Teknologi Pembiakan Biosensor

7/22/2019 Teknologi Pembiakan Biosensor

1/78

Teknologi Pembiakan

Biosensor

Yeni Cahyati


2/78

transgenetik


3/78

Generasi Organisme Tansgenik

Berikutnya di bidang Pertanian

Golden Rice

Kandungan vitamin A

meningkat Gen berasal dari bakteri

Kekurangan: produksi vitamin

A kurang banyak


4/78

Bunga matahari

Tahan jamur putih Gen ketahanan berasal dari gandum

Rumpu t lapangan gol f

Tahan herbisida

Tumbuh lambatmengurangi pemangkasan

mengurangi polusi


5/78

Arah Pengembangan yang Dituju

2001-03 data; collated from: Information Systems for Biotechnology(http://www.isb.vt.edu/)

Sifat Jumlah Penguian

2002-03 (%)

Tahan serangga 791 (31%)

Tahan herbisida 736 (29%)

Peningkatan kualitas 400 (16%)

Tahan penyakit 171 (7%)


6/78

Beberapa Sifat Lain yang Mulai Menarik

2001-03 data; collated from: Information Systems for Biotechnology(http://www.isb.vt.edu/)

Sifat Jumlah Pengujian

2002-03 (%)

Hasil tinggi 105 (4%)

Kandungan asam amino 94 (4%)

Kandungan gula 44 (2%)

Kandungan lemak 42 (2%)


7/78

Bioteknologi untuk Lingkungan

Bioremediasi (pemanfaatan untuk

mengurangi polutan

Bakter i I ndikator

Untuk membersihkan lingkngan

yang tercemarbahan beracun danberbahaya

Bateri tersebut dapat

memetabolismebahan beracun

dan berbahaya

Untuk mendeteksi lingkungan yang

tercemar bahan beracun dan

berbahaya

Bakteri tersebut peka terhadap

bahan beracun dan berbahaya


8/78

Deteksi Ranjau Darat

Dibutuhkan oleh m il i ter,

Tanpa upaya ini ,anak-anak dan penduduk sipi lterancam

Bantuan Bio tekno logi Tanaman

(dikembangkan oleh Aresa B iodetect ion)

Gen yang peka terhadap logam dimasukkan ke dalamtanaman

Apabila akar tanaman menyentuh ranjau darat,

Tanaman berubah warna dar i hi jau m enjadi

merahMendeteksi ranjau darat


9/78

Kongres AS Larang Kloning

Manusia

Washington DC, Sinar Harapan

Kongres AS memutuskan pelarangan kloning

atas embrio manusia setelah menempuh

perdebatan yang alot berdasarkan

pertimbangan ilmiah, moral, dan definisikehidupan.


10/78

Keputusan tersebut dikeluarkan setelah

melalui pemungutan suara dengankomposisi 265-162, sekaligus menutup

harapan beberapa anggota kongres atas

pembatasan penelitian kloning manusiauntuk mengobati penyakit Alzheimers, Lou

Gehrig, dan sejumlah penyakit kelumpuhan

lainnya.


11/78

Putusan untuk melarang segala bentuk

kloning manusia sekaligus melarang suatu

amandemen yang akan mengizinkanpenciptaan terbatas atas embrio hasil kloning

yang digunakan untuk penelitian.

Sementara itu beberapa anggota kongres

lain, Jim Greenwood (Republik) dan Peter

Deutsch (Demokrat) menyatakan alternatifuntuk mengizinkan penelitian kloning yang

dapat digunakan untuk menyembuhkan

sejumlah penyakit.


12/78

Larang Kucuran Dana

Perdebatan muncul saat membahas apakah

kalangan ilmuwan bisa mengkloning embrio

manusia yang digunakan untuk penelitian

menyembuhkan penyakit kelumpuhan.

Dari embrio-embrio tersebut, kalangan

ilmuwan dapat memperoleh sel-sel yang

berharga yang bisa membangun jaringan

sel tubuh.


13/78

Pemunculan kembali masalah besarlama

di dunia kesehatan di tengah masyarakat

kini memerlukan pendekatan terpadu,seperti dalam masalah euthanasia dan

transplantasi organ manusia, khususnya

dalam xenotransplantation;


14/78

Kloning Gen


15/78

Kloning - definisi

Dari Bahasa Yunani - klon, ranting

Kumpulan turunan suatu individu yangdihasilkan tanpa melalui perkawinan;kumpulan replika sebagian atau seluruhmakromolekul (contoh, DNA atau antibodi)

Suatu individu yang tumbuh dari satu selsomatik induknya serta memiliki identitasgenetik yang sama dengan induknya

Klon: Koleksi molekul atau sel yang semuaidentitasnya sama dengan molekul atau sel

penurunnya


16/78

Kloning DNA

Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan

memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)

yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan

DNA yang kompleks.


17/78

Kloning Gen

Ketika keseluruhanDNA dari suatuorganisme

diekstraksi, akandiperoleh seluruhgen yang dimilikiorganisme tersebut

Pada kloning gen,hanya gen (DNA)tertentu yangdiisolasi,

dimurnikan, dan


18/78

Tujuan mengklon Gen

Menentukan urutan basa nukleotidapenyusun gen tersebut

Menganalisis atau mengidentifikasi urutanbasa nukleotida pengendali gen tersebut

Mempelajari fungsi RNA / protein/enzimyang disandi gen tersebut

Mengidentifikasi mutasi yang terjadi padakecacatan gen yang mengakibatkan penyakit

bawaan Merekayasa organisme untuk tujuan

tertentu, misalnya memproduksi insulin,ketahanan terhadap hama, dll.


19/78

Sumber DNA untuk diklon

DNA kromosom

cDNA (complementaryDNA) yang

disintesis menggunakan mRNA sebagaicetakan (template)

DNA yang dihasilkan dari perbanyakan

menggunakan PCR


20/78

Mensintesis cDNA

Perban akan DNA dengan


21/78

Perbanyakan DNA denganPCR (Polymerase Chain

Reaction)


22/78

Bahan / Alat untuk Mengklon

Enzim endonuklease restriksi

Enzim ligase

Vektors

Inang (Host)

Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel

inang


23/78

Memotong DNA

Menggunakan enzimendonuklease restriksi Ujung lengket (sticky ends)

Ujung tumpul (blunt ends)

Penamaan enzim EcoRI

E= genus (Escherichia)

co= species (coli)

R = strain I = # of enzyme


24/78

Ujung lengket dan tumpul

(Blunt & Sticky ends)


25/78

Penyambungan (past ing)

DNA Pembentukan

ikatan-H padaujung-ujung yangkomplemen (sticky

ends)

Ligase membentuk

ikatan fosfodiesteruntuk merekatkanbenang-benangDNA


26/78

Vektor untuk


27/78

Vektor untuk

Mengklon

Diperlukan suatu wahana (vehicle)untuk memasukkan suatu potongan

DNA ke dalam sel agar DNA tersebut

dapat disimpan dan diperbanyak didalam sel tersebut


28/78

Plasmid

DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA)yang secara alami dimiliki suatu jasad

Bentuknya benang ganda (double strands DNA,

dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat

dengan menambahkan potongan-potongan DNAlain

Vektor untuk


29/78

Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu

membawa potongan DNA lain ke dalam sel

bila memiliki:

Replikator (origin of replication)

Penanda (Marker) yang mudah diseleksi

(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)

Situs untuk mengklon (potongan DNA yang

memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi

sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di

dalam daerah replikator atau penanda

Vektor untuk

Mengklon


30/78

Plasmid yang Dimiliki oleh

Escherichia coli

Berasal dari plasmid alamiE. coli

Potongan DNA tambahan

Potongan DNA tambahan


31/78

Plasmid Khimera (Chimeric


32/78

Plasmid Khimera (Chimeric

Plasmids)

Khimeraberasal dari mitologi Yunani, makhlukdengan tubuh gabungan dari bagian-bagianmakhluk binatang lain

Setelah pemotongan plasmid menggunakan

suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yangmemiliki ujung pemotongan yang sama dapatdisisipkan

Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNAasing disambung, akan dihasilkan "plasmidrekombinan"

Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel

inang yang sesuai


33/78


34/78

Kloning Terorientasi

Bila diinginkan untuk menginsersikanpotongan DNA asing dengan orientasi

tertentu

Dilakukan dengan memotong DNA vektormaupun DNA sumber gen yang

dikehendaki menggunakan dua enzim

restriksi yang berbeda


35/78

Vektor untuk


36/78

Vektor untukMengklon

1 Vektor berupa plasmid

2 Vektor berupa bakteriofaga

3 Cosmid

4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome)

& YAC (Yeast Artificial Chromosome)

e or erupa


37/78

1. Memiliki origin of replication dari inang yang

dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara

independen terhadap genom inang.

2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel

pembawa plasmid tersisipi DNA asing

ketahanan terhadap antibiotik ganda

penapisan biru-putih

3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiplecloning sites, MCS)

4. Mudah diisolasi dari sel inang.

e or erupaPlasmid


38/78

Multiple Cloning Site (MCS)

Pl id


39/78

Plasmid

Vektor berupa


40/78

Vektor berupa

Plasmid

Keunggulan: Kecil, mudah pengerjaannya

Strategi seleksi mudah

Berguna untuk mengklon potongan DNAukuran kecil (< 10kbp)

Kelemahan:

Kurang bermanfaat untuk mengklon potonganDNA ukuran besar (> 10kbp)


41/78

Bakteriofaga (l phage)

Vektor berupa bakteriofaga (
http://images.google.co.id/imgres?imgurl=http://oceanworld.tamu.edu/resources/oceanography-book/Images/BacteriophageCartoon.jpg&imgrefurl=http://oceanworld.tamu.edu/resources/oceanography-book/microbialweb.htm&usg=__-KvGTom-1CNJ_ljtMx1SxjslbQk=&h=481&w=500&sz=111&hl=id&start=1&um=1&tbnid=ZjRQv70MikcAwM:&tbnh=125&tbnw=130&prev=/images%3Fq%3Dbacteriophage%26hl%3Did%26sa%3DX%26um%3D1http://images.google.co.id/imgres?imgurl=http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Keogh/bacteriophage2.jpg&imgrefurl=http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Keogh/plasmids.html&usg=__iv8yyMrCjo9r15xMBnYhVOgBDYk=&h=454&w=377&sz=39&hl=id&start=8&um=1&tbnid=FslzXOE08bV0FM:&tbnh=128&tbnw=106&prev=/images%3Fq%3Dbacteriophage%26hl%3Did%26sa%3DX%26um%3D1


42/78

Vektor berupa bakteriofaga (lvectors)

Lengan kiri: Protein penyusun

kepala & ekor

Lengan kanan:

Sintesis DNA

Pengendalian

Lisis inang

Daerah yangdihilangkan:

integrasi & eksisi

Pengendalian


43/78

Vektor berupa bakteriofaga (lvectors)

V kt b


44/78

Vektor berupa

Bakteriofaga

Keunggulan:

Bermanfaat untuk mengklon potongan

DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)

Seleksi berdasar ukuran

Kelemahan:

Lebih sulit pengerjaannya

Vektor


45/78

VektorCosmid

Keunggulan:

Bermanfaat untuk mengklon potonganDNA berukuran sangat besar (32 - 47kbp)

Seleksi berdasar ukuran

Pengerjaan seperti plasmid Kelemahan:

Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan

plasmid dengan ukuran sangat besar (~

Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna

dari situs l cos(dihilangkan pada vektor l)


46/78

Vektor Cosmid


47/78

l ZAP

V kt BAC


48/78

Vektor BAC Replikasi dimediasi

oriS dan oriE parA andparB

mengendalikan agarhanya terdapat satu

vektor dalam sel Menggunakan

penanda ketahanan

terhadapKhloramfenikolR


49/78

Vecktor YAC

Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbpdan dimasukkan ke dalam yeast

telomeretelomere

centromere

URA3ARS HIS3

replication

origin

markers

largeinserts


50/78

BACs dan YACs

Keunggulan: Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA

dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)

Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan

basa nukleotida total genom Kelemahan:

Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan

ukuran sangat besar

BACs: Bacterial Artificial ChromosomesYACs: Yeast Artificial Chromosomes


51/78

Shu tt le Vecto r Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang

(memiliki origin of replication dari masing-masing inang)

Memilih Vektor


52/78

Memilih Vektor

Ukuran DNA yangdisisipkan

Ukuran vektor

Situs enzim restriksi

yang tersedia Jumlah salinan (copy

number)

Efisiensi kloning

Kemampuan untukmenapis DNA sisipan

Rencana penelitianselanjutnya


53/78

Cara Mengklon DNA (1) Isolasi vektor kloning

(plasmid bacterial) & DNAsumber gen

Pemotongan DNA sumber

gen & vektor kloning

menggunakan enzim

restriksi yang sama

Penyisipan potongan DNA

sumber gen ke dalam vektor

kloning yang telah dipotong

menggunakan enzim

restriksi yang sama;

potongan disambung

den an bantuan enzim


54/78

Cara Mengklon DNA (2)

Vektor kloning yangtelah tersisipi potongan

DNA dimasukkan ke

dalam sel inang

(transformasi sel inang) Penapisan sel pengklon

(dan gen yang

dimasukkan)

Identifikasi sel

pengklon pembawa gen

yang dikehendaki


55/78

Transformasi Sel Inang

Memasukkan plasmid (yang merupakan

vektor yang telah disisipi gen) ke dalam

sel inang


56/78

Transformasi (1)

PRA-INKUBASISel E. colicalon penerimaplasmiddipaparkan kepada ion positif kalsiumklorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan

cekaman kepada bakteri yangmengakibatkan membran sel dan dindingsel bakteri tersebut menjadi permeabelterhadap plasmid donor. Proses ini

mengakibatkan E. colimenjadi kompeten"untuk menerima plasmid .


57/78

Transformasi (2)

INKUBASI Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel

E. colikompeten.

Suspensi sel E. colikompeten lainnya yangtidak ditambah plasmid digunakan sebagaikontrol.


58/78

Transformasi (3)

KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)

Sel kompeten (baik yang diberi plasmid

maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90

detik) kepada suhu 42 oC. Langkah inimemaksimumkan masuknya plasmid

menembus membran dan dinding sel.


59/78

Transformasi (4)

PENYEMBUHAN (RECOVERY)

Sel kompeten (baik yang diberi plasmid

maupun kontrol) ditumbuhkan dalam

medium kaya nutrisi untuk memberikesempatan penyembuhan setelah

mengalami cekaman dan kejutan. Masa

penyembuhan biasanya berlangsung satuwaktu generasi (untukE. coliberkisar

antara 30 hingga 45 menit)


60/78

Transformasi (5)

PENAPISAN (SCREENING)

Sel kompeten yang telah mengalami

penyembuhan ditapis pada medium padat

yang mengandung senyawa penapisberdasarkan penanda yang dibawa oleh

plasmid.

Koloni E li yang membawa


61/78

Koloni E. co liyang membawa

plasmid dengan penanda gen

pendar fluor (pGLO)

E co li yang Membawa Plasmid


62/78

E. co liyang Membawa Plasmid

pGlo

Penanda selektif


63/78

Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi

DNA asing

ketahanan terhadap antibiotik ganda

penapisan biru-putih

Penanda selektif


64/78

Penapisan Klon Medium pertumbuhan

diberi antibiotik yangsesuai dengan sifatketahanan yangdigunakan sebagai

penanda, misalnyaKanamisin

Bakteri di paruh cawanpetri sebelah kanan

memiliki plasmiddengan penandaketahanan terhadapKanamisin(Kanr), yang

di sebelah kiri tidakmemilikin a

Penapisan warna koloni


65/78

Penapisan warna koloni

Biru/PutihlacZ

insert

Enzim tidak berfungsi

X-gal produk

lacZ

Enzim berfungsi

X-gal produk

b Pl id


66/78

pembawa Plasmid

Rekombinan

Hibridisasi Koloni


67/78

Hibridisasi Koloni

Dapat dilakukanjika memilikiDNA pelacak

Bagian dari genyangdikehendaki

Bagian dari genyang mirip dari

jasad lain Oligonukleotida

sintetik


68/78

End

See ya

Kultur


69/78

J

aringan A dalah tehnik in vitro untuk manipulasiregenerasi

sel vegetatif maupun generatif menjadi tanaman

lengkap.

Totipotensi : setiap sel memiliki set totalgenom

yang lengkap dan memiliki potensiuntuk

membentuk tanaman lengkap


70/78

Langkah pembuatan kultur jaringan

Setiap bagian tanaman yang masih dapat membelah dapat dijadikaneksplan (bahan tanaman untuk kulturjaringan).

Karena teknik ini bersifat aspetik, eksplan yang akan digunakan harusdisterilkan dulu.Sterilisasi dengan : klorok,deterjen, fungisida, bekterisida,betadine, air steril.

Potongan steril ditanam dalam botol yang berisi media steril.

Media adalah medium tanam yang mengandung mineral lengkap yangdiperlukan tanaman, zat pengatur (hormon)tumbuh dan gula (sumber karbon/energi).

Setiap 3-4 minggu eksplan yang ditanam di subkultur ke media yang baru(proses penyegaran media tumbuh).

Pada tahap ini eksplan akan membentuk Kalus.

D

ari kalus akan muncul Embrio Somatik Primer.

Embrio somatik primer jika di sub kultur akan menghasilkan Emrio SomatikSekunder.

Embrio somatik jika dipindah kemedia regenerasi dapat mengalamiregenerasi menjadi tanaman kecil.= Planlet

Tahap regenerasi : Perkecambahan/pertunasan, pengakaran.

Selanjutnya aklimatisasi : Lab rumah kaca lapangan

R


71/78

R

ekayasa Genetik PEN G

ER

TIA

N

:

Adalah usaha introduksi gen asing ke genomsuatu makhluk hidup

sehingga gen tersebutterintegrasi dan dapat memberikan ekspresi

PRODUK

:

Mahluk transgenik: Makhluk yangmempunyai sekuens transgen(semua genyang di introduksi secara geneticenginering).


72/78

R ekayasa genetik memiliki prospek luas :

di bidang kedokteran dan pharmasi

di bidang industri

di bidang pertanian

Terutama untuk meningkatkan hasil yang pernah dicapaioleh revolusi hijau.

R

evolusi hijau terbatas karena :

R

evolusi hijau merupakan produk hibrida. Gene-poolyang dapat dipakai untuk menghasilkan hibridharusada pada tanaman yang dipakai untuk pertukarangenetik.

Hibrid kerabat jauh menghasilkan tanaman steril ataumuncul gejala inkompatibilitas padaprosespenyerbukan pembuahan


73/78

Secara umum prasarat rekayasa genetik :

Gen yang akan dipakai

metode introduksi gen danregenerasitanaman transgenik

Ekspresi gen di dalam sel


74/78

Tahap prasyarat rekayasa genetik

Gen yang akan dipakai DNA yang

mengkode karakter yang diinginkan harus

diisolasi. Gen yang digunakan sebagai

materi rekayasa tidak dibatasi berasal darispesies atau genus tanaman yang sejenis

saja, dapat berasal dari mana saja.

METODE INTRODUKSI GEN DAN


75/78

REGENERASITANAMAN

TRANSGENIK Introduksi gen dapat menggunakan :

A. wahana biologi

Gen yang akan diintroduksi,diskontruksi

ke dalam plasmid

Selanjutnya plasmid dapat diserap bakteri

dan diinfeksikan ke sel tanaman


76/78

Wahana non biologi partocle


77/78

Wahana non biologi partocle

gun/particle bombartmen

GEN YANG AKANDIINTRODUKSIKAN DITEMPELKANPA

DA PARTIKEL METAL MIKROSKOPIK

SELANJUTNYADITEMBAKKAN KE SEL TANAMAN


78/78

Teknologi Pembiakan Biosensor

Documents