Tema: Cromatografía en Capa Delgada. Aplicaciones Farmacéuticas Garantía de Calidad de Medicamentos Área Análisis de Medicamentos - FCByF-UNR Preparado por el Dr. Dario A. Bianchi ~ ~ Año 2021 ~ ~
Tema: Cromatografía en Capa
Delgada. Aplicaciones
Farmacéuticas
Garantía de Calidad de Medicamentos
Área Análisis de Medicamentos - FCByF-UNR
Preparado por el Dr. Dario A. Bianchi
~ ~ Año 2021 ~ ~
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
A BFM
FM
Tapa de la cámara o cuba. Sistema cerrado.
Papel de filtro embebido con la fase móvil.
Permite saturar la cámara con FM.
Nivel de la fase móvil. Debe estar por debajo
del nivel de siembra de la placa.
Soporte solido: Placa
rígida de un material
inerte:
-vidrio
-Plástico
-Metal
Fase Estacionaria:
Capa uniforme y
relativamente
delgada (0,25 mm)
de un material
adsorbente
finamente
pulverizado
Una cámara de vidrio cilíndrica o rectangular
provista de una tapa el mismo material que
permita el cierre hermético para saturarla con
los vapores de la fase móvil. Además,
permite seguir y controlar el desarrollo
cromatográfico.
La fase móvil (FM) se
mueve
en dirección ascendente
a través de la fase
estacionaria
mediante fuerzas
capilares.
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Mx M1 STMx + M1 ST
Frente del solvente de elución o fase móvil (FM)
Línea de siembra
Fase Móvil (FM)
FM
FM
FM
Soporte sólidode la placa
cromatográfica
Fase estacionariade la placa
cromatográfica
SoporteSólido
Fase Estacionaria
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas Componentes de una placa cromatográfica:
SOPORTE SÓLIDO
- Vidrio
- Plástico
- Metálico
FASE ESTACIONARIA MECANISMO DE SEPARACIÓN
- Sílica-gel (activado) Adsorción
- Alumina (Óxido de aluminio) (activado) Adsorción
- Celulosa y derivados, Sílica gel (sin activar) Partición
- Fase silica modificada Partición – Fase reversa
- Resinas de cambio iónico Intercambio Iónico
FASE MOVIL
- Uno o varios disolventes según la polaridad deseada.
- La muestra bajo análisis debe ser totalmente soluble en la fase móvil y los disolventes miscibles entre sí.
Soporte solido: Placa
rígida de un material
inerte:
-vidrio
-Plástico
-Metal
Fase
Estacionaria:
Capa uniforme y
relativamente
delgada
de un material
adsorbente
finamente
pulverizado
SoporteSólido
Fase Estacionaria
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
-Industria farmacéutica
Control de calidad
Controles de identidad y pureza
Uniformidad
Estabilidad
-Medioambiente
Análisis de aguas, de suelos y de residuos
-Análisis de alimentos
Control de calidad
Aditivos (vitaminas)
-Pesticidas
Controles de estabilidad
Aplicación y ventajas de la cromatografía en capa delgada (CCD)
Ventajas del método:
*Rápido
*Económico
*Sencillo
- Medicina forense
Detección de documentos falsificados
Investigación en envenenamientos
- Aplicaciones clínicas
Estudios de metabolismo
Control de dopaje
Procedimiento general:
1) Elección de la Fase estacionaria
2) Elección de la Fase móvil
3) Acondicionamiento de la placa - ¿Requiere activación?
4) Aplicación de la muestra
5) Acondicionamiento de la cámara de desarrollo
6) Desarrollo del cromatograma
7) Secado de la Placa
8) Visualización de las manchas - Revelado
9) Interpretación de los resultados – Evaluación de las
manchas visualizadas: Observar:
1) Rf, 2) Forma, 3) Tamaño 4) Intensidad de las mismas.
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Mx M1 STMx + M1 ST
Frente del solvente de elución o fase móvil (FM)
Línea de siembra
Fase Móvil (FM)
FM
FM
FM
Soporte sólidode la placa
cromatográfica
Fase estacionariade la placa
cromatográfica
1) Elección de la Fase estacionaria. - Materiales adsorbentes finamente divididos que pueden ser divididos según su origen:
1) origen mineral (gel de sílice, alúmina, etc.)
2) orgánico (celulosa, poliamidas, etc.)
- Tamano de la partícula: normalmente de 5 a 40 μm de diámetro.
- Algunos ejemplos de fases estacionarias empleadas en las farmacopeas:
-Gel de sílice 60 de 0,25 mm de espesor.
-Gel de sílice 60 de 0,25 mm de espesor con indicador de fluorescencia.
-Gel de sílice para cromatografía, de 0,25 mm de espesor con un tamaño de poro promedio de 6 nm.
-Gel de sílice octilsalinizado con indicador de fluorescencia de 0,25 mm de espesor.
-Gel de sílice octadecilsalinizado con indicador de fluorescencia de 0,25 mm de espesor.
-Cromatografía en capa delgada recubierta con una mezcla para cromatografía de fase reversa de C18 con
indicador de fluorescencia de 0,25 mm de espesor.
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Fase Estacionaria:
Capa uniforme y
relativamente
delgada (0,25 mm)
de un material
adsorbente
finamente
pulverizado
SoporteSólido
Fase Estacionaria
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Serie elutrópica
Disolvente Fórmula P*
Hexano
Tolueno
Dietileter
Diclorometano
Butanol
Cloroformo
Acetato de etilo
Acetona
Metanol
Etanol
Acetonitrilo
Ácido acético
Agua
C6H14
C7H8
C4H10O
CH2Cl2
C4H9OH
CHCl3
C2H5COOEt
(CH3)2CO
CH3OH
C2H5OH
CH3CN
CH3COOH
H2O
0
2,4
2,8
3,1
3,9
4,1
4,4
5,1
5,1
5,2
5,8
6,2
9,0
Solvente o mezcla de
solventes de elución
muy poco polar para
las sustancias
analizadas
Solvente o mezcla de
solventes de elución
muy polar para
las sustancias
analizadas
Rf = 0,10
Rf = 0,02
A B
Rf = 0,94
Rf = 0,86
A B
Rf = 0,72
Rf = 0,37
A B
Solvente o mezcla de
solventes de elución
adecuado para
las sustancias
analizadas P*= Polaridad del disolvente
El frente del solvente tiene que recorrer aproximadamente
las tres cuartas partes de la longitud de la placa.
2) Elección de la Fase móvil
Frente
del
Solvente
de la
Fase móvil
Frente
del
Solvente
de la
Fase móvil
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas 3) Acondicionamiento de la placa - ¿Requiere activación?
4) Aplicación de las muestras sobre la línea de siembra en CCD:
- Capilares
- Jeringas
- Dispositivos de
alta precisión
- Micropipetas
Farmacopea Argentina (pág. 133): Aplicar por separado sobre la línea trazada anteriormente y a no menos de
2 cm entre cada aplicación la solución muestra y la solución estándar empleando una micropipeta para obtener
una mancha lo más pequeña posible (preferentemente con un diámetro no mayor de 5 mm o bien en una
banda perpendicular al sentido del desarrollo del cromatograma, de 10 a 20 mm de largo y 2 a 6 mm de ancho).
La aplicación puede realizarse en porciones sucesivas que permitan acumular la cantidad de material requerido,
dejando secar cada vez, antes de efectuar la siguiente aplicación. Dejar secar las aplicaciones, ubicar la placa
en el soporte y colocarla dentro de la cámara, de modo que la fase móvil llegue al borde inferior de la placa.
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
A B
dFMdB
dA0,25
0,50
0,75
1,0
0,0
A B
dFMdB
dA0,25
0,50
0,75
1,0
0,0
Aplicación de la muestra
en forma de banda Aplicación de la muestra
en forma de mancha
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Cámaras de CCD de desarrollo
ascendente
Rf = 0,37
Rf = 0,72
A B
- Adherir hojas de papel de filtro embebidas
en la fase móvil a las paredes de la cámara,
para facilitar la saturación de la misma con
el vapor del líquido, a menos que se especifique
de otro modo en la monografía correspondiente.
5) Acondicionamiento de la cámara de desarrollo
6) Desarrollo del cromatograma
Cámaras de CCD de desarrollo horizontal
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Específicos
- Reacciones de coloración
Inespecíficos
- Adición de yodo
- Fluorescencia
- Calentamiento
7) SECADO DE LA PLACA
8) VISUALIZACIÓN DE LAS MANCHAS - REVELADO
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
- Azul de Bromotimol al 0,1% en NaOH 0,01M (ácidos carboxílicos)
- K2Cr2O7 en H2SO4 al 4% (compuestos orgánicos no volátiles)
- Cl3Sb al 50% en ácido acético (Esteroides, vitaminas, carotenoides)
- Ninhidrina al 0,3% en n-butanol (Aminoácidos y aminas)
- Visualización fotodensitométrica
- Una vez visibles las manchas, puede ser determinado el valor de Rf de cada una de ellas
8) VISUALIZACIÓN DE LAS MANCHAS - REVELADO
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Rf (Relación de Frente)= distancia recorrida por una sustancia determinada (dX) dividida por
la distancia recorrida por el frente del solvente o fase móvil (dFM). Ambas distancias se miden
desde el punto de siembra (aproximadamente entre 1 a 2 cm del extremo inferior de la placa).
La distancia para la sustancia X se mide al centro de la mancha.
9) Interpretación de los resultados – Evaluación de las manchas visualizadas
distancia recorrida por
la sustancia (dX)
Rf(X)=
distancia recorrida por
el frente de la fase móvil (dFM)
A B DC
x xx x
Frente del Solvente o Fase Móvil
Línea de Siembra
Distance solvent migrated = 5.0 cm
Distance A migrated = 3.0 cm
Distance B y E migrated = 2.0 cm
2.8 cm
3.0 cm
Rf ( A) =
Rf ( B) =
Rf ( D) =
Rf ( C1) =
Rf ( C2) =
2.0 cm5.0 cm = 0.40
= 0.60
= 0.56
= 0.60
= 0.56
3.0 cm5.0 cm
0.8 cm5.0 cm
3.0 cm5.0 cm
2.8 cm5.0 cm
Ex
Rf ( E) = = 0.402.0 cm5.0 cm
Siembra C= Mezcla B + D
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Factores que afectan el valor de Rf y su reproducibilidad:
Fase estacionaria: calidad del adsorbente, espesor de la capa, activación de la
placa, distribución y tamaño de las partículas.
Fase móvil: calidad y pureza de los solventes. Se recomienda preparar antes de cada
corrida debido a que los solventes pueden ser muy volátiles o higroscópicos.
Cámara de desarrollo: saturación de la misma (mínimo 30 minutos antes de la
corrida). Asegurar que este bien cerrada.
Temperatura: la cámara de desarrollo no debe colocarse cerca de fuentes de
calor, ni luz solar directa, ya que un aumento de temperatura aumenta la
volatilidad de solventes y puede cambiar la composición de la fase móvil.
Cantidad de siembra: aumentar la cantidad de masa sembrada frecuentemente
produce un cambio de los valores de Rf especialmente por efecto de la
cola de las manchas. En este caso la distancia de la mancha a la línea de siembra se mide al
centro del área de más intensidad si la mancha tiene cola.
Para mejorar la reproducibilidad del Rf, es necesario cromatografiar en la
misma placa la muestra problema y la sustancia de referencia.
9) Interpretación de los resultados – Evaluación de las manchas visualizadas
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
1) Aplicación de CCD en Pruebas de Identidad:
2) Aplicación de CCD en Ensayos de Pureza:
2) Caso I: Ensayo límite de impurezas
por CCD. Impureza conocida y se dispone
de los respectivos patrones de referencia.
2) Caso II: Ensayo límite de impurezas por
CCD. Impurezas desconocidas o no
se dispone de los respectivos
patrones de referencia
Caso I: Procedimiento de dos siembras Caso II: Procedmiento de tres siembras
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Mx M1 STMx + M1 ST
Frente del solvente de elución o fase móvil (FM)
Línea de siembra
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
A B
dFMdB
dA0,25
0,50
0,75
1,0
0,0
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
1) Aplicación de CCD en Pruebas de Identidad
1) Caso I: Procedimiento de dos siembras
Procedimiento: Se realizan Dos siembras de igual volumen y concentración de la
muestra a analizar y el patrón de referencia del IFA en estudio.
Evaluación: Comparar la mancha principal de la muestra con la mancha principal
generada por el patrón de referencia. Se compara: Rf, apariencia, color y la intensidad.
Desventaja: la falta de especificidad hace que la NO IDENTIDAD entre dos
compuestos se fácil de determinar pero la identificación requiere de pruebas
adicionales para aumentar la presunción
Dos compuestos con
diferentes Rfs
en un mismo sistema
cromtográfico son DIFERENTES. No
Cumple con la Prueba
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
M ST IFA
dST
dM0,25
0,50
0,75
1,0
0,0
Rf = 0,72Rf = 0,72Rf = 0,72Rf = 0,72
M ST IFA
RfM=RfST
0,25
0,50
0,75
1,0
0,0
Caso donde
se obtiene
presunción de
identidad.
Cumple con
la Prueba
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
1) Aplicación de CCD en Pruebas de Identidad
1) Caso I: Procedimiento de tres siembras
Procedimiento: Se realizan tres siembras de igual volumen, dos de las cuales son de
igual volumen y concentración, que serían la muestra a analizar (M) y el patrón de
referencia del IFA en estudio (ST-IFA), y una tercer siembra que contiene la mitad de
la concentración de una mezcla de ambos (M+ST-IFA) en relación 1:1.
Evaluación: Comparar las manchas principales de la muestra y mezcla con la mancha
generada por el patrón de referencia. Se compara: Rf, apariencia y la intensidad. Si
coinciden hay presunción de identidad.
Dos compuestos con
diferentes Rfs
en un mismo sistema
cromtográfico son DIFERENTES . No
Cumple con la Prueba
Ejemplo donde
se obtiene
presunción de
identidad.
Cumple con la
Prueba
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
Rf = 0,37
Rf = 0,72
M ST IFAM + ST-IFA10uL 10uL5ul + 5uL
Rf = 0,72 Rf = 0,72 Rf = 0,72Rf = 0,72Rf = 0,72Rf = 0,72
M ST IFAM + ST-IFA10uL 10uL5ul + 5uL
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Identificación - Diazepam Se verificó la identidad de tres lotes de Diazepam (A, B y C) utilizando
el método de tres siembras para los lotes A y B y de dos siembras para el lote C.
Los análisis fueron realizados aplicando la siguiente técnica cromatográfica:
Fase estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa delgada recubierta
con gel de sílice para cromatografía con indicador de fluorescencia, de 0,25 mm de espesor.
Fase móvil - Acetato de etilo y n-heptano (1:1).
Solución estándar - Preparar una solución de Diazepam SR-FA en acetona con una concentración de
aproximadamente 5 mg por ml.
Solución muestra – Preparar una solución de Diazepam en acetona con una concentración de aproximadamente 5
mg por ml.
Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 10 μl de la Solución muestra y 10 μl de la Solución estándar.
Dejar secar las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas, en una cámara no saturada, hasta que el frente del
solvente haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara,
marcar el frente del solvente y dejar evaporar el solvente. Examinar la placa bajo luz ultravioleta a 254 nm. El valor de
Rf de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de la Solución muestra se debe corresponder con el
obtenido con la Solución estándar.
Luego de llevar a cabo el análisis se obtuvieron los siguientes resultados:
-El lote A cumple y el B No cumple con la prueba de identificación.
-El lote C cumple con el ensayo.
1) Dibuje estos resultados en tres placas cromatográficas indicando que contiene cada siembra.
Datos: Rfdiazepam= 0,5
Cl N
NO
H3C
Aplicación de CCD como criterio de Identidad
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Identificación - Paracetamol Se llevó a cabo el ensayo de identidad en un lote de
paracetamol (A y B) por CCD aplicando la siguiente técnica
cromatográfica:
Fase estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa delgada recubierta con gel de sílice para
cromatografía con indicador de fluorescencia, de 0,25 mm de espesor.
Fase móvil - Cloruro de metileno y metanol (4:1).
Solución estándar - Preparar una solución de Paracetamol SR-FA en metanol de aproximadamente 1 mg por ml.
Solución muestra - Preparar una solución de Paracetamol en metanol de aproximadamente 1 mg por ml.
Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 10 μl de la Solución muestra y 10 μl de la
Solución estándar. Dejar secar las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas hasta que el frente del solvente
haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la
placa de la cámara, marcar el frente del solvente y dejar secar. Examinar la placa bajo luz ultravioleta a 254 nm.
El valor de Rf de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de la Solución muestra debe ser
similar al obtenido con la Solución estándar.
Se observó que el lote cumple con el ensayo de identificación para el IFA en estudio.
1) Dibuje una placa cromatográfica indicando dicho resultado.
Datos: Rfparacetamol= 0,6
N CH3
HOO
H
Paracetamol
Aplicación de CCD como criterio de Identidad
Para cada IFA elaborado bajo un determinado proceso de producción se establece un perfil de
impurezas describiendo aquellas IMPUREZAS que son CONOCIDAS O NO en un lote típico.
Generalmente, el perfil de impurezas está estrechamente relacionado al proceso de elaboración o
degradación del IFA.
El perfil de impurezas no suele ser necesario para los IFAs de origen vegetal o provenientes de
tejidos animales.
Las IMPUREZAS DESCONOCIDAS determinadas por Cromatografía en Capa Delgada (CCD) o
por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (CLAE) no deberán exceder individualmente, el 0,2 %
de la intensidad de la mancha o del área de la sustancia principal (IFA), respectivamente, y su
sumatoria no deberá exceder el 1 % de los mismos valores.
De no cumplimentarse estos requerimientos, deberán presentarse estudios toxicológicos que
garanticen la inocuidad de las impurezas presentes.
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Aplicación de CCD como criterio de Pureza
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Caso I: Ensayo límite de impurezas por CCD. Impureza conocida y
se dispone de los respectivos patrones de referencia.
Ensayo límite de impurezas por CCD
Fundamento del ensayo:
Las sustancias químicas diferentes presentan generalmente valores diferentes de Rf en
un determinado sistema cromatográfico. Por lo tanto, se espera que los valores de Rf de
las impurezas sean distintos a los valores de los productos principales o IFAs.
Ventajas: Rapidez. Sencillez. Sensible. Económico
Caso II: Ensayo límite de impurezas por CCD. Impurezas desconocidas
o no se dispone de los respectivos patrones de referencia
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas Ensayo límite de impurezas por CCD
CASO I: Las IMPUREZAS O CONTAMINANTES SON CONOCIDAS y se dispone de los respectivos
patrones de referencia.
Evaluación del cromatograma:
Se compara la intensidad de color o fluorescencia proveniente de la mancha de la impureza que se
investiga con la producida por el patrón de referencia a la concentración del límite tolerado.
CASO II: LAS IMPUREZAS O CONTAMINANTES SON DESCONOCIDAS o no se dispone de los
respectivos patrones de referencia.
Procedimiento para el caso II:
Se siembran una o varias diluciones de la muestra principal en estudio de manera que la intensidad
de la mancha producida equivalga a la que daría lugar el contaminante a la mayor concentración
permitida.
Supuesto:
Se supone que los contaminantes que se controlan y el producto principal (IFA) en estudio
mantienen una estrecha relación estructural y por lo tanto responden de igual forma al agente de
revelado o visualización.
Evaluación del cromatograma:
Se compara la/s mancha/s provenientes de las diluciones con las manchas de los contaminantes
provenientes de la muestra.
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Caso I: Ensayo límite de impurezas por CCD. Impureza conocida y
se dispone de los respectivos patrones de referencia.
Ensayo límite de impurezas por CCD
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas Pureza Caso I. Se dispone patron de referencia de la impureza.
Límite de p-Cloroacetanilida en Paracetamol Se llevó a cabo el límite de p-Cloroacetanilida en un dos lotes de
paracetamol (A y B) por CCD según la siguiente técnica cromatográfica:
Fase estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa
delgada recubierta con gel de sílice para cromatografía con indicador
de fluorescencia, de 0,25 mm de espesor.
Fase móvil - Éter de petróleo y acetona (75:25).
Solución estándar - Preparar una solución de p-cloroacetanilida en
éter de aproximadamente 10 μg por ml.
Solución muestra - Transferir 1,0 g de Paracetamol a un tubo de
centrífuga de 15 ml provisto de un tapón de vidrio y agregar 5,0 ml de
éter. Agitar mecánicamente durante 30 minutos y centrifugar a 1.000 rpm durante 15 minutos o hasta obtener una
separación neta, emplear la solución sobrenadante.
Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 200 μl de la Solución muestra (en porciones de 40 μl, de
manera de obtener una única mancha de no más de 10 mm de diámetro) y X μl de la Solución estándar. Dejar
secar las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas en una cámara no saturada hasta que el frente del solvente
haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Examinar bajo luz ultravioleta a 254
nm. La mancha obtenida en el cromatograma de la Solución muestra, con valor de Rf correspondiente a la mancha
principal obtenida con la Solución estándar, no debe ser mayor en tamaño o intensidad a la mancha principal
obtenida con la Solución estándar (0,001%).
Se observó que el lote A no cumple y el lote B cumple con el límite indicado en la técnica.
1) Dibuje dos placas cromatográficas indicando dichos resultados.
2) Indique que volumen de la solución estándar de p-cloroacetanilida debe sembrar?
Datos: Rfparacetamol= 0,6 y Rfp-cloroacetanilida= 0,8
N CH3
HOO
HParacetamol
(IFA)
N CH3
ClO
H
p-Cloroacetanilida.
Impureza
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
SULFAMETOXAZOL (IFA)
Se determinó la pureza de un lote de Sulfametoxazol aplicando el siguiente método cromatográfico:
Fase Estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa delgada recubierta con gel de sílice para
cromatografía de 0,25 mm de espesor.
Fase móvil - Alcohol, n-heptano, cloroformo y ácido acético glacial (25:25:25:7).
Solución estándar - Disolver 100 mg de Sulfametoxazol SR-FA en 0,10 ml de hidróxido de amonio, diluir a 10,0 ml
con metanol y mezclar.
Solución de comparación - Disolver 20 mg de Sulfanilamida SR-FA y 20 mg de ácido sulfanílico en 10 ml de
hidróxido de amonio y diluir a 100 ml con metanol. Transferir 2,0 ml de esta solución a un matraz aforado de 50 ml,
agregar 10 ml de hidróxido de amonio, completar a volumen con metanol y mezclar.
Solución muestra - Disolver 100 mg de Sulfametoxazol en 0,10 ml de hidróxido de amonio, diluir a 10,0 ml con
metanol y mezclar.
Revelador - Disolver 0,10 g de p-dimetilaminobenzaldehído en 1 ml de ácido clorhídrico y diluir a 100 ml con
alcohol.
Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 10 μl de la Solución estándar, 25 μl de la Solución de
comparación y 10 μl de la Solución muestra. Dejar secar las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas hasta
que el frente del solvente haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la
placa de la cámara, marcar el frente del solvente y dejar secar al aire. Pulverizar sobre la placa con Revelador: los
valores de Rf son aproximadamente 0,7 para sulfametoxazol, 0,5 para sulfanilamida y 0,1 para ácido sulfanílico.
Las manchas correspondientes a sulfanilamida y ácido sulfanílico en el cromatograma obtenido a partir de la
Solución muestra no deben ser mayores en tamaño o intensidad a las manchas, a los respectivos valores de Rf,
obtenidas para sulfanilamida y ácido sulfanílico con la Solución de comparación (0,2 %).
SULFANILAMIDA ACIDO SULFANILICO
SN
OOON
CH3
H2NH
SN
OO
H
H2NH
SOH
OO
H2N
H
NH3C
CH3
O
p-DIMETIL
AMINOBENZALDEHIDO
Pureza Caso I. Se dispone patrón de referencia de la impureza
1) Indique que observaría en una placa cromatográfica si se encuentra que la droga analizada no cumple con el
límite especificado para ácido sulfanílico y cumple con el límite de sulfanilamida.
2) Indique si estamos en presencia de una cromatografía en fase normal o reversa.
3) a) Calcular la concentración de Sulfametoxazol en la Solución estándar e indique que volumen aplica.
b) Calcular la concentración de Sulfanilamida y de ácido sulfanílico en la Solución de comparación e indique que
volumen aplica.
c) Calcular la concentración de Sulfametoxazol en la Solución muestra e indique que volumen aplica.
4) Determine cual es la concentración límite de ambos contaminantes en dicho ensayo.
5) Describa cual es la reacción química de color y los grupos funcionales involucrados.
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
SN
OOON
CH3
H2NH
SN
OO
H
H2NH
SOH
OO
H2N
H
NH3C
CH3
O
SULFANILAMIDA ACIDO SULFANILICO p-DIMETIL
AMINOBENZALDEHIDO SULFAMETOXAZOL (IFA)
Pureza Caso I. Se dispone patrón de referencia de la impureza
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Caso II: Ensayo límite de impurezas por CCD. Impurezas desconocidas o
no se dispone de los respectivos patrones de referencia
Ensayo límite de impurezas por CCD
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
Caso II. Impurezas desconocidas o no se dispone de patrones de referencia
Pureza cromatográfica
Fase estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa delgada recubierta con gel de sílice para
cromatografía, de 0,25 mm de espesor.
Fase móvil – Alcohol absoluto, ciclohexano e hidróxido de amonio (72:30:6).
Solución muestra A - Preparar una solución de Codeína en alcohol absoluto de aproximadamente 40 mg por ml.
Solución muestra B - Diluir 2,0 ml de la Solución muestra A a 100 ml con alcohol absoluto.
Solución muestra C - Diluir 1,0 ml de la Solución muestra A a 100 ml con alcohol absoluto.
Revelador - Mezclar 3 ml de solución de ácido cloroplatínico al 10 % con 97 ml de agua y agregar 100 ml de
solución de ioduro de potasio al 6 %.
Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 10 μl de las Soluciones muestra A, B y C. Dejar secar las
aplicaciones y desarrollar los cromatogramas hasta que el frente del solvente haya recorrido aproximadamente
tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara, marcar el frente del solvente y dejar
evaporar. Pulverizar sobre la placa con Revelador: A excepción de la mancha principal y de cualquier otra mancha
observada en el origen, ninguna mancha en el cromatograma obtenido a partir de la Solución muestra A debe ser
más intensa que la obtenida con la Solución muestra B (2 %) y no más de una mancha con un valor de Rf mayor
que el de la mancha principal debe ser más intensa que la obtenida con la Solución muestra C (1 %).
O
OH
H3CO
N
CH3H
H
CODEÍNA
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
1) Indique si estamos en presencia de una cromatografía en fase normal o reversa.
2) a) Calcular la concentración de la muestra A e indique que volumen aplica.
b) Calcular la concentración de la muestra B e indique que volumen aplica.
c) Calcular la concentración de la muestra C e indique que volumen aplica.
3) Determine cual es la concentración límite para ambos contaminantes en dicho ensayo.
4) Indique que observaría en una placa cromatográfica si se encuentra que la droga analizada cumple con el límite
especificado para la impureza de menor valor de Rf y no cumple con la de mayor valor de Rf.
5) Indique que observaría en una placa cromatográfica si se encuentra que la droga analizada cumple con el límite
especificado para la impureza de mayor valor de Rf y no cumple con la de menor valor de Rf.
Datos: Rf impureza A= 0,75
Rf impureza B= 0,25
Rf mancha principal= 0,5
O
OH
H3CO
N
CH3H
H
CODEÍNA
Caso II. Impurezas desconocidas o no se dispone de patrones de referencia
Pureza Caso II. Ensayo de pureza sin disponer de las referencias
de los contaminantes
Se llevó a cabo un ensayo de pureza por CCD de un lote de Ibuprofeno
y no se dispone de las referencias de dos contaminantes A y B.
Dibujar en tres placas cromatográficas separadas los siguientes resultados:
1) El lote cumple el ensayo respecto a los dos contaminantes A (0,1%) y B (0,2%).
2) El lote cumple el ensayo límite de impurezas para el contaminantes A y no cumple para el B.
3) El lote no cumple con ninguno de los dos contaminantes.
Datos: Rfibuprofeno= 0,80
RfA= 0,50
RfB= 0,75
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas
IBUPROFENO
C10H11N3O3S
PM: 206,3
15687-27-1
OH
OH3C
CH3
CH3
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas - Colorantes de uso farmacéutico. Identificación por CCD. Ejemplos
Identificación cromatográfica • Sistema A- Emplear una fase móvil constituida por una mezcla de n-butano, etanol, agua y amoníaco
(50:25:25:10). Sembrar las soluciones sobre una placa para cromatografía en capa delgada recubierta con celulosa de 0,1 mm de espesor. Desarrollar los cromatogramas en una cámara sin revestimiento interno y sin saturar.
• Sistema B - Emplear una fase móvil constituida por una mezcla de metiletilcetona, acetona, agua y amoníaco (140:60:60:1). Sembrar las soluciones sobre una placa para cromatografía en capa delgada recubierta con gel de sílice 60 de 0,2 mm de espesor. Desarrollar los cromatogramas en una cámara revestida internamente con papel de filtro y saturada durante 2 horas.
• Procedimiento - Preparar una Solución muestra y una Solución estándar que contengan aproximadamente 1 mg por ml en metanol. Aplicar por separado 10 μl de cada una de las soluciones y desarrollar los cromatogramas.
AZUL BRILLANTE FCF (CI 42090) C37H34N2Na2O9S3 PM: 792, 84
• Definición - El Azul brillante FCF es esencialmente la Sal disódica de α-[4-(N-etil-3-
sulfonatobencilamino)-ciclohexa-2,5-dienililideno]-tolueno-2-sulfonato y sus isómeros y colorantes
subsidiarios, junto con cloruro y/o sulfato de sodio como principales componentes incoloros.
• Identificación cromatográfica - (ver Identificación cromatográfica en Métodos generales de análisis).
• Sistema A: Rf aproximadamente 0,72.
• Sistema B: Rf aproximadamente 0,31.
Cromatografía en Capa Delgada.
Aplicaciones Farmacéuticas. Problemas
Límite para F: 0,1% y J: 0,2%
b) La solución de la muestra tiene una concentración de 0,2 g/mL y se
sembró 200uL, la solución patrón de referencia de p-cloroacetanilida
Es de 10 ug/mL ¿Qué volumen de la solución de p-cloroacetanilida debe
sembrar?