Questões de revisão da aula anterior 1. Descreva sucintamente a evolução da classificação dos seres vivos. 2. Refira as principais diferenças na parede e membrana celulares entre o Domínio Bacteria e Domínio Archea. 3. Escolha 3 características para distinguir células que pertençam ao reino Fungi e ao reino Protista. 4. No filo Ascomicota encontram-se fungos com reprodução assexuada por esporulação e por gemulação. Explique as diferenças e dê exemplos. 5. Os fungos têm um papel muito importante no desenvolvimento sustentável de processos biotecnológicos. Comente, justifique e dê exemplos. 6. Selecione uma espécie de fungo e descreva-o: filogenia, morfologia, reprodução, nutrição, interesse, etc.
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Questões de revisão da aula anterior
1. Descreva sucintamente a evolução da classificação dos seres
vivos.
2. Refira as principais diferenças na parede e membrana celulares
entre o Domínio Bacteria e Domínio Archea.
3. Escolha 3 características para distinguir células que pertençam ao
reino Fungi e ao reino Protista.
4. No filo Ascomicota encontram-se fungos com reprodução
assexuada por esporulação e por gemulação. Explique as
diferenças e dê exemplos.
5. Os fungos têm um papel muito importante no desenvolvimento
sustentável de processos biotecnológicos. Comente, justifique e dê
exemplos.
6. Selecione uma espécie de fungo e descreva-o: filogenia,
morfologia, reprodução, nutrição, interesse, etc.
Condições de cultura
Requisitos nutricionais
Meios de Cultura
Temperatura
Necessidades gasosas
pH
Pressão osmótica
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Requisitos nutricionais
Os microrganismos necessitam de assegurar
as suas funções vitais: Produção de energia
Síntese de biomassa
NUTRIENTES
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Principais requisitos nutricionais
Água: 80-90% peso
Macronutrientes:
C, O, H, N, P, S,…
Micronutrientes:
Elementos mínimos
Mg, Co, Cu, Zn,…
Cofactores - enzimas
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Exigências suplementares
Factores de crescimento
Nutrientes acessórios, não podem ser
sintetizados na célula Aminoácidos, purinas, vitaminas
Necessários a microrganismos auxotróficos
(ex. Mutantes)
Microrganismos prototróficos - não requerem
factores de crescimento (maioria dos fungos)
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Fontes de Carbono
Heterotróficos
Carbono orgânico, principal fonte
Compostos utilizáveis depende do tipo de microrganismo
Autotróficos
CO2 – principal e exclusiva fonte de C
Conversão de CO2 em compostos orgânicos, processo reductor que requer energia.
etc) são extraídos por fervura e depois concentrados e secos até à consistência de pasta ou pó. São fonte de amino ácidos, vitaminas, coenzimas...
Peptonas: Misturas complexas de componentes orgânicos e inorgânicos
obtidos por digestão de tecidos que contêm proteínas de animais, tais como musculo de bife, gelatina, caseína, cerais, etc... São productos comercializados em pó. As peptonas contêm principalmente peptidos e amino ácidos.
Ex: Triptona: resulta da digestão da caseína
Ex: Fitona: resulta da digestão de soja
Ex: Peptona: Resulta da digestão de musculo de bife. Peptona numa concentração de 0.1% é também usado como
diluente.
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Meios selectivos
Suprimem o crescimento de microrganismos
indesejáveis
Permitem isolamento de culturas puras ou
axénicas a partir de culturas mistas
Ex: sais biliares inibem crescimento de bactérias
Gram+
Outros agentes:
Antibióticos, ácidos, oxigénio, pH,...
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Exemplo: Sabouraud Dextrose Agar (SDA) inibe o crescimento de muitas
bactérias, é selectivo para leveduras e fungos
Meios selectivos
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Meios diferenciais
Meios que não inibem o crescimento mas
permitem distinguir tipos de microrganismos
Diferenciação:
Cor e tamanho das colónias, cor do meio, etc
Ex: agar MacConkey usa-se para isolar
enterobactérias patogénicas; permite também
distinguir entre microrganismos que fermentam a
lactose.
Meio selectivo-diferencial
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Meios diferenciais
Staphylococcus (growth, yellow colonies) vs.
Streptococcus (growth, white colonies)
Exemplo: CNA (agar com sangue) permite diferenciar
Estafilococos de Estreptococos
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Meios diferenciais e selectivos
MSA: crescimento/fermentação
Exemplo: MSA permite
seleccionar o género
Estafilococos e diferenciar
entre fermentativos e não
fermentativos
Exemplo: MAC selectivo
para gram negativas e
diferencia entre
fermentativos e não
fermentativos
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Meios enriquecidos
Permitem o crescimento de uma espécie em
detrimento de outras
São muito nutritivos
Favorecem crescimento de microrganismos de
crescimento fastidioso
Ex: Strepcoccus pyogenes; Haemophillus influenza
Ex: meios de agar/sangue; agar/chocolate,...
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Exemplo: Agar Sangue Exemplo Agar chocolate
Meios enriquecidos
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Temperatura
O microrganismo apresenta a sua temperatura
óptima, mas também sobrevive a temperaturas
mais altas ou mais baixas. De acordo com a
temperatura, os microrganismos podem ser
classificadas em:
- psicrófilos: cresce abaixo de 15 ° C (latente);
- mesófilos: entre 20 - 40 ° C;
- termófilos: entre 45 - 55 ° C;
- estenotermófilos: entre 65 - 80 ° C.
Fungos: mesófilos (filamentosos (20 a 25oC) < leveduras (25 a 30 0C)
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Necessidades gasosas
De acordo com o a necessidade de oxigénio:
- aeróbios: crescem na presença de O2; Aeróbios estritos – dependem totalmente da respiração aeróbia
- anaeróbios: crescem na ausência de O2; Anaeróbios estritos- O2 é letal
Anaeróbios aerotolerantes- metabolismo exclusivamente anaeróbio, mas O2 não é letal
- anaeróbios facultativos: crescem tanto com ou sem O2;
- microaerófilos: crescem em concentração de O2 menor do que a do ar atmosférico (5% O2).
Fungos são em geral aeróbios e alguns são anaeróbios facultativos
Podem suportar altas concentrações de CO2 e baixas de O2
Exemplo: Penicillium roqueforti suporta dentro de queijo 80 % CO2 e 4% O2
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Necessidades gasosa
Anaerobiose ou microaerofilia
Jarro de anaerobiose
Catalisador: paládio
Indicator de anaerobiose
Pacote
gerador de
gás
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pH Microrganismos acidófilos – pH entre 1.0 e 5.5
Microrganismos alcalófilos – pH entre 8.5 e 11.5
Microrganismos neutrófilos – pH entre 5.5 e 8.0 Fungos preferem meios ácidos, pH 5-6 mas toleram uma ampla
gama de pH: 2,5 a 9,5
Bactérias preferem meios neutros
Substâncias tampão Adicionadas ao meio para manter o pH dentro da gama óptima de pH de
crescimento do microrganismo. Ex: fosfatos de potássio e sódio, e carbonato de cálcio. Impedem variações bruscas de pH resultantes da produção metabólica de ácidos e bases. Nota: Peptona – poder tamponante.
Indicadores de pH São adicionados ao meio para detectar alterações na concentração de H+
durante o crescimento de um microrganismo, como por exemplo para avaliar a fermentação de hidratos de carbono. Muito utilizados em meios diferenciais. Ex: Púrpura bromo-cresol, azul de bromo-tiomol e vermelho de fenol
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Pressão osmótica
Usam-se substâncias para manter o equilíbrio do meio, impedem que a célula se rompa (NaCl 0.5 % ou sacarose 0.1 %) .
Atividade da água, 0<aw<1 Em geral >0.98
Fungos são em geral xerófilos (amigo do seco); Conseguem
crescer em condições de aw< 0,84
Fungos filamentosos<leveduras<bactérias
Microrganismos halófilos Adaptados a concentrações de sal elevadas >0.2 M
5.5 M NaCl → aw = 0.75 → Archaebacteria
Microrganismos osmofílicos Adaptados a concentrações de açúcar elevadas ou elevado
índice de desidratação
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Meios de culturaFungos filamentosos
Meios de cultura ricos e complexos
Meio de agar com batata e dextrose – PDA (rico em açucar)
Meios ricos em açúcar favorecem crescimento vegetativo
Meios menos ricos em açúcar favorecem esporulação
Exemplo PCA- batata, cenoura e agar.
Agar de Extrato de Malte (MEA)
Agar de Czapek (CZ)
Meio CZ apenas permite crescimento de espécies
capazes de utilizar o nitrato como fonte de azoto
Cultura de Fungos filamentosos
Crescimento em meio liquido
Inoculação
Suspensão de espóros
Suspensão de micélio
Agitação
Quebra das hifas
Micélio mais disperso e homogéneo
Fungos filamentosos- Prática (MB)
Crescimento em meio sólido – PDA
Inoculação do agar em caixa
Solução de espóros em Tween 80 (0.05%)
Porção de micélio
Incubação
Medir crescimento (diâmetro)
Meios de culturaLeveduras
Meios de cultura ricos e complexos
Meio YPD – Extrato de levedura, peptona, dextrose
Meio de Sabourough – Meio rico em carbohidratos, favorece o
crescimento de fungos e leveduras em detrimento das bactérias
Adicionando cloranfenicol e cicloheximida permite isolar dermatófitos
Meio YNB- Yeast Nitrogen Base
sem/com aminoácidos; sem/com sulfato de amónio
Utiliza-se para estudar a utilização de fontes de carbono
Peptona – 20 g/L
Extracto de levedura – 10 g/L
Glucose – 20 g/L
YPDA- adiciona-se 20 g/L de agar
Cultura de leveduras
Colónias bem definidas em meio sólido
Turvação do meio líquido indicando
crescimento celular – suspensão
homógenea
Técnicas de Preservação de microrganismos
Técnicas de esterilização e desinfecção
Tecnologia de cultura de
células microbianas
Módulo II
Engenharia Clínica
Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica
Introdução à Bioengenharia I
Mestrado em Biotecnologia
2014-2015Isabel Belo/DEB
Preservação
Objectivo
Conservar material biológico garantindo:
ausência de contaminação
perdas de viabilidade
ausência de alterações genéticas
Culturas stock Industria:
manter as estirpes de produção
Laboratórios académicos:
manter estirpes que desempenham determinadas reações
Laboratórios médicos:
estirpes referência para testes de patologia
Taxonomistas:
grande nº de culturas para fins comparativos
Investigação:
Culturas puras com características inalteráveis
Métodos de preservação
Aspectos a ter em conta Manutenção da viabilidade
Alteração da população
Alteração genética
Pureza
Custo
Nº de culturas
Valor da culturas
Fornecimento e transporte
Frequência de uso das culturas
Armazenamento no frio (Sub-cultura)
Inoculação de meio fresco em tubo ou frasco
Incubação a T adequado
Armazenamento (ex. 5 ºC) Reduzir entrada de ar – parafina liquida
Baixo custo de equipamento
Elevado trabalho manual (repicagens frequentes)
Tempo de armazenagem < 1 semana
Métodos de preservação
Armazenamento no frio (Sub-cultura)
Inoculação de meio fresco sólido Caixa de agar ou agar em tubo inclinado
Armazenamento (ex. 5 ºC)
Baixo custo de equipamento
Elevado trabalho manual (repicagens frequentes)
Risco de desidratação e contanimação
Risco de alteração da população aumenta com o nº de sub-culturas
Tempo de armazenagem 1 a 3 meses
Métodos de preservação
Secagem
Desidratação
Remoção de água e prevenção da rehidratação
Aplicável a fungos e algumas bactérias
Ex. secagem em sílica gel (5 anos)
Secagem em papel, armazenamento em caixas
herméticas
Em suportes pré-secos de amido, dextrano, …,
Em discos de gelatina
Liofilização (Freeze drying)
A água é removida por sublimação de uma
amostra congelada
Liofilização
A água é removida por sublimação de uma
amostra congelada Os organismos são suspensos num meio adequado,
congelados e expostos a vácuo.
Após liofilização as células são guardadas em vácuo ou num
gás inerte em ampolas individuais.
Liofilização Armazenagem do produto liofilizado à
temperatura ambiente ou 4ºC – 8ºC
Humidade residual 1 a 3%
Facilidade de transporte e
armazenamento
Durabilidade alta
Vários anos
Pode ocorrer perda de
viabilidade celular
(mantem até ~30 %)
Desvantagens: equipamento caro
Reativação das células
Abrir as ampolas em
ambiente asséptico
Usar uma pequena
quantidade de meio para
hidratar as células
Inocular meios sólidos
e líquidos
Avaliar a viabilidade
celular
Criopreservação
A água torna-se inacessível por congelação
Pode ocorrer danos celulares no processo de
congelamento/descongelamento
Adição de crioprotectores
Ex: glicerol (10% v/v) e DMSO (5% v/v)
Congelação
De -20 ºC a -196ºC
-80 ºC (arcas) vials com esferas e glicerol
-140 ºC (Nitrogénio em fase vapor)
-196ºC (Nitrogénio em fase líquida)
Criopreservação
Em tubos específicos
Com esferas para adesão celular
Com crioprotetores
Equipamento caro
Elevada manutenção da viabilidade celular
Grande durabilidade da estabilidade das
culturas
Tubos criogénicos
Colecções
Coleções de culturas de microrganismos
instruções específicas para aquisição, manutenção e distribuição
técnicas de preservação utilizadas devem garantir a manutenção do potencial do microrganismo
material biológico microbiano certificado – garantia de qualidade e autenticidade
Colecções de culturas de microrganismos
Funções
Coleccionar e catalogar
Manter
Fornecer
Desenvolvimento de bases de dados
Regulamentação dos depositários e clientes
Regulamentação do transporte
Requisitos
Definição da natureza do material biológico e do
grupo de risco
Equipa qualificada e treinada
competência para trabalhar com os microrganismos da coleção
conhecimento dos procedimentos de higiene e biossegurança -
evitar contaminação de amostras e riscos de infecção
Dependências físicas adequadas ao manuseio de
microrganismos do grupo de risco definido pela
coleção
ECCO European Culture Collections Organization
Colecções CélulasDSM – Deutsche sammlung
vom mikroornismen
Alemanha
Bactérias, plasmídeos, fungos, leveduras, células de
plantas e animais
CBS- centraalbureau voor
schimmelcultures
Holanda
Fungos e leveduras
http://www.cbs.knaw.nl/
MUM- Micoteca da
Universidade do Minho
Fungos
http://www.micoteca.deb.uminho.pt/
Colecções de culturas de microrganismos
Exemplos das maiores do mundo
ATCC – American Type Culture Collection, EUA https://www.atcc.org
JCM – Japan Collection of Microorganisms, Japão http://www.jcm.riken.go.jp/JCM/catalogue.shtml
WFCC – World Federation for Culture Collectionshttp://wdcm.nig.ac.jp/wfcc/index.html