Taller de Transposición Del DNA

Taller de Transposición del DNA

Helena Carranza Castillo 070100512012Tatiana Montilla Álvarez 070100242012

1. Represente gráficamente la estructura y organización de un transposon y haga una descripción de este gráfico.

TRANSPOSON

En el transposón la región central es una secuencia de DNA, a menudo de varios miles de pares de bases de longitud, que contiene un gen que codifica para la transposasa (la enzima que inserta el transposón en el cromosoma hospedador, cortando y empalmando el DNA hospedador). Este segmento también puede llevar otros genes que codifican para otras proteínas. Los genes centrales están flanqueados por repeticiones invertidas (RI) que son imágenes especulares; si una, por ejemplo, es AATG, la otra será GTAA. Las repeticiones invertidas son la secuencia de reconocimiento para las transposasas

Se considera que los Transposones son la fuente de mutaciones nuevas en mucho organismos pues cuando estos elementos transponibles exhiben escasa selectividad secuencial en su elección por los sitios de inserción, entonces a menudo pueden inhibir la función génica del gen, esta capacidad de insertarse de manera tan promiscua en el DNA condujo a su modificación y uso como mutageno y vectores para la entrega de DNA en la biología experimental.

2. Como se organizan los transposones (Clases) y describa cada uno de ellos.

a) Transposones de DNAb) Retrotransposones semejantes a virus y los retrotransposones

LTRc) Retrotransposones de poli-A

a. Transposones de DNA

Los transposones de DNA poseen frecuencias de DNA que actúan como sitios de recombinación. Los sitios de recombinación están situados al lado de los elementos de transposición y están organizados como secuencias repetidas invertidas. Estas repeticiones terminales invertidas varían en extensión de 25 a algunos centenares en pares de bases, no son repeticiones exactas de frecuencia y poseen las secuencias de reconocimiento al recombinarse.

Los transposones de DNA tienen un gen que codifica para su propia transposasa. Ellos pueden presentar genes adicionales que codifica proteínas y regula la transposición.

Las secuencias de DNA que flanquean el transposon exhiben un segmento corto de secuencia duplicada. Estos segmentos se organizan como repeticiones directas, reciben el nombre de duplicaciones de sitio diana y se generan duramente el proceso de recombinación.

Los transposones de DNA se hallan como elementos autónomos y no autónomos. Donde los primeros son los que portan un par de repeticiones invertidas terminales y un gen trasposasa , tienen todo lo necesario para promover su propia transposición, los transposones no autónomos son más sencillos ,

estos elementos portan solo las repeticiones invertidas terminales, esto es las secuencias de acción cis necesarias para la transposición.

b. Retrotransposones semejantes a virus y los retrotransposones LTR

Los retrotransposones similares a virus y los retrovirus también portan secuencias repetidas terminales invertidas que son los sitios de unión y acción de la recombinasa. Las repeticiones invertidas terminales están incluidas dentro de secuencias repetidas mas largas; estas se organizan en los extremos del elemento en la forma de repeticiones directas recibiendo el nombre de repeticiones terminales largas o LTR. Los retrotransposones semejantes a retrovirus codifican dos proteínas necesarias para su movilidad: la integrasa (transposasa) y la transcriptasa inversa.

c. Retrotransposones de poli-ALos retrotransposones de poli-A no tienen las repeticiones invertidas terminales que hay en las otras clases de transposones. En cambio, los dos extremos del elemento tienen secuencias distintas. Un extremo se llama UTR5’, mientras el otro tiene una región denominada UTR3’, seguida por un segmento de pares de bases A-T que recibe el nombre de secuencia de poli-A. Estos elementos también están flanqueados por duplicaciones de sitios cortas.

Los retrotransposones portan dos genes, conocidos como ORF1 y ORF2. El primero codifica una proteína de unión al RNA. ORF2 codifica una proteína con actividades tanto de transcriptasa inversa como de endonucleasa.

3. Describa el mecanismo por los que los transposones se recombinan

La transposición es una forma específica de recombinación genética qué mueve ciertos elementos genéticos de un sitio del ADN. Estos se denominan elementos transponibles o transposones. El movimiento se produce por medio de la recombinación entre las secuencias de ADN en los mismísimos extremos del elemento transponible y una secuencia de ADN de la célula huésped. El movimiento puede producirse con duplicación del elemento o sin esta. En algunos casos participa un intermediario de ARN temporal como es el caso del los retrovirus.

A su vez la transposición se divide en dos tipos:

Mecanismo no replicativo: este mecanismo comprende la extirpación del transposón de su sitio inicial en el ADN huésped, seguida por la integración de este transposón extirpado en un sitio nuevo del ADN. A este mecanismo también se le conoce como transposición por corte y pegado.

Mecanismo replicativo: En el que el ADN del elemento se duplica durante cada ronda de transposición.

4. En que consiste el mecanismo de transposición replicativa, explique

Transposición replicativa

El primer paso es la transposición replicativa es la congregación de la proteína transposasa en los dos extremos del DNA del transposon para generar un tranposoma.

El paso siguiente es el corte de DNA en los extremos del transposon. Esta reacción la cataliza la tranposasa dentro del transposoma. La transposasa produce un corte en el DNA en cada una de las dos uniones entre la secuencia transposónica y el DNA flanqueante del huésped. Este corte libera dos extremos DNA OH3’ en la secuencia del transposon.Luego, los extremos OH3’ del DNA del transposon se unen al sitio del DNA diana por la reacción de transferencia de cadenas del DNA. El intermediario en este caso es generado por la transferencia de las cadenas del DNA es una

molécula de DNA de ramificación doble. En este intermediario, los extremos 3´ del transposon están unidos de modo covalente al sitio diana nuevo, mientras que los extremos 5´ de la secuencia transposonica permanecen unidos al DNA flanqueante antiguo.

Las dos ramas de DNA dentro del intermediario tiene la estructura de una horquilla de replicación. Después de la transferencia de las cadenas de DNA, las proteínas de replicación del DNA de la célula huésped pueden congregarse en estas horquillas. El extremo OH3´ en el DNA diana escindido sirve como cebador para la síntesis de DNA. La replicación progresada a través de las secuencias transposónica y se detiene en la segunda horquilla. Esta reacción de la replicación genera dos copias de DNA del transposon. Estas se encuentran flanqueadas por las duplicaciones directas cortas del sitio diana.

5. Describa el mecanismo de formación de cDNA retrovírico

La formación del cDNA retrovirico se realiza por medio del proceso de transcripción inversa en esta podemos encontrar secuencias LRT que participaran en este proceso de formación la cuales está construida con 3 elementos que reciben los nombres de U3 (por extremo 3’ singular), R (por repetición) y U5 (por extremo 5’ singular).

Para empezar este proceso primeramente se realiza una transcripción de la copia integrada del genoma retrovirico que genera el RNA vírico con una secuencia R en cada extremo, por consiguiente en el proceso de la transcripción inversa se sintetiza una región U3 y una U5 adicionalmente.

RNA vírico está encerrado en las partículas y este se introduce en la célula nueva durante la infección. El RNA vírico es dentro de la

partícula junto con una molécula de tRNA celular que sirve como cebador para la síntesis de la primera cadena de cDNA. Este tRna se aparea con una secuencia específica cerca de la región U5 conocida como sitio de unión al cebador (PBS).

Para la formación de cDNA se tiene dos actividades enzimática la primera es una actividad de la DNA polimerasa y la otra es de RNAsa H. Las enzimas RNAsa H degradan el RNA apareado con el DNA (elimina las cadenas de RNA de plantilla). Cuando se genera este paso en el primer intermediario hibrido de RNA-DNA la cadena de DNA de U5-R se libera en la forma monocatenaria, esta cadena puede aparearse con la región R en el otro extremo de la molécula de RNA vírico (1 paso de cambio de cadenas), una vez producido este paso la transcriptasa inversa continua la síntesis de DNA para copiar el resto de la plantilla de RNA la cadena de DNA resultante termina con la secuencia PBS en su extremo 3’ y la cadena de RNA se elimina (por RNAsa H), esta genera un fragmento de RNA que sirve como cebador para la síntesis de la segunda cadena de cDNA, esta regio de RNA permanece apareada con una secuencia llamada segmento polipurinico, en el borde de la secuencia U3, el alargamiento de este cebador copia en el DNA la secuencias U3,R,U5 y PBS. Una vez el cebador de tRNA se elimina de la primera cadena de cDNA, se produce el segundo cambio de cadenas. La secuencia complementaria del PBS en los extremos 3’ permite las interacciones de apareamiento entre las dos cadenas de DNA y la formación de un intermedio circular. El alargamiento de cada uno de los extremos de ADN 3’ que hay en este intermediario hasta el final de la otra cadena genera el cDNA bicentenario con dos secuencias de LRT completas, ahora esta molécula de DNA esta lista para ser integrada al genoma de la célula.

6. En qué consiste el mecanismo de empalme inverso y en qué tipo de transposones se presenta.

El mecanismo de empalme inverso se presenta en los retrotransposones de poli-A y retrotransposones similares a virus, consiste en que una RNA polimerasa celular inicia la transcripción de una secuencia LINE, el RNA mensajero resultante se traduce para generar los productos de los ORF codificados que luego se unen al extremo 3´ de su mRNA. Después el complejo mRNA- proteína se une a un sitio con abundante timina en el DNA diana, las proteínas inicias escisión en el DNA diana, con lo que dejan un OH3´del DNA y forman un hibrido RNA-DNA. El extremo OH3´del DNA diana sirve como cebador para la transcripción inversa del RNA del elemento para producir cDNA. Los pasos finales de la reacción de transposición comprenden la síntesis de la segunda cadena, el resellado y la reparación del DNA para crear un elemento LINE de inserción nueva.

7. Realice un cuadro comparativo de los tipos principales de elementos transponibles

TIPO CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES

MECANISMO DE MOVIMIENTO

Transposición mediada por DNA

Transposones replicativos bacterianos (Tr3, fago MU)

Repeticiones invertidas terminales que flaquean los genes de resistencia a los antibióticos y de la transposasa

Copiado de DNA del elemento que acompaña cada ronda de inserción en el sitio diana nuevo

Transposones de corte y pegado bicaterianos (Tn5,Tn10,Tn7)

Repeticiones invertidas terminales que flaquean los genes de resistencia

Extirpación del DNA del sitio diana antiguo e inserción en un sitio nuevo

a los antibióticos y la transposasa

Transposones eucariontes (Elementos P, Elementos de la familia hAT)

Repeticiones invertidas que flaquean la región codificadora con intrones

Extirpacion del DNA del sitio diana antiguo e inserción en un sitio nuevo

Transposicion mediada por RNA

Retrotransposones similares a virus (Elementos Ty, Elementos Copia)

Repeticiones directas terminales de ˜250 a 600pb (LRT) que flaquean genes para la transcriptasa inversa, la integrasa y la proteína Gag semejante a la retrovírica.

Transcripcion en RNA desde el promotor en la LRT izquierda por la RNA polimerasa II seguida de la transcripción inversa y la inserción en el sitio diana

Retrotransposones de poli-A (Elementos F y G, Elementos LINE Y SINE)

Secuencia 3’ con abundante A-T y UTR 5’ flaquean genes codificantes de una proteína de unión al RNA y de la transcriptasa inversa

Transcripcion en RNA desde el promotor interno; la transcripcon inversa cebada por la diana es iniciada por el corte con endonucleasa

8. Como es el mecanismo de acción del Transposon bacteriano Tn10 y como se regula la expresión del gen de la transposasa y qué relación tiene con la duplicación celular

El mecanismo de acción del Transposon bacteriano Tn10 es un elemento compacto de 9kb y codifica un gen para su propia transposasa y genes que le permiten resistencia contra el antibiótico tetraciclina. El Tn1o se transpone por medio del mecanismo de corte

y pegado y utiliza la estrategia de la horquilla de DNA para cortar las cadenas no transferidas. La secuencia Tn10 también tiene un sitio para la unión IHF. El IHF contribuye con el armado del complejo transposómico, adecuado necesariamente para la recombinación.

La expresión del gen de la transposasa se regula mediante: El RNA anti-sentido es uno de los mecanismos por el cual Tn10 controla la expresión del gen de la transposasa. Cerca de la extremo IS10R hay dos promotores que dirigen la síntesis de la RNA por la RNA polimerasa de la célula huésped. El promotor que dirige la síntesis de RNA hacia adentro tiene a su cargo la expresión del gen de la transposasa. El promotor que dirige transcripción hacia afuera, en cambio, sirve para regular la expresión de la transposasa mediante la generación de un RNA anti sentido de la siguiente manera: los RNA sintetizados desde PIN y Pout se superponen y en consecuencia, pueden aparearse mediante enlaces de hidrogeno. Este apareamiento impide la unión de los ribosomas al transcrito de PIN y, por ende, la síntesis de la proteína transposasa.

Esto tiene relación con la duplicación celular porque las células que portan más copias de Tn10 transcribirán más RNA anti sentido, que as u vez limitara la expresión del gen de la transposasa. En consecuencia, la frecuencia de transposición será muy baja .En cambio, Si en la célula hay una sola copia de Tn10, la concentración de RNA anti sentido será baja, la síntesis de la proteína transposasa será eficaz y la transposición se producirá con una frecuencia mayor.

9. Como se da la regulación de la transposición por el fago MU.

Este fago es un como un transposón y su transposición es replicativa. Este se transpone de forma masiva antes de lisar.

El fago Mu transduce los genes adyacentes: al empaquetarse se lleva 2 kb adicionales

10. Cuál es la consecuencia de la falta de regulación de los transposones tipo Tc1/Mariner

La falta de regulación de los transposones tipo Tc1/Mariner, causan la inactivación de genes un ejemplo de este es el transposón bella durmiente es un derivado de la superfamilia de transposones de ADN Tc1/mariner prevalentes entre los dos genomas de vertebrados e invertebrados. Sin embargo, transposones de ADN endógenas de esta familia son completamente inactivos en los genomas de vertebrados. Un transposón Tc1/mariner activa, sintetizado a partir de la alineación de transposones inactivos de la subfamilia de

salmónidos de elementos, se "despierta" para formar el transposón llamado La Bella Durmiente. SB, al igual que otros transposones de ADN, se moviliza a través de un mecanismo de cortar y pegar mediante el cual una enzima transposasa, codificada por el propio transposón, los impuestos especiales y re-integra el transposón en otros sitios dentro del genoma. La proteína SB aminoácido 340 repeticiones terminales invertidas reconoce que flanquean el transposón; se une a estas secuencias y cataliza la escisión del transposón. SB se integra en sitios aleatorios en el genoma, aunque algunos estudios reportan muy leves preferencias para las unidades transcripcionales. También hay una simple exigencia de un TA-dinucleótido en el sitio diana, como todos los transposones Tc1/mariner.