TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK Predavač: Prof. dr Zoran Stanimirović
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
Predavač: Prof. dr Zoran Stanimirović
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
Tenologija rekombinantne DNK obuhvata veći broj tehnika preuzetih iz drugih disciplina (biohemija, mikrobiologija), kao i posebno razvije metodologije. Najvažnije među ovim tehnikama su sledeće:• Upotreba restrikcionih endonukleaza, posebnih enzima koji poput “makaza” seku specifične oligonukleotidne sekvence DNK, tako da je omogućena izolacija i manipulisanje izolovanim genom.• Kloniranje DNK je praktično neograničeno umnožavanje izolovanog DNK framenta. Postiže se ugrađivanjem željenog fragmenta u plazmid ili virus, tako da se sa njhovom replikacijom umnožava i ubačena sekvenca DNK. Poslednjih godina razvijena je metoda PCR (od engl. polymerase chain reaction – lančana reakcija polimeraze) kojom se u in vitro uslovima postiže izuzetno velika moćumnožavanja DNK sekvence.
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
• Hibridizacija nukleinskih kiselina zasniva se na komplementarnosti azotnih baza. Tako je moguće da se primenom radioaktivno obeležene “genske probe”(specifične sekvence DNK u koju su ugrađeni nukleotidi obeleženi radioaktivnim izotopima) izvrši detekcija date sekvence u uzorku tkiva ili odredi pozicija na hromozomu ili histološkom preparatu. Pored radioizotopa, za obeležavanje DNK mogu da se upotrebe različita fluorescentan jedinjenja.
• Brzo sekvencioniranje nukleotida u prečišćenom fragmentu DNK koristi se u identifikaciji gena i izvođenju moguće sekvence aminokiselina na osnovu genetičkog koda.
• Genetičko inženjerstvo podrazumeva promenu DNK sekvenci koje dovodi do stvaranja modifikovanih oblika gena koji se mogu da reintegrišu u ćelije, odnosno organizme
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
- RESTRIKCIONI ENZIMI -
Restrikcione endonukleaze su enzimi koji seku specifične kratke DNK sekvence označene kao palindromi. Palindromi predstavljaju nukleotidne sekvence koje imaju isti redosled nukleotida kada se okrenu za 180°.Restrikcioni enzimi su normalno prisutni u ćelijama bakterija štiteći ih od virusne DNK. Redosled nukleotida koje prepoznaju restrikcioni enzimi varira među različitim vrstama bakterija, tako da je do danas izolovano preko 200 različitih restrikcionih endonukleaza.
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK- RESTRIKCIONI ENZIMI -
Ovi enzimi prepoznaju nukleotidne sekvence dužine 4-8 baznih parova. Interesantno je da se iste takve sekvence pojavljuju u bakterijskoj DNK, ali su u njima adenin i citozin metilovani. Na taj način bakterijska DNK je zaštićena od samoubilačkog dejstva svojih restrikcionih enzima. Međutim, ukoliko se u bakteriji nađe strana DNK, restrikcioni enzimi je efikasno razgrađuju, pošto se u njoj po pravilu ne nalaze metil grupe.
Enzim DNK ligaza, zatim, spaja mesta prekida kovalentnim vezama čime se stvara rekombinovana DNK. Ukoliko se DNK obrađuju enzimima kojii ne stvaraju lepljive već ravne krajeve, moguće je naknadno posebnim enzimom dodati jednolančane lepljive krajeve i konačno, izvršiti spajanje DNK ligazom.
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK- RESTRIKCIONI ENZIMI -
Ako se DNK iz dva različita izvora tretiraju istim restrikcionim enzimom i zatim dobijeni restrikcioni fragmenti objedine, može doći do povezivanja ovih različitih DNK molekula usled komplementarnosti jednolančanih lepljivih krajeva.
Dobijanje rekombinovanih molekula DNK
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
RESTRIKCIONI ENZIMI
Redosled nukleotida nekoliko ciljnih mesta za restrikcione endonukleaze.
Enzimi Hpa I stvara ravne prekide, dok nakon dejstva enzima EcoR I, Hind III i Pst Idolazi do stvaranja lepljivih (kohezivnih) krajeva.
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK
RESTRIKCIONI ENZIMI
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK- RESTRIKCIONI ENZIMI -
Interesantno je napomenuti da enzim terminalna dezoksiribonukleotid transferaza izolovana iz timusa govečeta ima sposobnost da na 3′-OH krajevima sintetiše jednolančanu DNK bez prisustva komplementrarnog lanca, što je, inače, zahtev svih ostalih DNK polimeraza. Ipak, u genetičkom inženjeringu se rađe koriste restrikcione endonukleaze koje formiraju lepljive krajeve.
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK- KLONIRANJE DNK -
Polazeći od činjenice da se restrikciona mesta mogu naći u bilo kojoj DNK, lako je zamisliti spajanje restrikconih fragmenata iz različitih bioloških vrsta. Ukoliko je jedan od restrikcionih fragmenata u dobijenom hibridu ima moć replikacije (npr. plazmid), onda se nakon uvođenja u ćeliju domaćina pri svakoj replikaciji istovremeno umnožava i uvedena sekvenca strane DNK.
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK- KLONIRANJE DNK -
Uobičajeno je da se replikon sa ugrađenom DNK za kloniranje naziva vektorom. Vektori su najčešće plazmidi ili virusi (fagi) određenih bakterija. Kao domaćin u kome se omogućava umnožavanje vektora najčešće se koristi bakterija Escherichia coli, mada su konstruisani vektori za druge vrste bakterija i neke jednostavne eukariotske ćelije (kvasci). Nakon ubacivanja rekombinovane DNK u ćeliju domaćina dolazi do umnožavanja sekvence koja je ubačena u dati vektor. Ubačeni fragment može ponovo da se izvuče na sličan način kako je i ubačen – isecanjem istim restrikcionim enzimom.
Šematski prikaz uobičajenogpostupka za kloniranje
rekombinovane DNK
KLONIRANJE DNK
TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK-KLONIRANJE DNK –
S obzirom da su geni eukaritoa diskontinuirani (pored kodirajućih sekvenci sadrže i nekodirajuće), važno je da se u vektor ugradi DNK iz koje su eliminisani introni. To se postiže sintezom molekula DNK sa iRNK za dati protein pomoću enzima reverzne transkriptaze. Pošto se u molekulu iRNK ne nalaze introni (isečeni su tokom obrade primarnog transkripta), na taj način nastaje komplementrana DNK (cDNK).
Prilikom kloniranja molekula DNK kao polazni materijal može da se koristi ceo genom nekog organizma koji se obrađuje restrikcionim enzimom. Ukoliko se radi sa eukariotskim genomom, dobijeni fragmenti sadrže ne samo kodirajuće sekvence DNK-egzone, već i različite regulatorne sekvence, ponovljene nizove, kao i introne prisutne unutar samih gena.
Kada se cDNK ugradi u vektor na takav način da se može ispoljiti do nivoa genskog produkta (proteina), tada će se u ćeliji bakterije sinetetisati eukariotski protein.
Postupak sinteze komplementarne
DNK (cDNK)
KLONIRANJE DNK
Related Documents
