Prolonger votre offre de soins, jour après jour Cliquez pour modifier le style des sous-titres du masque TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE : DE LA FISH AUX PUCES A ADN KARINE CORDIER-COUREL XXème colloque ATC Aix-en-Provence - 2010 Prolonger votre offre de soins, jour après jour
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Cliquez pour modifier le style des sous-titres du masque
TECHNIQUES DE
CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE :
DE LA FISH AUX PUCES A ADN
KARINE CORDIER-COUREL
XXème colloque ATC
Aix-en-Provence - 2010 Prolonger votre offre de soins, jour après jour
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LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE
Cytogénétique conventionnelle
Biologie moléculaire
Cytogénétique moléculaire
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DE LA FISH AUX PUCES A ADN
v FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence)
• Principe
• Différents types de sondes
• Applications
• Avantages et inconvénients
v CGH (Hybridation Génomique Comparative)
• Principe
• Sensibilité
v FISH et CGH : Limites des techniques
v Puces à ADN
• Définitions
• Différents types de puces
• CGH-array
• Puces à SNP
• Intérêts, applications, inconvénients
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FISH : Principe
FISH = Fluorescence In Situ Hybridization
v Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un
génome entier : centromères, régions sub-télomériques, loci
spécifiques et peintures
v Détection de délétions, identification de translocations ou
d’autres réarrangements chromosomiques
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FISH : Principe
CIBLESONDE
ADN double brin (mitoses
ou noyaux interphasiques)
ADN double brin marqué
T A A G G A T A A T T C C T A T
Dénaturation thermique
Hybridation complémentaire
37°C O/N
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FISH : Principe
LavagesElimination des
sondes non spécifiquement fixées
La sonde moléculaire se fixe sur sa cible
Pas de sonde fixée = délétion
Analyse au microscope en épifluorescence (filtres adaptés aux différents fluorochromes)
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FISH : Différents types de sondes
Peintures chromosomiques
M-FISHSondes centromériques
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FISH : Différents types de sondes
Sondes télomériques
Loci spécifiques (Tuple1 / N85A3)
Sondes de BACs
RP11-335E8 2p12
RP11-356H17 2p13.3
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FISH : Sondes de BAC
v Bacterial Artificial Chromosome = ADN circulaire bactérien
dans lequel un fragment d’ADN (du génome humain) a été inséré
v Sonde de BAC = sonde fabriquée à partir d’une
séquence d’ ADN connue insérée dans un vecteur de clonage
bactérien
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FISH : Choix des BACs
v Sélection des BACs selon leur localisation chromosomique (en
fonction du réarrangement à étudier) ou la séquence d’un gène
Ø Puces à oligo (Agilent) : meilleure résolution (oligonucléotides de 60-mer)
v Puces à SNP ne nécessitant pas d’ADN de référence ( Illumina, Affymetrix) : haute résolution (oligonucléotides de 25 à 80-mer) + recherche de régions de perte d’hétérozygotie
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v Extraction de l’ADN => quantification (A260nm)
=> pureté (A260nm / A280nm)
=> intégrité (migration sur gel d’agarose)
v Digestion par des enzymes de restriction / Amplification par PCR
v Marquage et Fragmentation
v Hybridation
v Lavages
v Quantification du signal d’hybridation pour chaque sonde (lecture par
un scanner)
v Numérisation par un logiciel spécifique
PUCES A ADN : Etapes techniques
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CGH-array : Principe
v Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN
(ou ARN/ARN)
v Co-Hybridation compétitive de séquences d’ADN (ou ARN) test et
témoin marqués par fluorescence sur un grand nombre de loci
spécifiques présents sur un support solide (lame de verre)
v Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau de loci
spécifiques et connus sur un génome entier
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ADN test marqué en CYA3
ADN de référence marqué en CYA5
Dénaturation et hybridation sur puce à ADN
Loci spécifiques (BAC / PAC / oligonucléotides de synthèse)
SCANNER
Défaut d’ADN test
Excès d’ADN test
Lame de verre
CGH-array : Principe
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CGH-array : Capture et Analyse des résultats
Ex : BAC-array / Array-300 Abbott®
DAPI IV (sondes) Cy3 (ADN Test) Cy5 (ADN Référence)
ratio T/R calculé
3 spots / clone
• 0.8 < T/R < 1.2 => pas de déséquilibre
• T/R < 0,8 => délétion
• T/R > 1,2 => amplification
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CGH-array: Exemple d’application
v Dysmorphie faciale => caryotype t(5;9) + dup(9)(q?)
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v Confirmation par FISH (peintures des chromosomes 5 et 9)