TECNICAS INMUNOLÓGICAS CELULARES Prof. Caroline Weinstein
TECNICAS INMUNOLÓGICAS CELULARES
Prof. Caroline Weinstein
AISLAMIENTO DE LINFOCITOS
AISLAMIENTO DE LINFOCITOS
ENSAYO INCORPORACIÓN TIMIDINA TRITIADA (FUNCIONAL)
INCORPORACIÓN DE TIMIDINA TRITIADA
ENSAYO DE CITOTOXICIDAD (FUNCIONALIDAD)
ENSAYO MTT:ENSAYO MTT:
ALTERNATIVAS AL ENSAYO DE INCORPORACIÓN DE TIMIDINA TRITIADA:
CITOMETRIA DE FLUJO: UNA POTENTE HERRAMIENTA EN INMUNOLOGÍA
CITOMETRIA DE FLUJO: UNA POTENTE HERRAMIENTA EN INMUNOLOGÍA
Forward Angle Light Scatter
FALS Sensor
Laser
Purdue University Cytometry Laboratories
Flow Cell
Injector Tip
FluorescenceFluorescencesignalssignals
Focused laserFocused laserbeambeam
Sheath fluid
Purdue University Cytometry Laboratories
Forward Angle Light Scatter
FALS Sensor
Laser
Purdue University Cytometry Laboratories
90 Degree Light Scatter
FALS Sensor
90LS Sensor
Laser
Purdue University Cytometry Laboratories
Laser
Fluorescence Detectors
Fre
q
Fluorescence
FALS Sensor
Fluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)
Purdue University Cytometry Laboratories
PMT
PMT
PMT
PMT
DichroicFilters
BandpassFilters
Example Channel Layoutfor Laser-based FlowCytometry
Laser
1
2
3
4
Flow cell
original from Purdue University Cytometry Laboratories;modified by R.F. Murphy
CELLULAR ANTIGENS
Sensory AdhesionMetabolic
Log FITC
1000 100 10 1
11
0
.1
Co
un
t
3
0 7
0
0
1
5
0
ImmunophenotypingImmunophenotyping
Log FITC Fluorescence (CD8).1 1 10 100 1000
Lo
g P
E F
luo
resce
nce
(C
D4
)
.1 1
1
0 1
00
1 2
3 4
45% 2%
26%
CD4/CD8 Quadstats
27%
Otras aplicaciones citometria de flujo
• Evaluación funcional de la capacidad oxidasas (NADPH dependiente) de los neutrófilos
dihidrorodaminaneutrófiloneutrófilo
PMA
DIHIDRORODAMINA OXIDADA
Control- Unstim(Top),
Stimulated(Bottom)
Twin #1 (AD)Unstim(Top), Stimulated(Bottom)
Twin #2 (JD)Unstim(Top), Stimulated(Bottom)
Neutrophil oxidative index (NOI) = 1,614
NOI=1
NOI=2
HEMOGLOBINURIA PAROXÍSTICA NOCTURNA
CD59 CD55
Healthy Control
Patient
PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS POR CITOMETRÍA DE FLUJOPROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO:
Ejemplo: inmunohistoquímica para HER-2
SEPARACIÓN MAGNÉTICA DE CÉLULAS
EJERCICIOS:
La figura anterior representa un resultado de un ensayo de citotoxicidad para linfocitos CD8. Al respecto explique:
Fundamento del método.
Identifique que curva representa una menor actividad citotóxica
EJERCICIOS:
Dibuje una nube de puntos en el siguiente gráfico que represente los resultados de citometría de flujo de un paciente que no posee linfocitos CD8
CD8
CD4
EJERCICIOS:
Con respecto a la prueba de incorporación de timidina tritiada:a. Explique el fundamento del método b. Métodos alternativos. c. Cómo espera encontrarla en un individuo cuyo informe de citometría de flujo es
el siguiente. Fundamente su respuesta.
CD8
CD4
Un científico japonés sostiene que el cáncer se produce por una inmunodepresión. Describa un ensayo que le permita detectar una respuesta inmune deprimida ante tumores.
EJERCICIOS:
Usted ha sido contratado para ser el jefe del laboratorio de seguimiento de pacientes HIV positivos. Debe implementar una técnica para analizar las subpoblaciones linfocitarias. Describa la técnica escogida, haciendo un análisis crítico (ventajas y desventajas)
EJERCICIOS: