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Atlas de Histologı́a Vegetal y Animal
Técnicas histológicas
OBSERVACIÓN
Manuel Meǵıas, Pilar Molist, Manuel A. Pombal
Departamento de Bioloǵıa Funcional y Ciencias de la
Salud.Fcacultad de Bioloǵıa. Universidad de Vigo.
(Versión: Julio 2018)
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Contenidos
1 Introducción 1
2 El proceso histológico 2
3 Observación 4
4 Microscopio óptico 5
5 Microscopio electrónico 8
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Técnicas histológicas. Observación. 1
1 Introducción
En estas páginas dedicadas a las técnicas histológicasvamos a
describir los procedimientos experimentalesnecesarios para obtener
secciones teñidas y listas paraobservar al microscopio partiendo
de tejidos vivos ex-tráıdos de un animal o de una planta. Por
tanto, dedi-caremos espacios a la obtención, fijación,
inclusión,corte y tinción de los tejidos. Todos estos aparta-dos
seguirán el mismo esquema que los caṕıtulos ded-icados a los
tejidos o a la célula, partir de un es-quema básico y ampliar la
información sucesivamenteen páginas adicionales. No dedicaremos
demasiadoespacio a los instrumentos, desde el punto de
vistaoperativo, pero śı a la conveniencia de su uso y asus
capacidades. Además, se incluye un apartado deprotocolos y recetas
donde se incorporan los tiempos,productos y manera de proceder para
llevar a cabolas tinciones más comunes y cómo preparar sus
reac-tivos.También se han añadido algunos v́ıdeos
explica-tivos.
La mayoŕıa de las técnicas histológicas van encam-inadas a
preparar el tejido para su observación con elmicroscopio, bien sea
éste óptico o electrónico. Ello
es debido a que la composición de los tejidos, salvocontadas
ocasiones, no tienen contraste ni colores per-mitan diferenciar sus
estructuras de una manera claramediante la observación directa con
los microscopios.Por ello hay procesar las muestras, primero para
queno se se deterioren y después para resaltar sus estruc-turas y
poder estudiarlas en detalle.
Existen procedimientos rápidos y simples para laobservación de
tejidos y células vivas que reciben elnombre de vitales. Por
ejemplo, la observación delflujo sangúıneo en capilares del
sistema circulatorio.Otra forma de observar células o tejidos
vivos es medi-ante las técnicas histológicas supravitales, en los
quelas células y los tejidos se mantienen o se hacen crecerfuera
del organismo, como es el caso de los cultivosde células y de
tejidos.
Las técnicas histológicas postvitales son aquellas enlas que
las células mueren durante el proceso, pero lascaracteŕısticas
morfológicas y moleculares que poséıanen estado vivo se conservan
lo mejor posible, lo quedepende del tipo de técnica. Estas
páginas estarándedicadas a este tipo de técnicas, puesto que son
lasmás comúnmente usadas en los laboratorios de his-toloǵıa.
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Técnicas histológicas. Observación. 2
2 El proceso histológico
Denominamos proceso histológico a una serie demétodos y
técnicas utilizados para poder estudiarlas caracteŕısticas
morfológicas y moleculares de lostejidos. Hay diversos caminos
para estudiar los teji-dos, es decir, series de técnicas que se
utilizarán de-pendiendo de qué caracteŕıstica deseemos
observar.En el siguiente esquema se muestran los métodosy
técnicas comúnmente empleados durante el proce-samiento de los
tejidos para su observación con losmicroscopios óptico o
electrónico. Sin embargo, hayque tener en cuenta que existen
muchas variantes a es-tos ”caminos” y su elección dependerá del
resultadofinal que queramos obtener.
El proceso histológico comienza con la obtencióndel tejido
objeto de estudio. En el caso de los tejidosvegetales directamente
se toman muestras de los dis-tintos órganos que componen el cuerpo
de la planta,mientras que para los tejidos animales podemos op-tar
por dos opciones: coger una porción del tejidou órgano y
procesarla o procesar primero el animalcompleto y luego extraer la
muestra que nos interese.En cualquier caso las muestras son
habitualmente fi-jadas con unas soluciones ĺıquidas denominadas
fi-jadores, las cuales se usan para mantener las estruc-turas
celulares y moleculares inalterables durante elprocesamiento
posterior y con una organización lomás parecida posible a como se
encontraban en lamuestra viva. También podemos fijar las
moléculas delos tejidos por congelación rápida. Fijar un tejido
escomo hacer una fotograf́ıa de dicho tejido, su estruc-tura se
mantendrá hasta su observación. La fijaciónpor congelación se
emplea cuando la fijación qúımicao los procesos histológicos
posteriores alteran las car-acteŕısticas de la muestra que
queremos estudiar, porejemplo una molécula sensible a dichos
tratamientos.
Normalmente, tras la fijación se procede a incluir eltejido
para posteriormente obtener secciones. Cuantomás delgada queramos
que sea nuestra sección mástenemos que endurecer nuestra muestra.
Esto se con-sigue embebiendo el tejido con sustancias ĺıquidas
queposteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán
consistentes (ceras). También se puede conseguirel mismo efecto
mediante congelación rápida. Cortesmás gruesos de 40 µm se
pueden cortar sin necesi-dad de inclusión usando el vibratomo. Los
mediosde inclusión no son normalmente hidrosolubles porlo que
tendremos que sustituir el agua de los tejidospor solventes
orgánicos liposolubles y posteriormentesustituirlos por el medio
de inclusión.
Tras la inclusión o la congelación se procede a cor-tar los
tejidos, es decir, obtener secciones. Existendiferentes aparatos de
corte que permiten conseguirsecciones ultrafinas (del orden de
nanometros), semi-finas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10
µm)y gruesas (mayores a 10 µm). Habitualmente las sec-ciones se
procesan para poder observarlas y estudiar-las, aunque ciertos
tipos de microscoṕıa, por ejemplocon contraste de fase, permiten
observar secciones detejidos sin procesar. Normalmente las
secciones setiñen con colorantes que son hidrosolubles, por lo
quehay que eliminar el medio de inclusión para que loscolorantes
pueden unirse al tejido. Las secciones ul-trafinas (observadas con
el microscopio electrónico)o semifinas (observadas con el
microscopio óptico)se pueden contrastar con metales pesados o con
col-orantes, respectivamente, sin necesidad de eliminar elmedio de
inclusión.
Los tejidos procesados se observan con los micro-scopios.
Existen dos tipos básicos de microscopios:óptico y electrónico.
Los primeros ofrecen una granversatilidad en cuanto a modos de
observar los teji-dos: campo claro, fluorescencia, contraste de
fase,polarización o contraste de interferencia
diferencial,mientras que los segundos permiten un gran poder
deresolución, pudiéndose observar caracteŕısticas
ultra-estructurales.
Como dijimos al comienzo existen múltiples varia-ciones sobre
este esquema general de procesamientohistológico. Por ejemplo, se
pueden observar tejidoscon el microscopio electrónico de barrido
sin necesi-dad de incluir ni cortar, pero sólo observaremos
su-perficies. En las siguientes páginas veremos con ciertodetalle
algunas de las técnicas más empleadas para laobservación de los
tejidos.
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Técnicas histológicas. Observación. 3
Figura 1. Esquema del proceso histológico.
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Técnicas histológicas. Observación. 4
3 Observación
El último paso de todo proceso histológico es la ob-servación
del resultado producido por la técnica real-izada. El poder de
resolución del ojo humano es de 0,2mm (poder de resolución:
distancia mı́nima a la quese discriminan dos puntos), mientras que
una célulaeucariota t́ıpica suele tener unas dimensiones que
os-cilan entre 10 y 50 micrómetros (µm. 1 µm=10-6mm). Además, si
queremos estudiar la ultraestruc-tura celular hay que tener en
cuenta que el grosorde una membrana celular es de unos 7
nanometros.Todo ello implica que necesitamos aparatos que
nospermitan aumentar al imagen de las muestras paradiscriminar
estructuras tisulares diminutas como sonlas células o sus
compartimentos. Estos aparatos sellaman microscopios.
Hay dos tipos de microscopios: los ópticos y
loselectrónicos.
Los microscopios ópticos, o de campo claro, uti-lizan la luz
visible y lentes de cristal que permiten unaumento de las muestras
de unas 1000 veces, con unpoder de resolución de unos 0,2
micrómetros. Ésta esla máxima resolución que permite la luz
visible porsus propiedades de onda. Los microscopios se usan
para observaciones generales, caracteŕısticas celularesy
tisulares, y están presentes en todos los laboratoriosde
histoloǵıa.
Los microscopios electrónicos se basan en la altafrecuencia de
los electrones para conseguir un poderde resolución de 1
nanometro. Se usan para observarla ultraestructura de la célula y
los tejidos, es de-cir, para estudiar el nivel subcelular, como
orgánulos,membranas u organizaciones moleculares (por ejem-plo, se
pueden observar los ribosomas). Hay dos tiposde microscopios
electrónicos: los de transmisión, quese usan para estudiar la
ultraestructura de la célulaen secciones muy finas, y el de
barrido, que permiteestudiar superficies.
A los microscopios, sobre todo los ópticos, se lespueden
añadir dispositivos que permiten ampliar supotencialidad. Por
ejemplo, al microscopio óptico sele puede adaptar una fuente
luminosa y una seriede filtros para observar moléculas
fluorescentes, o fil-tros para destacar cambios de densidad en el
tejido,etcétera. A las diferentes formas de utilizar los
micro-scopios para la observación de caracteŕısticas de
lostejidos se les llama microscoṕıa. Aśı podemos hablarde
microscoṕıa óptica de contraste de fase, de fluores-cencia,
electrónica, etcétera.
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Técnicas histológicas. Observación. 5
4 Microscopio óptico
El microscopio óptico es un elemento esencial paralos estudios
generales de histoloǵıa puesto que es elque nos permite observar
las diferentes caracteŕısticasmorfológicas de las células y los
tejidos. Se basa enel uso de lentes para aumentar los rayos de luz
queatraviesan una muestra de tejido. Su invención seremonta al
siglo XVII. Desde entonces se ha ido per-feccionando hasta llegar a
los modernos microscopios.Durante estos siglos, el mayor avance en
cuanto a per-fección y calidad se ha producido en su principal
el-emento, las lentes, las cuales aumentan la imagen delas
secciones de tejido y permiten hacer visibles alojo humano detalles
ńıtidos que de otra manera seŕıaimposible observar.
Los microscopios ópticos tienen un ĺımite máximode
resolución de 0,2 µm. El poder de resolución es ladistancia
mı́nima a la que se pueden discriminar dospuntos. Este ĺımite
viene determinado por la longitudde onda de la fuente de
iluminación, en este caso laluz visible.
Contiene normalmente dos sistemas de lentes: elobjetivo y el
ocular. El objetivo recoge la luz queatraviesa la sección de
tejido, mientras que el ocular esel que proyecta la imagen sobre la
retina. El aumentototal que permite un microscopio óptico se
calculamultiplicando la magnificación que produce el obje-tivo por
la que produce el ocular. Por ejemplo, si es-tamos usando un
objetivo de 40x (aumenta 40 veces)y un ocular de 10x (aumenta 10
veces), el resultadofinal sera de 400x, es decir, vemos la muestra
aumen-tada 400 veces. Usando microscopios ópticos avanza-dos se
consiguen unos 1000-1500 aumentos (objetivode 100x junto con
oculares de 10x o 15x). Algunosmicroscopios ópticos tienen lentes
internas que pro-ducen aumentos adicionales que tendremos que
teneren cuenta para calcular la magnificación de la imagenque se
observa. No debemos confundir los aumentoscon el poder de
resolución. Por más que consigamosaumentar una imagen tomada de
un microscopio, in-cluso con metodoloǵıa digital, no se puede
aumentarla resolución de la imagen.
PARTES del MICROSCOPIO
Un microscopio óptico básico está formado por lassiguientes
partes:
Oculares. Son las lentes que forman la imagen queobservaremos
con nuestros ojos. Todos los microsco-pios actuales poseen dos
oculares, uno para cada ojo.Por eso a los microscopios actuales se
les llama binoc-ulares. Los primeros microscopios eran
monoculares,es decir, poséıan un solo ocular. Hay que tener
encuenta que en los microscopios más avanzados tantoel objetivo
como el ocular suelen estar compuestospor varias lentes. Al menos
uno de los oculares puederegularse para alejar o acercar la lente
al objetivo,permitiendo ajustar el enfoque a las condiciones
devisión, dioptŕıas, de cada observador.
Figura 2. Partes de un microscopio simple.
Objetivos. Los objetivos son las lentes que recibenla lux
directamente tras atravesar la sección his-tológica y quizá sean
los elementos más importantesdel microscopio. Hoy en d́ıa los
microscopios ópticosposeen un tambor o revólver donde se
encuentran var-ios objetivos. Cada uno de ellos posee lentes que
per-miten diferentes aumentos. Las magnificaciones de losobjetivos
más usados suelen ser de 4x, 10x, 20x, 40xy 100x. Rotando el
revólver se puede seleccionar elobjetivo y por tanto el aumento al
que queremos ob-servar la preparación. Aparte de los aumentos, los
ob-jetivos tienen una serie de caracteŕısticas para mejo-rar la
imagen. Aśı, pueden ser acromáticos, de fluo-rita o
apocromáticos, los cuales corrigen alteracionescromáticas, de
campo plano que eliminan la curvatura
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del campo de observación, de contraste de interferen-cia,
etcétera.
Cuando se usan objetivos de 100 aumentos (100x)es necesario
emplear un ĺıquido denominado aceite deinmersión , que se añade
entre el objetivo y la mues-tra. Esto es debido a que la
refracción de la luz esalta en el aire y provoca alteraciones en
la imagenque se manifiestan cuando se usan objetivos con
estacapacidad de aumento. El aceite de inmersión reduceenormente
esta refracción permitiendo imágenes mu-cho más ńıtidas.
Figura 3. Imágenes resultantes del uso de objetivos
condiferentes aumentos (especificados en las imágenes) al
ob-servar un epitelio estratificado plano queratinizado.
Platina. Es la plataforma donde se coloca el por-taobjetos con
nuestro tejido. Posee un dispositivopara sujetar el portaobjetos,
el cual se puede de-splazar en el plano de la platina, movimiento
con-trolado manualmente.
Condensador. Es un dispositivo con una lente queconcentra y
focaliza la luz proveniente de la fuentesobre la sección de
tejido.
Diafragma. Se sitúa entre la fuente luminosa y elcondensador.
Permite aumentar el contraste de lamuestra y la profundidad de
campo, es decir, el espe-sor de la muestra que está enfocado.
Lámpara luminosa. Es la que proporciona la luzque atraviesa la
sección de tejido. Inicialmente se us-aba la luz natural, la cual
se pod́ıa concentrar en lasección de tejido mediante espejos
cóncavos. Actual-mente se usa una lámpara cuyo haz de luz
atraviesael diafragma, el condensador, la muestra, y tras
ellopenetra por el objetivo y atraviesa los oculares hastanuestros
ojos. La intensidad de la fuente luminosa sepuede regular mediante
un reostato.
Macrométrico y micrométrico. El enfoque de la
muestra se consigue variando la distancia de la mues-tra a la
lente del objetivo. Esta distancia dependede los aumentos que
produzca el objetivo, mayor dis-tancia cuanto menores aumentos, y
del tipo de ob-jetivo. La distancia se controla mediante dos
ruedasdenominadas macrométrico y micrométrico, respec-tivamente.
La primera permite movimientos ascen-dentes y descendentes amplios
de la platina y la se-gunda ajustes finos.
Figura 4. Recorrido de la luz desde la fuente, pasando através
de los diferentes lentes de un microscopio básico,hasta el
observador.
MODIFICACIONES
Contraste de fase. Esta modificación del microsco-pio de campo
claro necesita de objetivos especiales yse basa en el ligero
retraso que sufre la luz cuandopasa por las estructuras tisulares
en función de sudensidad. De esta manera se consiguen diferentes
lu-minosidades para distintas estructuras tisulares. Seemplea para
ver muestras sin teñir o acuosas, aśı comocélulas vivas, por
ejemplo en cultivos celulares.
Campo oscuro. La observación en campo oscuro esun buen
sustituto del contraste de fase para observarespećımenes sin
teñir o medios acuosos. Consiste enla incorporación de un objeto
opaco bajo el conden-sador, entre la fuente luminosa y la sección
de tejido.Este objeto sólo deja pasar la luz más lateral que
in-cidirá sobre la muestra de forma oblicua y sólo aquellaluz que
sea reflejada por la muestra llegará a los ob-jetivos. Alĺı donde
no haya tejido aparecerá obscuroy distintas densidades o
propiedades del tejido refle-jarán diferente cantidad de luz.
Contraste de interferencia y Nomarski. Este tipode microscoṕıa
aparece sólo en los microscopios másavanzados y supone tener
objetivos especiales. Estosmétodos dan a los tejidos un aspecto
tridimensional,es decir, aumentan la profundidad de campo
(espe-
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Técnicas histológicas. Observación. 7
sor de tejido que está simultáneamente enfocado, esdecir, que
se ve ńıtidamente). Se basa en el uso defiltros que polarizan la
luz, lo cual consiste en dejarpasar sólo a la ondas
electromagnéticas que vibran enun determinado plano.
Posteriormente pasan por unprisma que reagrupa esta luz en
elementos separadospor una distancia que es similar al poder de
resolucióndel objetivo que se está usando. Existe un prismapara
cada objetivo. Entonces la luz pasa por el mues-tra y las
diferencias de densidad del tejido, como losbordes de las células
o densidades del interior celular omatriz extracelular, provocarán
alteraciones en la luzque se dirige hacia los objetivos, los cuales
transfor-marán esas diferencias en cambios en la
luminosidad.Todav́ıa existe una lente adicional entre el objetivoy
los oculares que permiten modular la luminosidadaún más.
FLUORESCENCIA
El microscopio de fluorescencia se usa para obser-var sustancias
fluorescentes denominadas fluoróforos.Una molécula fluorescente
es aquella que es capaz decaptar radiación electromagnética con
una longitudde onda determinada y emitir otra radiación
electro-magnética con otra longitud de onda diferente,
nor-malmente dentro del espectro de la luz visible. Losfluoróforos
se utilizan como marcadores para la de-tección de otras moléculas
tisulares, normalmente me-diante la técnica de
inmunofluorescencia. Los usadosen microscoṕıa absorben en el rango
de la luz ultra-violeta, normalmente producida por una lámpara
demercurio, y emiten en el rango de la luz visible. Paraseleccionar
el rango de longitud de onda con que serániluminados se utilizan
filtros espećıficos localizadosentre la fuente y la muestra que
sólo dejan pasar undeterminado rango de frecuencias. Con un tambor
defiltros se consigue iluminar la muestra con diferentes
rangos de ondas electromagnéticas y por tanto
activarselectivamente a diferentes fluoróforos.
La microscoṕıa de fluorescencia nos permite usarmás de un
fluoróforo para detectar varias moléculastisulares de forma
simultánea siempre que los espec-tros de absorción y emisión de
estos fluoróforos no sesolapen, puesto que entonces seŕıa
imposible discrim-inarlos.
Figura 5. Imágenes de fluorescencia. A la izquierda,
in-munocitoqúımica para el neuropétido Y en cerebro de
rata,utilizando el fluoróforo Texas-Red. A la derecha,
motoneu-ronas en el encéfalo de lamprea marcadas con el
trazadorneuronal fluorescéına que es en śı mismo un
fluoróforo.Cada uno de los fluoróforos se ha estimulado con
frecuen-cias diferentes y lo que se observa es la emisión en el
es-pectro de la luz visible de cada uno de ellos, rojo y
verde,respectivamente.
Una aplicación más avanzada de la fluorescencia seda en los
microscopios confocales, los cuales permiteneliminar la luz difusa
procedente de fluoróforos queestán en el tejido fuera del plano
de enfoque. Estaluz difusa, que aparece en los microscopios de
fluo-rescencia convencionales, provoca una difuminación ypérdida
de nitidez de la imagen. Por tanto, con el mi-croscopio confocal se
consiguen imágenes mucho másńıtidas y mediante la
digitalización y solapamiento deplanos de foco sucesivos se pueden
conseguir imágenestridimensionales.
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5 Microscopio electrónico
Cuando se quieren observar estructuras celulares queestán por
debajo del ĺımite de resolución del micro-scopio óptico, como
algunos orgánulos, membranas,estructuras citosólicas, complejos
moleculares de lamatriz extracelular o virus, se recurre al
microsco-pio electrónico. Se inventó en la primera mitad delsiglo
XX y su aplicación a la histoloǵıa desveló las es-tructuras
celulares más pequeñas denominadas en suconjunto ultraestructura
celular. Por tanto, observarultraestructuralmente a la célula
significa observarlacon el microscopio electrónico. Este tipo de
microsco-pio tiene un ĺımite de resolución más pequeño que
1nanómetro gracias a que no usa la radiación electro-magnética
de la luz visible sino la alta frecuencia deun haz de electrones
que incide sobre la muestra, ypermite aumentos de varios millones
de veces.
El microscopio electrónico no usa lentes sino imanesque
concentran los haces de electrones emitidos por unfilamento.
Normalmente son aparatos grandes puestoque el viaje de los
electrones tiene que ocurrir en vaćıo.Por eso, son grandes tubos
dentro de los cuales se creay manipula el haz de electrones.
En histoloǵıa se usan dos tipos de microscopioselectrónicos:
de transmisión y de barrido.
Microscopio electrónico de transmisión
En este tipo de microscopio electrónico se produceel haz de
electrones en un filamento de tungstenoque funciona como cátodo.
Los electrones se conden-san mediante electroimanes y se focalizan
sobre unasección de tejido. Las secciones de tejido deben sermuy
finas, se denominan ultrafinas (de unas decenasde nanómetros),
para permitir que sean atravesadaspor los electrones y para
conseguir imágenes ńıtidas.Previamente las secciones deben ser
tratadas con met-ales pesados como el osmio, el plomo y el uranilo.
Lafunción de estos metales es similar a las tinciones us-adas en
el microscopio óptico, dar color a las estruc-turas celulares,
pero sólo en tonalidades de grises. Es-tos metales se concentran
fundamentalmente en mem-branas y en los complejos macromoleculares.
Los elec-trones que chocan con estos metales rebotarán y
nocruzarán el tejido. Aquellos que consigan atravesar el
tejido chocarán contra una pantalla fluorescente queemitirá un
destello luminoso tras cada choque. Esaimagen emitida por la
pantalla fluorescente es la quepodemos observar nosotros. Por ello
las imágenes ob-servadas con el microscopio electrónico son
siempreen blanco y negro, aunque posteriormente se puedencolorear
con un ordenador.
Figura 6. Comparativa de la composición básica de
unmicroscopio óptico (izquierda), electrónico de
transmisión(centro) y electrónico de barrido (derecha).
Figura 7. Imágenes tomadas en con microscopioelectrónico de
transmisión. Se puede ver la capacidad deestos microscopios
observando el incremento de resoluciónde las imágenes de
izquierda a derecha. Las ĺıneas negrasde la imagen de la derecha
corresponden a las membranascelulares
Microscopio electrónico de barrido
Los microscopios electrónicos de barrido sirven paraobservar
superficies tisulares. Ello es posible porquelos electrones no
atraviesan la muestra sino que inter-accionan con su superficie y
rebotan. Para que estoocurra hay que cubrir a la muestra con una
máscarade metales que se adapta perfectamente al relieve dela
muestra. La muestra se barre con el haz de elec-trones y los
electrones reflejados por un punto de lasuperficie son captados por
una pantalla receptora quecreará una imagen en una pantalla
digital. La ima-
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Técnicas histológicas. Observación. 9
gen completa se formará cuando el haz recorra todala superficie
de la muestra y se consiga información decada uno de los puntos.
Es decir, se escanea la mues-tra, y de ah́ı el nombre de
microscopio de barrido, oen inglés ”scannig”.
Por supuesto, las muestras que se observan no sonsecciones, sino
porciones de órganos con superficies deinterés. Se pueden
observar superficies de seccioneshechas con un vibratomo o con un
microtomo de con-gelación, pero no aquellas que han sido incluidas
enresina o parafina.
Figura 8. Imágenes obtenidas con un microscopioelectrónico de
barrido. Muestran el interior del canal cen-tral de una médula
espinal de lamprea. Se pueden observarnumerosos cilios (con más
detalle en B) y pequeñas mi-crovellosidades en los dominios
apicales de las células queforman las paredes de dicho canal. (Ver
imagen de barridode estomas de una hoja).
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IntroducciónEl proceso histológicoObservaciónMicroscopio
ópticoMicroscopio electrónico