CONTROLES DE CALIDAD Taller 3 Coordina: Andres C. García ‐ Rosa Pinto (Banco Nacional de ADN, Salamanca) María Almeida Parra (Banco Nacional de ADN, Salamanca) María Pérez Caro (Banco Nacional de ADN, Salamanca) Raquel Paternain (Fundación para la Investigación Médica Aplicada, Navarra)
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CONTROLES DE CALIDAD Taller 3
Coordina: Andres C. García ‐ Rosa Pinto (Banco Nacional de ADN, Salamanca)María Almeida Parra (Banco Nacional de ADN, Salamanca)María Pérez Caro (Banco Nacional de ADN, Salamanca)Raquel Paternain (Fundación para la Investigación Médica Aplicada, Navarra)
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidosnucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
Dra. María Pérez Caro. Área de Control de CalidadBanco Nacional de ADN Carlos III‐ Universidad de Salamanca
12 de Noviembre de 2014
Cuando tratamos el control de calidad tenemos que distinguir entre:
PUREZA: ausencia de contaminantes
INTEGRIDAD: banda única de gran tamaño (DNA) /relación 28S:18S 2:1 (RNA)
FUNCIONALIDAD: que la solución sea apta para realizar los ensayos que se propongan.
CONCENTRACIÓN
• El término calidad engloba concentración, pureza e integridad.
• En el DNA y RNA el análisis de la calidad, tradicionalmente, comprende electroforesis y análisis del ratio 260/280
• En el RNA concretamente, se determina la calidad del rRNA (>80% ribosómico y 1‐3% mRNA)
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‐D.O A260/230 ~2,0
< 1.5 (contaminación sales, comp. orgánicos)
PUREZA ÓPTIMA
‐CONCENTRACIÓN Y PUREZA: RELACIÓN ABSORBANCIAS
PUREZA ÓPTIMA‐D.O A260/280 2.0‐2.1
1.8 Pureza aceptable
< 1.8 Contaminación comp. aromáticos
‐INTEGRIDAD DNA RNA
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‐FUNCIONALIDAD
5 parejas de oligonucleótidos (primers) simultáneamente
amplificación en 6 cromosomas diferentes
amplicones entre 17.5 kb y 2.0 kb
Long PCR Múltiple: DNA
M
RT‐PCR oligos inter‐exónicos: RNA
Agilent 2100 bioanalyzer combina técnicas de electroforesis capilar y fluorescencia.
•Evalúa calidad e integridad.•Requiere de muy poca cantidad de muestra.•Da valores numéricos a las imágenes que se ven habitualmente‐RIN (RNA Integrity Number)
RIN < 4 RNA baja calidad
RIN > 7 RNA alta calidad (arrays)
RIN 4‐7 RNA calidad media (qRT‐PCR)
Técnicas de microfluídos
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•Uso de geles multi‐línea y microfluidos que permiten un ensayo semi‐automático. •Simplifica el manejo de muestras y reduciendo los tiempos de ensayo.
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Tapestation‐Agilent
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TÉCNICAS DE MICROFLUÍDOSControl de calidad del RNA
OBJETIVO:Comprobar fiabilidad y repetitividad: RIN y concentración
• 5 muestras RNA (diluciones)• extraídas por métodos diferentes• analizadas por duplicado• y en días distintos
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El análisis de las medidas de concentraciónaportada por bioanalizador y tapestation de• lasmismas muestras,• por duplicado• y en días distintos,determinó la baja reproducibilidad entre ambastécnicas, resultando ser la medida más estable laaportada por el nanodrop.
DIA 1 DIA 2Tape 1 Tape 2 Tape 1 Tape 2 Agilent Agilent
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CONCLUSIONES:
Resultados obtenidos en el BNADN muestran cómo las mismas muestras de RNA analizadas en días diferentes, en ambas plataformas, NO reproducen la concentración entre réplicas (a pesar del que cumplen con las especificaciones del aparato)…
… pero SÍ reproduce los valores de RIN/ RINe en el RNA, siendo la diferencia entre ambos ~1
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TÉCNICAS DE MICROFLUÍDOSControl de calidad del DNA
TAPESTAT
ION‐AGILEN
T
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