Teknik Dasar Molekuler

TEKNIK BIOLOGI MOLEKULER

DASAR

Rizki Nisfi Ramdhini, M.Si

Universitas Lampung

Pendahuluan

• Membahas tentang:

– Struktur dan fungsi organisasi unit biologi pada level seluler dan molekular

– Ekspresi genetik

– Prinsip-prinsip rekayasa genetika

Tahapan Teknik Biologi Molekuler

Ekstraksi Asam Nukleat

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Elektroforesis

Ekstraksi Asam Nukleat

• Asam Nukleat >> Molekul makro yang tersusun dari rantai

nukleotida monomerik:

– DNA (deoxyribonucleic acid)

– RNA (ribonucleic acid)

• Tujuan Ekstraksi:

– Memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya

sehingga cukup murni untuk dianalisis dan atau

dimodifikasi lebih lanjut.

Ekstraksi DNA

1. Homogenisasi Sel

Organ dan jaringan

Peralatan steril Menghilangkan aktivitas

DNAse

Suhu 4ºC Menghindari digesti asam nukleat

oleh enzim nuklease

Ekstraksi DNA

2. Pelisisisan Sel

– Melisiskan sel tetapi mencegah fragmentasi DNA.

– Bahan yang dapat digunakan:

• EDTA mengikat ion magnesium (kofaktor yang

dibutuhkan oleh enzim DNase).

• Detergen lisis dinding bakteri. Contoh: Tween,

SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), Nonidet, Laureth dan

Triton. Untuk dinding lebih tebal dapat digunakan

enzim lisosim

Ekstraksi DNA

3. Pemisahan DNA dari komponen lain

Dapat menggunakan:

• Fenol (pelarut organik) protein larut dalam pelarut organik

sedangkan DNA tidak.

• Proteinase mendigesti protein.

• Garam kaotropik.

• Setelah itu, asam nukleat dipresipitasi. Dapat digunakan: etanol

100%, isopropanol, PEG (polyethylene glycol). Dapat pula digunakan

NaCl, sodium asetat, dan amonium asetat.

• Presipitasi etanol dan pencucian pelet dengan etanol 70% dapat

dengan efektif menghilangkan garam dari DNA.

Ekstraksi RNA

1. Metode hampir sama dengan ekstraksi DNA

2. Namun, RNA sangat mudah didigesti oleh RNase oleh karena RNase

relatif stabil terhadap panas karena adanya ikatan disulfida yang

menyebabkan proses renaturasi ketika dingin. Kesulitan penanganan

RNase juga karena RNase tidak membutuhkan ion logam sebagai

kofaktor

3. Dapat dicegah dengan menggunakan sarung tangan, tip berfilter, dan

penggunaan medium yang mengandung detergen kuat (misalnya

DEPC/diethylpryrocarbonate) mendenaturasi RNase. Reagen yang

sering digunakan adalah guanidium thiocyanate. Selain itu, suhu

inkubasi dan sentrifugasi di bawah suhu optimum RNase (37oC).

4. RNA tidak tahan terhadap suhu tinggi.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

• Teknik amplifikasi DNA selektif in Vitro yang meniru fenomena

replikasi DNA in Vivo

PCR (Polymerase Chain Reaction)

– Denaturasi (Melting)

• Memisahkan DNA untai ganda menjadi komponen untai

tunggal Memungkinkan Hibridisasi primer untai ganda

pada sekuen targetnya

Target Sequence

Target Sequence

PCR (Polymerase Chain Reaction)

– Annealing

• Hibridisasi primer PCR pada sekuen target suhu annealing

berasal dari suhu annealing primer hasil kalkulasi matematis

dikurangi 5ºC.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

– Elongasi

• Mengamplifikasi daerah yang sudah dihibridisasi oleh primer.

PCR (Polymerase

Chain Reaction) .

PCR (Polymerase Chain Reaction)

• Pada fase eksponensial

(tengah) pertambahan produk

PCR sebesar 2n+1, maka dengan

mengetahui pertambahan produk

ini dapat dihitung konsentrasi

awal DNA target dalam sampel.

• Setelah siklus ke-30-an biasanya

mulai memasuki fase plateau

(bahan habis, hasil sudah

banyak).

Elektroforesis

Analisis asam nukleat dan mendeteksi keberadaan produk PCR

Perpindahan molekul yang bermuatan sebagai respon terhadap

medan elektrik

DNA bergerak dari kutub negatif (katoda) ke kutub positif (anoda).

Kecepatan perpindahan dipengaruhi oleh:

Ukuran dan bentuk molekul, makin berat makin lambat.

Konsentrasi agarosa

Tegangan listrik

Kekuatan buffer

Komponen

Elektroforesis

1. Medium

• Agarosa

– Paling mudah dengan gel agarosa horizontal.

– Digunakan untuk molekul >100bp.

– Konsentrasi rendah digunakan untuk molekul DNA besar,

begitu sebaliknya.

• Poliakrilamid

– Biasanya untuk molekul <100bp.

– Disarankan menggunakan poliakrilamid dari pada

menggunakan 3% agarosa

Komponen

Elektroforesis

2. Buffer

• Buffer TAE (Tris-Asetat-EDTA) untuk fragmen asam nukleat berukuran >

4kb. Paling sering dipakai namun lebih mudah kehilangan fungsinya

pada elektroforesis tegangan tinggi atau pada proses yang berlangsung

lama/berulang.

• Buffer TBE (Tris-Base-EDTA) untuk fragmen asam nukleat berukuran

0,1-3 kb. Kapasitas buffering lebih besar, namun dihindari pada

purifikasi asam nukleat dari gel

Komponen

Elektroforesis

3. Marker

• Dibuat dengan memotong-motong plasmid yang telah

diketahui ukuran dan urutan sekuensnya.

• atau dengan mencampur fragmen DNA yang telah

diketahui panjangnya

Komponen

Elektroforesis

4. Visualisasi • Pengecatan fluorescent intercalating

dye etidium bromida (EtBr). EtBr

mengikat DNA dengan menginsersi di

antara stacked base-pairs.

• EtBr merupakan mutagen yang sangat

kuat! Alternatif : SYBR Green atau Gelstar

lebih aman.

• Luminasi dilakukan dengan sinar UV.

Nukleotida menyerap UV karena ikatan

rangkap terkonjugasi turunan purin dan

pirimidin yang menyerap UV.

Agarose 2%, Marker φX174/HaeIII digest

(Toyobo), voltase 100 volt, 400 A, 30

menit

Sekuensing

Terimakasih