Técnicas de biología molecular utilizadas en el ... · Tipos de polimorfismos: de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Se deben a cambios en la secuencia del ADN que

Explicación de TP Nº 1-2017

Técnicas de biología molecular

utilizadas en el diagnóstico de

enfermedades hereditarias

Química Biológica Patológica

Conceptos básicos en genética:

Gen

Alelo

Haplotipo

Locus (loci)

Mutación

Genotipo

Fenotipo

Natural, común o salvaje.

Alelos variantes o mutantes.

Desórdenes genéticos

Cromosómicos.

Monogénicos o mendelianos.

Multifactoriales.

Conceptos básicos en genética:

Desórdenes monogénicos:

Homocigotas

Heterocigotas

Heterocigotas compuestos

Formas de herencia de los trastornos monogénicos:

Autosómica. Ligada al cromosoma X.

El gen afectado selocaliza en un autosoma.En general, estostrastornos afectan porigual a hombres ymujeres.

El gen afectado se localiza enel cromosoma X.La incidencia en hombres ymujeres es diferente,dependiendo de si es deherencia recesiva odominante.

Un trastorno monogénico es aquel que está determinado principalmente por los alelos localizados en un único locus.

Variación genética:

mutación y

polimorfismo.

Mutaciones:

“Cualquier cambio en la secuencia de un nucleótido o en la organización del DNA”

Genómicas

Cromosómicas

Génicas

Mutaciones

“No todas las mutaciones tienen consecuencias

clínicas”

Tipos de mutaciones génicas:

Deleciones e

inserciones

Pequeñas (pueden producircorrimiento del marco delectura).

Grandes (afectan la estructuragénica).

Deleciones e inserciones grandes:

Tipos de mutaciones génicas:

Deleciones e inserciones pequeñas:

Sustituciones de nucleótidos

(puntuales)

Mutaciones de cambio de sentido

Mutaciones sin sentido

Tipos de mutaciones génicas:

Mutaciones del procesamiento de ARN

Mutaciones de cambio de sentido (missense) y sin sentido(nonsense):

Polimorfismos:

Son aquellas variantes alélicas tan comunes que se encuentran en una frecuencia mayor al 1% en la

población general.

Aplicaciones: ForensesFiliaciónMedicina

Tipos de polimorfismos:

SNPs, Inserción-Deleción (STR, VNTR), RFLP

Tipos de polimorfismos: de longitud de los

fragmentos de restricción (RFLP).

Se deben a cambios en la secuencia del DNA que modifican los patrones de corte de las endonucleasas

de restricción.

Han sido muy utilizados como

marcadores genéticos, es decir para determinar la presencia/ausencia

de una enfermedad/alelo

mutado en individuos .

Métodos de análisis de

los ácidos nucleicos.

Conceptos básicos en biología molecular:

Endonucleasas de

restricción

Electroforesis

Sonda

Hibridación

Endonucleasas de restricción:

Son enzimas que cortan la molécula de DNA doble cadena(dsDNA) en lugares definidos por la secuencia de nucleótidos,produciendo fragmentos de DNA definidos.

Endonucleasas de restricción:

Cuando se somete un fragmento de DNA a restricción con unaendonucleasa, esta genera fragmentos definidos, quedependen del patrón de corte de la enzima.

Separación de ácidos nucleicos mediante

electroforesis en gel:

Geles de poliacrilamida

� Alta resolución.� Separan fragmentos de DNA

<500pb.

Geles de agarosa

� Baja resolución.� Separan fragmentos de DNA

de entre 300 a 10000pb.

Separación de ácidos nucleicos mediante

electroforesis en gel:

Separación de ácidos nucleicos mediante

electroforesis en gel:

Sondas de ácidos nucleicos:

Molécula de DNA o RNA marcada, usada para identificar secuencias complementarias mediante

hibridación.

Marcación de sondas

Interna

Externa

Radiactiva

No radiactiva

Formas de marcación

de sondas de ácidos

nucleicos: Radiactiva

y no radiactiva

Hibridación de ácidos nucleicos:

Las hebrascomplementarias deácidos nucleicospueden separarse(desnaturalización) ydadas las condicionesadecuadas pueden reasociarse(hibridación).

Hibridación de ácidos nucleicos:

Factores que afectan la velocidad y especificidad de hibridación:

� Longitud del acido nucleico.� Composición de base.

� Fuerza iónica.� Viscosidad.� Temperatura

� Presencia de agentes desnaturalizantes.� pH

Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:

Las reacciones de hibridación con sondas de DNA son tansensibles y selectivas que pueden usarse para detectarsecuencias complementarias cuya concentración sea inclusode 1 sola molécula por célula.

Hibridación:

Rigurosa (bajo condiciones astringentes).

Poco rigurosa (bajo condiciones no astringentes).

Longitud de una sonda:

Desde 5 hasta miles de nucleótidos

Hibridación con

sondas de ácidos

nucleicos:

Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:

Métodos de análisis de ácidos nucleicos

que utilizan sondas.

Transferencia Southern

Transferencia Northern

PCR-ASO (Dot/Slot-Blot)

Análisis de DNA.

Análisis de RNA.

Revelado mediante sondas ASO.

GRANDES DELECIONES

• Southern blot

• PCR Multiplex• GAP-PCR• MLPA

MUTACIONES PUNTUALES Y DELECIONES PEQUEÑAS

• PCR-RFLP (PCR-ER)

• Mutagénesis mediada por PCR

Alelo-Específicas:• PCR-MAS• PCR-ARMS/MARMS• PCR-ASO

Plataformas:

• PCR-OLA

MUTACION O POLIMORFISMO DESCONOCIDO

(Métodos de barrido)

• PCR-SSCP y secuenciación• PCR-DGGE y secuenciación

Técnicas de biología molecular según la

mutación a detectar

Grandes deleciones:

Transferencia Southern

Se utiliza para analizar fragmentos de DNA

generados por digestión con enzimas de

restricción.

1. Extracción de ADN

2. Digestión con la Enzima de

Restricción apropiada

3. Separación de los

fragmentos por

electroforesis,

desnaturalización del ADN y

transferencia a membrana

(Southern Blotting)

4. Hibridación con la sonda

especifica y revelado.

5. Análisis de los resultados

Transferencia Southern:

Transferencia Southern:

Principales usos:

� Detección de secuenciasrelacionadas ( ej. familias de genes).

� Detección de deleciones einserciones grandes causantes deenfermedades (ej. Distrofiamuscular de Duchenne).

� Identificación de individuosmediante VNTR.

� Detección de RFLP.

Se utilizan sondas de gran tamaño, con grados de actividad variable, dependiendo del uso.

Tipos de polimorfismos: de longitud de los

fragmentos de restricción (RFLP).

Se deben a cambios en la secuencia del ADN que modifican los patrones de corte de las endonucleasas

de restricción.

Han sido muy utilizados como marcadores genéticos, es decir para determinar la presencia/ausencia de una

enfermedad/alelo mutado en individuos .

RFLP: detección mediante Southern Blotting

Utiliza una sonda que hibrida en una región conocida, pero no tienerelación con la mutación que produce el trastorno.De gran utilidad cuando no se conoce la mutación que produce eltrastorno.Permite el seguimiento de alelos mutados dentro de una misma familia.Para su utilización, el polimorfismo y el gen a estudiar deben estarligados (separados por una distancia no mayor a 106 pb).

RFLP

Mutaciones puntuales:

PCR-RFLP (PCR-ER)

• Más simple yeconómico que el RFLPtradicional.• Se requiere mayorinformación de la zonadonde ocurre lamutación.• Generalmente es lamutación que genera eltrastorno la que da lugaral polimorfismo.

RFLP

RFLP: PCR-RFLP

1. Extracción de ADN

2. Amplificación por PCR

3. Digestión con la Enzima de

Restricción apropiada

4. Separación de los fragmentos

por electroforesis y

visualización de los resultados

(Tinción con Gel Red)

Mutaciones puntuales:

PCR-ASO: Dot Blot

Se utiliza para detección de mutaciones puntuales,principalmente aquellas que no modifican el patrón derestricción de una secuencia de nucleótidos.

Revelado: Sondas ASO

Condiciones de hibridación de elevada astringencia.

Consiste en el análisis de mutacionespuntuales utilizando la hibridación desondas ASO. Se basa en el principio de quela presencia de UN SOLO ERROR DEAPAREAMIENTO entre un nucleótido de lasonda y el ADN blanco es suficiente paradesestabilizar el híbrido.

Se trata de una de las primeras técnicasutilizadas para el análisis de mutacionespuntuales CONOCIDAS sobre fragmentosamplificados de ADN.

PCR-ASO

1. Amplificación por PCR del fragmento de interés.

PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)

2. Dot Blot: desnaturalización y transferencia de los productos

amplificados a una membrana.El producto de PCR se

desnaturaliza (NaOH

2N y 95 °C). Se añade

a los pocillos donde

el vacío impulsa el

pasaje de la solución

a través de la

membrana (nylon o

nitrocelulosa).

La membrana se seca

entre filtros durante

una hora a 80° C en

estufa (o por cross –

linker).

PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)

3. Hibridación de las sondas ASO marcadas, específicas y

complementarias para la secuencia de interés.

Pre-hibridación: solución de SDS y ADN de

esperma de salmón desnaturalizado.

Bloquea la membrana para evitar

reacciones inespecíficas (2h a 37°C).

Hibridación: sonda normal y mutada (8h

a 37°C).

PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)

4. Revelado: dependiente de la marcación utilizada.

Interpretación e informe:

Individuo 1: +/- : Heterocigota para la mutación.

Individuo 2:-/- : No presenta la mutación.

Individuo 3:+/+: Homocigota para la mutación.

Individuo 4:+/- : Heterocigota para la mutación.

Individuo 5:-/- : No presenta la mutación.

Individuo 6:+/+: Homocigota para la mutación.

Individuo 7:-/- : No presenta la mutación.

Individuo 8:+/+: Homocigota para la mutación.

5. Interpretación e informe.

PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)

PCR-OLA (PCR-Ensayo de Ligamiento de

Sondas)

1. Amplificación por PCR del fragmento de interés.

2. Desnaturalización del producto de PCR doble cadena.

3.Hibridación de las sondas marcadas (sondas alelo específicas

marcadas con biotina y sonda común marcada con fluoresceína)

4.Ligamiento

PCR-OLA (PCR-Ensayo de Ligamiento de

Sondas)

5.Captura y revelado

PCR-OLA (PCR-Ensayo de Ligamiento de

Sondas)

Estreptavidina

tapizando los wells

Sonda capturada

Ac acoplado a la

enzima+ sustrato

WT M

GRANDES DELECIONES

• Southern blot

• PCR Multiplex• GAP-PCR• MLPA

MUTACIONES PUNTUALES Y DELECIONES PEQUEÑAS

• PCR-RFLP (PCR-ER)

• Mutagénesis mediada por PCR

Alelo-Específicas:• PCR-MAS• PCR-ARMS/MARMS• PCR-ASO

Plataformas:

• PCR-OLA

MUTACION O POLIMORFISMO DESCONOCIDO

(Métodos de barrido)

• PCR-SSCP y secuenciación• PCR-DGGE y secuenciación

Técnicas de biología molecular según la

mutación a detectar