TEKNIK ASEPTIK
• Kultur jaringan meliputi penanaman sel atau agrerat sel, jaringan, dan organ tanaman pada medium
• Komposisi medium tumbuh ternyata sangat menguntungkan bagi pertumbuhan mikroorganisme
• Mikroorganisme dapat menyerang eksplan sehingga mengakibatkan kematian eksplan
Sumber kontaminan• Medium; sebagai akibat proses sterilisasi yang
tidak sempurna• Lingkungan kerja dan pelaksanaan penanaman
yang kurang hati-hati dan kurang teliti• Eksplan1. internal (kontaminan terbawa di dalam jaringan) 2.Eksternal (kontaminan berada di permukaan
eksplan)• Serangga atau hewan kecil
Prosedur aseptik
• Sterilisasi lingkungan kerja• Sterilisasi alat-alat dan media• Sterilisasi bahan tanaman
Sterilisasi lingkungan kerja
Lingkungan Umum1.Membatasi personil2.Membersihkan ruangan (desinfektan)3.Memakai alas kaki dan jas lab khusus untuk di
dalam ruangan4.Penanaman eksplan dan prosedur lain seperti
isolasi protoplasma, dilakukan di dalam transfer box
Sterilisasi lingkungan kerja
Lingkungan spesifik (transfer box;LAFC)1.Sebelum mulai bekerja permukaan dilap
dengan alkohol 70%, lampu UV dinyalakan ½ - 1 jam
2.Setelah kerja, prosesnya sama
Sterilisasi alat-alat dan media
• Alat-alat yang dipakai ketika penanaman harus dalam keadaan steril : pembakaran (pinset, gunting, scalpel), otoklaf (media, aquadest, alat-alat, kertas saring), oven (botol-botol, tabung reaksi, erlenmeyer,dll).
Sterilisasi bahan tanaman
• Harus bebas kontaminan, selain debu dan kotoran; ada kontaminan hidup (cendawan, bakteri, serangga, spora); kontaminan internal yang berasal dari jaringan tanaman (bakteri) sangat sulit diatasi harus diberi perlakuan antibiotik atau fungisida
Tingkat kontaminasi permukaan pada tanaman tergantung pada :• Jenis tanaman• Bagian tanaman yang digunakan• Morfologi permukaan (berbulu;berduri)• Lingkungan tumbuhnya• Waktu pengambilan• Umur tanaman• Kondisi tanaman
• Pada prinsipnya, sukar untuk menentukan suatu metode baku yang berlaku untuk semua jenis tanaman dan semua bagian tanaman.
• Secara garis besar ada ketentuan umum, namun secara spesifik metode sterilisasi yang paling tepat akan diperoleh dari trial and error;percobaan pendahuluan
• Proses sterilisasi bahan tanaman harus dilakukan dalam beberapa tahap
Bahan sterilisasiBahan konsentrasi waktuCa.hipoklorit 1-10 % 5-30’Na.hipoklorit 1-2 % 7-15’Hydrogen peroksidaGas klorin
10-12 %-
5-15’60-240’
Perak nitrat 1 % 5-30’Merkuri klorida 0,1-0,2 % 10-20’Betadine 2,5-10 % 5-10’Fungisida 2 g/l 20-30’Antibiotik 50 mg/l 30-60’alkohol 70 % ½-1’
Prosedur sterilisasi bahan dapat dimodifikasi sebagai berikut:1.fungisida / ab – merkuri klorida – aquadest
steril2. alkohol - sodium hipoklorit – merkuri klorida –
aquadest steril3. alkohol – sodium klorida – betadin – aquadest
steril
Untuk menghindari pemborosan media perlakuan maka :• Eksplan tidak langsung ditanam didalam
media perlakuan, tetapi pada media preconditioning ( media dasar tanpa hormon) u/ menguji efektifitas sterilisasi
• Selama 3-7 hari pada media preconditioning dan tidak menunjukkan adanya gejala kontaminasi, eksplan siap ke media perlakuan yang sesungguhnya
• Eksplan yang terkontaminasi dibuang
Cara sterilisasi organ/ eksplan dgn bahan kimia:1. Ambil organ yang akan dijadikan eksplan, cuci
sampai bersih dgn air (2-3x) letakkan dalam petridish atau erlenmeyer
2. Timbang zat kimia untuk sterilisasi larutkan dalam aquadest sesuai dengan kebutuhan
3. Selanjutnya kedua bahan tersebut dimasukkan ke dalam laminar air flow yang sudah dibasahi dengan alkohol atau spiritus
4. Masukkan potongan organ / eksplan yang akan disterilsasi ke petri / erlenmenyer ;digoyang secara perlahan agar eksplan terbasahi secara sempurna
5. Apabila eksplan masih mengandung daun pembungkus, sisik, bulu, duri, ataupun bahan lain maka harus dibersihkan sampai yang muda yang berwarna tampak keputihan
6. Cuci eksplan dengan aquadest steril 2-3 kali kemudian dipotong kecil2 dengan ukuran 1-5 mm eksplan siap ditabur
Penanaman eksplan
• Eksplan diambil dengan pinset, diletakkan dalam petridish, kemudian dipotong-potong dengan skalpel
• Potongan eksplan dimasukkan ke dalam erlenmeyer berisi media hingga permukaan yang teriris dapat bersentuhan dengan media
• Erlenmeyer ditutup kembali dan disimpan dalam ruang inkubator dengan suhu dan intensitas cahaya yang sesuai
Inisiasi kultur suspensi sel
• Bahan awal adalah kalus yang meremah (friable)
• Media yang digunakan adalah media cair (tanpa agar)
• Wadah berupa labu erlenmeyer• Labu erlenmeyer yang digunakan hanya diisi
media seperlima kapasitas• Zat pengatur tumbuh ditambahkan sebanyak
sepersepuluh kadar dalam media padat
Kondisi kultur suspensi sel• Digojog berputar pada penggojog berpusing
(gyrotory shaker), disebut aerasi• Kecepatan berpusing 80-100 rpm, dengan
simpangan ± 3 cm• Suhu ruang inkubasi (25±3)°C• Pencahayaan dengan lampu TL-day light 40 w
atau gelap• Subkultur dilakukan setiap sekitar 7 hari, setelah
diketahui kurva pertumbuhannya• Pengukuran tinggi enapan dengan alat tertentu
Subkultur suspensi sel
• Suspensi sel dienapkan, bila tidak terjadi kontaminasi cairan di atas enapan jernih
• Secara aseptis media lama dituang, kemudian diganti dengan media segar sebanyak 2 kali volume media yang dituang, dipindah dalam wadah dengan kapasitas 2xlipat
• Wadah media ditutup kembali dan diinkubasi pada penggojok berpusing
• Subkultur diulang sampai diperoleh biomassa yang dikehendaki
Pembuatan kurva pertumbuhan
• Diukur tinggi enapan pada saat inisiasi kultur suspensi sel
• Diukur tinggi enapan setelah setiap 3-5 hari• Disarankan agar kultur suspensi sel sudah
dalam wadah dengan kapasitas 250-300 mm• Pengukuran endapan dengan alat, dihitung
sampai mm saja• Buat poligon antara waktu vs tinggi enapan