RB siduva molekuli poolt tingitud funktsionaalse T-raku hüporeaktiivsuse 20

indutseerimise tõttu võidakse nimetatud antikeha rakendada haiguste puhul,

milleks on näiteks autoimmuunhaigused, transplantaadi äratõukereaktsioon,

psoriaas, dermatiit, põletikuline soolehaigus või allergiad, kus aktiveeritud T-raku

populatsioon etendab arvatavalt osa patoloogias.

Näide 12: In vivo uuringud SCID-hu Skin hiirtel 25

CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha ravitoimet nahapõletikes testitakse SCID

hiirtel. Tervete inimeste nahk siirdatakse SCID hiirtele (SCID-hu Skin) ja

põletikulist protsessi kopeeritakse, siirdades hiirtele adopteeritult ka

mononukleaarsed leukotsüüdid, mis on isoleeritud inimpatsientidelt, kes pole

suguluses nahka andnud doonoritega. 30

EE - EP1664122 B1 113

Täiskasvanud inimese naha siirdamine SCID hiirtele (SCID-hu Skin hiirtele)

Kaks väikest (1 cm2) täiskasvanud inimese naha osa (saadud Lääne-Ungari

Piirkondlikust Koepangast; WHRTB, Gyor), mis koosnesid tervest epidermist,

papillaarsest pärisnahast ja osaliselt retikulaarsest pärisnahast, siirdatakse SCID

hiirte ülaosa paremasse ja vasakusse külge C.B 17 /GbmsTac-Prkdcscid Lystbg 5

mice (Taconic, Germantown, NY), asendades nii vastava hiire naha.

Transplantaatide kvaliteeti jälgitakse 5-6 nädalat pärast siirdamist ja edukalt

siirdamise läbinud hiired (SCID-hu Skin hiired, üldiselt >85%) valitakse

CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha in vivo testideks.

Inimese mononukleaarsete rakkude pookimine SCID hiirtele 10

Mononukleaarsed leukotsüüdid (Spl) isoleeritakse täiskasvanud inimese põrna

biopsiatest (WHRTB, Gyor) pärast raku suspensiooni (kasutades raku

dissotsiatsiooni sõela, millel on suurus 50 avad) ja standardse tihedusgradiendi

protseduure. ~5 x108 Spl alikvoodid resuspendeeritakse 1,5 ml RPMI-10% FCS ja

süstitakse intraperitoneaalselt (i.p.) katsepäeval 0 SCID-hu Skin hiirtele. Need Spl 15

näitajad on eelnevate uuringute põhjal piisavad, et indutseerida letaalset kseno-

GvHD >90% hiirtest 4-6 nädalaga pärast rakkude ülekannet.

SCID-hu Skin hiirte töötlemine antikehaga

SCID-hu Skin hiiri, kellele on siirdatud inimese Spl, töödeldakse CD45RB/RO

siduva kimäärse antikehaga või anti-LPS monokloonse kontrollantikehaga päeval 20

0, vahetult pärast mononukleaarsete rakkude süstimist, 3. ja 7. päeval ning

seejärel nädalaste intervallidega. Antikehi manustatakse nahaaluselt (s.c.) doosis

100 µl PBS lõppkontsentratsioonis 1 mg kehakaalu kg kohta (b.w.).

Anti-CD45 ravi hindamine

CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha efektiivsust hinnatakse siirdamise läbinud 25

hiirte elumuse alusel, jälgides naha transplantaatide äratõukereaktsioone. Nende

tulemuste olulisust hinnatakse elumuse analüüsi statistilisel meetodil, kasutades

Log-rank testi (Manteli meetod) Systat v10 tarkvara abiga. Iga katse lõpus

võetakse ohverdatud hiirtelt histoloogilisteks uuringuteks inimnaha

EE - EP1664122 B1 114

transplantaatide ning hiire kopsu, neeru, maksu ja põrna biopsiad. Kõiki hiiri

kaalutakse katse alguses (enne rakkude siirdamist) ja kogu katse vältel (iga kahe

päeva tagant), et hinnata otse nende tervislikku seisundit. Lineaarse regressiooni

jooned saadakse, kasutades kehakaal versus päevad pärast PBMC siirdamist

väärtused, mis saadakse iga hiire kohta, ning hiljem võrreldakse nende kaldeid 5

(kontroll versus anti-CD45 töödeldud hiired), kasutades mitte-parameetrilist Mann-

Whitney testi.

Tulemused

Inimnaha transplantaate taluvad SCID hiired väga hästi. Esialgu teevad

transplantaadid läbi keratinotsüüdi hüperproliferatsiooni perioodi, mis on tingitud 10

hüperkeratootiliste kahjustuste (koorikute) tekkest. Ligikaudu 5 nädalat pärast

siirdamist kukuvad nimetatud koorikud transplantaatidelt ja paljastavad koe, mis

sisaldab normaalsele inimnahale omaseid struktuurilisi omadusi. Selle protsessi

käigus sulanduvad inimnaha transplantaadid nendega külgneva hiire nahaga,

luues värskelt kasvatatud inimese soonte võrgustiku, mis ühendab transplantaate 15

hiire aluskoega. Ringlevad inimese Spl viiakse SCID-hu Skin hiirtele (katsepäeval

0, ligikaudu 6 nädalat pärast naha siirdamist), need infiltreeruvad naha

transplantaatidesse ja pärast alloantigeeni molekulide ära tundmist, mida

ekspresseeritakse inimnahal, tingitakse põletikuline vastus, mis sarnaneb naha

põletikulise protsessiga, mis esineb psoriaatilisel nahal, ning mis teatud juhtudel 20

hävitavad transplantaadi täielikult.

Nende hiirte ravimine CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga surub maha

põletikulise protsessi ja ennetab inimnaha transplantaatide äratõukereaktsiooni.

Samas näitab proov, mis saadase kontrolliga töödeldud hiirtest, massiivset

infiltratsiooni mitmete nekroosi ja epidermi dramaatilise hävitamise märkidega. 25

Seda protsessi vaadeldakse silmaga ja dokumenteeritakse hiirte lihtsa

fotografeerimisega.

Kuus kuuest SCID-hu Skin hiirest, kellele siirdati allogeensed inimese Spl ja keda

töödeldi anti-LPS monokloonse kontrollantikehaga, näitavad tugevat põletikulist

vastust, mis on selgelt silmale nähtav 23 päev pärast mononukleaarsete rakkude 30

siirdamist. Kõigil hiirtel täheldatakse märkimisväärseid lesioone, kaasa arvatud

EE - EP1664122 B1 115

erüteemi, kestendamist ja nähtavaid mädaville. Ent naha transplantaadid kõigil

hiirtel, keda on töödeldud CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga, on tavaline

välimus. Selline dramaatiline erinevus kahe hiirte rühma vahel on tingitud

antikehaga töötlemisest, sest kõigi hiirte inimnahal on identne välimus katse

alguses. See välimus ei muutu kuni teise nädalani pärast rakkude siirdamist, millal 5

kontrollrühmal hakkavad naha lesioonid välja kujunema. Katse lõpetatakse 34.

päeval pärast mononukleaarsete rakkude siirdamist. Selleks ajaks on üks

kontrollhiirtest juba surnud (30. päev) ja neli hiirt ohverdatakse (27., 27., 27. ja 30.

päeval) tugeva kseno-GvHD tõttu. Need patoloogilised reaktsioonid, mida

täheldatakse antikeha kontrolliga töödeldud hiirtel, korreleerub samuti nende 10

loomakeste kehakaalu langusega.

Samas on CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga töödeldud rühm tervet

välimust kogu katse ajal.

Näide 13: CD45RB/RO siduva kimäärse antikeha in vivo aktiivsused inimese saarerakkude siirdamise mudelis 15

Hiired

NOD/SCID emaseid hiiri (Charles River Laboratories, Calco, Itaalia) hoitakse

spetsiifilistel patogeenivabadel tingimustel. Kvantifitseeritakse glükoosi tase

venoosses sabaveres, kasutades Glucometer Elite süsteemi (Bayer, Saksamaa).

Diabeeti indutseeritakse NOD/SCID hiirtes, süstides neile intravenoosselt 180 20

mg/kg streptosototsiini (Sigma, St.Luis, MO). Diabeet diagnoositakse pärast kaht

järjestikust glükoosi mõõtmist, mis on sealjuures kõrgem kui 250 mg/dl.

Saarerakkude valmistised ja siirdamine

Saarerakud saadakse tuksleva südamega kadaveersetelt mitme elundiga

doonoritelt. Saarerakud isoleeritakse vastavalt meetodile, mida on kirjeldanud 25

Bertuzzi et al., Diabetes, 1999, 48: 1971-8. Puhastatud saarerakke kasvatatakse

steriilsetes kolbides, mis sisaldavad 25 ml M199 söödet (Seromed Biochrom,

Berliin, Saksamaa), millele lisatakse 10% FCS, 1% L-glutamiini, 100 ükskused/ml

penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini (täielik sööde). Saarerakke inkubeeritakse

temperatuuril 30 °C 5% CO2 atmosfääris ja 95% niiskusega õhus. Hiired 30

EE - EP1664122 B1 116

tuimestatakse, süstides neile intraperitoneaalselt avertiini ning 1500 IE inimese

saarerakkude alikvoodid siirdatakse diabeetiliste NOD/SCID hiirte

neerukapslitesse, nagu kirjeldanud Davalli A.M. et al., Diabetes, 1996, 45: 1161-7.

Pärast siirdamist süstitakse NOD/SCID hiirtele intraperitoneaalselt 50 x 106

värskelt isoleeritud PBMC rakke. 5

Siirdamise läbinud hiirte ravi

Hu-PBL-NOD/SCID siirdamise läbinud hiiri töödeldakse päeval 0, +3 ja +5 1 mg/kg

CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga. Kontrollhiiri töödeldakse kas

saliinilahuse või IgG puhastatud monokloonse antikehaga (Vinci. Biochem, Itaalia).

Histoloogiline analüüs 10

Neeru poolused, mis sisaldavad inimese saareraku transplantaati, külmutatakse

Tissue Tek komplektis (Miles Lab., IN) ja neid säilitatakse temperatuuril -70 °C.

Jämedate külmutatud 5 µm sektsioone määritakse biotinüülitud monokloonse

antikehaga inimese insuliini või inimese CD3 suhtes, seejärel streptavidiin-

peroksidaasi konjugaadiga. Diaminobensidiini (DAKO, Carpenteria, CA) 15

kasutatakse kromogeenina ja hematoksüliini vastuvärvina. Transplantaatide

lümfotsüüdi infiltratsiooni hinnatakse hematoküliiniga ja eosiiniga määratud

külmutatud sektsioonide alusel.

Tulemused

Normaalsed NOD/SCID hiired, kelle on siirdatud inimese saarerakke, püsivad 20

normoglütseemilistena kuni 100 päeva pärast siirdamist, kusjuures inimese

saarerakkude siirdamise läbinud hu-PBL-NOD/SCID hiirte keskmine

retentsiooniaeg on 35 ± 13 päeva. Inimese saarerakkude siirdamise läbinud hu-

PBL-NOD/SCID hiirte lühiajaline ravi leiutise monokloonse antikehaga pikendab

oluliselt inimese saarerakkude elumust määral >70% 60. päeval ja 50% 100. 25

päeval pärast siirdamist.

Inimese saarerakkude transplantaatide histoloogiline analüüs, mis viiakse hu-PBL-

NOD/SCID hiirtel läbi 100. päeval pärast siirdamist, näitab CD3+, CD4+ ja CD8+

positiivsete T-rakkude massiivset infiltratsiooni kontrollhiirtes. Samal ajal kui hiirtel,

EE - EP1664122 B1 117

keda töödeldi CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga, täheldatakse inimese

rakkude oluliselt madalamat infiltratsiooni. Positiivne määrimine insuliiniga näitab

transplantaadi funktsiooni hu-PBL-NOD/SCID hiirtel, keda on töödeldud

CD45RB/RO siduva kimäärse antikehaga, erinevalt kontrollhiirtest. hu-PBL-

NOD/SCID hiirtel, kellele on siirdatud saarerakke ja CD45RB/R siduvat kimäärset 5

antikeha, tuvastatakse seerumis madalamas koguses inimese IFN-� kui

kontrollhiirtel.

Need andmed näitavad, et lühiajaline ravi CD45RB/RO siduva kimäärse

antikehaga tingitud pikemaajalise inimese saareraku transplantaadi elumuse,

tõkestades transplantaadi infiltratsiooni ja inhibeerides leukotsüüdi vahendatud 10

äratõukereaktsiooni in vivo.

EE - EP1664122 B1 118

Patendinõudlus

1. Humaniseeritud antikeha, millel on sidumise spetsiifilisus nii CD45RO kui ka

CD45RB suhtes ja mis hõlmab raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 31

või 32 ja kerge ahela varieeruvad piirkonda SEQ ID nr: 7 või SEQ ID nr: 8.

2. Humaniseeritud antikeha vastavalt punktile 1, millel on sidumise spetsiifilisus nii 5

CDR45RO kui ka CD45RB suhtes, mis hõlmab:

- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 31 ja kerge ahela varieeruvat

piirkonda SEQ ID nr: 7,

- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 31 ja kerge ahela varieeruvat

piirkonda SEQ ID nr: 8, 10

- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 32 ja kerge ahela varieeruvat

piirkonda SEQ ID nr: 7, või

- raske ahela varieeruvat piirkonda SEQ ID nr: 32 ja kerge ahela varieeruvat

piirkonda SEQ ID nr: 8.

3. Isoleeritud polünukleotiidid, mis kodeerivad humaniseeritud antikeha vastavalt 15

punktile 1 või 2.

4. Ekspressioonivektor, mis hõlmab polünukleotiide vastavalt punktile 3, milline

vektor suudab toota humaniseeritud antikeha, kui nimetatud vektor sisaldub

vastavas peremeesrakus.

5. Isoleeritud peremeesrakk, mis hõlmab ekspressioonivektorit vastavalt punktile 20

4.

6. Humaniseeritud antikeha vastavalt punktile 1 või 2 kasutamiseks ravimina.

7. Antikeha vastavalt punktile 6 kasutamiseks autoimmuunhaiguste, transplantaadi

äratõukereaktsiooni, psoriaasi, dermatiidi, põletikulise soolehaiguse ja/või

allergiate raviks ja/või ennetamiseks. 25

8. Antikeha vastavalt punktile 7 transplantaat-peremehe-vastu (GvHD) haiguse

raviks ja/või ennetamiseks,

EE - EP1664122 B1 119

9. Antikeha vastavalt punktile 7 ravimi valmistamiseks pankrease saarerakkude

transplantaadi äratõukereaktsiooni raviks.

10. Ravimkoostis, mis sisaldab antikeha vastavalt punktile 1 või 2 kombineerituna

vähemalt ühe farmatseutiliselt vastuvõetava kandja või lahjendusvedelikuga.

EP 1 664 122 B1

86

EP 1 664 122 B1

87

EP 1 664 122 B1

88

EP 1 664 122 B1

89

EP 1 664 122 B1

90

EP 1 664 122 B1

91

EP 1 664 122 B1

92

EP 1 664 122 B1

93

EP 1 664 122 B1

94

EP 1 664 122 B1

95

EP 1 664 122 B1

96

EP 1 664 122 B1

97

EP 1 664 122 B1

98

EP 1 664 122 B1

99