Technical Tips & Cautions

Technical Tips & Cautions

1. DNA Extraction 에서 주의 사항2. Hybridization & Detection 에서 주의 사항3. False Band 가 보고된 case

4. Woongbee Ambiguity Data

5. Woongbee New Data

DNA Extraction 주의 사항

왜 DNA Extraction 이 중요한가1. HLA 실험 성공을 결정짓는 Key Step

2. 쉽지만 , 가장 중요한 실험

High Quality DNA & Optimal

concentration

= Best Results


채혈 및 Blood 보관

1. Anticoagulant - ACD 또는 EDTA recommend

; Heparin 은 PCR 의 inhibition 을 초래함

2. 채혈 후 5 일 이내는 4C 보관 가능

3. HLA interpretation 이 끝날 때까지 blood 를 4C 보관

- 냉동보관은 절대 하지 말것

4. Interpretation 이 완료되면 , DNA 를 분리하여 4C or -20C 보관

* 냉동 보관한 Blood 를 녹일 때는 , 37C 에서 빠르게 녹인 후 ,

Extraction 전까지 냉장 또는 On ice 보관


DNA Extraction 사전 확인 사항

1. Cell 수 확인 ( 특히 혈액종양내과 )

2. 정상 범위 (4,000 ~ 10,000/ul) 일 경우는 Normal protocol 을 이용하여 분리

3. 정상보다 적거나 , 많을 경우는 웅비 권장 protocol

을 이용하여 분리


DNA Quality & Optimal Concentration

1. Dynal Recommend (Package insert P. 9. Note 참조 )

; A260/A280 1.65 ~ 1.80

13 ~ 15 ng/ul i.e. 약 200 ng 을 PCR 에 사용할 것을 권장

AB

CwDRB

DNA Extraction 주의 사항DNA Quality & Optimal Concentration

2. 1.65 이하 또는 2.0 이상의 DNA 를 사용했을 경우의 문제점 ( 아래 그림 )

; PCR inhibition 으로 인한 False band 의 원인

3. 13 ng/ ul 이하의 DNA 를 사용했을 경우의 문제점

; PCR 증폭이 되지 않는 원인이 될 수 있음

4. 너무 많은 DNA 를 사용했을 경우의 문제점 ( 아래 그림 참조 )

; 몇몇 allele 들만 증폭되거나 , 증폭되지 않는 문제점

; 즉 , False Positive or False Negative 의 원인이 됨

DNA Extraction 주의 사항DNA 정량 (Dynal DNA Direct Blood 이외의 제품 사용시 필수 )

1. UV Spcetrophotometer 이용2. 전기영동을 이용한 반정량 방법 1) 준비물 – 농도를 알고 있는 DNA ( 외국정도관리 검체 , control DNA) 2) 방법 – 1 번 well : 200 ng 에 해당하는 DNA - 2 번 well : 정량하고자 하는 DNA 1 ul - 3 번 well : 정량하고자 하는 DNA 5 ul - 4 번 well : 정량하고자 하는 DNA 10 ul 3) 정량 - 1 번 well 의 band intensity 가 2 번과 3 번 well 의 중간쯤 - 따라서 , (1+5)/2 = 3 ul 가 200 ng volume

1 2 3 4

WBC 가 부족한 경우 - 항암제를 투여 받은 Leukemia 환자 - 신장 투석 환자 - 이들 환자 검체의 경우 반드시 WBC 수를 확인한다 . - 정상범위 ; 성인 4000 ~ 10,000/ ul ; 15 세 이하 유아 10,000 ~ 12,000/ul

WBCWBC 가 부족한 검체로부터 가 부족한 검체로부터 DNA IsolationDNA Isolation- Dynabeads DNA Direct Blood - Dynabeads DNA Direct Blood 사용시사용시



Red Cell Lysis Buffer (5X)

# of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentrate (μl) 200 410 620 830 1040 1250 1460 1670 1880 2090

H2O (ml) 0.80 1.64 2.48 3.32 4.16 5.00 5.84 6.68 7.52 8.36

Washing Buffer (10X)

# of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentrate (μl) 300 630 930 1260 1560 1890 2190 2520 2820 3150

H2O (ml) 2.7 5.67 8.37 11.34 14.04 17.01 19.71 22.68 25.38 28.35

I. WBC 가 4,000 개 이상의 정상 환자 ; Dynabeads DNA Direct Blood 시약 준비 (2~8C 에서 1 개월 보관 가능 )


1. blood sample 을 2~3 초간 vortex 후 ,

2. 1.5 ㎖ E- tube 에 100 ㎕ 혈액을 분주

3. 1x Red Cell Lysis Buffer 1 ㎖을 넣고 inverting 하면

RBC 가 용해되어 맑게 됨

4. 실온에서 5 분간 incubation

5. 13,000 rpm 에서 1 분 원심분리 → 백혈구 모음

6. 상층액 제거 후 Vortexing

7. Resuspended Dynabead 200 ㎕ (1 units) 첨가 후 pipetting

8. 5 분간 실온 incubation

I. WBC 가 4,000 개 이상의 정상 환자



9. MPC-S 에서 1 분간 방치

10. 상층액이 맑아지면 상층액 제거 후 MPC 에서 분리

11. 1x Washing buffer 나 D.W. 1 ㎖ 첨가

12. 7~9 과정 2 회 반복

13. MPC 에서 분리 후 200 ㎕ Resuspension Buffer 나 D.W. 첨가

14. Pipetting 반복하여 complex 분리

15. 15 ㎕을 PCR 주형으로 사용

I. WBC 가 4,000 개 이상의 정상 환자



II. WBC 가 2,500 ~ 4,000 개인 환자 ; Dynabeads DNA Direct Blood 시약 준비 (2~8C 에서 1 개월 보관 가능 ) ; 정상환자의 경우보다 Red Cell Lysis buffer 를 2 배 준비



Red Cell Lysis Buffer (5X)

# of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentrate (μl) 410 830 1250 1670 2090 2500 2920 3340 3760 4180

H2O (ml) 1.64 3.32 5.00 6.68 8.36 10.00 11.68 13.36 15.04 16.72

Washing Buffer (10X)

# of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentrate (μl) 300 630 930 1260 1560 1890 2190 2520 2820 3150

H2O (ml) 2.7 5.67 8.37 11.34 14.04 17.01 19.71 22.68 25.38 28.35

1. blood sample 을 2~3 초간 vortex 후 , 2. 1.5 ㎖ E- tube 에 100 ㎕ 혈액을 분주 3. 1x Red Cell Lysis Buffer 1 ㎖을 넣고 inverting 하면 RBC 가 용해되어 맑게 됨 4. 실온에서 5 분간 incubation 5. 13,000 rpm 에서 1 분 원심분리 → 백혈구 모음 6. 상층액 제거 후 Vortexing

7. 2~5 단계 1 회 반복 8. Resuspended Dynabead 200 ㎕ (1 units) 첨가 후 pipetting

II. WBC 가 2,500 ~ 4,000 개인 환자







13. MPC 에서 1 분간 방치

14. 11~13 과정 2 회 반복




II. WBC 가 2,500 ~ 4,000 개인 환자



주의사항반드시 blood 100 ul 에 Red Cell lysis buffer 1 ml 의 비율로 처리

* blood 200 ul 에 Red Cell lysis buffer 1 ml 첨가 시

1) DNA purity 가 감소되고 ,

2) PCR 시 non-specific amplification

즉 , false positive band 의 원인이 된다 .

II. WBC 가 2,500 ~ 4,000 개인 환자



III. WBC 가 1,000 ~ 2,500 개인 환자 ; Dynabeads DNA Direct Blood 시약 준비 (2~8C 에서 1 개월 보관 가능 )

; Red Cell Lysis buffer I & II 준비

- Red Cell Lysis buffer I

: Red Cell Lysis concentrate 10:1 희석

: 0.5 M EDTA 첨가 - Red Cell Lysis buffer II




II. WBC 가 1,000 ~ 2,500 개인 환자Red Cell Lysis Buffer I

# of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentrate (μl) 100 220 320 420 540 640 740 840 940 1040

H2O (ml) 0.88 1.848 2.728 3.608 4.576 5.456 6.336 7.216 8.096 8.976

0.5 M EDTA (μl) 20 42 62 82 104 124 144 164 184 204

Red Cell Lysis Buffer II

# of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentrate (μl) 100 220 320 420 540 640 740 840 940 1040

H2O (ml) 0.9 1.89 2.79 3.69 4.68 5.58 6.48 7.38 8.28 9.18

Washing Buffer

# of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentrate (μl) 300 630 930 1260 1560 1890 2190 2520 2820 3150

H2O (ml) 2.7 5.67 8.37 11.34 14.04 17.01 19.71 22.68 25.38 28.35



1. blood sample 을 2~3 초간 vortex 후 , 2. 1.5 ㎖ E- tube 에 500 ㎕ 혈액을 분주

3. Red Cell Lysis Buffer I 1 ㎖을 넣고 inverting 하면

RBC 가 용해되어 맑게 됨 4. 실온에서 5 분간 incubation 5. 13,000 rpm 에서 1 분간 원심분리 → 백혈구 모음 6. 상층액 제거 후 Vortexing

7. Red Cell Lysis Buffer II 1 ㎖을 넣고 1 분간 Incubation

8. 13,000 rpm 에서 1 분간 원심분리 후 상층액 제거

II. WBC 가 1,000 ~ 2,500 개인 환자



9. Vortexing 후 Resuspended Dynabead 200 ㎕ (1 units) 첨가 10. Pipetting 후 즉시 새로운 E-tube 로 옮긴 후 , 5 분간 실온 incubation 11. MPC-S 에서 1 분간 방치 12. 상층액이 맑아지면 상층액 제거 후 MPC 에서 분리 13. 1x Washing buffer 나 D.W. 1 ㎖ 첨가 14. MPC-S 에서 1 분간 대기 15. 12~14 과정 2 회 반복 16. MPC 에서 분리 후 200 ㎕ Resuspension Buffer 나 D.W. 첨가 17. Pipetting 반복하여 complex 분리 18. 15 ㎕을 PCR 주형으로 사용

II. WBC 가 1,000 ~ 2,500 개인 환자



IV. WBC 가 1,000 개 이하인 환자 ; Dynabeads DNA Direct Blood 시약 준비 (2~8C 에서 1 개월 보관 가능 )

; 1 ml whole blood (500 ㎕ x 2 tubes) 에서 DNA extraction

; Red Cell Lysis buffer I & II 준비

- Red Cell Lysis buffer I


: 0.5 M EDTA 첨가 - Red Cell Lysis buffer II




IV. WBC 가 1,000 개 이하인 환자Red Cell Lysis Buffer I

# of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentrate (μl) 210 440 640 840 1080 1280 1480 1680 1880 2080

H2O (ml) 1.848 3.696 5.456 7.216 9.152 10.912 12.672 14.432 16.192 17.952

0.5 M EDTA 42 84 124 164 208 248 288 328 368 408

Red Cell Lysis Buffer II

# of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentrate (μl) 210 440 640 840 1080 1280 1480 1680 1880 2080

H2O (ml) 1.89 3.78 5.58 7.38 9.36 11.16 12.96 14.76 16.56 18.36

Washing Buffer

# of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentrate (μl) 300 630 930 1260 1560 1890 2190 2520 2820 3150

H2O (ml) 2.7 5.67 8.37 11.34 14.04 17.01 19.71 22.68 25.38 28.35



1. blood sample 을 2~3 초간 vortex 후 ,

2. 1.5 ㎖ E- tube 2 개에 각각 500 ㎕ 혈액을 분주

3. 각각의 tube 에 Red Cell Lysis Buffer I 1 ㎖ 첨가

4. 수회 inverting 후 , 실온에서 5 분간 incubation

5. 13,000 rpm 에서 1 분간 원심분리 → 백혈구 모음

6. 상층액 제거 후 Vortexing

7. 각각의 tube 에 Red Cell Lysis Buffer II 1 ㎖ 첨가

8. 1 분간 incubation

9. 13,000 rpm 에서 1 분간 원심분리 후 상층액 제거

IV. WBC 가 1,000 개 이하인 환자



10. Vortexing

11. 한 tube 에 Resuspended Dynabead 200 ㎕ (1 units) 첨가

12. Pipetting 후 즉시 나머지 E-tube 로 옮긴 후 ,

13. Pipetting 후 즉시 새로운 E-tube 로 옮김

Tube 1 Tube 2 Tube 1

Add 200 ulDynabeads

Pipetting &Transfer to tube2

Tube 2

Pipetting &

Transfer to New E-tube

New E-Tube








18. MPC-S 에서 1 분간 대기

19. 16~18 과정 2 회 반복







V. WBC 가 많은 환자- 만성 백혈병 또는 백혈병양반응 (Leukemoid reaction)- 50,000/ul 이상으로 증가- 이들 환자 검체의 경우 반드시 WBC 수를 확인한다 .- 정상범위 ; 성인 4000 ~ 10,000/ ul ; 15 세 이하 유아 10,000 ~ 12,000/ul

WBCWBC 가 많은 검체로부터 가 많은 검체로부터 DNA IsolationDNA Isolation- Dynabeads DNA Direct Blood - Dynabeads DNA Direct Blood 사용시사용시


- Blood volume 을 줄여서 Normal Protocol 사용 ; 10,000 cell/ ul 양으로 줄여 사용 ( 예 참조 )- 100 ul blood 사용시 문제점 ; WBC 가 많아 충분한 cell lysis 가 되지 않아 , PCR 이 제대로 되지 않는 경우가 발생 ; DNA 가 bead 의 binding capacity 를 벗어나기 때문에 pipetting 시 DNA 가 딸려 나오는 불편함



V. WBC 가 많은 환자

예 ) WBC 가 50,000 cells/ ul 개인 환자 - 10,000 cells/ ul 가 되려면 1/5 volume 만 사용 - 즉 , 100 ul whole blood 대신 20 ul 사용 - 50,000 x 20 = 10,000 x 50



V. WBC 가 많은 환자

Hybridization & Detection 주의 사항

Hybridization & Detection 성공 요소

1. PCR product

2. 정확한 시약 조제3. 정확한 온도4. 시간 준수

Importa

nt

&

Serious !

!!

1. 시약 준비 - Protocol 에 언급된 대로 정확한 희석배수를 지킨다 .

- Working hybridization buffer, Wash buffer 및 Citrate buffer 는 조제 후 3 개월간 실온에서 안정 - Contamination 에 주의

Hybridization & DetectionHybridization & Detection


2. Pre-hybridization 처리 - Dynal RELI SSO 는 50±1C 의 온도에서 안정적

- 온도에 영향을 주는 주변환경이 매우 중요하다

; Tray 에 Strip 을 넣는다

; Hybridization Buffer 를 첨가한다

; Tray 를 Waterbath 에 위치시킨다

; 50C water bath 에서 10 분 이상 Warming 해준다

- 비교적 온도 변화가 없는 장소에 Water Bath 를 설치



Water bath 온도 QC

> 50 – False negative 증가< 50 – False positive 증가1. water bath 온도를 calibration 하고 ,

2. 일반 온도계를 이용하여 매일 온도 check 를 하고 , 기록 - ex) 온도를 calibration 한 후 일반 온도계의 온도가 51℃ 이면 지속적으로 51℃ 를 확인 .

만일 52℃ 를 나타낸다면 온도가 1℃ 틀리므로 water bath 를 49℃ 에 맞춰서 사용하고 즉시 웅비에 연락을 해서 water bath 온도를 calibration 한다 .



3. Denatured DNA 첨가 - 반드시 Tray 를 water bath 내에 위치 시킨 상태에서 첨가한다 - 절대로 probe 위에 직접 loading 하지 않고 ,

- Tray 제일 아래에 loading 한다

4. Hybridization 1) Cross-contamination 주의 - 절대로 buffer 가 서로 넘치지 않도록 주의할 것 2) Tray cover 와 Tray 사이로 물이 스며들 경우 - 우선 반응을 중지한 후 Lab tissue 를 tray 와 cover 사이에 대어 물을 흡수한 후 tray cover 를 열고 나머지 물을 닦아낸다 - 절대로 당황해서 바로 tray cover 를 열지 않는다



5. Stringent Wash

- 시간 및 온도 준수

- Hybridization & Detection 과정에서 Key Step

; Dynal Package Insert P. 12. Note 참조

- 특히 , 오랜 시간 stringent wash 를 할 경우 hybridized probe 이

모두 제거됨



6. SA-HRP 조제 - 사용 전 , 15 분 이내에 조제할 것

; Dynal Package Insert P. 13. Note 참조 ; 즉 , Stringent Wash Step 에서 준비할 것 - HRP 는 enzyme 이기에 실온에서 오래 있을 경우 activity 감소 * HRP 첨가 후 4C 에 보관하지 말 것 - 반드시 , 실온에서 SA-HRP 반응을 할 것

7. Citrate buffer 의 역할 - High background 의 원인이 되는 SDS 제거

- Substrate 발색에 필요한 최적의 pH 상태 조성 및 유지 - Color 유지



8. Assay time - 반드시 protocol 이 언급한 시간만큼 실시할 것 - Substrate incubation 을 오래 하면 전체적으로 푸른 빛을 띠는데 이 때는 D.W. 에서 푸른 빛이 사라질 때까지 washing 을 해준다

9. Strip 의 보관 - 공기와 접촉은 TMB substrate 가 산화되어 탈색의 원인이 된다 - Strip 이 건조된 후 , 투명 tape 를 이용하여 공기와 접촉을 막는다

10. Tray 의 보관 - 실험 후 반드시 Et-OH 를 이용하여 substrate 를 완전히 제거한 후 물로서 washing 한 후 건조시킨다 - 세제 사용은 절대금지



False Band 가 보고된 Case

False Band 의 빈도가 높아진 경우 조치사항

1. DNA concentration & Quality Check (Dynal 사용 경우 )

- Cell 수 확인

- Normal range 의 경우 DNA extraction 을 다시 하되 ,

- F.M. 대로 할 것 - Dynal 제품을 사용하는 경우에는 대부분 washing step 에서 solution

제거가 불충분하여 , 낮은 순도의 DNA 가 False band 의 원인


False Band 의 빈도가 높아진 경우 조치사항

2. DNA concentration & Quality Check (타사 제품 사용 경우 )

- Qiagen, Promega, Gentra 및 Home made methods 를 사용하는 경우는

대부분 너무 많은 양의 DNA 를 사용하는 것이 false band 의 원인

- False band 가 나와서 interpreatation 에 의심이 가는 경우는 우선 DNA

정량을 한다 .

- DNA 정량 결과 , Quality 가 양호하면

; DNA 농도를 확인하여 200 ~ 300 ng 의 DNA 를 PCR 에 사용한다 .

- Ratio 가 1.5 이하 또는 2.2 이상이면 DNA extraction 을 FM 대로

다시 한다 .

False Band 의 원인을 찾기 위한 실험 순서

Step 1. Sample DNA, (+) Control & (-) Control (D.W.) 각각 PCR 실시

Step 2. 5 ul씩 PCR product 전기영동 실시

- Control DNA 의 PCR product와 같거나 높은 intensity ; Detection step 으로 - Sample DNA 의 PCR product 보다 낮은 intensity ; Sample DNA 문제 - 모든 PCR product 가 나오지 않음 ; PCR machine 이상 - Negative control 에서 band detection ; 사용중인 시약 contamination, 모두 교체할 것


False Band 의 원인을 찾기 위한 실험

Step 3. Step 1, 2 에서 이상이 없는 경우 detection

- 만일 , 결과에 문제가 생기면

; 온도 문제

; 시약 조제의 문제를 생각할 수 있다 .

- 이상의 모든 step 에서 반드시 Control DNA (+/-) 를 세워야 한다 .


1. 27,28,29 probe 의 경우 True 이면 매우 강한

band intensity (Control band 보다 2.5 배

이상 ) 를 보임

따라서 , 2 배 이하이면 무시참고 1) 27 번 probe 와 관련이 있는 08023,0810,0823 allele 및

1201,1206 allele 은 한국인에 흔한 allele 임

참고 2) 28,29 번 probe 는 한국인에 없거나 매우 드문 allele 관련

따라서 28,29 번은 한국인에서 거의 나오지 않음

I. HLA-DRB 27,28,29I. HLA-DRB 27,28,29 번의 번의 weak false positiveweak false positiveFalse Positive 가 보고된 Case

Control probe

27 28 29

Control probe

27 28 29

4. 27,28,29 번 probe 가 weak false

positive 인 경우

5. 27,28,29 번 probe 의 true positive

인 경우

I. HLA-DRB 27,28,29I. HLA-DRB 27,28,29 번의 번의 weak false positiveweak false positiveFalse Positive 가 보고된 Case

Probe 27 Control probe

Control probe

Control probe

Probe 28

Probe 29

Probe 27Probe 27 Control probe

Control probe

Control probe

Probe 28Probe 28

Probe 29Probe 29

Control < 2 배

Control > 2.5 배

1. 2 번 band 가 positive 일 경우 발생 1) DRB1*15 일 경우 31 번 probe 의 false positive 가 보고 되었음 (Dynal 본사 ) - 이는 DRB1*15 의 antisense primer (3' end)와 31 번 probe 의 5 base 가 overlap 되었기 때문 - 따라서 DRB1*15 가 나올 경우 증폭된 antisense primer 의

끝부분이 31 번 band와 hybridization 이 일어나 weak positive signal 발생

가능2. 그러나 31 번 probe 는 DRB1*0401 group 과 관련이 있고 , true

이면 매우 강한 band intensity (Control 보다 2 배 이상 ) 를 보임 따라서 , DRB1*0401 & 15 일 경우를 제외하고는 31 번 probe 은

무시

II. HLA-DRB 31II. HLA-DRB 31 번의 번의 weak false positiveweak false positive

False Positive 가 보고된 Case

1. 2 번은 DRB1*15와 16 에 관련된 probe 로서 2 번이 증폭되어야 36 번 37 번이 true band 이다 .2. 만일 2 번이 증폭이 되지 않았으면 36 번 , 37 번 probe 는 결과에 영향을 미치지 못한다 . 즉 2 번이 증폭되지 않으면 36,37 번은

무시3. PMP 에서는 2 번 probe 를 positive 로 인정하면 36,37 번 probe 부분이 녹색으로 나타나며 , 4. 만일 2 번 probe 를 표시하지 않으면 36,37 번 probe 부분이 회색으로 typing 에 영향을 미치치 않는 부분으로 표시됨 5. 36 번 probe 는 DRB1*15 confirm 37 번 probe 는 DRB1*16 confirm6. 한국형 프로그램 사용시는 2 번 probe 가 나오지 않았을 경우에 3

6, 37 번을 넣지 말것

III. HLA-DRB 2III. HLA-DRB 2 번과 번과 36,3736,37 번의 번의 weak false positiveweak false positiveFalse Positive 가 보고된 Case

1. 3 번은 A*24 Allele 과 Cross Reaction

- A*24 일 경우 3 번 probe 의 false positive 가 보고 되었음 (Dynal

본사 )

- 이는 A*24 의 primer와 31 번 probe 가 overlap 되었기 때문

- 따라서 A*24 가 나올 경우 증폭된 primer 의 끝부분이

3 번 probe와 cross-hybridization 이 일어나 weak positive signal

발생 가능

2. 3 번 probe – A*01,02,03,32 allele 과 관련이 있으며 , 이 allele

과의 조합 이외에서 3 번 probe 이 약하게 나오면 무시

3. 3 번 probe 과 관련이 있는 allele 이 나오는 경우 , 즉 true 이면

매우 강한 band intensity (Control 에 비해 2 배 이상 ) 를 보임

IV. HLA-A 3IV. HLA-A 3 번의 번의 weak false positiveweak false positiveFalse Positive 가 보고된 Case

1. 27, 31 번은 B*44 Allele 과 Cross Reaction

- B*44 일 경우 27, 31 번 probe 의 false positive 가 보고 되었음 (Dyn

al 본사 )

- 이는 B*44 의 primer와 27, 31 번 probe 가 overlap 되었기 때문

- 따라서 B*44 가 나올 경우 증폭된 primer 의 끝부분이 27, 31 번 ba

nd와 hybridization 이 일어나 weak positive signal 발생 가능

2. 27 번 probe – B*51, 57, 58 과 관련

31 번 probe – B*15, 18, 38, 39, 40 과 관련이 있으므로 ,

이 allele 과의 조합 이외에서 27,31 번 probe 이 나오면 무시

3. 27, 31 번 probe와 관련 있는 allele 이 나오는 경우 즉 , true 이면 27,

31 번 probe 은 매우 강한 band intensity (Control 의 2 배 ) 를 보임

V. HLA-B 27, 31V. HLA-B 27, 31 번의 번의 weak false positiveweak false positiveFalse Positive 가 보고된 Case

1. B*07 에서 32 번 probe 의 weak 한 경향 - B*07 일 경우 32 번 probe 에서 weak 한 경향을 보임 - Scanner 를 사용한 interpretation 의 경우 false

negative 로 판정하는 경우가 있음 - 그러나 , Intensity Reference probe 와 거의 같은

정도의 intensity 를 보인다 .

2. 따라서 , control probe 보다 약간 약하더라도 positive probe 로 인정할 것

VI. HLA-B 32VI. HLA-B 32 번의 번의 weak false negativeweak false negativeFalse Negative 가 보고된 Case

I. HLA-A*30 & 33 or 30 & 68 AmbiguityI. HLA-A*30 & 33 or 30 & 68 AmbiguityWoongbee Ambiguity Data

HLA-A Amb11. Positive Probe – 1,4,5,9,10,11,14,18,19,22,24,26,28,30,32,

36,38,40

2. Result – HLA-A*30 & 68 or 30 & 33

3. 한국인에서 발현빈도가 높은 HLA-A allele

A*30 – 3001 (76.6%), 3004 (23.4%)

A*33 – 3303 (100%)

4. Interpretation

A*3009 가 한국인에서 발견되지 않았기 때문에

HLA-A*30 & 33 으로 Report 가능

I. HLA-A*30 & 33 or 30 & 68 AmbiguityI. HLA-A*30 & 33 or 30 & 68 AmbiguityWoongbee Ambiguity Data

HLA-A Amb1

II. HLA-A*01 & 02 or 02 & 26 AmbiguityII. HLA-A*01 & 02 or 02 & 26 AmbiguityWoongbee Ambiguity Data

HLA-A Amb21. Positive Probe –

3,5,6,11,13,15,19,22,23,25,26,30,34,36,38,39,40

2. Result – HLA-A*01 & 02 or 0236 & 3604


A*02 – 0201 (56.5%), 0203(1.5%), 0206(31.2%), 0207 (10%), 0210 (0.4%)

4. Interpretation

A*0236 과 36 은 한국인에서 발견되지 않았기 때문에 HLA-A*01 & 02 로 Report 가능

II. HLA-A*30 & 33 or 30 & 68 AmbiguityII. HLA-A*30 & 33 or 30 & 68 AmbiguityWoongbee Ambiguity Data

HLA-A Amb2

III. HLA-A*01 & 02 or 02 & 26 AmbiguityIII. HLA-A*01 & 02 or 02 & 26 AmbiguityWoongbee Ambiguity Data


3,6,9,10,11,13,14,19,23,24,26,28,30,36,38,40

2. Result – HLA-A*02 & 33 or 0255 & 7404


A*02 – 0201 (56.5%), 0203(1.5%), 0206(31.2%), 0207 (10%), 0210 (0.4%)

A*33 – 3303 (100%)

4. Interpretation

A*0255 가 한국인에서 발견되지 않았기 때문에 HLA-A*01 & 02 로 Report 가능

III. HLA-A*02 & 33 or 02 & 74 AmbiguityIII. HLA-A*02 & 33 or 02 & 74 AmbiguityWoongbee Ambiguity Data

HLA-A Amb3

IV. HLA-A*01 & 29 or 29 & 36 AmbiguityIV. HLA-A*01 & 29 or 29 & 36 AmbiguityWoongbee Ambiguity Data


3,5,8,11,12,15,19,22,24,25,28,30,34,36,38,39,40

2. Result – HLA-A*01 & 29 or 2903 & 3604

3. Interpretation

A*36 은 한국인에서 발견되지 않았기 때문에 HLA-A*01 & 29 로 Report 가능

Woongbee Ambiguity Data

HLA-A Amb4

IV. HLA-A*01 & 29 or 29 & 36 AmbiguityIV. HLA-A*01 & 29 or 29 & 36 Ambiguity

V. HLA-B*07 & 35 or 35 & 81 AmbiguityV. HLA-B*07 & 35 or 35 & 81 AmbiguityWoongbee Ambiguity Data

HLA-B Amb38 – 웅비로 반드시 검체를 보내는 경우1. Positive Probe - 1,6,7,8,13,15,16,20,28,29,30,32,40,43,48,50,53,54, 56,60,612. Result – HLA-B*07 & 35 or 35&813. 한국인에서 발현 빈도가 높은 HLA-B alleles HLA-B*0705,0706 (0.5%) HLA-B*3502,3504,35091,35092,3515 (0.1%) HLA-B*3508 (0.1%) HLA-B*8101 (0.1%)4. Interpretation 한국형 결과 300 : 1 이상의 빈도 차일 경우 실험 의뢰 그 이하일 경우는 Most Probable 로 Report 가능

V. HLA-B*07 & 35 or 35 & 81 AmbiguityV. HLA-B*07 & 35 or 35 & 81 AmbiguityWoongbee Ambiguity Data

HLA-B Amb38 – 웅비로 반드시 검체를 보내는 경우5. PMP 결과

6. 한국형 program 결과

Woongbee New Data

HLA-DRB1*12031. 한국인에서 보고된 적은 없음2. 그러나 , Asian 에서 0.27% (26.6/10,000) 정도로 보고3. 따라서 , 드물게 나올 수 있음

HLA-DRB3*0106/01071. 한국형 프로그램에서 Rare2. DRB1*1201-DRB3*0106/0107 (2 Case 보고 – 서울대 병원 ) ; 모두 A2-B70-DRB1*1201 haplotype 을 가지고 있었음3. DRB3*01 New 로 보고 (Human Immunology 보고에 기술 )4. Reference : Song E.Y. et.al., HLA-DRB1 and –DRB3 allele frequencies and haploty

pic associations in Koreans. Human Immunology. 2004; 65; 270~276

한국인의 HLA-A, B, DR 형별 빈도2003년 춘계학술대회 발표 서울대학교 노은연 외

HLA-A (13 종 )

GF(%)

HLA-B (31 종 )

GF(%) HLA-B

GF(%)HLA-DR (13 종 )

GF(%)

A01A02A03A11A23A24A26A29A30A31A32A33A68ABL

1.9 28.6

1.9 10.3

†0.0 22.

36.6 0.6 4.8 5.6 0.9 16.3

0.20.0

B07B08B13B14B27B35B37B38B39B44B46B47B48B49B50B51B52B54B55

4.4 †0.0 4.8 1.2 2.8 6.0 1.5 1.1 1.5 10.0 4.6 0.2 3.3

†0.0 0.1

10.0 3.3 6.2 1.9

B56B57B58B59B60B61

0.2 0.3 6.7 1.8 4.3

‡9.2

DR01DR03DR04DR07DR08DR09DR10DR11DR12DR13DR14DR15DR16DRBL

6.9 1.9

19.5 6.5

10.2 9.8 1.7 5.1 7.3

11.0 8.0

11.1 1.1 0.0

B4002 B4003 B4006

4.7 0.7 3.8

B62B63B67B71B75

10.1

0.1 1.2 1.1 2.1

B1502 B1511

0.2 1.9

B81BBL

†0.00.0

한국인의 2 유전자좌 일배체형 분포 HF≥1.0% and LD with chi square≥6.63 (P<0.01)

A-B (23 종 ) HF(%) ChiSQ

A33 A33 A02 A24 A30 A24 A24 A11 A24 A02 A26 A26 A02 A02 A31 A31 A02 A24 A01 A30 A24 A02 A11

B44 B58 B46 B51 B13 B52 B07 B62 B54 B35 B61 B62 B27 B48 B61 B51 B75 B60 B37 B14 B59 B39 B54

7.55.83.03.02.92.92.82.72.52.31.71.61.61.51.41.41.41.41.21.21.11.01.0

902.0843.6102.510.7

1061.3259.2151.9108.239.38.0

77.353.039.013.153.147.745.97.9

1439.1739.045.434.27.3

B-DR (25 종 ) HF(%) ChiSQ

B44 B62 B58 B07 B46 B52 B44 B13 B61 B54 B27 B61 B58 B59 B62 B51 B37 B13 B51 B61 B51 B61 B54 B35 B54

DR13 DR04 DR13 DR01 DR08 DR15 DR07 DR07 DR09 DR04 DR01 DR14 DR03 DR04 DR15 DR09 DR10 DR12 DR12 DR04 DR14 DR12 DR15 DR14 DR08

5.15.04.03.42.92.82.72.52.52.42.01.81.71.61.61.51.31.21.21.21.21.11.11.0

1.0

589.5214.0541.2

1163.0476.1587.7242.8576.6109.450.1

632.561.3

679.7177.3

7.010.7

2054.972.310.89.39.1

10.58.4

21.07.9

Bold: chi square>500

A-DR (18 종 ) HF(%) ChiSQ

A33 A24 A02 A24 A11 A24 A02 A33 A02 A30 A33 A33 A31 A26 A24 A11 A26 A01

DR13 DR04 DR08 DR15 DR04 DR01 DR12 DR07 DR11 DR07 DR03 DR04 DR08 DR09 DR08 DR12 DR14 DR10

7.9 5.4 4.6 4.2 3.6 3.0 2.9 2.5 2.4 2.1 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.3 1.2 1.0

895.3 12.6 50.5 53.3 59.1 62.4 15.1 79.0 27.5

387.8 134.0 44.6 43.5 33.4 15.9 17.7 31.0

915.8

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