Técnicas de Histoquímica e Inmunohistoquímica en … · Técnicas de Histoquímica e Inmunohistoquímica en Patología Neuromuscular: utilidad diagnóstica Soraya Barrera Cabañeros

Técnicas de Histoquímica e Inmunohistoquímica

en Patología Neuromuscular: utilidad

diagnóstica

Soraya Barrera Cabañeros ( TEAP)

Servicio de Anatomía Patológica y Neuropatología. Hospital Meixoeiro

Complexo Hospitalario Universitario de Vigo – CHUVI

Instituto de Investigación Biomédica de Vigo

¿QUÉ SON LAS ENFERMEDADES

NEUROMUSCULARES?

• Son enfermedades crónicas de evolución variable

• La mayoría son de origen genético y algunas adquiridas

• Se caracterizan por debilidad muscular, miotonía,

calambres…

• Afectan al SNC, SNP, unión n-m y fibra muscular

• Pueden afectar a otros órganos

• Su aparición puede ser en cualquier etapa de la vida

SARCÓMERO: Unidad contráctil del músculo

Enfermedades Neuromusculares

Historia clínica

Datos paraclínicos Biopsia muscular

Laboratorio Miopatología

Disección - Orientación

Congelación M/E

Inmunogold

Banco de Tejidos

Histoquímica

Inmunohistoquímica

Microscopía Confocal

Extracción de DNA

PCR multiplex

RFLP

Secuenciación

Otras

Banco de DNA Cortes criostato

DIAGNÓSTICO Consejo genético

Wb

Bioquímica

+

250-300 biopsias de músculo y nervio/año

(85% de la Comunidad Gallega)

Microscopía electrónica

Morfología

Histoquímica Inmunohistoquímica

Estudio de proteínas

Estudio bioquímico Estudio genético

TAMAÑO Y FORMA

Fibras atróficas, anguladas o no

Fibras hipertróficas

Fibras hipercontraídas

Fibras redondeadas

Figuras de “splitting”

NÚCLEOS

Múltiples

Internalizados

Agregados (“clumps”nucleares)

ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS I

CITOPLASMA

Degeneración – necrosis

Miofagia

Vacuolización: lípidos, glucógeno, vacuolas autofágicas

Invasión parcial

ESPACIO EXTRACELULAR

Infiltrados inflamatorios

Fibrosis

Sustitución adiposa

ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS II

Patrón intermiofibrilar

Mitocondrias (RRF)

Bastones nemalínicos

Cuerpos citoplásmicos

Retículo sarcoplásmico

Vacuolas autofágicas

TRICRÓMICO DE GOMORI

(Modificado por Engel y Cunningham, 1963)

Fibras(“ragged red fibers”) Bastones nemalínicos

Vacuolas ribeteadas

1- Valorar el exceso de un sustrato determinado: glucógeno, lípidos

2- Mostrar cambios estructurales no visibles con técnicas histológicas

3- Evaluar los tipos de fibras musculares:

1, 2A, 2B, 2C

4- Ausencia de un enzima determinado

TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS

OIl RED

Gotas lipidicas, lipofucsina

PAS Tipos de fibras

Glucógeno (lisosomal, libre)

ENZIMAS OXIDATIVAS

• NADH (Nicotinamida adenina

dinucleótido)

– Patrón intermiofibrilar:

• Retículo sarcoplásmico

• Mitocondrias

• SDH (Succino-Deshidrogenasa)

– Mitocondrias

• COX-SDH (Citocromo oxidasa )

– Mitocondrias

HISTOQUÍMICA. PRINCIPIOS BÁSICOS IV

Central core Fibras apolilladas

Targets Fibras anulares

NADH

HE Gomori

SDH COX-SDH

Miopatía mitocondrial

HE

SDH NADH

TRI

Miopatía por agregados tubulares

ATP-asas

9.4 4.6

4.3

Fibras

tipo 1

Fibras

tipo 2a

Fibras

tipo 2b

Fibras

tipo 2c

ATPasa

9.4

Marrón

claro

Marrón

oscuro

Marrón

oscuro

Marrón

oscuro

ATPasa

4.63

Marrón

oscuro

Blancas Marrón

claro

Marrón

claro

ATPasa

4.35

Marrón

oscuro

Blancas Blancas Marrón

claro

4.3

Atrofia por denervación

Atrofia neurógena

HE PAS

Miofosforilasa Miofosforilasa

Mioadenilato Desaminasa

CONTROL (MAD+) MAD NEGATIVO

Miopatía por déficit de MAD

• Permite visualizar y localizar proteínas específicas

déficit primario

déficit secundario

• Debe valorarse conjuntamente con las técnicas

histológicas e histoquímicas

INMUNOHISTOQUÍMICA

Guillaume- Benjamin Amand Duchenne

(1806-1875)

1868: Paralysie pseudo-hypertrophique, or myosclerotique, de l’Enfance

(Archives Générales de Médecine)

• Espectrina

• Distrofina (Dys 1, 2 y 3)

• DRP1

• DRP2

• Alfa-SG

• Beta-SG

• Gamma-SG

• Delta-SG

• Alfa-DG

• Beta-DG

• Disferlina

• Calpaína 3

• Merosina

• Alfa2-laminina

• Emerina

• LAMP2

• Caveolina

• Miotilina

• Miosina (slow, fast)

• Troponina PGP 9.5

• Colágeno VI

• Notch 3

• Serie linfoide, desmina,

marcadores vasculares,

actina, etc

ANTICUERPOS

Distrofina

Utrofina (DRP2, Control) Utrofina

Duchenne

Espectrina

Becker

Dystrophin DRP

CMD

Spectrin Merosin

Emery Dreyfuss

Emerin, Control Emerin

Emerina, Control EDMD

Emerina, Control EDMD

Emery Dreyfuss

-DISTROGLICANO

Control

Antibody: clon VIA4 (glycosylated epytope)

• Interacción de varias proteínas (distrofina-sarcoglicanos;

disferlina-otras)

• Pueden obtenerse falsos resultados si se usa un único

anticuerpo

• La ausencia de una proteína puede dar lugar a la

sobreexpresión de otras (distrofina y dystrophin-related

protein)

• Las proteínas nucleares se expresan en cualquier tipo

de célula (emerina, lamina A/C)

INMUNOHISTOQUÍMICA DIFICULTADES DE INTERPRETACIÓN Y SOLUCIONES

• LA MUESTRA DEBE SERVIR PARA TODOS LOS ESTUDIOS

• CUALQUIER MUESTRA DEBE PODER RETOMARSE EN EL

FUTURO (Bancos de tejidos y ADN)

PRINCIPIOS PARA EL MANEJO DE LAS MUESTRAS