Tecnologia do DNA Recombinante Tecnologia do DNA recombinante Enzimas de Restrição (endonucleases): tesouras do DNA enzimas produzidas por bactérias para.

Tecnologia do DNA Recombinante

Tecnologia do DNA recombinante

Enzimas de Restrição (endonucleases): tesouras do DNA

enzimas produzidas por bactérias para restringir a proliferação de vírus invasores;

diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de bases de DNA;

reconhecem e clivam o DNA em pontos específicos, geralmente em sequências de 4, 6 e 8 bases – palíndromas.

Nomenclatura: as enzimas de restrição são chamadas de acordo com a bactéria que a produziu:

IzosquizomerosIzosquizomeros: diferentes enzimas de restrição que possuem a mesma sequência de reconhecimento

Tecnologia do DNA recombinante

Extremidades: coesivas X “cegas”

coesiva = EcoRI =

“cega” = SmaI = 5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

5’-CCC GGG-3’3’-GGG CCC-5’

-3’

Tecnologia do DNA recombinante

Cortando e Juntando o DNA....

Tecnologia do DNA recombinante

Amplificação do DNA recombinante....

Tecnologia do DNA recombinante

Escolha de um vetor de clonagem: molécula pequena – fácil manipulação capaz de se replicar em uma célula viva presença de sítios de restrição para inserção do DNA a ser clonado possuir um método de identificaçãoe recuperação das moléculas recombinantes

Ex: pUC18

ampR - bactérias transformadas serão resistêntes a ampicilina

popiligador – sítio de clonagem múltipla

lacZ’ - codifica para –galactosidade que converte X-Gal em um corante azul

Tecnologia do DNA recombinante

Construção de uma biblioteca de DNA

Construção de uma biblioteca de cDNA cDNA = DNA complementar;feito a partir do mRNA; não tem introns

Uso do DNA clonado como sonda

transferência de Southern (E.M. Southern) - DNA transferência de Northern- RNA transferência de Western - PTN

Tecnologia do DNA recombinante

Tecnologia do DNA recombinante

Mapas de Mapas de RestriçãoRestrição

As unidades do mapa são expressadas em pares de bases ou para distâncias mais longas em pares de kilobases

É uma compilação do número, da ordem e da distância entre locais do corte da enzima de

restrição ao longo de um segmento de DNA

O DNA encontra-se, geralmente, dentro de um vetor bem caracterizado do plasmídeo ou do bacteriófago, onde a sequência é conhecida

Normalmente, o mapeamento é a primeira etapa para caracterizar um DNA desconhecido e um pré-requisito para manipulá-lo para outras finalidades.