TECHNISCHE UNIVERSITÄT DRESDEN ILB Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Lehrstuhl Lebensmitteltechnik Verbundprojekt: Aktive Verpackung mit antimikrobiellen Eigenschaften - Teilprojekt 3: Toxikologische Bewertung von aktiven Verpackungen mit antimikrobiellen Eigenschaften Abschlussbericht: Forschungsvorhaben: 0330313 Bearbeitungszeitraum: 01.01.2003 bis 30.04.2004 für: Forschungszentrum Jülich GmbH, Berlin bearbeitet von: Autor: Dipl.-Lebensmittelchem. Tommy Opitz Durchführende Institution: Technische Universität Dresden Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Projektleiter: Prof. Dr. rer. nat. habil. Th. Bley
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TECHNISCHE UNIVERSITÄT DRESDEN - cleaner … · die durch Wasserdampfdestillation oder Extraktion von Pflanzen oder Pflanzenteilen bzw. ... den Nelken, deren Stielen sowie Blättern
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TECHNISCHE UNIVERSITÄTDRESDEN
ILB
Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Lehrstuhl Lebensmitteltechnik
Verbundprojekt: Aktive Verpackung mit antimikrobiellen Eigenschaften - Teilprojekt 3:
Toxikologische Bewertung von aktiven Verpackungen mit antimikrobiellen
Eigenschaften
Abschlussbericht: Forschungsvorhaben: 0330313
Bearbeitungszeitraum: 01.01.2003 bis 30.04.2004
für: Forschungszentrum Jülich GmbH, Berlin bearbeitet von:
Autor: Dipl.-Lebensmittelchem. Tommy Opitz
Durchführende Institution: Technische Universität Dresden Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik
Projektleiter: Prof. Dr. rer. nat. habil. Th. Bley
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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt
Inhaltsverzeichnis
1. Aufgabenstellung und Zielsetzung ………………………………….………3
2. Methodische Umsetzung ...………………………………………….………6
3. Ergebnisse ………………………………………………………….……...20
4. Zusammenfassung und Ausblick …………………………………...……..30
Eugenol konnte in einer Dreifachbestimmung durch Massenspektrometrie eindeutig als
Hauptkomponente des Nelkenblätteröls identifiziert und mit 73,5 + 3,2 % bestimmt werden
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(siehe Tab. 3). Die beiden wichtigen Nebenbestandteile Aceteugenol und ß-Caryophyllen
wurden mit Gehalten von 12,0 + 1,9 % und 10,6 + 1,8 % gefunden.
Abb.7 GC-MS Chromatogramm der Probe W 19 (20 % Nelkenextrakt in Druckfarbe)
Reinheitsuntersuchungen des verwendeten Nelkenblätteröls ergaben einen Anteil von 85,43 +
1,77 % Eugenol beim Nelkenblätterextrakt betrug dieser Anteil 83,71 + 1,91 %. Über den
Anteil dieser Hauptkomponente ist die Rückrechnung auf die Gesamtmenge an ätherischem
Öl / Extrakt im Produkt möglich.
3.3. Beurteilung der Lagerstabilität
Die Beurteilung der Lagerstabilität der mit Nelkenblätteröl bzw. Nelkenblätterextrakt
versetzten Proben erfolgte anhand des Eugenolgehaltes. Der Eugenolgehalt wurde mittels
GC-MS Analytik mit vorangegangener SDE als Summenparameter aus Eugenol und
Aceteugenol bestimmt.
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Tab. 5 Beurteilung der Lagerstabilität über die Abnahme des Eugenolgehaltes
Probe
Herstellung
/ Eingang
Anteil in %
an aufgetragenem Nelken-
Eugenolgehalt (mg/m²)
Wieder-findung
(%)
Eugenolgehalt (mg/m²)
Wieder-findung
(%)
-extrakt
-blätteröl
März / April 04
Juni / Juli 04
G 16 17.09.03 10 0,204 51,0 0,183 45,8
G 17 04.12.03 20 0,539 67,4 0,506 63,3
G 18 04.12.03 20 0,548 68,5 0,512 64,0
G 19 04.12.03 100 3,412 85,3 3,291 82,3
G 20 04.12.03 100 3,288 82,2 3,197 79,9
G 21 04.12.03 10 0,291 72,8 0,272 68,0
G 22 04.12.03 10 0,287 71,8 0,256 64,0
K 17 06.12.03 10 0,033 8,3 nicht
K 20 06.12.03 5 0,016 8,0 bestimmt
K 23 06.12.03 10 0,037 9,3 0,044 11,0
W 17 11.12.03 10 0,189 47,3 0,166 41,5
W 18 11.12.03 20 0,492 61,5 0,459 57,4
W 19 11.12.03 20 0,422 52,8 0,383 47,9
W 20 11.12.03 20 0,445 55,6 0,391 48,9
W 21 11.12.03 20 0,460 57,5 0,418 52,3
W 22 11.12.03 20 0,474 59,3 0,423 52,9
Die Berechnung der Wiederfindung erfolgt mit der Annahme einer gleichmäßigen Verteilung
auf der Oberfläche des Papiers bzw. im Leim des Bodens und der Seitennaht. Es wurde von
einer durchschnittlichen Auftragsmenge von 4 g/m² ausgegangen, da eine exakte Bestimmung
des Auftrages während der Herstellung der Proben bei den Industriepartnern nicht möglich
war. Diese Auftragsmenge entspricht in etwa dem Anteil an Druckfarbe für einen
vollflächigen Druck.
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G 16G 17
G 18G 19
G 20G 21
G 22K 17
K 20K 23
W 17
W 18
W 19
W 20
W 21
W 22
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Euge
nolg
ehal
t [m
g/m
²]
Probe
Juni / Juli März / April
Abb. 8 Abnahme des Eugenolgehaltes während der Lagerung über 6 Monate
Die geringe Abnahme des Wirkstoffgehaltes (von 2,3 % bei Probe G 20 bis 7,8 % bei Probe
G 22) im Vergleich zu den im März gemessenen Werten lässt sich z.T. durch die idealen
Lagerbedingungen, im Kühlschrank bei 8°C in jeweils einzeln verschweißten
Umverpackungen, erklären. Weiterhin findet in der Zeit direkt nach der Herstellung der
größte Übergang von leicht flüchtigen Öl- und Extraktbestandteilen in die
Umgebungsatmosphäre statt und wurde hier nicht berücksichtigt.
Für die untersuchten Proben der Fa. Elbtal Druckerei Dresden (K 17, K 20 und K 23)sind mit
der verwendeten Methode zur Eugenolbestimmung keine verlässlichen Angaben zur
Wiederfindung möglich. Die Komponenten des ätherischen Öls lassen sich aufgrund des
Einbringens in eine Lackschicht nicht mittels SDE (Wasserdampfdestillation) in das
Lösungsmittel n-Pentan überführen. Eine direkte Extraktion mit n-Pentan führt jedoch durch
eine Reihe von aus dem Papier und Lack gelösten Stoffen (Weichmacher,
Konservierungsmittel, Füllstoffe usw.) zu zahlreichen Störpeaks und Überlagerungen im GC-
MS Spektrum.
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3.4. Migrationsexperimente
In Auswertung der durchgeführten Lagerversuche mit dem trockenen Modell-Lebensmittel
Mehl konnten bei keinem Temperatur-Zeit-Regime Eugenolgehalte nachgewiesen werden.
Beispielhaft ist in Abbildung 9 das GC-MS-Chromatogramm einer bei 40°C gelagerten
Mehlprobe dargestellt (Stresslagerung: 200g Weizenmehl (Type 505) bei 40°C über einen
Zeitraum von 7 Tagen).
Abb. 9 Lagerversuch Weizenmehl (7 Tage bei 40°C)
Wie im Chromatogramm ersichtlich fehlt der typische Eugenol-Peak bei einer Retentionszeit
von 22.58 min. Die auftretenden Siloxan-Peaks bei 13,83 min; 21,22 min und 27,97 min
werden durch Auswaschungen des GC-Säulenmaterials (sog. Ausbluten der Säule)
verursacht. Die Siloxane sind sehr leicht durch ihre hohen Molmassen mz > 450 zu
identifizieren und sind nur in geringen Konzentrationen enthalten. Nach dem Austausch der
Chromatographie-Säule traten Siloxan-Peaks nur noch sehr vereinzelt auf (siehe auch Abb. 7)
Siloxane
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Tab. 6 Auswertung der Stresslagerung von Weizenmehl bei 40°C
Bezeichnung Herstellung Nelken- Nelken- Anteil Ort Einwaage
Weizenmehl Eugenol-
gehalt extrakt blätteröl in % [ g ] [ µg/ml ]
Neg-Kontrolle 19.04.04 0 10,009 n.n
W 16 11.12.03 x 10 Druckfarbe 10,092 n.n W 18 11.12.03 x 20 Druckfarbe 10,032 n.n W 19 11.12.03 x 20 Druckfarbe 10,052 n.n W 21 11.12.03 x 20 Druckfarbe 10,044 n.n
Trotz des fehlenden quantitativen Nachweises der Nelkenkomponente entwickelten speziell
die im Wärmeschrank bei 40°C gelagerten Proben beim Öffnen einen sehr dominanten und
charakteristischen Nelkengeruch. Daraus lässt sich ein Vorhandensein von Eugenol im
Gasraum um die Verpackung sowie über dem Packgut ableiten.
3.5. Toxikologische Untersuchungen
Wachstumskurven
Die Wachstumshemmtests mit den im Zwischenbericht 1 dargestellten AQUALYTIC ® -
Digitalmanometer verliefen unspezifisch. Das heißt, dass es bei Pseudomonas putida im
wässrigen Medium bei Zugabe von unbehandeltem Verpackungsmaterial einerseits zu
Wachstumshemmung kam, andererseits zu vermehrter Sauerstoffzehrung durch das einer
weiteren Kohlenstoffquelle in Form von Papier (Fremdbesiedelung). Eine verlässliche
Aussage über die Hemmwirkung der in verschiedenen Konzentrationen aufgetragenen
antimikrobiellen Agenzien ist daher nicht möglich.
Leuchtbakterientest
Die Bestimmung der Biotoxizität mittels Leuchtbakterientest (DIN EN ISO 11348) gehört
neben den ebenfalls normierten Fisch-, Daphnien- und Algentest zu den führenden Tests in
der Toxizitätsanalytik. Als Organismen werden marine Leuchtbakterien der Spezies Vibrio
fischeri NRRL B-11177 eingesetzt. Es handelt sich um ein halophiles, fakultativ anaerobes,
gramnegatives Stäbchen mit polarer Begeißelung, dessen Biolumineszenz Bestandteil des
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Stoffwechsels ist. Jede Art von Toxizität beeinträchtigt diese Stoffwechselprozesse und kann
entsprechend erfasst werden.
Im durchgeführten Test wurde die Hemmung der Biolumineszenz ermittelt, indem definierte
Volumina des Heißwasserextraktes der Proben mit einer Leuchtbakteriensuspension in einer
Küvette vereinigt werden. Das eigentliche Testkriterium ist die nach einer Kontaktzeit von 30
min gemessene Abnahme gegenüber einem Kontrollansatz. Die Lumineszenzmessungen
wurden an einem Fluoreszens-Spectrometer F 4500 der Firma HITACHI durchgeführt.
Die Toxizität einer Substanz wird üblicherweise in Prozent der Leuchtkraft-Hemmung bei der
jeweiligen Verdünnungsstufe bzw. als EC50-Wert angegeben. Als Effektkonzentration EC
wird die Konzentration des Analyten bezeichnet, bei der ein bestimmter Prozentsatz
untersuchter Organismen betroffen ist (EC20 - 20%; EC50 - 50%).
Tab. 7 Auswertung Leuchtbakterientest
Probe
G 14 10%
Nelkenblätteröl im Bodenleim
G 17 20%
Nelkenblätter-extrakt in der Druckfarbe
W 18 20%
Nelkenblätteröl in der
Druckfarbe
W 20 20%
Nelkenblätter-extrakt im Bodenleim
K 35 10%
Nelkenblätteröl im Lack
Verdünnungs-
stufe D
Hemmung nach 30 min
30H [%]
2 69,78 79,07 84,77 77,68 54,97
3 54,19 63,87 75,85 58,08 21,08
4 20,28 32,34 43,70 41,61 5,49
6 7,37 10,93 13,65 14,73 1,67
8 1,34 3,60 9,06 7,66
12 3,20
EC20 - Wert [%]
24,7 20,9 17,0 18,4 33,3
EC50 - Wert [%]
35,5 31,2 26,6 30,3 46,6
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In Tabelle 7 sind die ermittelten Werte für die Toxizitätsuntersuchungen mit dem
Leuchtbakterium Vibrio fischeri aufgeführt. Die kursiv dargestellten Werte der Verdünnung
(D) werden als niedrigste unwirksame Verdünnung (LID) bezeichnet sind solche, bei denen
H30 < 20 % ist. Die Daten für Hemmung 30H sind Mittelwerte aus jeweils 3 Messungen.
Die EC50 - Werte schwanken in einem Bereich von 26,6 (Probe W 18)bis 46,6 (Probe K 35)
wobei die Zahlenwerte als Reziproke ihrer Toxizität zu verstehen sind, d. h. EC50 > 100% -
nicht toxisch; EC50 < 1% - extrem toxisch.
Wie bereits bei der Aufarbeitung für die GC-MS Versuche ersichtlich, kommt es bei einer
Applikation des Nelkenblätteröles im Lack (Probe K 35) zu einer sehr starken / hydrophoben
Bindung und die Wirkstofffreisetzung erfolgt nur langsam.
Es lassen sich jedoch aufgrund der Aufarbeitung der Proben für den Leuchtbakterientest;
Überführen des Nelkenblätteröls bzw. -extraktes von den Trägermaterialien in den flüssigen
Aggregatzustand durch Heißwasser-Extraktion; keine detaillierten Aussagen über die
alleinige Hemmwirkung der aufgebrachten antimikrobiell wirksamen Komponenten treffen.
Eine Vergleichsprobe aus unbehandeltem Karton GC - 270 g/m² (Grundkörper der Probe W
35) zeigte durch herausgelösten Verbindungen die während der Extraktion eine Hemmung
von 37,2 % bei D = 2. Das, zum weiteren Vergleich eingesetzte, reine Eugenol (>99% der Fa.
Merck Darmstadt) ist mit einem ermittelten EC50-Wert von 1,6 % bereits als stark toxisch zu
bewerten.
Die Hersteller von Druckfarben und Leim geben in den entsprechenden
Sicherheitsdatenblättern lediglich eine verbale Beschreibung der humantoxischen Wirkung an
(GefahrstoffVO / EG-Richtlinie 88/379/EWG). Es kann aber davon ausgegangen werden,
dass diese Trägermaterialien der antimikrobiellen Komponenten an sich schon eine Hemmung
im Leuchtbakterientest bewirken.
Die in Tabelle 7 aufgeführten Werte verstehen sich demnach als eine Durchschnittsangabe der
Toxizität aller wasserlöslichen Verbindungen des Verpackungsmaterials zu beurteilen.
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3.6. Lebensmittelrechtliche Beurteilung
Bedarfsgegenstände sind gemäß Definition in § 5 Abs. 1 Deutschem Lebensmittel- und
Bedarfsgegenständegesetz (LMBG):
(1) Gegenstände, die dazu bestimmt sind, bei dem Herstellen, Behandeln,
Inverkehrbringen oder dem Verzehr von Lebensmitteln verwendet werden und dabei
mit den Lebensmitteln in Berührung kommen oder auf diese einwirken;
(2) Packungen, Behältnisse oder sonstige Umhüllungen, die dazu bestimmt sind, mit
kosmetischen Mitteln oder Tabakerzeugnissen in Berührung zu kommen….
In dieser Erweiterung müssen sich die hergestellten antimikrobiellen Verpackungsmaterialien
dem LMBG unterwerfen.
Der Fünfte Abschnitt: Verkehr mit sonstigen Bedarfsgegenständen des LMBG regelt in § 30
Verbote zum Schutz der Gesundheit:
Es ist verboten,
(1) Bedarfsgegenstände derart herzustellen oder zu behandeln, dass sie bei bestimmungs-
gemäßem oder vorauszusehenden Gebrauch geeignet sind, die Gesundheit durch ihre
stoffliche Zusammensetzung, insbesondere durch toxikologisch wirksame Stoffe oder
durch Verunreinigungen, zu schädigen;
(2) Gegenstände oder Mittel, die bei bestimmungsgemäßem oder vorauszusehenden
Gebrauch geeignet sind, die Gesundheit durch ihre stoffliche Zusammensetzung,
insbesondere durch toxikologisch wirksame Stoffe oder durch Verunreinigungen, zu
schädigen, als Bedarfsgegenstände in den Verkehr zu bringen; …..
Speziell die Wirkstoffe des Nelkenblätteröls / -extrakts besitzen ein allergenes Potential
[SCHUMANN, 2001] und sind somit auch geeignet den Gesundheitszustand der Verbraucher
negativ zu beeinflussen.
Der § 31 LMBG regelt den Übergang von Stoffen auf Lebensmittel:
Es ist verboten,
(1) Gegenstände als Bedarfsgegenstände im Sinne des § 5 Abs. 1 Nr. 1 gewerbsmäßig so
zu verwenden oder für solche Verwendungszwecke in den Verkehr zu bringen, dass
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von ihnen Stoffe auf Lebensmittel oder deren Oberfläche übergehen, ausgenommen
gesundheitlich, geruchlich und geschmacklich unbedenkliche Anteile, die technisch
unvermeidbar sind……
Dieser Paragraph lässt wenig Spielraum hinsichtlich einer Beeinflussung von Lebensmitteln
durch Nelkenwirkstoffe, allein schon durch ihren geringen Geruchsschwellenwert. Den
Übergang von Stoffen auf das Lebensmittel die „technisch unvermeidbar“ sind regeln u.a.
auch die EU- Verordnungen RL 76/893/EWG Art. 2 und RL 89/109/EWG Art 2.
In der Bedarfsgegenstände-Verordnung findet man in den Anlagen zu § 8 Übergang von
Stoffen auf Lebensmittel:
Anlage 3 Abschnitt 3 Zugelassene Stoffe, für die besondere