TECHNIQUES DE CULTURE TECHNIQUES DE CULTURE CELLULAIRE CELLULAIRE
TECHNIQUES DE CULTURE TECHNIQUES DE CULTURE CELLULAIRECELLULAIRE
Année 2006-2007Année 2006-2007 Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS)Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS)
POCHETPOCHET 22
Techniques de culture Techniques de culture cellulairecellulaire
Les cellulesLes cellules Les milieux de cultureLes milieux de culture Les contenantsLes contenants L’environnementL’environnement L’entretienL’entretien
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POCHETPOCHET 33
Les cellulesLes cellules
Cellules normalesCellules normales À nombre de repiquages limitéÀ nombre de repiquages limité
ObtentionObtention À partir d’un prélèvement tissulaire : avec ou sans À partir d’un prélèvement tissulaire : avec ou sans
dissociationdissociation Dissociation des liaisons fortes entre cellulesDissociation des liaisons fortes entre cellules
Mécanique : broyage, vortexage …Mécanique : broyage, vortexage … Enzymatique essentiellementEnzymatique essentiellement
Mise en culture : culture primaireMise en culture : culture primaire Repiquage ou « passage » : culture secondaireRepiquage ou « passage » : culture secondaire
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POCHETPOCHET 44
Les cellulesLes cellules
Cellules transformées (ou éventuellement Cellules transformées (ou éventuellement embryonnaires)embryonnaires) À nombre de passages illimité donnant une lignée continueÀ nombre de passages illimité donnant une lignée continue
les plus utilisées en culture cellulaire et virologie médicale :les plus utilisées en culture cellulaire et virologie médicale :Cellules Vero,Cellules Vero, cellules rénales de singe vert africain ( cellules rénales de singe vert africain (Cercopithecus Cercopithecus aethiopsaethiops)) Aspect de fibroblaste : fusiformeAspect de fibroblaste : fusiforme Adhérant rapidement au support de verre ou plastique grâce Adhérant rapidement au support de verre ou plastique grâce
aux ions Caaux ions Ca2+2+ ou Mg ou Mg2+2+.. Autres cellulesAutres cellules
Cellules tumorales : Cellules tumorales : HeLa (tumeur utérine) ; HeLa (tumeur utérine) ; KB (carcinome oral humain)KB (carcinome oral humain)
Cellules embryonnaires : Cellules embryonnaires : MRC-5 (poumon de foetus humain) ; MRC-5 (poumon de foetus humain) ; 3T3 (embryon de souris) 3T3 (embryon de souris)
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POCHETPOCHET 55
Les cellulesLes cellules
Cellules non transforméesMort programmée = apoptose
Log n cellules
Temps
Culture primaire
Culture secondaire
Cellules transforméesLignée continue
Premier passage Deuxième passage
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POCHETPOCHET 66
Les cellulesLes cellules
Division : environ 25 à 30 heuresDivision : environ 25 à 30 heures Si cellules adhérentesSi cellules adhérentes
Formation d’un tapis (« à confluence ») pour Formation d’un tapis (« à confluence ») pour une densité 10une densité 1055 / cm / cm2 2
Puis détachement et mortPuis détachement et mort Nécessité d’un changement de milieu Nécessité d’un changement de milieu
tous les 2 à 3 jourstous les 2 à 3 jours
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POCHETPOCHET 77
Les milieux de cultureLes milieux de culture Exigences cellulaires minimalesExigences cellulaires minimales
eaueau ions minérauxions minéraux donnant une osmolarité identique à celle du donnant une osmolarité identique à celle du
sérum physiologique sérum physiologique source de carbone et d'énergiesource de carbone et d'énergie (glucose par exemple) (glucose par exemple) source d'azotesource d'azote : acides aminés : acides aminés source d’acides grassource d’acides gras pHpH constant 7,4 (indicateur de pH : rouge de phénol) grâce un constant 7,4 (indicateur de pH : rouge de phénol) grâce un
système tampon COsystème tampon CO22/HCO/HCO33-- ou phosphates. ou phosphates.
Base commune (milieux Hanks, Earl, PBS, Gey) :Base commune (milieux Hanks, Earl, PBS, Gey) : Sels minéraux : NaCl, KCl, CaClSels minéraux : NaCl, KCl, CaCl22, MgCl, MgCl2, 2, NaHNaH22POPO44…… Sucre : glucose Sucre : glucose
Compléments variables selon les milieux (RPMI, MEM, Compléments variables selon les milieux (RPMI, MEM, DMEM…)DMEM…) Acides aminésAcides aminés Vitamines et cofacteursVitamines et cofacteurs Bases azotées, ribose et désoxyriboseBases azotées, ribose et désoxyribose
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POCHETPOCHET 88
Les milieux de cultureLes milieux de culture Compléments à ajouterCompléments à ajouter extemporanément : extemporanément :
Mélanges d’antibiotiquesMélanges d’antibiotiques au taux final de au taux final de 1 %1 % Pénicilline G, Pénicilline G, Streptomycine, Streptomycine, Amphotéricine B (antifongique)… Amphotéricine B (antifongique)…
GlutamineGlutamine à à 1% 1% (acide aminé instable)(acide aminé instable) Sérum de veau fœtalSérum de veau fœtal (S.V.F. ou F.C.S. Fœtal Calf Serum)(S.V.F. ou F.C.S. Fœtal Calf Serum)
entre 1,5 et entre 1,5 et 10 % 10 % prélevé stérilement et décomplémenté prélevé stérilement et décomplémenté apportant apportant
facteurs de croissance cellulairefacteurs de croissance cellulaire EGF (facteur de croissance épidermique), EGF (facteur de croissance épidermique), FGF (facteur de croissance fibroblastique) FGF (facteur de croissance fibroblastique) PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes)PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes)
Facteurs de différenciation comme Facteurs de différenciation comme fibronectine (ancrage fibronectine (ancrage des cellules).des cellules).
InhibiteursInhibiteurs comme l’alpha1 antitrypsine (neutralisation de comme l’alpha1 antitrypsine (neutralisation de l’action enzymatique de la trypsine)l’action enzymatique de la trypsine)
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POCHETPOCHET 99
Les contenantsLes contenants FlaconsFlacons
En polystyrène optiquement clair stérileEn polystyrène optiquement clair stérile Traités ou non pour adhérenceTraités ou non pour adhérence De contenance et surface variable par ex :De contenance et surface variable par ex :
25 cm25 cm2 2 contenance totale 60 mL / vol 5 mLcontenance totale 60 mL / vol 5 mL 75 cm75 cm2 2 contenance totale 250 mL / vol 10 mLcontenance totale 250 mL / vol 10 mL 150 cm150 cm2 2 contenance totale 60 mL / vol 20 mLcontenance totale 60 mL / vol 20 mL
Plaques multipuitsPlaques multipuits En polystyrène optiquement clair En polystyrène optiquement clair
stérilestérile Traités ou non pour adhérenceTraités ou non pour adhérence À fond plat et couvercleÀ fond plat et couvercle Nombre de puits et contenance Nombre de puits et contenance
variablevariable 6, 12, 24, 48, 966, 12, 24, 48, 96
BoitesBoites En polystyrène optiquement clair En polystyrène optiquement clair
stérilestérile Traités ou non pour adhérenceTraités ou non pour adhérence Diamètre allant de 35 à 150 mmDiamètre allant de 35 à 150 mm
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POCHETPOCHET 1010
L’environnement durant l’incubationL’environnement durant l’incubation
Respectant certains paramètres physico-chimiques Respectant certains paramètres physico-chimiques nécessaires à la culture cellulairenécessaires à la culture cellulaire
la température : 37 °C la température : 37 °C l'hygrométrie : 84 à 85 % d’humidité l'hygrométrie : 84 à 85 % d’humidité le pH 7,4 maintenu grâce aux systèmes tamponle pH 7,4 maintenu grâce aux systèmes tampon
du milieudu milieu renforcés par à l’atmosphère enrichie à 5% de COrenforcés par à l’atmosphère enrichie à 5% de CO22 (système (système
tampon avec HCOtampon avec HCO33--) )
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POCHETPOCHET 1111
L’incubateur à COL’incubateur à CO22
5 %37°C
Incubateur fermé avec
Voyants de Pression en CO2 et température
Bonbonne d’anhydride carbonique
Ses manomètres de pression
Son système d’injection
Double porte avec verrouillage
Bac d’eau stérilisée pour maintien d’un taux d’humidité suffisant
Clayettes perforées pour circulation d’air
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POCHETPOCHET 1212
L’environnement durant le repiquageL’environnement durant le repiquage
Respectant la stérilité Respectant la stérilité Sensibilité des cellules aux infections Sensibilité des cellules aux infections
Bactériennes (en particulier les mycoplasmes), Bactériennes (en particulier les mycoplasmes), Fongiques,Fongiques, Virales.Virales.
Utilisation de façon adéquate d’une enceinte à Utilisation de façon adéquate d’une enceinte à atmosphère stérile :atmosphère stérile : PSM Poste de Sécurité MicrobiologiquePSM Poste de Sécurité Microbiologique
Indicateur de pH : Rouge de phénol rose à pH 7,4 rouge si alcalinisation (infection fongique) jaune si acidification (contamination bactérienne ou mort cellulaire)
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POCHETPOCHET 1313
Le PSMLe PSMEnceinteEnceinte
une paillasse inox (parfois une paillasse inox (parfois perforée)perforée)
des grilles d’aspirationdes grilles d’aspiration un écran transparentun écran transparent un ventilateurun ventilateur
créant une aspiration d’air par les créant une aspiration d’air par les grilles d’aspirationgrilles d’aspiration
une zone de filtration d’air par une zone de filtration d’air par deux filtres HEPAdeux filtres HEPA retenant toute particule de retenant toute particule de
diamètre >0,3 µmdiamètre >0,3 µm redistribuant l’air filtréredistribuant l’air filtré
dans l’enceinte de travail 65 % dans l’enceinte de travail 65 % d’air stériled’air stérile
dans l’atmosphère les 35% dans l’atmosphère les 35% restantsrestants
35%
65%
100%
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POCHETPOCHET 1414
L’entretienL’entretienSuivi de la culture cellulaireSuivi de la culture cellulaire
Aspect macroscopiqueAspect macroscopique Observation du milieu de culture limpide et rose pouvant Observation du milieu de culture limpide et rose pouvant
devenir trouble et/ou rouge ou jaunedevenir trouble et/ou rouge ou jaune Au microscope inverséAu microscope inversé
sous la platine : les objectifs sous la platine : les objectifs au dessus de la platine : l’éclairage au dessus de la platine : l’éclairage avec contraste de phase : meilleure visualisation des avec contraste de phase : meilleure visualisation des
prolongements cytoplasmiques, organites et vacuolesprolongements cytoplasmiques, organites et vacuoles Vacuolisation et présence de cellules arrondies en Vacuolisation et présence de cellules arrondies en
suspension = souffrance et perte d’adhésionsuspension = souffrance et perte d’adhésion Nécessité de changer le milieu tous les 2 ou 3 joursNécessité de changer le milieu tous les 2 ou 3 jours
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POCHETPOCHET 1515
L’entretienL’entretien
Microscope inverséMicroscope inversé
sous la platine : les objectifs sous la platine : les objectifs
au dessus de la platine : au dessus de la platine : l’éclairage l’éclairage
avec contraste de phaseavec contraste de phase
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POCHETPOCHET 1616
L’entretienL’entretien
Installation du Poste (PSM)Installation du Poste (PSM) Nettoyage des mains et avant brasNettoyage des mains et avant bras Désinfection à l’alcool Désinfection à l’alcool
du plan de travaildu plan de travail de tout le matériel nécessairede tout le matériel nécessaire
Pipettes stériles, portoirs, auxiliaire de pipetage ou Pipettes stériles, portoirs, auxiliaire de pipetage ou pipettes automatiques avec filtres et cônes stériles, pipettes automatiques avec filtres et cônes stériles, tubes stériles…tubes stériles…
de tous les récipients contenant les réactifs de tous les récipients contenant les réactifs stérilesstériles
Milieu complémenté (ou réactifs pour le constituer)Milieu complémenté (ou réactifs pour le constituer) TrypsineTrypsine
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POCHETPOCHET 1717
L’entretienL’entretien
Lavage des mains et des avant-bras
Désinfection du matériel
Installation sous PSM après désinfection du
plan
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POCHETPOCHET 1818
L’entretienL’entretien
Élimination du milieu ancien
Rinçage en tampon sans Ca2+
Ajout de trypsine
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POCHETPOCHET 1919
L’entretienL’entretien
Action de la trypsine
surveillée au microscope
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POCHETPOCHET 2020
L’entretienL’entretien
Inaction de l’activité enzymatique de ta trypsine par ajout de milieu complémenté
Prélèvement d’une fraction de la suspension pour dénombrement après une série d’aspirations refoulements prolongée pour détacher les
cellules
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POCHETPOCHET 2121
L’entretienL’entretienDénombrement en présence d’un colorant pour estimation de la viabilité cellulaire : Par exemple, Bleu de Funk (ou Trypan) exclus des cellules vivantes et pénétrant dans les cellules mortes
Calcul du volume de suspension cellulaire (cellules viables) à introduire dans le milieu neuf pour une nouvelle incubation de 2 à 3 jours