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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

CORRELACION BIQECOLOGICA ENTRE WEMATODOS TRANSMISORES DE VIRUS(Xlphinema spp.)Y EL VIRUS DE lA DEGENERACION INFECCIOSA” DE LA VID -

ENTRENUDO CORTO - (GFLV)

1Memoria que presentaJesusFRESNOPEREZ

para optar al gradode Doctor en CienciasBiologicasEnero 1992

Directora: Dra. Dña. Maria ARIAS DELGADOPonente: Prof Dr. 13. Benjamín FERNANDEZ RUIZ

Facultad de CienciasBiológicas. Universidad ComplutenseMadrid

~RCMIVO

TESIS DOCTORAL

CORRELACION BIQECOLOGICAENTRE NEMATODOS TRANSMISORES DEVIRUS<Xivhinemna_spp.)Y EL VIRUS DE LA “DEGENERACION INFECCIOSA”

DE LA VID - ENTRENUDO CORTO - (GFLy>

Jesus FRESNOPEREZ

Enero 1992

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDEMADRID

RESUMEN

CORRELACION BIQECOLOGICA ENTRE NEMATODOS TRANSMISORES DE VIRUS(Xiohinema spp.) Y EL VIRUS DE LA DEGENERACION INFECCIOSA”

DE LA Vil) - ENTRENUDO CORTO - (GFL’i’)

JesusFRESNOPEREZ

La memoria que lleva por título CORRELACION BIOECOLOGICA ENTRE

NEMATODOS TRANSMISORES DE VIRUS (Xlvhinema spp.) Y EL VIRUS DE LA

DEGENERACION INFECCIOSA” DE LA VID - ENTRENUDO CORTO - (GFLV), que

presenta Jesús FRESNO PEREA para optar al grado de DOCTOR en Ciencias

Biológicas,ha sido realizadaen el Departamentode Agroecologíadel Centrode Ciencias

Medioambientales(CSIC), bajo la dirección de la Dra. Dha. Maria ARIAS DELGADO

con la supervisióndel ponenteProf. Dr. D. BenjamínFERNANDEZRUIZ, Profesordel

Departamentode Zoología de la UniversidadComplutensede Madrid.

Madrid, Enerodc 1992

7 /1

>71.

¡¡

¿(ovÁ .lesusFRESNO PEREZ

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Dra. Dha. Maria ARIAS DELGADO

Prof. Dr. D. BenjamínFERNANDEZ RUIZ

RESUMEN

VII

Se pretendecontribuir con este trabajo al conocimientode la incidenciadel virus de ladegeneraciónde la vid y de sus nematodosvectoresen los viñedosespañoles,así comosu correlación con la sintomatologíaque producen y la influencia de los factoresambientalesen el desarrollode los patógenos.

Se realiza en primer lugar una recopilaciónde los estudiosa nivel mundial sobre lavirosis en el viñedo, centrándoseen aquellos referentesa la degeneracióninfecciosa”de la vid; de igual modo se revisan los trabajos existentessobre la incidencia eimportancia de los nematodos fitoparásitos en el viñedo, con especial énfasis en lasespeciestransmisorasde virus. En el capítulo de material y métodos,tras la indicaciónde los planteamientospara la realización de las muestras,se hace una descripcióndetallada de la zona de estudioy de las fincas experimentalesdondese llevó a caboeltrabajo. A continuaciónse expone la metodología utilizada en la deteccióndel virus,estudio de la nematofauna,caracterizaciónen el estudio de los parámetrosedáficos.tratamientoestadísticoy cartografiadoautomáticode los datos.

Los resultadosobtenidos indican que la incidencia del virus alcanzael 12 5+ y que lacoincidenciadel virus con los nematodosvectoreses variable,puedeir de próxima al 1(30

a prácticamentenula dependiendode las zonas. Se indica la importancia de losfactores medioambientales,especialmenteel contenido de agua en el suelo, en eldesarrollode estosnematodosy por lo tanto la importanciade realizar los muestreosenlos distintos horizontesdel suelo y en épocas del año adecuadas,dada la distribuciónaleatoria y contagiosade estos organismos.Se resalta, asimismo, la baja correlaciónentre la sintomatología que muestran algunas plantas y la presencia de virusindicándoseque,en muchos caso.se debe a la acción de otros nematodosfitoparasitosó, incluso, algunos focos de filoxera, condiciones ambientales o a característicasfisiológicas de la planta, observándoseque dicha sintomatologíamuestra una relaciónmás clara con la presenciadel virus en unas variedadesque en otras.

Por último, se destacala necesidadde teneren cuenta la presenciade ambos patógenos,puesto que aún en el casode que la infección se haya producido a través del injerto,la existencia de un solo nematodotransmisor de virus garantiza la persistenciadc lainfección; así como ¡a importancia de abordar estos problemas desde una órbitamultidisciplinar profundizandoen el conocimientotanto de la morfología y fisiología dela planta como en las característicasagroecológicasde los patógenosimplicados y de laespecificidadde transmisióna fin de conseguirun control de la enfermedadque seaecológicamentecompatible.

INDICE

lx

PáR

.

RESUMEN VI

INTRODUCCION 1

PLAN DE TRABAJO 4

1. ANTECEDENTES 10

1.1 Enfermedadesvíricas de la vid 121.1.1. Nepovirus 131.1.2. Virus de la degeneracioninfecciosa o del entrenudocorlo

de la vid (GFLV) 161.1.2.1. Caracteristicasgenerales 19¡.1.2.2. Acidos nucléicos 191.1.2.3. Uliraestructura 22¡.1.2.4. Mecanismosde transmisión 231.1.2.5. Técnicasde diagnósticodel GFLV 24

1.2. Nemalodosasociadosa la vid 271.2.1. Nematodosectoparasitosy transmisoresde virus 28

1.2.1.1. Sistematicay taxonomiade la familia Longidoridae 281.2.1.2. Característicasmorfológicas 29

1.2.2. Nematodosde la familia Longidoridaeasociadosal viñedo 34¡.2.2.1. Xiphinema index 371.2.2.2. X jtahiae 41)¡.2.2.3. Otras especiesde nematodosde la familia Longidoridae 42

1.3. Relacion virus-vector 45

1.4. Metodología parael estudiode la transmisión 47

1.5. Estadoactualde los estudiossobreGFLV y los nematodosasociadosa la vid en España 48

1.5.1. Virus de la degeneracioninfecciosade la vid 481.5.2. Nematodosde la vid 49

x

Pa2

.

II.MATERIAL Y METODOS 52

11.1. Planificación de muestreos 53

11.2. Descripción de las zonasde estudio 5411.2.1.Zonas vitícolas. La Mancha 5711.2.2. Fincas Experimentales 65

11.2.2,1. Finca Experimental“La Higueruela” 6511.2.2.2.Finca de La EscuelaMuseo de la Vid y el Vino

de Madrid 67

11.3. Muestreosrealizados 6711.3.1. Muestreosprevios 6911.3.2. Muestreoen la región de La Mancha 7011.3.3.Muestreosen Fincas Experimentales 71

¡1.4. Recogiday preparaciónde muestras 7611.4.1. Muestrasde suelo 7611.4.2.Muestrasde material vegetal 79

11.5. Metodos de extracciony estudiode nematodosdel suelo 7911.5.1. Preparacionde muestrasde suelo 8<)11.5.2. Método de sedimentación-decantación 8111.5.3. Método decentrifugación 8211.5.4. Métodos de estudio cuantitativo y cualitativo de

los nematodos 8411.5.4.1. Recuento,aislamiento,fijacion y montaje 8511.5.4,2. Conservacióndel extracto de la muestra 8711.5.4.3.Observacionesmicroscopicas 87

11.6. Técnicaspara el estudiodel material vegetal 89

11.7. Técnicaspara la deteccióndel virus 8911.7.1.Transmisión mecánicaa planta herbácea 8911.7.2. Tincién negativa(MicroscopiaElectrónica) 9011.7.3. Inmunoelectromicroscopía 91

11.7.3.1. ISEM (InmunosorbentElectromicroscopy) 9211.7.3.2.AVM (Antiserum Virus Mixture) 9311.7.3.3. Decoración 9411.7.3.4.Tamponesy colorantesnecesarios 95

11.7.4. Seccionesultrafinas 9611.7.5.Métodos serológicos 97

XI

11.7.5.1.ELISA-DAS 9811.7.5.2. Sistemasde amplificación de ELISA 101

11.7.6.Hibridacionesde ácidosnucléicos,sondasradioactivasy colorimétricas 102

11.8. Metodología para el estudio de los virus en el interior delos nematodos 103

11.8.1.Metodología para la deteccióndel virus en el nematodoporMicroscopiaElectrónica 103

11.8.2.Preparaciónde nematodospara la deteccióndel virus en suinteréspor ELISA e ISEM 105

11.8.3. Metodologíapra detectarel virus en el nematodopor la reacciónen cadenade la polimerasa(“PolimerasaChain Reaction’) (PCR) 108

11.9. Metodología para el estudio de la transmisión por vectores 108

11.10. Métodos para el estudio de las característicasedáficas 112

11.11. Métodos estadísticospara el tratamiento y cartografiadoautomático 113

11]. RESULTADOS 114

111.2, Muestreoprevio 115

111.2. Detección del virus de ¡a degeneracióninfecciosa 127111.2.1. Comprobaciónde la fiabilidad del método 128111.2.2. Comparaciónde tamponesde extracción 131111.2.3.Variación del pH en función del tampón utilizado 136111.2.4.Ensayosde comprobaciónentre distintas partesy estados

de la planta frente a diferentestampones 141111.2.5.Sensibilidaddel test ELISA para distintas concentraciones

de la muestra 144

111.3. Variación de la concentración del virus 155

111.4. Correlación entresintomatologíay virosis 180111.4.1.Correlación sintomatología-virosis en distintas variedades 180111.4.2. Correlación sintomatología-virosisen Garnacha 181111.4.3. Correlaciónsintomatología-virosisen focos de La Mancha 191

211.5. Incidencia del GFLV en La Mancha 197

111.6. Incidencia virus-nematodosvectores 198

XII

PaR

.

111.7. Estudios ultraestructuralesde plantasindicadorasy de X.index 207

111.8. Transmisióndel virus de la degeneracióninfecciosapor Kindex

.

Detección del virus en el nematodovector y en planta herbácea 215

y. DISCUSION 222

IV.1. Incidenciay deteccióndel virus de la degeneracioninfecciosa 223

IV.2. Incidencia de nematodosfitoparásitos y transmisoresde virus 231

IV.3. Correlaciónbioecológicaentre virus y nematodovector 237

V. CONCLUSIONES 240

VI. BIBLIOGRAFíA 245

VII. AiPENDI CES

VIII. Relacciónde muestreos.

VII.2. Tablas y matricesde resultados.

INTRODUCCION

2

La prácticadel cultivo de la vid surge en Asia, desdedonde pasaa Egipto, de allí al

resto de la cuencamediterránea(Grecia y Las Galias) y con el Imperio Romanose

propagó por el Continente Europeo. La vid es ci frutal más conocido en el mundo,

puedecultivarse desdelas regionestempladasa las tropicales,pero la mayor partede

los viñedosse encuentranen las zonastempladas,donde ocupanuna superificie de 10

millones de ha, distribuidasa lo largo de los paralelos4042, en dos franjas que incluyen

la cuenca mediterránea,fuera de las cuales destacanlos cultivos de los países del

hemisferiosur - Sudafrica,Chile y Argentina -. Sin embargo,la mayor concentracióndel

viñedo se encuentraen Europa: Albania, España,Francia, Grecia, Italia, Portugal y

Yugoslavia.

De igual manera,las enfermedadesde la vid se conocendesdeantiguo,así en la mitad

del siglo XIX el mildio se extendió desdeel oeste de Europa a todo el Continente

causandopérdidasde hastaun 80%en la producción,de modoparecidoa lo que ocurrió

con la filoxera y, una vez controladasestas epidemias, al introducir en los viñedos

patrones resistentes, se han desarrollado nuevas enfermedades, entre ellas “la

degeneración infecciosa”, que es tan antigua como el cultivo de la vid, su hospedador

principal, que también parece tener su origen en el Oriente Medio y de cuya

sintomatologíaya se teníanreferenciasen 1800 segúnVUITTENEZ (1970), pero que

basta los años 30 no se comprobó que se transmitíapor injerto y era una enfermedad

de origen edáfico (HEWITT, 1956) y es en los años50 cuandose supoque era causada

por un virus y su vector un nematododel suelo (HEWITT al 1958).

3

Actualmente se consideraque dicha enfermedades la que causamayorespérdidasen

el viñedo en todo el mundo por decaimientoprogresivo de las vides, reducción del

contenidode clorofila de las hojas, pérdidasde produccióny calidad,etc. (Bovey, 1973).

Por el momento, no existen métodosde control del virus, aunqueen los últimos años

los métodosde diagnósticohan sido de una gran ayuda para la selecciónde material

de propagaciónvegetativa libre de virus, y dentrode ellos ha sido, sin duda, la técnica

ELISA la que en mayor grado ha contribuido al reconocimientode los niveles de

infección en los estudiosepidemiológicosy en el mejor conocimientode la relación virus-

vector. Por otro lado, conocido el papel como vectores del virus de los nematodos

Xiphinema index y X. italine -, los estudiosde ecologíade la transmisión y la relación

virus-vector son de gran interésen las investigacionessobre la patologíade la vid, a fin

de dar pautas para la correcta solución de los procesostradicionalesde arranquey

replante dirigidas al control de la degeneracióninfecciosa”.

Respectoa la producción vitivinicola mundial, Españaestá clasificadaen tercer lugar,

tras Franciae Italia, el viñedo es uno de sus cultivos más tradicionales siendode gran

importancia para la economíaespañola,ocupa el tercer lugar en extensión,despuésdel

trigo y del olivo. Según el Anuario Estadísticode la ProducciónAgraria (1988)el viñedo

ocupa1.513.810ha, que representanel 7% de las tierras cultivadas.Además,hay que

destacarel valor social y económicode estecultivo, si se tiene en cuenta que la mayor

densidadde población dentrode algunasComunidadesAutónomícasse encuentraen las

zonasvitícolas y su explotaciónresultarentableen comarcasy zonasmarginales,donde

no lo son otros cultivos, debido al terreno pobre y al clima seco, como son las tierras

albarizasde Jeréz y las calizasdel miocenomanchego.

4

El virus de la degeneracioninfecciosade la vid (GFLV) fué identificado en Españaen

los años 70 (PEÑA-IGLESIAS y AYUSO, 1971) al igual que sus nematodosvectores,

Xlphinema index y X italiae ( ARIAS y NAVACERRADA, 1973); por aquellos años se

creó el DepartamentoRegional y Coordinadorde Viticultura y Enología del INIA a fin

de realizar una selecciónsanitaria de la vid, que durantemuchos años se ha venido

realizandoa base de diagnósticovisual (determinaciónde síntomas),por transmisión

a indicadores leñosos (Vitis rupestris) y herbáceos (Chenopodium quinoa, Ch.

amaranticolor, Ch. murale, etc), técnicasserológicasde floculación y/o precipitación,

determinación de virus por microscopia electrónica y sólo recientemente métodos

serológicose inmunoenzimáticos(ELISA>.

Todo ello nos ha llevado al estudiode la epidemiología del virus en relación con sus

nematodosvectores,en nuestrosviñedos,dentro de un contextobioecolégico.A tal fin

hemos centradoel trabajo en La Mancha,dado que por su extensión(717.295ha) esta

zona representala mayor concentraciónde dicho cultivo en el mundo, el 8% de la

superficie vitícola mundial y el 11,4%de Europa y el 5% de la nacional,por otro lado,

debido a sus característicasgeográficasy climáticas, que retrasaronen su día el avance

de la filoxera, y por constituir un buen marco de referencia para el estudio

epidemiológico de las enfermedadesde las plantas de origen edáfico y su control

ambiental(BELLO al 1990).

PLAN DE TRABAJO

6

Las referenciasbibliográficas y la experienciade nuestroslaboratorios de diagnóstico

han conducidoa la idea de la presenciageneralizadadel virus cte la degeneración

infecciosaen los viñedos españoles.Ademásde los datos recogidosen los antecedentes

sobrela presenciaen determinadasregionescomoJerez, La Rioja, Montilla, etc., existe

evidenciade dicha sintomatologíaen todas las zonasvitícolasdebidaa la información de

los técnicos agrarios y agentesdel SEA. De acuerdocon estos trabajos, generalmente

visuales, se tiene la creencia en nuestro pais de que prácticamente el lOO % de las

plantas de vid son portadoras y manifiestan en mayor o menor grado los efectos del

virus, a tal extremode que PENA-IGLESIAS (1972)en las 11 JornadasTécnicasde Vid

y vino en Rioja (Haro - Logroño) manifestabaque ‘... siendo los virus transmisiblespor

injerto y siendoesteprocedimientousualde reproducciónde la vid, es lógico pensarque

será difícil encontrarcepasde variedadescomercialesque esténexentaso libres de los

virus que con mayor incidenciaeconómica y extensiónafectaneste cultivo’.

En algunos casosse ha comprobadola correlaciónde los síntomascon la presenciade

virus, como es el caso de viñedos de Cebolla (Toledo) donde las alteracionesque se

veníandetectandodesdelos años70 por PEÑA y ALFARO, presumiblementecausadas

por virus, fueron confirmadasmediantela realizaciónde test de diagnósticoen nuestros

laboratoriosdel INIA, peroen otrasocasionesla sintomatologíase debe a características

varietaleso es la manifestaciónde alteracionesfisiológicas debidasa causasdiferentes

a los virus, y que pueden inducir a error, máxime cuandolos dianósticosvisuales se

realizan en distintas zonasy variedadesy por técnicosdiferentes.

7

La cuestión es si, de estar tan extendidala virosis, la mayor parte de nuestrosviñedos

deberíanser improductivos, y la infección se habría producido a través del material

vegetal, injertos o patrones,siendo de menor importanciael papel del nematodovector

en su dispersión,aunquesi en la persistencia.Por otro lado la selecciónsanitaria, que

se venía realizandoen base a esta sintomatología de visu, da lugar a la posible

eliminación de genotipos de interés agronónico, al confundir síntomas virales con

característicasvarietales.

Debido a estos problemas,al iniciar el estudio,se realizaronuna seriede contactoscon

agentesdel SEA y técnicosen viticultura de los principalescentrosnacionales,a fin de

conocer la situación en cada comarca; la mayor parte de ellos considerabanmuy

extendidaslas virosis, con la casi única excepciónde .1. PROVEDO del departamento

de Viticultura y Enología de la consejeríade Agricultura y Alimentación del gobierno

de La Rioja, quien manifestó que: “... a pesar de la opinión generalizadade que el

viñedo estabaafectadopor virosis en un porcentajealto, la producciónera aceptable,

no acusándosela disminuciónpropia de la enfermedad’.

De acuerdocon los objetivos y planteamientosexpuestos,se realizó en primer Jugaruna

síntesisde las enfermedadesvíricas de la vid, con especialénfasisen las producidaspor

Nepovirus, para centrarnosa continuación en la revisión de los estudiosexistentes

sobre el virus de la degeneracióninfecciosa (GFLV), sus característicasgenerales,

morfología, mecanismos de transmisión y técnicas de diagnóstico utilizadas en su

detección.

8

A continuaciónse lleva a cabo, igualmenteuna revisión de los nematodosasociadosa

Ja vid, cenirándonos en los ectoparásitos y transmisores de virus de la familia

Longidoridae. Se detalla su posiciónsistemática,taxonomíay caracteresmorfológicos

de la familia, y asimismo se descubrencon detalle la morfología y biología de X. mdcx

y 3<. italiae que son los nematodosmás importantescomo transmisoresde GFLV en

Europa. Se pasaa revisar las relacionesvirus-vector, la metodologíaempleadaen el

estudiode la transmisión,para terminar el capítulode antecedentescon el análisis del

estadoactual en Españade los estudiossobre el virus causantede la degeneración

infecciosa,como de los nematodosque los transmiten.

En el siguiente capítulo se describela metodologíaempleadaen la planificación de los

muestreos, se dá una descripción detallada de las zonas de estudio y fincas

experimentalesen que se llevó a efecto el trabajo. Asimismo se detallanlos muestreos

realizados,la metodologíaseguidaen la toma de muestras,preparaciónde las mismas,

métodos de extracción y estudio de los nematodos,las técnicas utilizadas para la

detección dcl virus en material vegetal por transmisión mecánica, estudios

ulíraestructuraleso inmunológicas(ELISA), los métodospara el estudiodel virus en el

interior del nematodoy, en fin, los seguidospara el estudio de las característicasdel

medio y en el tratamientoestadísticoy cartografiadoautomáticode los datos.

En el capitulo de resultadosse exponenen primer lugar los obtenidosen los muestreos

previos, para entrar a continuaciónen la problemáticarelacionadacon la deteccióndel

virus de la degeneracióninfecciosa, los resultadosobtenidosen la comprobacióndel

método de extracciónmás correctoy su grado de sensibilidad.Los ensayosrealizados

para el diagnósticodel virus y el estudiode la concentracióndel mismoen las distintas

partesde la planta y su variación a ¡o largo del año.Asimismo se estudiala correlación

9

existente entre la sintomatología observaday la presencia del virus en distintas

variedadesen campos de experimentacióny en distintos focos de los viñedos de La

Mancha,pasandoa continuacióna los resultadosobtenidossobre la incidencia real del

virus en La Mancha, la zonamás profundamenteestudiada,y a la comprobaciónde la

incidencia virosis-nematodos.Los dos últimos apartados del capítulo tratan de los

resultadosobtenidosen los estudiosultraestructuralesdel virus que hansido realizados

bien en planta herbáceaindicadora,bien en el interior de sus nematodosvectores,y se

termina con la realizaciónde los postuladospreestablecidosy con la deteccióndel virus

en planta herbáceaindicadora y en el nematodovector.

En la discusiónse distinguen tres apartadosprincipales,el primero de los cualestrata

de la incidencia y detección del virus, pasandoa continuacióna discutir la incidencia

nematodos fitoparásitos y transmisores de virus en el viñedo, sus exigencias

ambientales~para terminar con la incidencia virus-vector.A continuaciónse destacanlas

conclusionesprincipales,para terminar con una extensabibliografía donde se recogen

las refencias más importantessobreel tema. Se ilustra el trabajo con esquemasde la

metodologíaseguiday de la morfologíade los patógenosasí como una gamacompletade

fotografías de sintomatologíay ultaestructuras.

1. ANTECEDENTES

11

En este capítulo se hace, en primer lugar, una revisión de las virosis que vienen

afectandoa las zonas vitícolas del mundo, indicándose brevemente las principales

característicasde cada virus, su importanciaeconómicay mecanismosde transmision.

A continuaciónse hace una someradescripción de los Nepovirus asociadosal viñedo,

para centrarnosen el virus de la degeneracióninfecciosao entrenudocorto haciendouna

descripcióncompl,eta de sus característicasmorfológicas y serológicasasí como de la

sintomatologíaque provoca y las alteracionesultraestructuralesque provocanen las

plantas infectadas.

Del mismo modo, se revisan los nematodosasociadosa dicho cultivo, su importancia

económica y distribución mundial con especial atención a los ectoparásitos y

transmisoresde virus de la familia Longidoridae,indicándosesu taxonomía,caracteres

morfológicos mas importantes para su determinación,sus característicasbiológicas,

distribución mundial y asociación con virosis; para centrarnos directamenteen las

especiesque afectanal viñedo, Xiphinema index y )C italiae del que se hace una

descripcióncompleta.

Finalmente,se hace una puesta a punto de los conocimientos existentes sobre la

especificidadde transmisión,la metodologíautilizadapara comprobardichatransmisión

y, por títimo, el estadoactualde las investigacionessobreestetema en España.

12

1.1. ENFERMEDADES VIRICAS DE LA VID

.

Las virosis de la vid son enfermedadesque puedenpropagarsemecánicamentea través

del material vegetal (por cortes o injertos), por inoculación de savia de una planta

enfermaa otra sanao por medio de vectores,que puedenser invertebrados(insectoso

nematodos)u hongos edáficos,también pueden transmitirse a través del pólen y la

semilla infectada. Las primeras referencia sobre síntomas de virosis en vid ya se

encuentrana finales del siglo XIX y principio del XX, pero no es hasta los años30.40

cuandoaparecenlos primeros trabajossobre virus en viñedo. Hasta 1950 se consideró

que toda la sintomatologíaobservadaen vid, no debida a alguno de los patógenos

conocidos,estabamotivadapor un solo virus (BRANAS, 1948). A partir de estafechase

realizantrabajoscomo los de HEWITT (1950) que describenel virus de la degeneración

de la vid o “fanleaf’ (GFLV) o el de DíAS y HARRISON (1963) que consiguenaislarlo.

De gran repercusiónfijé el descubrimientopor HEWITT ~ (1958) de la transmisión

del GFLV por un nematododel suelo Xiphinema mdcx, puesto que a partir de este

momentosurgen numerosostrabajossobre sintomatología,aislamiento,descripcrnnes,

mecanismosde transmisión, importancia económica,etc. PADiLLA (1989) hace una

revisión de todos estos artículos,en la que recoge más de 450 trabajos referentesal

tema.En los años60 se atribuían las enfermedadesvíricas de la vid a 7 virus diferentes

(HEWITT, 1968), en la actualidadhan sido aisladosmás de 20. De ¡os 34 grupos de

virus vegetales aprobados por el Comité Internacional de Taxonomía de Virus

(MATTHEWS, 1991), cuatro afectan a la vid, dos de ellos de origen edáfico (los

Nepovirustransmitidospor nematodosy los Necroviruscuyos vectoresson hongosdel

suelo),otro grupo del virus del mosaicode la alfalfa, “Alfalfr Mosaic Virus Group”. se

13

transmite mediante pulgones y el Último, los Closterovirus, cuyo mecanismo de

transmisiónes poco conocidopor el momentoaunquese ha demostradoque algunos se

transmiten por cochinillas de la familia PseudococcidaeGUGERLI ~L.4(1990> y

MURANT et al. (iii: MATHEWS, 1991).

De todos ellos, los que causan enfermedadesmás importantes en la vid son los

nepovirus: entrenudocorto infecciosode la vid (“FanleafGrape Virus” (GFLV); manchas

en anillo del tomate”TomatoRingspot Virus” (TRSV); virus de la manchaen anillo del

tabaco“TobaccoRingspotVirus” (TobRV) y virus del mosaicoen rosetadel melocotonero

“Peach Rossetta Mosaic Virus” (PRMV), así como el “enrrollado” ‘Leafrolí”; madera

acorchada‘Corkey bark” y ahoyado del tallo de la vid “Rupestris Stem Pitting”,

enfermedadesde sintomatologíavírica en las que no se ha comprobadoel agentecausal,

aunquese han encontradofrecuentementeasociadasa la presenciade closterovirus.Los

restantescausanenfermedadesde menor importancia o son de interés local, estando

restringidosa determinadasáreas(GOHEEN, 1988>.

1.1.1.NEPOVIRUS.-Son virus de partículaspoliédricasde unos30 nm de diámetroque

se transmitenpor nematodos;los siguientesse han aisladode vid:

- Virus del mosaico del Arabis ‘Arabis Mosaic Virus” (AMV), se transmite por 3<.

diversicaudatum.Estárelacionadoserológicamentey produce unasintomatologíasimilar

a la del entrenudocorto con el que puedehallarseen infeccionesmixtas. Se encuentra

dispersoen Europay tambiénse ha citadoen Japón.

- Virus latente búlgaro de la vid “Grapevine Bulgarian Latent Virus” (GBLV),

MARTELLI et al. (1977), de Bulgaria, también citado en Nueva York, su nematodo

vector es 3<. americanums.l.

14

- Virus del mosaico cromático de la vid Grapevine Chrome Mosaic Virus” (GCMV),

MARTELLI et al. (1965) y MARTELLI (1970), causamosaico amarillo, detencióndel

crecimiento y decaimiento de la vid pudiendo inducir síntomas de “fanleal’. Se ha

encontradoen Hungríae Inglaterray lo transmite>C vuittenezí,MARTELLI et al.(1972)

.

- Virus de las Enacionesde la vid GrapcvineEnationsDisease”(GED).Se pensóque se

producíapor un nepovirusporquesu sintomatologíaaparecefrecuentementeunida a la

presenciade virus de este grupo, pero aún no se ha aisladoel agentecausal,PEÑA-

IGLESIAS, (1989).

- Virus del entrenudocorto infeccioso de Ja vid “Grapevine FanleafVirus” (GFLV),

descrito por HEWITT (1950); CADMAN et al. (1960); DíAS (1963); MARTELLI y

HEWITT (1963>; VUITTENEZ (1963) y IIEWITT LL.jj. (1970>, causa la degeneración

infecciosade la vid, se encuentradispersoen todas las zonasvitícolas del mundo, siendo

el más importantepara el cultivo desdeel punto de vista económico.Sus vectoresson

3<. mdcx y X. italiae , este Último de menor importancia como vector en campo,

MARTELLI (1978).

- Virus del mosaicoen rosetadel melocotonero“Peacli RosetteMosaic Virus” (PRMV),

RAMSDELL y MYERS (1974), produce la degeneraciónde la vid (Vitis labrusca cv.

concord); estáextendidoen USA en el Estado de Michigan con algunasrepercusiones

en NuevaYork. Comovectoresde estevirus se hancitadoXiphinemaamericanumCobb

y Macroposthoniaxenoplax(Criconemoidesxenoplax) (KLOS et al., 1967); pero la

transmisiónpor M. xenoplaxrequiereser confirmada (RAMSDELL y MYERS, 1974),

asi como tambiénpor Longidorus diadecturus(ALLEN etal., 1982).

- Virus de las manchasen anillo del frambueso RaspberryRingspot Virus’ (RESV),

CADMAN (1956), es un virus dispersoen los vifiedos de Europa, Turquía y URSS,

transmitido por Longidorus elongatus y L. macrosoma(MURANT, 1978).

15

- Virus de los anillos latentes de la fresa StrawberryLatent Ringspot Virus” (SLRV)

(LISTER, 1964), presenteen el oeste de Europa, habiéndoseencontradouna vez en

Canadáy, recientemente,en Turquía (SAVINO et al 1987), sus vectoresson 3<. coxi

y 3<. diversicaudatum(MURANT, 1974).

- Virus de las manchasen anillo del tabaco TobaccaRingspot Virus” (TobRSV), se

encuentra bastanteextendido en las regiones de Norteamérica donde existen sus

vectores,así como en Australia, Canadá,Holanda, India, Irán, Japón, Nigeria, URSS

y Yugoslavia. Se transmite por 3<. americanums.l. y, aunque tambiénse citó como

vector 3<. coxi por Van HOFF (1971), TRUDGILL et al. (1983) consideranque debe

confirmarse,así como 3<. rivesi (GONSALVES, 1988). Se sospechaque también puede

ser transmitido por artrópodos, Thrips tabaci, Tetranvchus spp. Melanoplus spp.,

Epitrix birtipennis y algunasespeciesde áfidos (STACE-SMITH y RAMSDFLL, 1982).

- Virus de los anillos negros del tomate “Tomato Black Ringspot Virus (TBRV),

sólamente ha sido citado en Europa, transmitido por L. attenuatusy L. elongatus

(MURANT, 1970).

- Virus de las manchasen anillo del tomate “Tomato RingspotVirus’ (TRSV) o “Grape

YeIIow Vein Virus’ (GYVV), es un virus de regiones templadas de Norteamérica

(California) donde abundansus nematodosvectoresX americanums.l.; también se ha

aislado en Chile, Dinamarca,Holanda, Japón,Nueva Zelanda,Reino Unido, Suecia,

URSS y Yugoslavia. Sus principalesvectoresson 3<. rivesi y X. californicum (STACE-

SMITH y RAMSDELL, 1987). La enfermedades másseveraen climas fríos y es el virus

más importante de &rboles frutales.

De todos ellosel de mayor repercusiónes el GFLV que,al igual que su principal vector

3<. index, aparececon una distribución paralelaal viñedo, en todas las zonas vitícolas

del mundo y, a diferencia de otros parásitos y enfermedadescriptogámicas,por el

momentono estácontrolado.

16

1.1.2. VIRUS DE LA DEGENERACION INFECCIOSA O DEL ENTRENUDO CORTO

DE LA VID (GFLVY- Es conocido como “Grapevine Fanleaf Virus’, ~(;rapevine

arriciamentoVirus’, “Grapevine court-noneVirus”, “Grapevine infentious degeneration

Virus”, “Grapevine ReisigkrankheitVirus”, “Grapevíneroncet Virus”, “Grapevineurticado

Virus”, entre otros nombres.

La degeneracióninfecciosade la vid constituye el mayor problemaen todas las zonas

vitícolas del mundo, siendoel virus más antiguo del viñedo. Ya en 1800 se describiósu

sintomatologíaen varios paíseseuropeos(VUITTENEZ, 1970), por lo que se considera

que la enfermedad existe en la cuencamediterránea desde la implantación de la

viticultura (HEWITT. 1968).El virus fué aisladopor CADMAN et al. (1960),existiendo

descripcionesposterioresde DíAS (1963), DíAS y HARRISON (1963), MARTELLI y

1-IEWITT (1963), I-IEWITT (1970), VUITTENEZ (1963 y 1970), VUITTENEZ et al

.

(1964), BOVEY (1973), BOVEY et al. (1980), ENGELBRECHT (1980). I-IUSS et al

.

(1986), OUAOUARELLI et al. (1976).

HEWITT (1956) ya especulabasobrela naturalezade enfermedadedáficade estavirosis

y HEWITT et al. (1958) descubrieronsu transmisiónpor X. index, constituyendoésta

la primera cita de un nematodo como vector de virus; ALFARO y GOHEEN (1974)

establecieronque el umbral máximo de adquisición del virus por el nematodoes de 5

minutos.

En principio se pensóque Vitis spp. era el único hospedadoren condicionesnaturales,

quizá debido a la presuntaespecificidaddel nematodo vector X. index; sin embargo

COIRO tu4. (1980) demuestranque tiene otros hospedadoresentre ellos diversas

plantas cultivadas y malas hierbas;por otro lado, COHN et al. (1970) compruebanla

17

capacidadde >C italiae para transmitir el virus, aunqueMARTELLI (1978) considera

que,a pesar de haberselogrado la transmisiónexperimentalmedianteeste nematodo,

en condicionesnaturalesno es un vector eficaz. El impacto de la enfermedadvaria con

la toleranciadel cultivo al virus y las condicionesambientales.En condicionesextremas

(suelos pocoprofundos, climas cálidos y soleados)puedellegar a la muertede las vides,

sin embargo, en general, las vides afectadaspueden sobrevivir mucho tiempo en

condicionesde mayor o menorproductividad.La productividadse reduceen cierto grado

segúnel clima y sobre todo en el periodode floración, perola media estimadaen países

europeospara las variedadessusceptiblesde Vitis vinifera, llega al 50% de reducción

del peso,con depreciacióncomercialde la uva de mesa.Ademáslos plantonese injertos

de plantasenfermastienen un crecimientodébil, reducenla capacidadde enraizamiento

y los injertos prendencon dificultad (VUITTENEZ, 1970).

Los síntomas que se le atribuyen son muy variados, tanto en hoja como en fruto y

madera,DíAS, (1970); HEWITT (1970); VUITTENEZ (1970); MARTELLI y SAVINO

(1988).Estavariabilidad ha dadolugar a cierta confusióny actualmentese consideraque

dichos síntomasson más bien resultadode la fisiología de la planta y de determinadas

condicionesgenéticasy ambientales(WALKER et al., 1985).

De acuerdocon MARTELLI y SAVINO (1988) la enfermedadse caracterizapor tres

síntomasdistintos, provocadospor diferentes reaccionesdel agentecausal:

-Malformacionesinfreciosas: Hojas distorsionadas,asimétricas,con denticionesagudas.

Manchas cloróticas, acompañadaspor deformacionesfoliares, brotes malformadoscon

ramificacionesanormales.Nudos dobles,entrenudoscortos, fasciacionesy crecimiento

en zig-zag. Racimos menoresy en menor númerode lo normal, maduraciónirregular,

18

con uvas pequeñasy racimos pobres. Los síntomasfoliares se desarrollanal principio

de la primavera y persistena lo largo de todo el periodo vegetativo, aunquepueden

enmascararseen verano.

- Mosaico amarillo, desarrollode decoloraciones,amarillo brillante al principio de la

primavera,que puedenafectar a todas las partesvegetativasde la cepa (hojas,ramas,

pámpanose inflorescencias).Las alteracionescromáticasde las bojas varian desdeunas

pocasmanchassalteadas,a anillos o líneaso un extensomoteadode las venasy/o áreas

intervenales,a un amarillo total. En primavera, las partes afectadasse distinguen

facilmente a distancia.El follaje y las ramasmuestranpocaso ninguna malformación,

pero los racimos son pequeñoscon uvas que no madurany de coloración débil, en las

variedadestintas. En climas cálidos, la vegetaciónen veranoresume su color verde

normal y el amarillo se torna blanquecinoy tiende a desaparecer.

- Bandeadode venas(GOHEEN y HEWITT, 1962).Amarillo en las venasprincipalesde

las bojas madurasque despuésse extiendea las áreasintervenales.Esta decoloración

desaparecea mediadoso final del verano,generalmenteen un númerolimitado de hojas.

Las hojas descoloridas muestran una ligera malformación. Racimos pobres y la

producción puedeser virtualmentecero.

La aparición de trabéculaso cordones endocelularesse consideraroncaracterísticas

sintomatológicasinternas de las vides afectadaspor degeneracióninfecciosa de las

células.Son barras radiales que cruzan el lumen del parénquimaepidérmico,floema y

xilema. Se forma un nÚcleo rodeadode una capa de celulosa incrustadacon lignina,

suberinao cutina,dependiendodel tejido dondese forme. Estasestructurasseutilizaron

en el diagnósticode la enfermedad,pero se ha comprobadoque son más abundantesen

unas variedadesde vid que en otras, lo que limita su aplicaciónen diagnóstico.

19

1.1.2.1. Caracteristicas2enerales.-El virus de la degeneracióninfecciosa (GFLV) es un

nepovirus formado por partículas isométricas de unos 30 nm de diámetro con un

contornoangular y pocaresoluciónde superficie de estructura.Al purificar el virus y

someterlo a una centrifugacióndiferencial en gradientede sacarosa,se separantres

bandascorrespondientesa tres tipos de partículas denominadas,en función de su

coeficiente de sedimentación:T (Top, bandasuperior), M (Middle, bandamedia y 13

(Botton, fondo), de 53, 93 y 126 S respectivamente.Examinadosextractos brutos de

savia o virus purificado, por microscopiaelectrónicase aprecianclaramentedos tipos de

partículas, unascon RNA en su interior, correspondientesa las bandasfi y M y, otras

vaciaspertenecientesa la “1’.

Los aisladosde GFLV son antigénicamenteuniformes frente anticuerpospoliclonales,

incluso los de áreasgeográficamentedistantes.HUSS et al. (1986), fueron capacesde

reconocerdiferentesaisladosdel virus, utilizando anticuerposmonoclonales.Todos estos

aisladosson serológicamentedistintos del “Arabis Mosaic Virus” (ArMV). La diagnosis

serológica puede hacerse por tests convencionales como ELISA, Inmuno-

electromicroscopía,etc.

Acidos nucleicos. Son virus RNA de sentido positivo que presentandos tipos distintos

de RNA (RNA1 y RNA2) que encapsidanen partículasdiferentes.Puedehaberun tercer

tipo de RNA, un RNA satélite (RNA3) de pequeñotamaño, 1150 nucleótidos y que

encapsidaconjuntamentecon los otros RNAs (PINCK et al, 1988), pero sin homología

de secuenciacons éstos. Las estirpesde virus que llevan este tercer tipo de RNA

satélite (F13) se diferenciande las que no lo llevan en que al serinoculadasa Ch.Quínoa

producensíntomasseveros(Fig.1).

TRES SUBGRUPCS DE NEPOVIRUS

SUBORUPO 1I.~ZE.M (Miembro tipo)- Dos tipos de componente 8- Tamaño del RNA 3: 7-8 Kb- Tamaño del RNA 2 = D Kb

SUBORUPO III.&RY (Miembro tipo>- Componente E único

- Tamaño del RNA 1: 7-8 Kb

- Tamaño del RNA 2: ~ Kb

Componente [‘1(RNA 2) Componente 8 (RNA II

SUBORUPO IIILLB.M (Miembro tpo)

— Componente 8 únIco- Tamaño del RNA 1:7-8 Kb- Tamaño del RNA 2: = 7 Kb

Componente Pl (RNA 2> Componente E (RNA 1)

1. Los nepovirus se pueden dividir en tres subgrupos en función deldel RNA 2 y del tipo de componente E.

Representa el extremo 3 poliadenilado.Representa el extremo 5 con la Vpg unida covalentemente.

Componente ri (RNA 2)

Componente 5 (RNA 2) Componente E <RNA

Figuratamañow

E

21

En función del tamañodel RNA2 se han establecidosubgruposdentrode los Nepovirus.

El virus GFLV pertenecea los de RNA2 pequeño,de pesomolecular 1,4 X ío6 daltons

que encapsidanen partículas M, mientras que el RNA1 de peso molecular 2,4 X 106

encapsidaen partículasB. Puedehaberdos tipos de partículas13, no distinguiblesni por

microscopia electrónicay dificilmente en gradiente por tener en gradiente por tener

coeficientesde sedimentaciónmuy próximos, unascon RNA1 en su interior y otras con

dos moléculas de RNA2. Se pueden encontrartambién variacionesen los coeficientes

de sedimentacióndependiendode la existencia o no de RNA3.

Los dos RNAs en el extremo 3’ estánpoliadenilados,en el extremo 5’ se encuentra

unida covalentementeuna proteina pequeñadenominadaVPg (MAYO et al,, 1979 y

MAYO 1982), con función desconocida,pero que pudiera estar relaccionada con

fenómenosde infectividad del virus (CHU et al., 1981; HELLEN et al., 1987). El RNA2

lleva la información genéticapara la síntesisde la proteina de la cápsida,mientras que

la capacidadde infección puederadicar en la información cifrada en el RNA1.

Mediante tinción negativa,sombreadocon metalespesadosy rotación, CHAMBERS et

al. (1965) indican que la cápsidade viriones de TRSV está formadapor 42 capsómeros

con simetría5:3:2. Por gelesde poliacrilamidase determinaque la cápsidade todos los

nepovirus está formada por una única poliproteina de peso molecularentre 5.4 y 6 X

io4 daltons y que la cápsidade los nepovirus está formada por 60 unidadesde esta

única poliproteina,dispuestassegún un numerode triangulación T = 1 (MAYO £L.giL,

1971; TAKEMOTO eta!., 1985 y ROBERTS, 1988>, mientras que CHU y FRANCKZ

(1979) manifiestan que para ToBRV, esta proteína de 5,5 X UY4 daltons, forma

tetrámeros de peso molecular 13 X 106 daltons de los que entrarían 240 unidades a

formar cadapartícula con un númerode triangulaciónT = 4.

22

Ultraestructura.-Las modificacionesultraestructuralesde célulasinfectadascon GFLV

en hospedadoresnaturales o experimentalesson las típicas debidas a NEPOVIRUS,

inclusiones citoplásmicas,vacuolas vesiculares,paredes celulares gruesas,virus con

tubulos y agregadosparacristalinosde partículasde virus.

Secciones ultrafinas de plantas herbáceasinfectadas con GFLV, muestran como

característicascomunes la asociación de particulas de virus a plasmodesmos(PEÑA-

IGLESIAS y RUBIO HUERTOS, 1971), la formación de filas de partículas en el

citoplasma,sin túbulos, la acumulaciónde vesículas,estructurasmembranosas,aparatos

de Golgi, la acumulación de partículasdentro de membranas(GEROLA el al., 1969,

SALRIC y WRISCHER, 1975), la formación de viriones alineadosdentrode membranas

formando túbulos (ROBERTS y HARRISON, 1970, PEÑA-IGLESIAS y RUBIO

HUERTOS, 1971 y FRESNOet al., 1976), la formación de estructurascristalinasen el

nucleo compuestaspor partículasvacias(PEÑA-IGLESIAS y RUBIO HUERTOS, 1971:

PEÑA-IGLESIAS et al., 1978, FRESNO el al., 1978 y RUSSO,1985); estructurasde

dificil comprensiónhastael momento,en cuantoa su posiciónen el núcleo, ya que está

descritoque la cápsidade estevirus se forma en el citoplasmaen los ribosomasdentro

de complejos multivesiculares(REZAIAN et al.,1974 y 1976). HONDA et al. (1972 y

1974) consigueeliminar ribosomasen los que las particulasdel virus del mosaicodel

pepino(CMV) sedestacan.Este virus tiene la capacidadde invadir con rapideztodos los

tejidos de la planta, incluidos los meristemos(WALKER y WEBB, 1970; JONES al

1973).

23

1,1.2.2. Mecanismosde transmision.-Se transmite fácilmente por inoculaciónde savia

a planta herbácea.No se ha comprobadosu ransmisióna través de semilla de vid,

a pesarde que el virus se ha encontradoen gran concentraciónen el endospermode la

mismasin infectar el embrión.Sin embargose transmiteexperimentalmentepor semilla

en algunoshospedadoresherbáceos(Ch. quinoa y Ch. amaranticolor) (HEWITT et al.

1970).

Aunque, en condiciones normales, el número de hospedadores es limitado,

experimentalmentetiene un rango de hospedadoresque comprendeunas 30 familias

botánicas.Cbenopodiumamaranticolor Costaet Reyn, Ch. guinoa Willd., Gomphrena

globosa L. y Cucumis sativus L. son especiesútiles para su diagnóstico,así como Vitis

rupestris “St. George’ inoculadamedianteinjerto.

El GFLV, de acuerdocon su naturalezade Nepovirus, se transmite de vid a vid por

nematodoslongidóridosKindex Thorne et Míen y 3<. italiae Meyl (HEWIT et al 1958

COHN ~L4., 1970). Basta que cl nematodose alimente una sóla vez en una planta

infectada y por un periodo de 5 minutos (ALFARO y GOHEEN, 1974) para adquirir el

virus. 3<. mdcx lo retiene durante más de 8 mesesen ausenciade planta huéspedo

hasta 3 mesessi el Nepovirusse alimentaen plantashospedadorasinmunesal virus.

El virus se retiene en la capa cuticular del lumen del esófagodel vector. Tanto los

adultos como los estados larvarios transmiten el virus experimentalmente, en la

naturalezaX mdcx pareceser su vector más eficaz. Debido al movimiento limitado del

vector la dipersión del GFLV en condicionesnaturales es lenta (1,3-1,5 m/año), los

vectoresno son agentesde dispersióneficaces;la propagacióna grandesdistanciasse

realiza a travésdel materialvegetal.A pesarde su existenciaen Europa,en zonasmuy

concretas,desdelos comienzosde la viticultura, su diseminacióncomenzóa finales del

siglo XIX con la introducción de la vid americanapara el control de la filoxera; al no

24

transmitirsepor semillas de vid su principal reservorioen la naturalezaes la vid misma,

debido a que las raíces permanecenen el suelo muchosaños despuésde quitar la cepa

madresinfectada,puedenconstituir la fuentede inóculo paralos vectoresen el intervalo

entre que se levanta un viñedo y se implanta el siguiente, por lo que los procesos

tradicionalesde arranquee implante, si no se realizancorrectamente,no son efectivos.

El virus se ha encontradoen el endospermode semillasde vid infectada,pero no en el

embrión y en el pólen de vid y plantas herbáceas(CORY y HEWITT, 1968) cuyas

semillas son capaces de transmitirlo. Estas plantas herbáceas, Chenopodiuni

amaranticolor,Ch. guinoa,Cucumis sativa,Gomphrenaglobosa y Phaseolusvulgaris

,

puedenser reservoriosdel virus en la naturalezay se vienen utilizando conjuntamente

con especiessensiblesde Vitis (V. rupestris var. St. George)como plantas indicadoras

para la deteccióndel virus y como fuentespara la purificación del mismo.

Aunque no existenmétodosde control contra los virus, en los Últimos años,las técnicas

de diagnóstico han sido de gran ayuda en la seleción del material de propagación

vegetativaexentode virus, siendosin duda la técnicaELISA (CLARK y ADAMS, 1977)

la que en mayor grado ha contribuido al conocimiento de la incidencia y niveles de

infección en estudiosepidemiolóligos y de la relación virus-vector.

1.1.2.3. Técnicas de dia2nóstico del GFLV.- Se ha venido realizando mediante la

inoculación en las plantashospedadorassensiblesanteriormentecitadas,que dan una

respuestarápida con sintomatología clara y bien conocida. La inoculación puede

realizarse mediante nematodos vectores, por injerto (VUIITENEZ, 1957 y 1965;

TAYLOR et al 1969; CONVERSE, 1979; BOVEY, 1980; JIMENEZ y GOHEEN, 1980)

ó por inoculaciónmecánicade la savia ( HEWITT y CORY, 1965; VUITTENEZ, 1965).

25

Sin embargo,las infeccionescruzadaspuedeninducir a error yen programasde indexaje

y mejorase precisa de métodosmás sensibles,segurosy rápidos, como son las técnicas

serológicas,que han adquirido un papel clave en el diagnóstico de virus en tejidos

vegetales.De todosellos la técnicaELISA (Enzyme-Linked-InmunoabsorbentAssay)es

la más importante y se utilizó por primera vez en la detecciónde virus vegetalespor

VOLLERet al. (1976) para el “Plum Fox Virus’ (PBV) y casidesdeesta fechase viene

aplicandoa la detecciónde GPLV en vid (GONSALVES, 1979; RAMSDELL et al., 1979;

BOVEY al 1980; CLARK, 1981; ENGLEBRECHT, 1980; JIMENEZ y GOHEEN,

1980;SHANMUGANATHANYFLETCHER, 1982;TANNE, 1980 yVUITTENEZ. 1980).

Este método muestra una serie de ventajassobre las técnicas convencionales,es

cómoda,rápida, de gran sensibilidad y permite su aplicación en la detección de virus

en mezclasde muestrassanasy enfermasen las que los porcentajesde infestaciónson

pequefios(LISTER, 1978; NOLASCO, 1982). La potencialidadde esta Iécnica permite

su aplicación en estudios epidemiológicos y en el certificado de material vegetal de

propagación,como complementoy confirmación de la selecciónvisual (VOLLER et al

1976; CLARK y ADAMS, 1977; LISTER, 1978; BARBARA et al 1978; BOVEY, 1980;

NOLASCO, 1982; RUDEL al 1983;WALTER et al 1983), así como la deteccióndel

virus en el nematodo(BOUQUET, 1983).

Al ser una técnica serológica con especificidad en reacciones antígeno (virus) -

anticuerpo, a veces dificulta los ensayos de diagnóstico por lo que para diferentes

estirpes de un mismo virus, a veces se Tequierensueros distintos. Para evitar tal

inconveniente,VAN REGENMOSTEL ~ (1980) y CLARK (1981), recomiendanel

ELISA indirecto que requiere la obtenciónde suerosde distintosanimales.ROWHANI

(enprensa)aplica unamodificación del F(ab’)2 ELISA(BARBARA y CLARK, 1982) que

26

es,a su vez, una modificación del ELISA indirecto, a la detecciónde GFLV y CLRV,

encontrandoque este método muestrauna mayor sensibilidad para la detección de

GFLV. Asimismo, y debido a la naturaleza ácida de los tejidos de la vid, ensaya

diferentes tamponesde extraccióny concluye que para GFLV, la absorbanciaaumenta

cuandose consigue en un pH 7.0 - 7.5, mientras que para CLRV no se aprecian

diferencias. MENDOCA et al.(1980) utilizan igualmente nicotina para visualizar

partículas de virus directamente.SegÚn BOVIEY et al. (1980), NOIASCO (1982) y

RUDEL £t.~i- (1983) la facilidad de deteccióndel virus dependede la época del año,

siendo más sensibleen Junio y menos en Diciembre y Marzo.

ROWHANJS.L.~J. (en prensa)encuentrandiferenciasen los valoresde la absorbanciacon

F(ab’)p entre los distintos tejidos de la planta a lo largo del año; los brotes apicales

pasan de máximos en mayo a mínimos en septiembre,las hojas madurassolo dieron

valores altos en mayo que decrecieronrápidamentemanteniéndoseen valores bajos el

restode la estación,en maderatriturada las lecturas fueron moderadasa lo largo dc la

estacióny en sarmientosvaloresaltos.

GOLINO ~j.pj.(en prensa),hallan diferenciasen la severidadde la sintomatologíade

vides afectadaspor GFLV de una misma viña y en las mismasvides en distintos años;

aunqueen algunascepashay predominio de uno u otro síntoma,en la mayoría de los

viñedos puedenobservarselos tres tipos de síntomasdescritospara el virus. También

encuentrandiferenciasen la titulación en las mismascepasde un añoa otro, por lo que

consideranque es precisoestablecerniveles de confianzapara trabajosde rutina. Por

Último, FUCHS et al. 1991 utilizan sondasradiactivaspara detectarel virus con gran

sensibilidad.

27

1.2. NEMATODOS ASOCIADOS A LA VID

.

Los nematodos titoparásitosocasionanalteracionesen las plantas por acción directa

sobrelas mismasen el desarrollode susactividadestróficasy, sobretodo, como vectores

de virus. Todaslas especiesasociadasal viñedo son de origen edáfico y se alimentande

susraíces;el dañoque producenes,en muchos casos,de muy difícil evaluacióndebido,

por un lado, a su asociacióncon otros microorganismospatógenosde origen edáfico y,

por otro, porque los síntomasque provocanson en general inespecíficos.

En una revisión de los nematodosasociadosa la vid, TACCONI y MANCINI (1987)

encuentranreferenciasde 89 especies,pertenecientesa 35 géneros,de hábitos tanto

saprofitos y depredadorescomo fitoparásitos; de estos últimos, los que puedenafectar

al viñedo son los endoparásitossedentariosdel género~ M. arenaria (Neal>

Chitwood, M. incognita (Kofoit et White) Chitwood,M. iavaníca(Treub) Chitwood y M

.

thamesi (Chitw.) Goodey; endoparásitos migratorios: Pratylenchus penetrans

;

semiendoparásitos:RotylenchulusmacrodorusDasgupta,Raski et Sher y Tylenchulus

semipenetransCobb, que es un problema grave para los viñedos de Australia;

ectoparásitossedentarios:Macropostonia xenoplax (Raski) De Grisse et Loof que

produce clorosis y otras alteracionesa viñedos de California y, de menor importancia,

Gracilacus peratica Raski y algunas especies de Paratylencbus; los ectoparásitos

migratorios de los géneros Helicotylenchus, Rotylenchus y Tylenchorhynchus s.l

.

aparecen frecuentementeasociados al cultivo, pero se sabe poco de su posible

patogenicidad;los de mayor repercusiónen el viñedo son los ectoparásitosmigratorios

vedares de virus de la familia Longidoridae.

28

1.2.1. NEMATODOS ECTOPARASITOS Y TRANSMISORES DE VIRUS-La

comprobaciónpor HEWITT etal. (1958) de la transmisióndel GFLV de la vid por K

mdcx fué la primera pruebaexperimentaldel papelde los nematodoscomo vectoresde

virus vegetales;desdeentoncesseintensificaronlas investigacionesen estesentidoy hoy

se conocenotras especiestransmisorasde virus, quepertenecena dos familias distintas,

Trichodoridae y Longidoridaey que transmitengrupos de virus distintos,Tobravirus

y Nepovirus, respectivamente,este Último grupo tiene interés para el viñedo.

1.2.1.1. Sisíematicay taxonomia de la familia Lonpidoridae.-Como antesse indicó, los

nematodostransmisoresde virus vegetalesse sitúan dentro del OrdenDorylaimida de

la ClaseNematoda,se encuentranincluidos en dos familias distintasTrichodoridaeque

englobaespeciestransmisorasde Tobravirus,y Longidoridae,algunasde cuyasespecies

son vectoresde Nepovirus,que estudiamosen detalle.

De los nuevegéneros descritos dentro de la familia Longidoridae(Xiphinema Cobb;

Longidorus Micoletzky; ParalongidorusSiddiqi, Hopperfl Khan; Xiphidorus Monteiro;

Longidorus Khan, Chawla et Saha Siddiqia Khan, Chawla et Saha; Brevinema

Stegarescu;Inagreius Khan y Neolongidorus(Khan),COOMANS (19S4¡~5)excluye tres

de ellos Brevinema,Inagreius y Siddigia por considerarque las característicasque los

distinguen de los otros son insuficientespara establecerun nuevo género,de igual modo

los caracteresque diferencianNeolongidorusde Longidorus no tienen suficientebase

para mantenerun géneroseparado.

29

De acuerdocon estasconsideraciones,dentrode la familia se distinguencinco géneros

atendiendoa la forma y aperturasanfidiales, naturaleza del odontostilo, posición y

naturalezadel anillo guía del estilete y tamañoy posiciónrelativa de los núcleosde las

glándulas esofágicas subventrales. COOMANS (1984,85) propone, en base a las

consideracionesfilogenéticas,la siguienteclasificación:

Familia Lon~ídoridae

5 ubfamilia Xlphinematinae 5 ubfamilia Longidoridae

Género: Xiphinema Tribu Xiphidoríni

GeneroXiphidorus

Tribu Longidorini

Géneros: ParalongidorusLongidoroides

Lengidorus

1.2.1.2. Característicasmorfologicas.-La morfología de los Longidóridos es básicamente

dorilaimida (Fig. 2), s¿n largos (de 2 a más de 14 mm de longitud), delgadoscon un

estilete (odontostilo)axial huecocon unaextensión(odontéforo),el esófagoes cilíndrico

con una parte anterior delgada y un bulbo posterior musculoso, formado por una

glándula dorsal y dos subventrales,con el orificio de la dorsal en la parte anterior y el

de las subventralesen la parte media del bulbo. En la unión esófago-intestinoexiste

una válvula esofageo-intestinal(cardias). Los longidóridos se distinguen de otros

doriláimidos por suestilete largo, la naturalezadel anillo guía del odontostiloy el cuerpo

largo y delgado. La cutícula parece lisa pero, a grandesaumentosse distinguenen su

capainterna,sobretodoen los engrosamientosde la región cervicaly caudalestríasmuy

finas que le dan apariencia radial a la cola. A lo largo de todo el cuerpo pueden

distinguirse los cordones hipodérmicos más estrechosen la región esofágicay más

anchosen la anal.

30

Las aperturasanfidialesson laterales,sublabiales;puedenser alargadascomo un corte

o como un poro. Los sacos anfidiales pueden ser en forma de estribo o saciformes

lobuladoso no, con lóbulos simétricoso asimétricos.

Fig. 2-— Morfologia general de ‘los Longidóridos:A = Aspecto de la hembra; B = regionesesofágicas del adulto y el primer estadojuvenil; C = sistema reproductivo- O —

cola del macho; E = Espícula

31

CUADRO1.— CARACTERESUTILIZADOS PARA DISTINGUIR LOS EflIEROS DE LA FAMILIA Longidoridae

Longidorus Longidoroides Paratongidorus Xiphidorus Xiphinema

sin. lnaoreius sin. ~iddioic

— Anillo gula tubular,

en el tercio posterior. —

— Idea, anuLar en •L

tercio inferior. + t

- Base del odontostito

no bifurcada + +

— Idem bifurcada

— Odont¿f oro sin

extensiones + +

- Idea, con extensiones -

— Apertura del anfidio

puntiforme +

— Idem alargado +

— Anfidio en forma

de embudo

Nucteo de La gLánduLa

esofágica dorsal distante

de su apertura. + +

32

Las hembraspresentanla vulva como un corte transversal,generalmenteen la parte media del

cuerpo.Las ramasgenitalesson relativamentecortas,dobles,opuestasy con el ovario retroflexo.

El macho presentauna región caudal similar a la hembra; tienen espículascurvas con piezas

accesoriaslaterales,un par adanal y una seriede papilassubmedianas.Los testículosson dobles

y opuestos.

Su ciclo biológico tiene cuatroestadiosjuveniles,que se distinguen fácilmentede los adultospor

poseer dos odontostilos, uno funcional que pierden con la muda y el de repuestoque pasa a

funcional despuésde dicha muda.El primero de los cuales(Li) emergedel huevo y en algunas

especiestiene una forma característicade la región caudal que la distinguede los otros estadios

y puedetener valor taxonómico, también se distinguen de los otros estadiosjuveniles porquela

parte anterior del odontostilode repuestose encuentraincluida en la pared del odontóforodel

estilete funcional, los otros estadosjuveniles (J2, i3 y J4) tienen el odontostilo de repuestoen

la pared de la parle anterior del esofago.Por lo demás,la morfología de los estadosjuveniles es

básicamentesimilar a los adultos,por lo que no puedehablarsepropiamentede estadoslarvarios.

La taxonomíapara la determinación de los distintos génerosse basaen la forma de anlidios y

aperturasanfidiales, basedel odontostilo,naturalezadel odontóforo, posición y naturalezadel

anillo guía del estilete y tamaño y posición relativa de los núcleosde las glándulasesofágicas.

Puededecirseque los génerosfundamentalesson Lengidorus y Xiphinema, los restantesparecen

ser intermedios y participan de las característicasde uno y otro (Fig. 3).

Xlpbinema presentaanfidios en forma de embudoo estribo invertido, con aperturaanfidial en

forma de corte, el anillo gula del estilete se encuentrasiempre en el tercio posterior del

odontostilo y es doble; el odontostilo en su unión con el odontóforopresenta la basebifurcada

o dentada;el ondontóforopresentaesclerotizacionesbasales;el núcleo de la glándulaesofágica

Id

Y

1~

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LONGIDOJitiS LONDIDOJiQIDES PAJiALONGIDO RUS XLPHIDOflUS XIPIIIN EMA

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Y:¡ ,.. ‘ ~~1.’

Fig. 3~— Caracteristicas morfológicas para diferenciar losgéneros de la familia Longidoridae

34

dorsal es grande y se encuentrasituadomuy próximo a la aperturade dicha glandula,los núcleos

de las glándulassubventralesson menoresy se encuentransituadosen la partemedia del bulbo

esofágico. El útero puede ser desde corto y simple hasta largo con varias porciones bien

diferenciadas.

Por el contrario Longidorus se caracterizapor teneranfidios saciformes,bifurcados o no, con

lóbulos simétricos o asimétricos,con la aperturaanfidial difícil de distinguir, como un poro; la

basedel odontostilo siempre lisa; el odontóforocon su parte basalligeramenteengrosada,pero

sin esclerotizacionesbasales,el anillo guía situadoen posiciónanterior, generalmenteen el tercio

anterior del odontostilo,a veces en el segundotercio, al 40% de su longitud. El núcleo de la

glándulaesofágicadorsales pequeñoy se encuentraalejadodel orificio de la misma; los núcleos

de las glándulassubventralesson mayoresque el de la dorsal. El sistema reproductor de la

hembraes siempreanfidélfico-didélfico con el útero uniforme.

Paralongidorus y Longid¿roidescomparten las característicasde Longidorus excepto en la

forma y aperturaanfidiales que son en forma de embudoy como un corte, respectivamente,en

Paralongidorusy solo en la aperturaanfidial alargada, en Longidoroides

.

Xlpbidorus es más próximo a Xiphinema del que se distinguepor la forma de los sacosanfidiales

y el tamañoy posiciónde los núcleosde las glándulasesofágicassubventrales(Cuadro1).

1.2.2. NEMATODOS DE LA FAMILIA Lonzidoridae ASOCIADOS AL VIÑEDO-Se han citado

asociados al viñedo dos especies de Paralongídorus 1’ epxmxkis Dalmasso y 1’. njaximus

(Butschb); 24 de Longídorus: L. afrícanusMerry, L. attenuatusHooper, L. auratusJacobset

Heyns, L. belloi Andrés et Arias, L. coespiticola Hooper, L. closelongatus Stoyanov, L

.

diadecturusEveleigh et Alíen, L. elongatus (De Man Thorne et Swanger,L. eridanicus Roca,

35

LambertiQ Agostinelli, L. enonymusMali et Hooper, L. goodeyi Hooper, L. iranícusSturhan eL

Barooli, L. juvenilis Dalmasso, L.kakamus Jacobs et Heyns, Llaevicapitatus Williams, L.

macrosomaHoeper,L. mart¡ni Herny, L. micrus Khan, Chawle et Seshadri,L. protaeLamberti

et Bleve-Zacheo,L. rotundicaudatusJacobset Heyns, L. sylphusThorne, L. taniwha Clarke, L.

tardicaudaMerzhevskayay L. vineacolaSturhanet Weischer)y 31 especiesde Xiphinema: 5<.

Luc et Kostadinov, 5<. americanum Cobb, SC arenarium Luc el Dalmasso, SC

barbercheckaeCoomanset Heyns, 5<. basilgoodeyiCoomans,5<. bolandium Coomanset Heyns,

SC brevícolle Lordello el Da Costa, SC bulgariensis Stoyanov, X. capenseHeyns, 5<. clavaíum

Coomanset Heyns,5<. diversicaudatum(Micoletzki) Thorne, 5<. elongatusSchuurmanStekhoven

el Teunissen,5<. hybrabadiensisOuaraishiet Das 5<. mdcx Thorne et Alíen, 5<. ingens Luc et

Dalmasso,SC insigneLeos, SC italiae Meyl, SC kosaigudensisOuaraishiet Das, SC la foenseRoca,

Pereiraet Lamberti, 5<. meridianumHeyns,5<. monohysterumBrown, 5<. neovuitteneziDalmasso,

5<. opistohysterumSiddiqi, 5<. pachtaicumTulaganov,SC pacificum Ebsary,Vram et Graham,5<.

pini I-leyns, 5<. rivesi Dalmasso,SC rotundicaudatumSchuurman,Stekhoven et Teunissen,X.

sabelenseDalmasso,5<. turcicum Luc el Dalmasso,y SC vuittenezi Luc, Lima Weischersi Flegg);

de todasellas solamente L. attenuatus,L. coespiticola,L. elongatus,L goodeyi, L. macrosoma

,

Paralongídorusmaximus, 5<. amerícanum,SC con, X.diversxcaudatum,~j~4ex 5<. italíae. 5<

.

rivesi y SC vuittenezi han sido comprobadoscomo transmisoresde virus. Su distribución en

Europa la recogenALPHEY y TAYLOR (1986).

SC americanumCobbse ha citadocomo vector de] “TobaccoRingspotVirus’ (TRSV> (FULTON,

1962), “Tomato Ringspot Virus” (Tom RSV) (TELIZ fl~i., 1966), del “Feach RossetteMosaic

Virus’ (PRMV) (KLOS etal., 1967) y Cherry Rasp Ieaf Virus’ (CRLV) (NYLAND j.al., 1969).

Según LIMA (1965 y 1968) SC americanum sensu lato es un complejo de especies

morfológicamentemuy próximas, que,para TARJAN (1969) son poblacionesde distintas áreas

geográficas.LAMIBERTI y BLEVE-ZACHEO (1979) distinguen 25 especiesdistintas dentro del

36

complejo y consideranque SC americanum sensu estricto tiene una distribución geográfica

limitada en el estede USA Sin embargoGRIESBACH y MAGGENTI (1990) consideranque la

especieexiste tambiénen California. Se consideraque no existe en Europa y las citas en este

Continentese refieren a SC pachtaicum,SC rivesi y SC brevicolle

.

SC pachtaícum(Tuloganov)Kirjanova, conocidaanteriormentecomo SC amerícanumCobb y como

SC mediterraneum Martelli et Lamberti es una especie de amplia distribución en la cuenca

mediterránea(AJpheyy Taylor, 1986>frecuentementeasociadaal viñedo (LAMBERTI y S]DD]OI,

1977; ARIAS eL al., 1986). Se ha citado como posible vector del virus del entrenudocorto

infeccioso de la vid (GFLV) (ALFARO GARCIA, 1971) y Stem Piuing del melocotonero

(GIUNCHEDI y TACCONI, 1974), pero no ha sido comprobadaexperimentalmentecomo vector

de ningún virus.

Otra especie del grupo SC americanums.l. presenteen Europa es SC rivesi Dalmasso,está

ampliamentedistribuida en USA y Canadá(GEORGI, 1988; GRIESBACH y MAUGENTI, 1990;

EBSARY et al., 1984) y se le considera la principal responsablede la transmisión del TRSV

(FORER, POWELL y HILL, 1981; FORER y STOUFFER, 1982). En Francia se encuentraen

viñedo del Bourdelais y en Españaen la Región Central y zona costeramediterráneaasociada

a diferentescultivos, especialmentevid y rosal al que parasita(ARiAS et al., 1991).

SC brevicolle Lordello et Da Costa,también del grupo SC americanums.l. se ha citado como

vector de Tom RSV (FRIZTSCHE y KEGLER, 1968), perose consideradudoso(TRUDGILL et

al 1983) al no haberserealizadolas pruebasexperimentalesde transmisiónde acuerdocon las

posibilidadesestablecidaspor estosautores.Se encuentracon escasafrecuenciaenEuropaCentral,

Españay Yugoslavia (ALPHEY y TAYLOR, 1986).

37

1.2.2.1. Xiphinema mdcx.- La especiede mayor importancia parael cultivo es sin duda,por el

momento, SC mdcx Thorneet Alíen debido a que su distribución coincide con la del viñedo, que

es su principal hospedadorjunto a la higuera, y por transmitir el virus del entrenudocorto

infeccioso de la vid “Grapevine Fanleal” (GFLV).

Morfológicamentese caracteriza(Fig. 4) por presentarel cuerpoalargadocilíndrico, de unos 3

mm de longitud, formando una espiral abierta con mayor curvatura en la mitad posterior; la

cutícula esgruesacon estrias finas superficiales,mostrandouna seriede poros todoa lo largo del

cuerpo.La región labial es hemisférica,casicontinuacon el contornodel cuerpo,pero mostrando

una ligera depresiónbajo las aperturasanfidiales.Los anfidios en forma de estribo con aperturas

como cortescasi del tamañode la anchuralabial. El estilete, típico del género,con un odontóstilo

huecode 126 pm de longitud, bifurcadoen el punto de unión con el odontóforocon unas70 ~xm

de longitud y mostrandotres extensionesbasales.El anillo guía del estilete se encuentraa 108

(100-114) iám del extremo anterior. El anillo nerviosose encuentrapor debajo de la base del

odontóforo. La parte poste+ior del esófagoes cilíndrica, musculosa,2,5 veces más larga que su

anchuraen la base.La vulva es como un corle transversalaproximadamenteen la parte media

del cuerpo; generalmentese localiza al 3840 % de la longitud del cuerpo. Las gónadasson

didélficas, retroflexas en el oviducto y no presentanorgano 7~ Los ovarios son alargados,

simétricos con varios oocitosen fila exceptoen la región de multiplicación. La región caudal es

mamiforme, con una longitud de 1 a 1,3 veces su anchuraal nivel del ano,convexo-cónicacon

mayor curvaturaen su partedorsal y un mucrón en la parte ventral de 9 a 13 pm de longitud,

aunquea vecesaparecenhembrasamucronadas.Los macbosson muy escasos,no son esenciales

para la reproducción,de morfología similar a la de la hembra excepto por la presencia de

espiculasy testículos,dos,uno recto y otro retroflexo, ademásen la parte ventromedianade la

región caudalmuestraun par de suplementosanterioresa la cloacay una seriede cinco papilas.

Mg. 4.— Mcrfologfa general de X. lndex: A — Aspecto general delcuerpo; 8 — Detalle de los poros cuticulares; C —Regióncaudal del macho; O — Reglón labial mostrando la formadel anfidio; E — Detalle del estilete del juvenil de pri-mer estadio CO 1) Csegón Thorne etAl-len, 1950)

39

Diversostrabajosde campoy laboratorio(RADEWALD y RAS KI, 1962; AMICI, 1967; COHN y

MORDECHAI, 1969,1970; PROTAet al 1973, 1977;WEISCHER, 1973; COIRO y LAMBERTI,

1978; HARRIS, 2979; PiNOCHET et al 1986; ALLEN et al 1988 y SCOTfO LA MASSESE e

<

al 1988) demuestranla influencia que tienen los factoresambientales(temperatura,humedad

y textura del suelo,principalmente)en el desarrollode 5<. index de maneraque la duración de

su ciclo de vida puedevariar entre 2 a 14 mesesdependiendoprincipalmentede la temperatura

y el desarrolloestacionalde la planta huesped;pareceser que en campo5<. americanums.l. y

SC diversieaudatumse desarrollan com mayor rapidez que SC index que,en zonastempladas,

pareceteneruna sola generaciónal año,con un ciclo que se completaen 2-3 mesesy adultos que

sobrevivenen el suelo varios años;de cualquier modoen estudiosde campoes difícil determinar

la duracióndel ciclo puestoque,como en la mayor parte de las especiesde 5<iphinema,pueden

encontrarsea lo largo del añotanto los adultos como todos los estadosjuveniles (FLEGG, 1966,

1968; REUDEL, 1971; HARRIS,1979). Las diferencias fisiológicas existentesentre poblaciones

de SC index de disúntas áreas, unidas a las diferencias morfológicas e histoquimicas entre

poblacionesviruliferas y libres de virus, observadaspor ROGGEN (1966),explicarálas diferencias

en la capacidadde transmisiónde distintos aisladosde GFLV por poblacionesde distintas áreas

geográficasque encuentranCATALANO . (1989) de manera similar a lo observadopor

BROWN y TAYLOR (1981) en la transmisiónde distintos aisladosde SRLV por poblacionesdc

SC diversicaudatumde distintas procedencias.Por otro lado,DAS y RAS Kl (1968) comprueban

que la presenciadel virus aumenta la supervivenciadel nematodoen ausenciade alimento y

RAS Kl . (1965) queen sueloestéril no perduramás de 9-10 meses,peroen suelosde viñedo

con restos de raicessobrevivemás de 4 años.

40

Respectoa los suelos,5<. mdcx se desarrollamejor en suelosarenososy limosos de origen aluvial

ligeros que en los arcillosos, pero muestragran tolerancia a la textura y pH de los suelos,

(SIDDIOI, 1986; ARIAS y NAVAS, 1986; SCOTTO LA MASSESE et al., 1988), lo que, como

indica WEISCHER (1975) explica su amplia distribución mundial. En cuanto a su distibución

vertical se ha comprobadoque en suelos de buenapermeabilidadse encuentraentre30 y 50 cm

de profundidad que correspondea la zona de máxima densidadde raíces (WE]SCHER, 1975;

SCOTTO LA MASSESE g.Q~j., 1988) pero puedesobrevivir a profundidadesde hasta3,5 m en

ausenciade racies y a 2 m es frecuenteencontrarejemplaresvirulíferos (RAS Kl et al., 1965).

5<. mdcx tiene unagamarestringidade hospedadres(vid, higuera,rosaly morera)aunqueCOlRO

et al. (1987) han comprobadoque tiene otros hospedadoresen una serie de cultivos y malas

hierbasque puedenservirle de reservorlo. Independientementede su papel de vector de virus

produce una serie de alteracionesen las raíces de las plantas como consecuenciade su actividad

trófica, y que consisten en engrosamientoy necrosisde los extremos apicales de las raicillas

secundarias,con alteracionescelulares(LEHMANN y WYSS, 1978).

1.2.2.2. SC italiae.- También ha sido señaladocomo transmtsorde GFLV en test de laboratorio

(COHN et al.. 1970), pero no ha sido comprobadoen campo,dondeno pareceser un vector muy

efectivo (MARTELLI, 1978). Se caracteriza(Fig.5) por el cuerpo delgado, de unos 3 mm de

longitud, casi recto en la parteanterior y arqueadoventralmenteen la posterior, cutícula lisa,

gruesa,con estríasmuy finas más visibles en la región acudal.Poros en unasola fila, visibles en

la región esofágica.Región labial suavementeredondeada,diferenciadadel contornodel cuerpo

por una constricciónclara. Anfidios postíabiales,en forma de estribo,con aperturascomo cortes

de 1/2 a 2/3 el diámetrode la región labial. Odontostilo típico del género,de 95 pm de longitud

y bifurcadoen la base,odontóforode 60 pm con tres extensionesbasales.Millo guíadel estilete

a 81 pm del extremoanterior, anillo nerviosotras la basedel odontóforo.Parteposteriordel

A-1t

•1

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E

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F

Hg. 5.— Morfologia general de X. ltaliae: A y O — Regi6n anterior;E — Reglón caudal de la hembra; c — r — Variabilidad de laregión cadual de los distintos estados juveniles; 1 — H —

Región caudal del macho; L — K — Forma del cuerpo cuandomuere por calor; N — Rama ovárica (según Cohn, 1977)

L 1<

H

42

esófagocilindrica, muscular.Vulva como un corte transversoen posición ligeramenteanterior a

la parte media del cuerpo(4349% de la longitud total del cuerpo).Gónadasdobles,opuestasy

retroflexasen el oviducto; no presentanorgano“1, úterodiferenciado.Formade la región caudal

variable incluso dentro de la misma población, generalmente conoide alargada ligeras,

constricciones ventral y dorsal hacía el terminus, a veces conoide e incluso subdigitada. La

longitud caudal es de 2,8 a 4,3 veces la anchura del cuerpoal nivel del ano, con dos pares de

caudales. Los machos son escasos no son esenciales para la reproducción,papilas

morfológicamentesimilares a la hembraexcepto por la presenciade espículasarqueadasy los

suplementosventromedianos.

Es una especiedistribuida en Europa Central y Meridional, especialmenteen el área costera

mediterránea(COHN, 1977, A.LPHEY y TAYLOR, 1986) donde apareceen viñedos asociadaa

5<. index y 5<. pachtaicum.También se ha citado en Sudáfrica (HEYNS, 1974) y en Nigeria

asociadaa GFLV (KHAN, 1988). Presentaun amplio rangode hospedadores,en generalplantas

cultivadas, pero solamenté se ha comprobado su desarrollo en vid y cítricos (COHN y

MORDECHA]. 1969; COIRO y AGOSTINELLI, 1991), aunquetambién es frecuenteen bosques

(HEYNS, 1974; LAMBERTI et al., 1985; NAVAS y ARIAS, 1986), prefiere suelos arenosos.

NAVAS y ARIAS (1986) la encuentranasociadaa suelosareno-limososy limo arenososcon pH

ácido (5-5,5) y contenidosde materiaorgánicaentre 2,5 y 5,5%.

1.2.2.3. Otras especiesde la familia Lo2idoroideae.-5<. coxi Tarjan se cité como vector del virus

del mosaico del Arabis ‘Arabis mosaic” (AMV) (FRJTZSCHE,1964>, “Cherry Leaf Rolí (CLRV)

(FRITZSCHE y KEGLER, 1964), virus de los anillos latentes de la fresa “Strawberry Latent

Ringspot” (SLRV) (PUTZ y STOCKY, 1970) y Tom RSV (VAN HOOF, 1971) peroTRUDGILL et

al. (1983> consideranestascitas dudosasal no haberserealizadolas pruebasexperimentalesde

transmisiónde acuerdocon los postuladosestablecidospor estos autores.

43

Por otro lado, esta especiedescrita en poblacionesde Florida (USA) y Alemania ha sido citada

en numerosospaíseseuropeos,DALMASSO (1969 y 1970) y RAU (1975) aludíana la existencia

de dos formasmorfométricasdistintasy STURHAN (1985) llegó a la conclusiónde que la especie

constituyeun complejoque englobadosespeciesbien diferenciadas,X coxi Tarjan y SC nseudocoxi

Sturhan, con dos subespecies SC coxi coxí Sturban y SC coxi eurooaeum Sturhan que pueden ser

formas ecológicas, ARIAS . (1987) encuentran 5<. c. eurooaeum y SC nseudoeoxien la Región

Central de España preferentemente asociados a vegetación natural, aunque también lo

encuentran en viñedos. 5<. diversicaudatum (Micoletzky) Thorne, distribuido en zonasde clima

templado y húmedo de todo el mundo, es vector del virus del mosaicodel Arabis (AMV) (JHA y

POSNETTE,1959) y del virus de los anillos latentes de la fresa (SLRV) (LISTER, 1964),aunque

también ha sido citado como transmisor del (CLRV> y virus de las manchasen anillo del

frambueso(RRSV) por FRIZTSCHF y KEGLER (1964 y 1968) respectivamente.

Estas últimas citas se considan dudosas por no haberse realizado las pruebas experimentales de

transmisión de acuerdo con la metodología establecida a tal fin por TRUDGILL £t.Q.i. (1983). Es

una especiemuy frecuenteen la parteseptentrionalde Francia,a lo largo de las cuencasfluviales

y en la Costa Atlántica y se encuentramuy dispersaen el Reino Unido y Centro Europa

(ALPHEY y TAYLOR, 1986). ARIAS tL4 (1985) lo encuentranasociadoa vegetaciónnaturalen

sueloscon un 60 -70% de arena,preferentementeen suelos ácidosy condicionadospor la humedad

ye> clima continental(subhúmedoa húmedo>,su limite sur en Europapareceestaren la Región

Central de España.Ocasionalmenteapareceasociadoa vid donde parece ser el tranmisor de

AMV. SC vuittenezi Luc, Lima, Weischery Flegg es la especiemás común en Europa Central

(ALPHEY y TAYLOR, 1986) donde apareceasociadaa la vid y se indica la posibilidad de que sea

vector de GFLV en Alemania (RUDEL, 1977, 1980 y 1985; WEISCHER, 1973) y Francia

44

(VUITTENEZ fl.~j., 1972> donde el virus se propagaen ausenciade SC mdcx y SC italiae

,

hipótesis que está por confirmar (BERCICS et al., 1977). Pué citado como vector de CLRV por

FLEGO (1969), pero para TRUDGILL cl al. (1983) es una cita dudosa por las razones ya

indicadas.

Las restantesespeciesde Xiphinema que aparecenen viñedos en Europa, SC basilgoodevi

Coomans, SC clavatum Heyns, 5<. ingens Luc et Dalmasso, 5<. neovuittenezi Dalmasso, 5<

.

rotundalurn SchuurniansStekhovenel Teunissen, 5<. sahelenseDalmassoy SC turcicum Lic el

Dalmasso no parecenestar asociadasa la transmisiónde virus.

Respecto a las especies de Lengidorus y Paralongidorus asociadas al viñedo, han sido

comprobadas como vectores de virus L. apulus Lamberti et Bleve-Zacheo,que transmite el

‘Artichoke Italian Latent Virus (AILV) (RANA y ROCA, 1975); L. attenuatus Hooper Tom BRV)

(HARRISON, 1964); L. elongatus (De Man) Thorne et Swagen (Tom BRV) (HARRISON et al

1961> y RRSV(TAYLOR, 1962>; L. macrosoma1-Iooper (RRSV) (HARRISON, 1964) y L. martini

Merny del “Mulberry Ringspot (MRSV) (YAGITA y KAMURO, 1972). Las citas de L. attenuatus

Hooper como vector del AILV (RANA y ROCA, 1975), L. caespiticolaHooper, del AMV y RRSV

(VALDEZ, 1972) y L. profundorum del RRSV (FR¡ZTSCHEy KEGLER, 1968), asi como la de

Paralongidorus maximus (Butschli) como vector del AMV y RRSV se consideran dudosas

(TRUDGILL s.t..4., 1983) por las razonesya expuestas.

45

¡.3. RELACION VIRUS-VECTOR

.

La mayoría de los estudiossobre relacion virus-vector se han realizado para SC index - GFLV que

es una de las interacciones mejor estudiadas. Se ha comprobado que es suficiente que el nematodo

se alimente por una sola vez en una planta infectada, para que adquiera el virus (TAYLOR y

ROBERTSON,1975). El tiempo mínimo necesario para la adquisición del virus fué establecido

por ALFARO y GOHEEN(1974) en cinco minutos, pero este detalle es de poca importancia

práctica dado que las raíces permanecenen el suelo durante periodos largos, a disposición del

nematodo. De mayor interés es el tiempo de retención del virus en el vector, ya que de ello

depende la mayor o menor posibilidad de infección entreun cultivo y otro, según los estudiosde

TAYLOR y ROBERTSON(1975) y DAS y RASKl (1968) principalmente, SC mdcx es capaz de

retener el GELV hasta 8 meses cuando permanece alimentándose de hospedadores inmunes al

virus, como es la higuera; en presencia de restos de raices de vid mantiene la infeccion varios

años.

E] lugar de retención del virus es la capa cuticular que recubrela pared del lumen esofágico

donde pueden observarsepor microscopiaelectrónicalas partículassituadasen una sola capaa

lo largo del lumen (TAYLOR y ROBERTSON,1970; RAS Kl et al., 1973). Esta capa cuticular se

cambia en las mudas por lo que durante el periodo de desarrollo del nematodo los estados

juveniles pierden su infectividad al pasar de una fase a la siguiente, por lo tanto los adultos como

todas las fasesdel desarrollodel nematodotienen igual capacidadinfectiva (RASKl y HEWJTT,

1963; COHN e! al., 1970), aunque RUDELL <2977) observaque los estadosjuveniles de L.

attenuatusson menoseficacesen transmisiónque los adultos. De cualquier modo, la eficacia de

transmisiónse incrementaconsiderablementecon el tiempo de adquisición y con el número de

individuos utilizadosen el test.

46

La transmisiónde Nepovirus por vectoreses específica(TAYLOR y ROBERTSON,1975), así 5<.

diversicaudatumtransmiteel AMV peto no GFLV a la inversaque SC index. Pero además,virus

serológicamentediferentespuedentener un mismo vector (AiMV y SLRV se transmitenpor £

diversicaudatum~y aislados diferentes de un mismo virus pueden transmitirse por especies

diferentes de un mismo género,así serotiposescocesesde RRV y TRBV se transmitenpor .L

~iingaUia, mientrasque los serotiposinglesestienensusvectoresen poblacionesde L. macrodorus

y L. attenuatusrespectivamente(HARRISON, 1964).Inclusoexisteel casode que un virus pueda

tener dos vectores pertenecientesa génerosdistintos, así PRMV puede transmitirse por 5<.

amerícanumy por L. diadecturus(ALLEN etal., 1982).

Esta asociaciónespecíficaentre el virus y el vector parecerelacionar la proteina de la cápsida

del virus que interactúa con la cutícula del aparatodigestivo del vector en el punto de fijación

del virus, odontóforo y esófago(ROBERTS y BROWN, 1980; BROWN y TRUDGILL, 1983).Esta

retenciónespecíficadel virus, en opinión de ROBERTSON y HENRY (1986), se debe a la capa

de carbohidratosque tapizade maneradiscontfnuaodontóforo y esófago,que puedereconocer

las moléculasde lectina de la proteínade la cñpsidadel virus.

Las diferencias sustancialesen la eficacia de la transmisión de un virus entre las distintas

poblacionesde un nematodohacen pensaren la posibleexistenciade razasbiológicas dentro de

las especies,sobretodo en aquellasespeciesde amplia distribución geográficaque no presentan

suficientes diferencias morfológicas como para considerarlas especiesdistintas (BROWN y

TOPHAM, 1985) cuandoademáshibridan entresí (BROWN y TAYLOR, 2987). BROWN (1986)

opina que la capacidadde un nematodopara transmitir virus es hereditariay estácontroladapor

un único gen,las diferenciasen la eficacia de transmisiónentre las distintas poblacionesindican

la posibleexistenciade diferenciasbiológicas que no son suficientespara considerarlasespecies

distintas.

47

Por otro lado, la capacidadde un vector para transmitir un virus también radica en eí propio

virus. La asociaciónvirus-vector-plantaes un procesointeractivo que probablementeha llevado

a una selecciónevolutiva paralelaen el desarrollode relacionesespecíficasentre determinadas

cepasde virus y poblacionesde nematodosvectores(BROWNer al., 1988).Esteprocesoevolutivo,

como respuestaa los cambios en las condicionesmedioambíentaleses un flujo continuo en las

relacionesvirus-vector-planta.La apariciónde distintos aisladosde virus asociadosa especiesde

nematodospuedeser el resultadode un procesode selecciónrelacionadocon diferenciasen la

planta huespedy en la biología del vector, todo ello daría lugar al descubrimientode nuevas

asociaciones virus-vector conforme progresen las técnicas de identificación de virus y nemabodos

(BROWN et al., 1988).

1.4. METODOLOGíA PARA EL ESTUDIO DE LA TRANSMISION

La mayorparte de las citas sobretransmisiónde virus se han basadoen pruebasexperimentales

en las que se ponia un cierto númerode individuos del nematodopresuntovector en macetasen

las que crecíanplantas infectadasde virus, para transferirías posteriormente,trás un periodo

más o menos largo, a macetas con plantas herbáceas cebo, susceptibles al virus. Las

transmisionesobtenidasde estemodoestabaninfluenciadaspor unaseriede factoresque pueden

enmascararla transmisión(TRUDGILL cÉ al., 1983; BROWN y TRUDGILL, 1983; BROWN et

al., 1989).

Ya Mc ELROY (1978) opinabaque paraestablecerque un nematodoes vectordebeseguirseun

criterio único en las pruebasexperimentalesy TRUDGILL et al. (1983) establecenlos siguientes

criterios: 1. El virus y el nematododebenestarcorrectamenteidentificados;2. Debe comprobarse

que las plantas cebose han infectado como consecuenciadel test y 3. Debe comprobarseque el

48

nematodoes el único vector posiblea lo largo del experimento.Paraasegurarestos criterios se

han desarrolladounaseriede metodologíaspor Mc ELROY (1978);TRUDGILLet al. (1981), pero

la propuestapor TRUDGILL e! al. (1983)esla más sensiblepara detectarpequeñasdiferencias

en la eficacia de la transmisión permitiendo determinar dicha eficacia en cada proceso,

adquisición,retencióny transmisióndel virus, por lo que es la que se viene siguiendo.

1.5. ESTADO ACTUAL DE LOS ESTUDIOS SOBRE GFLV Y LOS NEMATODOS

ASOCIADOS A LA ViD EN ESPANA

Se revisan, en este apartado,en primer lugar, los trabajos realizadossobre el virus de la

degeneracióninfecciosa y su importanciaen Españay a continuaciónlos referentesa nematodos

asociadosal viñedo y su distribución, con especialatenciona los transmisoresde virus.

1.5.1. VIRUS DE LADEGENERACION INFECCIOSADE LA VID-Es MARCILLAARRAZOLA

(1942) quien se refiere en primer lugar en Españaa la degeneracióninfecciosade la vid como

enfermedadvírica y FERNANDEZDE BOBADILLA (1948 y 1950) describe la sintomatologíaen

vínedos de Jerez, pero es en los años setenta cuando la aparición de las primeras publicaciones

haciendoreferenciaexpresaa la aparición del virus en España.ALFARO (1971) y FIJO y ARIAS

(1976) detectan la enfermedadasociadaa su nematodo vector, SC index; PEÑA-IGLESIAS y

AYUSO (1971) y AYUSO y PEÑA-IGLESIAS (1973) identifican el virus y PEÑA-IGLESIAS y

RUBIO (1971),FRESNOet al. (1918)yPENA-IGLESIAS aAi. (1978)hacen un estudiobiológico,

bioquímico y biofísico del virus. GARCíA DE LUJAN (1975 y 1976) indica la gravedaddel

problemaen la regiónde Jerez,asícomo GUZIVIAN (1970),PROVEDOy FERNANDEZ-SEVILLA

(1973) ; DIAZ-YUBERO y ESTEBAN (1973) en La Rioja y PEREZCAMACHO (1981) en la zona

de Montilla-Moriles. PEÑA-IGLESIAS (1912) indica queel virus del entrenudocortose encuentra

49

en España en el 20% del viñedo causando problemas graves, el mismo autor (1989) opina que las

enfermedades víricas son el principal problema de los viñedos y afectan al 67% de los mismos, lo

que da lugar a unas pérdidas mínimas de 346 millones de dólares, considera que el 90% dc las

vides de las variedades Cayetana Blanca y Garnacha están infectadaspor GFLV, así como el 87%

de las Macabeo, 85% de Airen; 75% de Tempranillo,60% de Xarelo; 49% de Palomino; 45% de

PedroXimenezy 5% de Monastrel.PADILLA y MARTíNEZ (1986)establecenla importanciadel

entrenudo corto en las variedadesde la uva de mesa, no sólo por una disminución del

rendimientosino también por la mermade calidad.PADILLA siAl. (1990) sometena procesos

de indexaje y control de producciónparrasde las variedadesDon Mariano,Domínguezy Ohanes,

procedentesde preselección,encontrandoun alto nivel de infección viral que no se corresponde

con la producción satisfactoriade las mismas.

El DepartamentoRegional y Coordinadorde Viticultura y Enologíadel INIA viene desarrollando

desdelos años70 un programa de selecciónsanitaria de las vides españolasa nivel nacional,

en el que las cepasse seleccionanen basea las buenasaptitudes varietales(vigor, producción,

etc.) y compruebansu sanidadpor diagnósticovisual, comprobaciónde síntomas,no siempre de

valor diagnóstico,por transmisióna indicadoresleñosos y herbáceosy muy recientementepor

indexaje serológico(ELISA) (PENA-IGLESIAS, 1989).

1.5.2. NEMATODOS DE LA VID. - NAVACERRADA (1975)haceuna revisión de las publicaciones

existenteshastael momentode los nematodosasociadosal viñedo,encontrandodocepublicaciones

que hacenreferenciaa 20 especiesy 50 géneros;de ellas merecedestacarla primera cita de 5<

.

index y M. xenoplaxen viñedos españoles(JIMENEZ-MILLAN, 1962), la distribución geográfica

de las especiesde 5<lphinema en los viñedos españoles,las Únicas estudiadasen profundidad

(ARIAS y NAVACERRADA, 1973) y el hallazgode Tylencbulus semipenetransen vid en España

(NAVACERRADA, 1975).

50

PosteriormenteARIAS . (1985) recogentodas las citas sobre nematodosectoparásisosy

transmsoresde virus en EspañaContinental, dondeaparecen29 referenciasde 5<. index Thorne

et Alíen y de SC ingens Luc et Dalmasso,16 de SC italiae Meyl, una de 5<. neovuitteneziDalmasso,

198 de 5<. pachtaicum (Tulagarov) Kirjanova, una de SC rivesi Dalmasso,2 de SC turcicum Luc

et Dalmasso,2 de 5<iphinemaspp., una de Longidorus attenuatusHooper, una de L. elongatus

(De Man) Thorne et Swagen, 2 de L. macrosomaHooper, 4 de L. profundorum Hooper,

posteriormenteidentificado como L. belloi Andrés et Arias y una Longidorus spp. Merece

destacarseel trabajo de TOBAR, JIMENEZ y PEMAN MEDINA (1979) que estudian la

distribución vertical y horizontal y hacen una valoración de los niveles de población de

Xlphinema en relación con la sintomatologíade degeneracióninfecciosaen los viñedos de Jerez.

PINOCHET y BERGUA (1983) estudian los nematodos fitoparátos asociadosa viñedos de

Cariñena,encontrando18 especiesde 12 génerossiendo los más importantespor su frecuencia

y patogenicidad:Xiphinema, Helicotylenchus,Macrophostonía,Paratylenchus,Pratvlenchus

,

Tylenchorhynchus,Gracilacus y Zygotylenchus PINOCHET y CISNEROS (1986) estudian las

fluctuacionesestacionalesde poblacionesde tres nematodos(Críconemellaxenoplax,Xiphinema

mediterraneumy Helicotylenchusdih~tera) que consideran los más importantesen viñedo en

Castilla, Cataluñay La Rioja.

NAVAS et al. (1986) realizan estudiossobre la ecologíay distribución de 2<. mdcx y SC italiae

,

ARIAS si.~i.( 1986) y NAVAS £LAI( 1988) sobre la de 5<. diversicaudatumy SC pachtaicumy

ARIAS et al. (1987) sobre la de SC coxi s.l. La distribución de estas especiesen España

continentalaparecereflejadaen la Fig.6. BELLO e! al. (2989)encuentranfocos de Meloidogvne

íncognita afectandoal viñedo en La Mancha.

51

fig 6

lALo,Loo,oiicivivi(~1~1

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.4

II. MATERIAL Y METODOS

53

La planificación correcta de los muestreosy la elección de una metodologíaadecuada

es fundamentalen estudiosde ecología y epidemiologíade organismosedáficos y muy

especialmenteen el caso de los nematodos del suelo. Debido a ello, en el primer

apartado,de los 11 que componenestecapitulo, se reflejan los motivos que llevaron a

la elección de las áreas de estudio, para pasar a continuacióna la descripción de las

mismas. En los apartadossiguientesse describencon detalle las metodologíasseguidas

para la toma de muestras,tanto de suelo como de material vegetal,para la extracción

y estudio de nematodos y para la detección, identificación y transmisión del virus.

Finalmente,se indican las técnicas utilizadas en la determinaciónde los parámetros

edáficos, elaboración de mapas climáticos y de suelo, así como en el tratamiento

estadísticoy cartografiadode datos.

11.1. PLANIFICACION DE MUESTREOS

Teniendoen cuenta de las consideracionesanteriores,se hanplanificadodistintos tipos

de muestreos,según los fines pretendidos,bien en zonas vitivinícolas concretaso en

fincas experimentales.

Para estimar el grado real de la incidencia del virus y sus nematodosvectoresen el

viñedo en contrastecon las opinionesgeneralesexpuestas,se realizó un muestreoprevio

al azar en La Mancha.Dicho muestreoplanteéla necesidadde diseñarotro en tres

zonas con diferentes condicionesmedioambientales,en base a muestrearno sólo los

viñedos más importantes,sino tambiénzonasperiféricas de menor interés vitivinícola,

teniendoen cuenta,dentro de lo posible, el tipo de suelo y como basea la eleccióndel

área de estudio.

54

Asimismo se diseñaronsendosmuestreosen dos fincas experimentales,uno de ellos

encaminadoprincipalmentea la comprobaciónde la persistenciadel virus en distintos

tejidos de la planta (hojas,sarmientos,raíz,etc.) y a lo largo de todo el año y otro a fin

de comprobar la correlaciónentre sintomatologíaobservaday presenciade virus en

distintas variedadesde vid.

11.2. DESCRIECION DE LAS ZONAS DE ESTUDIO

Para la elección de las áreas de estudio se han tenido en cuenta los trabajos sobre

litología dc SOLE SABARIS (1984), que distingue en la Penínsulatres zonas, la España

arcillosa,la caliza y la silícea (fxg.7), los de climatología de FONT TULLOT (1983), que

considerados zonas climáticas (la verde y la parda) y tres áreas (árida, semiáriday

húmeda) de acuerdocon el índice hídrico de Thorntwaite (Fig.8), así como el modelo

bioclimático de GONZALEZ REBOLLAR (1983); MONTERO DE BURGOS Y

GONZALEZ REBOLLAR (1989) que integra los datos de precipitación con las

características del suelo y relieve, sintetizando la variación estacionaria de la

temperaturamedia con el balancehídrico en cadacaso;los parámetrosqueutilizan son:

temperatura media (-- ), precipitación real (p), evapotranspiraciónpotencial (E),

evapotranspiraciónresidual (e), capacidadde resistenciadel suelo (CR) y escorrentia

lateral (W) y, en base a estos parámetros,establecerunidades de medida (unidades

bioclimáticas)que permitencuantificar la actividad vegetativapotencialy real, así como

el grado de inactividad por sequía y frío (Fig. 9), que estructuranlas características

generales de los ambientes de la Península en cuatro categorías, en tres de las cuales

Fig. 7.-.- Litologia (Según Solé Sabarís, 1984)

oSILíCEO

uCALCI CO

OARCILLOSO

OHUMEDO

SUBHUMEDOoSEMlAR IDO

ARIDO

Fig. 8-— Clima <Según Font Tullot, 1983)

57

existen enclavesde viñedo: Furosiberianos,tipo 1, del norte peninsularen los que no

se presenta inactividad vegetativa ni por sequíani por frio; Mediterráneos,tipo 3,

templados y secos, con las variantes continentales de la Meseta, con inactividad

vegetativaen invierno; Subdesérticos,tipo 4, de Almería con inactividad vegetativaen

verano.

11.2.1. ZONAS VITíCOLAS. LAMANCHA.-Con el fin de comprobarsi la incidenciadel

virus y el nematodo, por un lado, y su relación con la sintornatologia observada, por otro,

mostrabadiferenciasen las distintas condicionesambientales,seeligieronpara el estudio

previo tres zonasque presentabanambientes distintos, en un transecto que iba de

Galicia a Murcia: Galicia como representantede la Españasilícea, verde y hÚmeda,con

un ambienteFurosiberianodonde,comose indicabaanteriormente,no existe inactividad

vegetativa ni por sequíani por frío; La Mesetaarcillosa, correspondientea la España

parda. con uno clima semiárido, representante de los ambientes mediterráneos

continentalesdonde existe inactividad vegetativaen invierno; Murcia, caliza, de clima

mediterráneoárido y ambientede transición hacia el subdesértico(Fig.9). Finalmente,

el estudio se centró en los viñedos de La Mancha, debido a su extensión y

peculiaridades ambientales.

La Manchaes la región natural de más extensióny quizás la más continentalde todas

las regionescentralesde la Península.Es una planicie de tipo fisiográfico con unaaltura

media de 650 m sobre el nivel del mar. Limita al Norte con la Mesa de Ocaña,planicie

que constituye una continuaciónde La Mancha y se extiendehastael rio Tajo; por el

sur Iimila con el Campo de Montiel y estribacionesde Sierra Morena; al Este con las

Serraníasde Cuencay Alcaraz,en Albacete, y al Oeste con el Campode Calatrava y

estribacionesde los Montes de Toledo.

58

El clima es continentalcon precipitacionesescasasque oscilan alrededorde los 400 mm,

dándose las máximas en primavera y finales de otoño y las mínimas en invierno y

verano. Según el índice hídrico anual de Thorntwaite, se distinguen cinco tipos

climáticos gradientes (Fig. 10), de los que los más extendidos en el área de estudio son

el seco subhúmedo (Im = -20 -0) y semiárido Im = -40 - 20. La temperatura media

anual va desde los 9 a los 170 C (Fig. 11>, si bien el área de estudio está comprendida

entre los 13 y j50 C, con riesgo de heladas nocturnas desde finales de otoño a

primavera avanzada, los veranos son secos y calurosos. Su hidrografía está representada

fundamentalmente por dos nos, el Guadiana y el Júcar, que afectan poco a la region

manchega. Los dos afluentes principales del Guadiana, el Záncara y el Ciguela aportan

poco caudal, lo que unido a la escasa pendiente del terreno y al drenaje imperfecto de

la roca subyacente, caliza, hace que se produzcan fenómenos de endorreismo y la

formación de lagunas o charcas de carácter salino. Por otro lado, el agua de lluvia se

filtra por las numerososasfisuras de la roca y se acumulaformandoun manto acuífero

muy potente. Los restantes afluentes y arroyos son de poca importancia, debido a su

curso intermitente y normalmente están secos en verano debido a las escasas lluvias.

la intensa evaporación estival y el carácter kárstico de la roca caliza.

Desde el punto de vista geomorfolágico, ha seguido la misma evolución del antiguo

Macizo Ibérico del que es parte integrante. Desde el litológico se encuentran en La

Mancha los siguientes materiales que, a continuación se indican y que darán lugar a los

respectivos suelos:

- Sierras constituidas por materiales paleozoicos (pizarras y cuarcitas) y que forman,

aparte de las grandes cordilleras, los montes-islas ditribuidos principalmente por las

provincias de Toledo, Cuenca y, en menor proporción, Ciudad Real.

él

- Los conos de materiales volcánicos (basaltos y limburgitas) que forman el Campo de

Calatravay que hacende límite occidental.

- Materiales de origen secundario(margas abigarradas,dolomitas,areniscas,calizas y

margas)que pertenecena los pisos Triásico, Jurásicoy Liásico y que se localizan en

las proximidadesdel Campode Montiel, entre Valdepeñasy Villanueva de los Infantes.

Dan lugar a suelosmuy aptos para el cultivo del cereal.

- La llanura manchega,formadaprincipalmentepor materialesterciarios y cuarternarios

de origen químico y detrítico. Los primeros constituidos por arcillas, yesos,margasy

calizasde origen miocenoy oligocenoprincipalmente;los segundosformadospor cantos

de cuarcita,arena,arcillas, etc., de naturalezamás bien silícea.

- Entre los materialesde origen químicohemosde destacarla costracaliza ó caliche que

forma parte u origina la mayoría de los suelos manchegos,cuyo aprovechamiento

principal hastahace pocotiempoha sido el cultivo de la vid y ahora seestánimponiendo

los cultivos de regadio (alfalfa, maíz, etc.).

-Otros terrenoscuaternariosson los constituidospor los derrubiospedregososde ladera

de las sierras paleozoicaso montes-isla, compuestospor cantos de cuarcita apenas

rodados y unidos por una matriz arcillosa que proviene de la descomposiciónde la

pizarra. Suelen estaraprovechadospara el cultivo del olivar.

Desdeel punto de vista edáficodestacael marcadocaráctercútrico de la casi totalidad

de los suelos presentesen esta región. En consecuencia,salvo raras excepciones,los

suelosmás desarrolladosno suelensobrepasardel estadiode Luvisol, como también es

frecuente en otras regionesmediterráneas.En el área de estudio, de acuerdocon el

mapade suelos de la FAO/UNESCO(1985), se distinguennueveasociacionesde suelos

(Fig. 12), luvisoles rodocrómicosy cromocálcicos,cambisolescálcicos,dístricos,eutrícos,

gléicos,solonchaksgléicos y vertisoles,los que presentanuna mayor extensión

63

superficial poseencomo tipo principal los Cambisoles(suelospardos),dístricosy eútricos,

en la región occidental (sobre sustratos graníticos y neisicos en el primer caso y

pizarrosos en el segundo) y cálcicos en la oriental (sobre calizas y otros materiales

carbonatados).Como en otras áreascon predominanciade los ambientesmediterráneos

semiáridos(caracterizadospor recibir menos de 400 mm de precipitación anual), los

principalesriesgos de estossuelosson los de erosión y los de salinización,tras su puesta

en regadio,si no se toman las medidaspreventivasoportunas.Por último cabe destacar

los problemas que, en este tipo de ambientes, tiene la pérdida de materia orgánica del

suelo, por acción de las prácticas agrícolas. Si ésto ocurre, se inicia un proceso de

degradaciónde la estructura del suelo, se pierde gran parte de la capacidaddc

almacenamiento de agua y se favorecen los procesos erosivos. En otras palabras se

aridifica el ambienteedáfico con los consiguientesproblemasde desertizaciónen unos

ecosistemasmediterráneossemiáridosde por sí muy frágiles.

La extensión del viñedo en estaregión representala mayor concentraciónmundial de

dicho cultivo, el 8% de la superficie vitícola mundial, el 11,4%de la europea,cl 9,7% de

la superficie geográficatotal de la región, el 18,3% de sustierras cultivadas y el 73,35

de las dedicadasa cultivos leñosos y en torno al 50% (47,4t¿en regadío y 48,55 en

secano)de la superficie nacional dedicadaa viñedo. Su distribución de acuerdocon el

“Mapa de Cultivos y Aprovechamiento del Ministerio de Agricultura, Pesca y

Alimentación” (1986)se indica en la Fig. 13. Se recomiendapreferentementeque según

RealDecreto115/1985de 5 de Junioparael cultivo en estazona, 14 variedadesdistintas

y otras seis estánautorizadaspero la variedadmás extendidaes la Airen, seguidade

Garnacha,Bobel, Monastrel y Cencibelentre otras.

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l!!!E]~ Coba? t 8,71C,rnidia t 6 £1.tlnt•

ronastrel t 3,21.

CencibOl ±1.41.

B D Otros t I,fl

Fig. 13.— A Distribución del viñedo según denominaciones de origen.B. Porcentaje de las distintas variedades cultivadas (deacuerdo con el mapa de cultivos y aprovechamiento del MAPA)

EJ LA MANCHA

W VALDEPENAS

MENTRIDA

ALMANSA

~ IJUMILLA

65

Respectoa la producción, según el Anuario Estadísticode la Producción Agraria de

1988, representael 50,98%de la producciónnacional de uva, correspondiendocasi el

70% a la variedadAiren.

Desdeel puntode vista demográficoexisten en La Mancha511 ha de vid por cada 1000

habitantes,lo que representa1334 ha/lOCOhabitantesde poblaciónactiva y 4528 li/lOGO

habitantes de problación económicamenteactiva, por lo que actúa como factor de

riqueza y fijación de población.

Las zonas vitícolas se asientanen una gran llanura de escasasondulaciones,con una

altitud media que oscila entre los 600-900 m, con clima continental extremadomuy

adecuadoal cultivo de la vid, perode escasafertilidad y pluviometría (menosde 400 mm

año), que le hacen poco rentable para otros cultivos, si no se introduce el regadío.

Debido a ello el viñedo constituye en La Mancha el aprovechamientoidóneo de los

terrenosmás desfavorables- pobres,secos,semiáridosy arenososde poco fondo.

11.2.2. FINCAS EXPERIMENTALES -Para la realizaciónde estudiospuntualesse han

elegidodos fincas que por sus característicasresultan idóneasa nuestrosfines y que a

continuaciónse describen.

I].2.2.1 Finca experimental “La Higueruela’ (Fig. 14>.- La Finca Experimental ‘La

Higueruela” se encuentrasituada entre los términos municipales de Santa Olalla y

Maqueda,a 80 km de Madrid, tiene una extensiónde 90 ha distribuidas en 7 parcelas

(Fig.14), de acuerdocon las característicasy topografíade la finca. Casien su totalidad

se dedica a cultivos de secanoy actualmenteexisten 4 ha de viñedo, ya que en 1983,

siguiendolas directricesdel Ministerio de Agricultura se levantaron6,5 ha de viña vieja.

DEHESA

CEREAL

m

r

Hg. 14 .— Finta E,q,erilflefltfil La HiguerUela’ t.s.i.C

67

Los suelos de la finca se incluyen en los suelos desarrollados sobre sedimentos detríticos

arcósicosque se definen como ‘FaciesMadrid’k El viñedo se encuentrasobreun luvisol

con horizonteA franco arenoso,un Bt variable entre arcilloso, franco-arcillosoy franco-

arcilloso-arenoso,la presenciade carbonatocálcico en profundidades desordenaday

arbitraria, generalmenteen forma de vetas blancasen los sedimentosdetríticos. La

variedadde vid cultivada es la Garnachatípica de la denominaciónde origen Méntrida

sobre pie Ritcher. La producciónmedia es de 3.000 kg/ha, lo que supone3 kg/cepa.El

clima, de acuerdo con OLIVER et al. (1985), se encuadra en el clima continental

semiárido,con inviernos frescos y elevadastemperaturasestivales.

11.2.2.2. Finca de la EscuelaMuseo de la vid y el vino de Madrid .- Situada dentro del

recinto de la Casade Campo(Avda.dePortugal),tiene una superficiede unos15.000rn2

cultivados de vid, unas 5.400 cepas de las variedadesGarnacha,Tinto Fino, Airén,

Ohanes y Cavernet Sauvignon principalmente, y dos subparcelas con distintos

portainjertos (Fig. 15). Conociéndose la procedencia y evolución de todas las variedades,

11.3. MUESTREOSREALIZADOS

.

Los datos existentesen la bibliografía sobre GFLV en España,indicabanla existencia

del virus en aproximadamenteel 80%de los viñedos,ante tales planteamientosbastaría

diseñarun muestreoen La Mancha, en el que para un error menor del 0,025%sería

necesariotomar 1.000 muestraspara confirmar tales hipótesis.Todas las estimasde

frecuenciasque vienenacompañadasde un intervalode confianzaal nivel estadísticodel

95 % como los tamañosde las muestrasson relativamentegrandes.Utilizamos para

calcular los intervalos la aproximaciónnormal:

1 9(1-9)/N = 1.96 1 9(1-9)/N

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69

donde N es el tamaño de la muestra.Sin embargo,se considerónecesariorealizar un

muestreoprevio al estudio epidemiológicoen zonas vitícolas con distintas condiciones

medioambientales,a fin de comprobarsi la magnituddel problemapresentabadiferencias

en unas y otras condiciones.

11.3.1. MUESTREOS PREVIOS.- En las zonas vitivinícolas elegidas se realizaron

muestreosentre Junio y Noviembre de 1989, dirigidos, en general, a aquellas zonas

donde previamentese habíadetectadosintomatologíao algún otro problema,teniendo

en cuenta los distintos tipos de suelos y el mayor númerode variables posible.

En cadamuestreose inventarió la sintomatologíaobservada,en el viñedo en general y

en la cepamuestreaday se tomaronmuestrastanto de suelocomo de material vegetal

(hojas, sarmientos y raíces), a fin de estudiar la presenciade virus y/o nematodos

vectores,así como la de otros factores hióticos y abióticos que puedieranser causade

las alteracionesobservadas.Las muestras,en estecaso, se lomaron siemprede suelo y

material vegetal en la cepa más deprimida o con sintomatologíamás clara y, además,

se tomó material vegetal de otras dos cepaspróximas, una de las cualesse eligió en

todos los casos con buen porte.

En la Tabla ¡ se dá la relación por orden cronológico de recogida de las muestrasde

suelo tomadasen las tres zonasvitícolas elegidas,indicandoel númerode orden, fecha

de recogida, número de laboratorio, localidad y coordenadaUTM a que pertenece,

variedad,cuandose conoce,y sintomatologíaobservadaambascodificadasy nbmerode

muestrasde material vegetaltomadasen cada punto. En las muestrasrecolectadasen

Noviembre de 1989, la sintomatología consideradafué únicamente deformación de

madera,al no existir ya hoja por lo avanzadode la época.

YO

Paralelamentese ha estudiado e incluido el material amablementecedido por los

compañerosdel Centro de Diagnósticode Aldearrubia(Salamanca)quienesrealizaron

prospecciones,en colaboracióncon técnicosy agricultores de la Autonomía de Castillafi

León, en las zonas de denominaciónde origen de Toro, Cebreros,Cigales, El bierzo,

Ribera de Duero y Rueda. Las muestrasde material vegetal fueron recogidasen las

zonas de dichas denominaciones que venían planteando problemas y mostraban una clara

sintomatología, posteriormente se tomaron muestras de suelo en aquellas zonas en que

se habia detectadopresenciade virus. En la Tabla II se recogeel total de muestras

estudiadas,con indicación del númerode parcelasestudiadasy muestrasrecogidas en

cada una, en los distintos municipios, ordenadassegún la denominaciónde origen y

señalandosu coordenadaLJTM.

11.3.2. MUESTREO EN LA RECION DE LA MANCHA- Tras los análisis de los

resultadosde los muestreosprevios se centró el estudioen los viñedos de La Mancha

debido, como ya se ha indicado, a la gran extensión del cultivo en la zona, su

homogeneidady peculiarescaracterísticasedafoclimáticas.

Por lo tanto,durantelos mesesde Noviembre (1989), Mayo y Junio(1990)se realizaron

en la zona una serie de muestreosen los que únicamentese recogiómaterial vegetal

(sarmientos y brotes jóvenes respectivamente>a fin de realizar en el laboratorio el

seguimientode la presenciay titulación del virus a lo largo del año, tanto en material

recientecomo en el procedentede su estaquilladoen invernadero.Paraello se tomaron

dos muestrasen cadapunto,al azaren las recolectadasa lo largo de Noviembrede 1989

y tomandouna al azar y eligiendopara la segundaaquella que mostrabamayor

71

deformaciónde madera en el muestreode Mayo-Junio de 1990. En la Tabla III se

relacionan los puntos de muestreo,con indicación de fechas de recogida,localidad y

coordenadaUTM correspondientea ambosmuestreos.

En Diciembre de 1990 se llevó a caboun nuevo muestreo de maderadeformadapara

estaquillaren invernaderoy seguir su evolución,a la par se tomó al azar una muestra

de suelo por cada5 de madera,la relación de todasellas se refleja en la Tabla IV, en

la que se indica, fecha, localidad, coordenada,UTM y punto en que se tomó suelo.

Posteriormente,a lo largo de 1991, se realizarion muestreosperiódicos de suelo y

planta en aquellos puntosdonde se habíanobtenido resultadospositivos en muestreos

anteriores,a fin de comprobar la correlación virus-nematodo,estudiar la biología del

nematodo, obtener material para la realización de pruebas de transmisión en laboratorio

y estudiar en estos puntos en qué parte de la planta y época del año se conseguían

lecturas mayores por ELISA

11.3.3. MUESTREOS EN FINCAS EXPERIMENTALES.- Debido a que en la parcela

dedicadaa viña en la finca de “La Higueruela”se veníanobservandoclorosis,desdehacía

algunosaños, y tras comprobarsu correspondenciacon la presenciade virus se diseñó

en dicha parcelaun muestreoal azarpor ordenador(Figló) a fin de comprobarel grado

de infección existente,de acuerdocon el diseño se tomaron 30 muestrasde material

vegetal y 10 de suelo.

72

A la vista de los resultadosse realizó un seguimientode las cepasinfectadas,a fin de

comprobar la presenciadel virus en las distintaspartesde la planta, todo a lo largo del

año y comprobarlos posiblesefectosde la termoterapiaen los mesesmás cálidos,dadas

las altas temperaturasque se alcanzanen la zonaen los mesesestivales.Paraello se

tomaba material vegetal de 15 cepas,cadasemanadurante los mesesde primavera,

veranoy otoño de 1990 y mensualmentea lo largo del invierno hastatomar los primeros

brotesen la primavera de 1991,cerrándoseasí el ciclo vegetativo.Se tomaron también

muestrasde tierra a distintasprofundidadespara comprobarla presenciao ausenciadel

vector.

En Agosto de 199<), cuandola sintomatologíaera más patente, se diseñó un nuevo

muestreo,en que tomando como centroalguna de las cepas positivas en que se venía

realizandoel seguimiento,se hacía una toma de las cepascolindantesde forma radial,

con ello se pretendíadiscernir si la infección se venía propagandoa través del vector

o era debida al patrón ó material de injerto; de este modo se recogió una media de 25

muestrasdc material vegetalpor cada punto lo que suponeun total de 294 muestras.

A fin de establecerla correlación entre la sintomatologíaobservaday la presenciade

virus se realizaron tresobservacionesvisualesen toda la finca, con suscorrespondientes

muestreos,cepa a cepa a lo largo del mes de Agosto, representandoun total de 3832

muestras.

Para comprobar la incidencia de la enfermedad en la producción, en la época de

recolecciónse estimé la producciónde 100 cepaspositivasde virosis frente a 100 sanas,

pesándoseel total de uva procedentede cadacepa.

4435.5

4435.3

4435.1

4434.9

4434.?

379.7 379.9 379.1

• Muestra material vegetal

• y suelo

Fig. 16.— Muestreo en la Finca ta l-ligueruela

74

La existenciaen la EscuelaMuseode la Vid y del Vino de Madrid de variedadesde vid

bien tipificadas brindaba la oportunidad de comprobar la relación síntoma—variedad-

virosis. A tal fin se realizó, igualmentepor ordenador,un diseño (Fig. 17) que implicó

la toma en Junio de 1990, de 126 muestraspertenecientesa 6 variedadesdistintas:

Airén, Cavernet-Souvignon,Chadornnay,Garnacha,Ohanesy Tinto Fino.

Posteriormentese realizarondos muestreossucesivos,siempre de material vegetal,el

primero de 11 muestras de las variedadesde vid más ampliamente cultivadas en

Castilla-La Mancha, A.irén y Tinto Fino, que presentaban fuertes síntomas de

deformación de madera.El otro consistió en la toma de 49 muestrasde las mismas

variedadesen dos filas de cepas contiguas,lo que igualmentenos permitirá establecer

la relación sintomatología-virosis y el “pattern de transmisión por vector o

injerto/patrón. El total de muestrastomadasen estecaso fué de 178.

En la colección de variedadesde la Finca del Departamentode Viticultura y Enología

del Centro de InvestigacionesAgrarias de la Consejeriade Agricultura y Alimentación

de La Rioja se tomaron muestrasde las siguientes:Viura, Malvasia, Garnachablanca,

Garnacha tinta, Tempranillo, Mazuelo y Graciano. De estas mismas variedadesse

estudió, en distintas partes de la planta y en diferentes épocas del año, material

estaquilladoen invernadero,enviadoen repetidasocasionesdesdeestafinca.

En la tercera repetición del campo de variedadesde la Finca de Investigación y

Experimentación Vitivinícola de Tomelloso. <Consejeria de Agricultura de la Junta de

Comunidades de Castilla-La Mancha) se tomaron muestrasde las siguientes:cepa12 de

la variedad Merlot, la 16 de la Cencibel,la 16 de la PedroXimenez, la 14 de la Cavernet

franc, la 13 de Airén, la 15 deAlbillo, la 12 de Garnacha, la 10 de Chadornnay, la 8 de

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76

Cavernet-Sauvignon,la 6 de Macabeo,la 15 de Tinto Velasco, la 4 de Malvar, la 3 de

Ugni-blanc,la 4 de Moscatelgranomenudo,la 6 de Monastrel, la 9 de Pinot Noir, la 10

de Messeguera,la 12 de Tintorera, la 14 de Sauvignon,la 15 de Coloraillo, la 16 de

Riesling y la 17 de Torrontés; y cinco muestras de la colección de variedadesde

portainjertos y viníferas. Las 22 muestrasdel campode variedadeshabíansido tratadas

con DO.

11.4. RECOGIDA Y PREPARACION DE MUESTRAS

.

La recogida y preparaciónde muestraspuedetenergran influenciaen los resultadasque

se obtengan,por lo que debehacersede acuerdocon los fines perseguidos.En el caso

de los nematodosfitoparásitoshay que teneren cuenta que al dependerdel hospedador

tienen una distribución espacialen agregadoso contagiosa,una distribución vertical o

temporal,dependiendode su biología y medio ambienle.En el casode los virus, también

puedenexistir variacionesen su concentraciónen las distintaspartesde la planta y en

las diferentes épocas del año. Por tanto, se describe a continuación con detalle el

procedimientoseguidopara la toma de muestrasde suelo y material vegetal.

11.4.1. MUESTRAS DE SUELO.- Para la toma ordinaria de una muestrade suelo se

utilizan como instrumentosunaazadilla y enocasionesunasondao un pico, dependiendo

del tipo de suelo. Con la azadilla se eliminan los primeros centímetros de la capa

superficial del suelo y a partir de este punto se cava, en la orientaciónconveniente,

hastaencontrarlas raicillas secundariasde la planta,en cuya proximidad se toma una

porciónde tierra y raícesde unos500 g aproximadamente,en el mismopunto se vuelve

a cavar hastaencontrarun horizonte distinto de donde se toma una segundamuestra

de característicassimilares.Las muestrasse introducen en sendasbolsas de plástico y

77

se cierran, para evitar la pérdida de humedad y se etiquetan debidamentecon un

número correspondienteal cuaderno de campo, de este modo se transporla al

laboratorio.Paralelamentese anotanen el cuadernode campotodos los datosde interés

sobre localidad, coordenadaUTM, sintomatologíaobservaday cualquier otro dato de

interéspara el estudiodel materialrecogido.

Parael estudiode las poblacionesde nematodosen los distintoshorizontesde un punto

concretocon fuerte infección de virus en “La Higueruela’ y Socuéllamos,se diseñaron

una seriede muestreosen invierno, primavera,verano y otoño, en zonasde coincidencia

de puntos positivos de virus y de Xiphinema que ademáseran focos claramente

viróticos. Las zonas elegidas fueron: Socuéilamos,una zona de mosaico amarillo; Ossa

de Montiel, tambiénzonade mosaicoamarillo; Valdepeñas,en los parajes“Les Córdoba

y ‘La Encomienda. Viñedos con fuertes síntomas de virus y, por último, entre

Valdepeñasy Daimiel se tomó un punto con mosaicoamarillo, que siempre da positivo

de virus, aunqueno se ha encontradoel vector.

La toma de muestrasse hizo en las cuatro orientaciones de la cepa y a distintas

profundidades(Fig. 18). Simultáneamentese tomaronmuestrasde material vegetalen

las distintas orientacionesde la cepa (N.S.E.O.) y de raíces de distintas tomas y a

diferentesprofundidades,para analizarpor ELISA.

En la Finca Experimental“La Higueruela”se haceun corte entrelas cepas1 y II de 2,50

x 0,70 x 1,50 tu de profundidady se toman muestrasde raíz y de tierra en el talud junto

a CI y CII y en el lateral entre ambascepas a 1,25, 0,40, 0,80, 1,20 y 1,50 m de

profundidad (Hg. 19).

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A

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21

Figs. 18 y 19:—Esquemas de la metodologia seguida en la toma de mnuesen distintas orientaciones y profundidades, en Socué—liamos <flg.18) y La Higueruela CF1gi9

.r<rt

79

11.4.2. MUESTRAS DE MATERIAL VEGETAL.- En los muestreosprevios de las zonas

vitícolas y fincas experimentalesse tomaronmuestrasde cepasaparentementeviróticas.

Las muestrasse tomaronen los brotes terminalesde diferentespartesde la planta,así

como de hojas y tallos más viejos, próximos a la basede la cepa,así como de raíz.

De acuerdo con los resultados obtenidos, en los siguientes muestreosse buscaba

cuidadosamentela planta que presentabauna sintomatologíamás acusada,tomando

igualmentetallo, raíz y hoja, y en la misma viña se tomaron de igual modo otras tres

muestrasde distintas cepasuna de ellas con porte normal o ausenciade síntomas.Las

muestrasse introducenen bolsasconvenientementeetiquetadasy se trasladanen nevera

al laboratorio. En las muestrasde otoño se tomaron 5 varetasde unas cinco yemas de

cepaselegidasal azar.

11.5. MÉTODOS DE EXTRACCION Y ESTUDIO DE NEMATODOS DEL SUELO

Existe un gran númerode técnicasde extracciónde netuatodos,muy variadadesen su

complejidady eficacia,desdeel sencillo método de Cobbpor tamizado,que sólo requiere

dos cubos y dos cedazosde distinta malla, hasta el complejo elutriador diseñadopor

SEINHORST(1956 y 1962).

De todos ellos, el de centrifugación en azúcar (NOMBELA y BELLO, 1983) puede

considerarsecomo el método de extracciónmás general,medianteel cual se obtiene la

mayor partede los nematodoscontenidosen unamuestrabasándoseen su flotabilidad,

siendo de especialaplicaciónpara nematodosde bajamovilidad y huevos.Sin embargo,

para el estudio de los grandesLongidóridos,entre los que se encuentranlos

80

transmisoresde virus es mucho más eficáz el método de FLEGG (1967), basadoen su

movilidad y velocidad de sedimentación,que es una modificación de la técnica de

decantación-fijaciónde CORE y que es el que básicamentese ha utilizado en este

estudio, junto al de centrifugación,antescitado, que se utilizó en el muestreoprevio

y que permitió la extracciónde los jóvenesde primer estadiode menor tamaño.

En este tipo de extracciones pueden distinguirse una serie de pasos previos a la

preparaciónde muestrasy el procesode extracciónpropiamentedicho, que es diferente

si se partede una muestrade suelo,raíz o fracción peri-radicular.

11.5.1. PREPARACION DE MUESTRAS DE SUELO,- En el laboratorio la muestrase

etiqueta y se registra con el númerocorrespondienteen el cuadernode laboratorio,

donde se anotan todos los datosrecogidosen campo.Parasu conservaciónse mantiene

en cámara a 5’ C hasta el momentode su extracción, para evitar en lo posible, la

variación de poblacionesde nematodosdesdeel momentode la recoleccion.

La preparaciónde la muestrapara la extracciónde nematodoscomienzavertiendo el

contenidode la bolsa sobreun papel de filtro, procediendoa separarcuidadosamentelas

raíces del suelo. Despuésde homogeneizadoel suelo se pasapor un tamiz de 2 mm de

malla, con objeto de eliminar la grava, y se anotanen una hoja de característicassus

rasgosmás destacables:textura, humedad,compactación,presenciade raices de malas

hierbas.Otra fracción se utiliza para la extracción de nematodos.

81

En estudiosnematológicosel aislar los nematodoscontenidosen las muestrasde suelo

y raíz, con objeto de proceder a su posterior recuento, determinación y estudio

consitituye uno de los aspectosfundamentales.El métodoempleadopara ello será tanto

más eficaz cuanto mayor númerode nematodosconsigaextraer,despuésde eliminar,

a ser posible, los demáscomponentesdel suelo (arcilla, arena, limo, materiaorgánica,

etc.) y su elección dependedel tipo de nematodoque se investigue.

11.5.2.METODO DE SEDIMENTACION - DECANTACION (Fig. 20 A).- Se ponen 250

ce de agua en un vaso graduadoy se le añadesuelo cribadoy homogeneizadocomo se

indica arriba, suficientehastaenrasara 450 cc con lo que dará una media de 200 cc de

suelo independientede los espaciosocupadospor el aire. La suspensiónresultantese

vierte en un vaso de plástico de un litro que se enrasacon agua.

Paralos suelosarenososes suficiente que se remoje durantemedia hora, pero para las

muestrasarcillosasse precisauna hora. Durante el periodo que permaneceen agua la

suspensiónse agitados o tres veccscon unaplaca circular de diámetropocomenor que

el del vaso y taladradacon númerososagujeroscónicos,removiendorápidamentehacía

arriba.Una vez pasadoel periodo de remojonecesariode la muestra,tras enrasarlocon

agua, se mueve profundamentea mano para suspenderlas partículas. Despuésde 25

segundosde sedimentación,el fluido sobrenadantese decantaa travésde una bateria

de 3 cedazosde 150 ~smde aperturade malla.

El residuode los cedazosse lava de un modosuavey se recogeen un vaso.El residuo

de la filtración se enrasacon agua, se remuevede nuevo profundamentey, tras 15

segundosde sedimentación,se decantaa través de la misma bateria de cedazos.El

residuode los cedazosse lava cuidadosamentey se recogejuntamentecon el anterior.

82

Los filtrados así recogidosse agitan suavementepara suspendertodas las partículas

antesde verterlo sobre el cedazode nylon de 90 j.tm de aperturade malla, montado

sobre un anillo de polietileno, que despuésse coloca en un embudoBaernian con agua

suficiente para que el filtro y los residuosqueden sumergidos.Pasadas20 horas se

puedenrecoger en el extremo del embudo en una copa de unos 25 cc de agua que

contendrálos nematodosde la muestra.

11.5.3. METODO DE CENTRJFUGACION.(Hg. 20 B).- Como en el caso anterior, del

suelo tamizadose toman 100 cc, que se depositanen una cápsulade porcelana,junto

con una etiqueta de plástico en la que figure el númerode muestra;se cubre de agua

y se deja durante un cuarto de tora como minimo, antes de procedera la extracción

propiamentedicha. En el caso de que la muestraesté húmeda y no se puedatamizar,

se eliminan con la mano las piedrasy fibras y se ponendirectamentelos 100 cc.

El bocal se completacon agua, sí es necesario,para que quede lleno bastael borde,

dejándoloreposar2 horascomo mínimo o mejor toda unanoche,para que sedimenteel

limo y suban a la superficie los restos vegetales,los cualesse eliminan a presiónsobre

la superficie del bocal.

Si se sospechala presenciade Heterodera,es necesariocolocar una bandade papel de

filtro de una anchurade unos 10 cm alrededordel bocal antesde llenarlo, para que los

quistes se adhierana ella. En este caso, la bandase retirará cuidadosamentepara

observarlabajo el microscopio estereoscópicoa 20 aumentos,antesde procedera la

eliminación de las fibras vegetales.

A

FIg. 20

A—¿squema del método de extracción por sedimentación filtración.

8-Idem del método por centrifugación en azúcar.

84

Para eliminar parte de la arcilla que está en suspensiónse utilizan unos sifones de

filtración con un tamiz de 28 ram, mediantelos cualesel contenidodel bocal se reduce,

y se trasvasaa un recipientegraduadode un volúmen aproximadode 1000 cc, dejándolo

reposaralrededorde unahora;esterecipientecontienefundamentalmentelos nematodos

y el limo.

Tras la sedimentaciónse filtra por un tamiz de 28 pm reduciendoel volumen a unos300

ce, los cualesde distribuyen uniformementeentrecuatrotubosde centrífuga,procurando

que su contenidono llegue al borde, y se sometea unas 1800 revoluciones durante3

minutos.El líquido sobrenadantede los tubos se recogeen un recipiente y se añade a

los tubos de centrífuga una solución de azúcar al 30% homogeneizandoel contenido

perfectamentecon una espátulaantesde volver a introducirlos en la centrífuga,esta vez

sólo durante 30 segundos.El líquido sobrenadantese recoge en un recipiente que

contiene la suspensiónprocedente de la primera centrifugación y se ultra todo a

continuaciónpor un tamiz de 20 pm, al mismo tiempo que se lava intensamentecon

agua para eliminar el azúcar.El tamiz se inclina y se lava cuidadosamentehaciendo

escurrir el agua hacia la parte inferior para recoger todo su contenido en una sóla

porción de dicho tamiz, pasandoa continuacióna una placa de Petri; así quedalista la

muestra para su conservacióny recuentobajo el microscopioestereoscópico,después

de haberladejado reposarunos minutos.

11.5.4. METODOS DE ESTUDIO CUANTITATIVO Y CUALITATIVO DE LOS

NEMATODOS .- En este apartado se describen los métodos empleados para la

cuantificación de los nematodos extraídos, así como los métodos y caracteres

morfológicosutilizados en la determinaciónde las especies.

85

11.5.4.1. Recuento,aislamiento. fliacion y montaje.-El recuentode los nematodosse

realiza en placas de Petri de fondo plano, bajo microscopio estereoscópicoa 30

aumentos;si el númerode nematodoses pequeñose recuentandirectamente,pero si

se observauna gran cantidadde ellos, se divide la placa en cuadrantescon un lápiz

graso. Les resultados se anotanen unahoja de recuentoen la que constanlos géneros

más frecuentesestudiados.La cantidadde nematodospresentesen 1.000 cc. de suelo

se obtienen multiplicando por 5 el númeroobtenido en el recuento, ya que éste está

referido a 200 cc.

El aislamiento de los nematodosse realiza inmediatamentedespués de la extracción

para evitar eí crecimientode micelios de hongosen la placa. Les nematodosse aislan

con un pincel y se colocan sobreun portaobjetos,dondepreviamentese ha colocadouna

gota dc aguadestilada.El númerode nematodospor preparaciónno sobrepasaráa 10,

poniéndoseen un pocillo con agua destiladael resto de los nematodos,cuyo estudiose

considerede interés, para su posteriormontaje y fijación.

La muertede los nematodosaisladosen el portaobjetosse realizacalentandoligeramente

éste con la llama de un mecherode alcohol para que se evaporeal mismo tiempo la

mayor partede la gota de agua,procurandoque no lleguea evaporarseen su totalidad,

a fin de que los nematodosno se contraigan.A continuaciónse añadeuna pequeñagota

de azul-lactofenoly se desliza suavementesobre ella un cubreobjetos.Por último la

preparaciónse bordea con “glyceel”, primero en cuatropuntos y, una vez estos secos,

en su totalidad.

81,

La muerte y fijación de los individuos consideradosde interés,previamenteaisladosen

el pocillo, se realiza en el mismo día para evitar así que crezcanlos micelios de hongos

sobre ellos. Con una pipeta se procedea retirar la mayor partede aguadel pocillo y a

continuaciónse añade fijador 1, previamentecalentadoa 75-80’ C, al bañoMaría y se

tapa el pocillo. Transcurridos unos días se destapael pocillo y se introduce en un

recipiente de cierre hermético con alcohol de 96’ y éste, a su vez, se coloca en una

estufa durante 12 horas a 390 ~; transcurrido este tiempo el pocillo se saca de la

atmósferade alcohol y se deja evaporarlentamenteen la estufa.

Una vez evaporadoel fijador 1, se añade fijador 11 y se vuelve a introducir en la estufa

hastaque éste se evapore;por último se añade fijador 111, introduciéndosede nuevo

en la estufa,en la que debepermanecerhastauna semana.Posteriormentese extrae

el pocillo de la estufay se lleva a un desecadorque contienecloruro cálcico o silicagel,

donde permaneceráen glicerina hastael momentode su montaje.

La composiciónde los fijadores utilizados siguiendoel método de DE GRISSE (1969)

es la siguiente

Fijador 1:

Agua destilada 89 ce

Formol 40% 10 ce

Glicerina 1 ce

Fijador 11:

Etanol 96% 95 ce

Glicerina 5 ce

87

Fijador III:

Etanol 96% 50 cc

Glicerina 50 cc

11.5.4.2. Conservaciondel extracto de la muestra.- Realizado el aislamiento de los

nematodospara sumontaje,el contenidode la placa de Petri con los nematodosrestants

se pasaa una copa graduada,dejándosesedimentarcomo mínumo durantedos horas.

Una vez sedimentadose reduceel aguacon un fraseo lavador,pasándoseel contenido

a un frasquito de 15 cc de volumen,para su posteriorconservación.A continuación, la

copagraduadase lava con fijador 1, previamentecalentadoa 75-80’ C al baño María, y

éste se vierte en el frasco de conservación,con lo que los nematodosquedan fijados.

Posteriormenteel frasco se tapa con un tapón de corcho, quedandodispuestopara ser

etiquetado. En la etiqueta se indica el número de la muestra, así como la planta,

localidad y fechaen que se preparael frasco para su conservacion.

11.5.4.3.Observacionesmicroscopícas-Lasobservacionesse hanrealizadode 400 a 1.200

aumentos,utilizando un microscopio ‘~lSS con contraste de fases y cámaraclara

incorporados.

Mediante inmersión y contraste de fases se han estudiado las características

morfológicasde los nematodos,permitiendosu determinacióna nivel de género; y por

medio del estudio morfo-métrico de los ejemplares,complementadoscon dibujos a

cámara clara, se ha llegado a su determinación a nivel de especie, utilizando

principalmentelos indices somatométricosde De Man.

88

Indices de DE MAN (Fig. 21):

L~ Longitud total en mm

Loneitud totalanchuramáxima

LonQitud totalLongitud del extremoanterior bastael

final del esofago

Lontnittid total

Longitud de la cola

V= Distancia del extremoanterior de la vulva xlOOLongitud total

SOUTHEY (1970) introduce la longitud en hm dcl odontostilo y el siguiente índice:

c = Distancia del anoal extremoposteriorDiámetro anal

FIQOPER y SOUTHEY (1973> añadenlas longitudesdel odontostilo(oc)) y odontofoi-o

(odp) en .¿n~ y el índice: oa-gr= Distancia en pm del anillo guía del estilete al extremo

anterior.

Fig. 2V— Indices de DE MA N: L= Lóngitud total; v= distanclá reglananterior — vulva; L es= longitud del esófago; O, y O —longitud ramas ováricas; L c= longitud de la reglón cLidal

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89

11.6. TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DEL MATERIAL VEGETAL

Ya en el laboratoriotanto el material verde como los sarmientosse preparany procesan

inmediatamentede acuerdo con los fines y métodoselegidos en cada momento. En

algunos casos, debido a la cantidad de muestrasrecogidas,seha conservadoalguna

mediantecongelacióna 20’C.

Por otro lado, los sarmientosse estaquillaronen mesacaliente (24’ C> en invernadero

parasu brotación rápida.Para ello se cortan varetasde tres yemas,enterrandodos de

ellas en arena y parafinandoel extremolibre del sarmiento,periódicamentese hacen

riegos con solución nutritiva. Parte de la madera también se conservaen frigorífico a

4’ C para su posteriorestudio.

11.7. TECNICAS PARA LA DETECCION DEL VIRUS

Las técnicas que se han utilizado para la detección de) virus son: 1) transmision

mecánicaa planta herbácea;2) tinción negativa; 3) inmunoelectromicroscopía(1PM);

4) seccionesultrafinas; 5) métodos serológicos (ELISA - DAS, Biotina - streptavidina);

6) hibridacionesde ácidosnucléicos,que a continuaciónse describen.

11.7.1.TRANS MIISION MIECANICA A PLANTA HERBACEA- Parael estudiodel virus

en planta herbácea,se transmite a plantas susceptiblesen las que produce síntomas

claros en periodos cortos de tiempo según las condiciones de invernadero. Se ha

utilizado,a tal fin, ChenopodiumquinoaWilld, GomphrenaglobosaL. y Petuniahibrida

L. Para ello se inoculan plántulas de 2 a 4 hojas del modo siguiente:

90

Para preparar el inóculo se homegeinizael material vegetal infectado en un tampón

fosfato pH 6,5 y molaridad 0,05, con 2,5%de nicotina si el material infectadoprocedede

vid. Se espolvoreanlas hojas de la plántula a infectar con un abrasivo(carborundo600

mesh)para provocar heridasen la superficie foliar, a continuaciónse frota suavemente

el inóculo sobrelas bojas utilizando guanteso sirviéndosede un bastoncillode algodón.

Se dejan dos tipos de planta testigo, unas inoculadas con tampón en las mismas

condicionesque las anteriores y otro lote sin inocular para apreciar el efecto de las

heridasrealizadasal hacerla transmisión.

11.7.2.TINCION NEGATIVA (MicroscopiaEleetrónica).-EIMicroscopioElectróniconos

permite, gracias a la sencilla técnica de las tinciones negativas,conocer la forma y el

tamaño de las partículas virales presentesen una disolución de savia, medio de

extracción,purificado, etc.

Esta información morfológicaes de gran interésen diagnósticoo en investigaciónpues

permite conocer frecuentementeal menosel grupoa que perteneceel virus en estudio.

Para su realizaciónes convenienteseleccionarla partede la planta que presentemayor

concentraciónde virus. Suelen preferirse las zonascon más síntomaso las próximas

a ellas.

Son varios los agentesde tinción utilizados: PTA (ácido fosfotúngstico), acetato de

uranilo, formiato de uranilo,molibdato amónico,etc. Todosellos tienen en común el ser

sales de metales pesadosque se unen en la superficie de la partícula haciendo

electrodensoslos contornosde ésta,mientrasqueel interior de la partículasí puedeser

atravesadopor los electrones.

91

No es posible utilizar un sólo colorante de forma universal, ya que cada virus necesita

una concentración,tampón y pH determinados,para GFLV se útilizó PTA a pH 6,5 y

a una concentracióndel 2%. La técnicase ha desarrolladode dos manerasdiferentes:

A. - Triturar la muestracon unasgotasde PTA sobreun porta con unaspinzaso varilla

de vidrio redondeada.

- Poner una gota de la muestratriturada (que no esté muy verde,preferiblemente

de color amarillo verde pálido) sobreuna rejilla del MicroscopioElectrónico.

- Dejar dos minutos a temperaturaambiente.

- Retirar el líquido en excesocon una pipeta Pasteur y secarcon un papel de filtro

tocando suavementela rejilla. Dejar secar a temperaturaambiente y observar al

Microscopio Electrónico.

B.- Triturar la muestraen un morterocon un tampón adecuadoen una proporción 1/10.

- Centrifugar 10 minutos a 10.000 RP; en una microfuga.

- Llevar una gota del sobrenadantea un porta y mezclar con otra gota de PTA. Dejar

2 minutos a temperaturaambiente.

- Retirar el líquido en excesocon una pipeta Pasteur y secarcon un papel de filtro

tocando suavementela rejilla. Dejar secar a temperaturaambiente y observar al

Microscopio Electronico.

11.7.3. INMUNOELECTROMICROSCOPIA (I.E.M.t- La técnicaI.E.M. conbinala gran

sensibilidadde la serologíacon el alto poderde resoluciónde la microscopiaelectrónica.

Permiteobservardirectamentela interacciónvirus-anticuerpoy cuandoestase produce,

deducir la relación entreantígenoy anticuerpocon valor de diagnóstico.En realidad es

un ELISA efectuadosobre una rejilla del microscopioelectrónico donde no utilizamos

92

un conjugado ni un revelador con sustrato. Se tapiza la rejilla con anticuerpos,

acontinuaciónse pone el antígeno,y según el método se añadeun segundoanticuerpo.

Esta asociación anticuerpo-antígenoo anticuerpo-antígeno-anticuerpopuede ser

observadaal microscopio.Se ha utilizado para la deteccióndel virus tanto en tejidos

vegetalescomo en los vectores.

Se han utilizado tres técnicasde IEM: ISEM “inmunosorbent electromicroscopy’,que

consisteen tapizar una rejilla con antisuero,añadirel antígenoy posteriormenteteñir;

AVM “antiserum virus mixture” que,como su nombre indica, es una mezclade virus y

antisuerosque se coloca conjuntamenteen la rejilla y Decoración,que es básicamente

como IS EM, pero añadiendo después del antígeno o anticuerpos que recubren la

partícula,decorándola.

11.7.3.1. ISEM (lnmunosorbent Electromicroscopvy- El proceso a seguir para su

realización,es e! siguiente:

- Triturar la muestraen el tampón apropiadoen una proporción 1/10.

- Centrifugar en microfuga a 10.000RPM durante10 minutos.

- Prepararun porta parafinadocon divisionesen cadarejilla y ponerlo en una Placade

Pdn con 3 papelesWatmannhumedecidos.

- Sobreesteporta poner pequeñasgotasde 10 pI) de antisuerodiluido 1/500 en tampón

Sórensens66 mM pH 6,5.Sobre estasgotascolocar las rejillas. Incubar 1 horaa 37’ C.

Lavar las rejillas durante 10 minutos en el mismo tampón y a temperaturaambiente.

Situar las rejillas de tal manera que la parte que haya estado en contacto con el

antisueroestéhacíael tampón.

93

- Poner en otro porta parafinadocon las adecuadasdivisiones gotas de 10 ml de la

muestra.Colocar todo en una placa de Petri con papel humedecidocomo en 1). Poner

las rejillas nadandosobrela muestracon el tapizadohaciael antígenoe incubar2 horas

a 37’ C. Lavar dejandocaer 10 gotasde aguadestiladasuavementesobrela rejilla. Teñir

con PTA dejandocaer 1 ó 2 gotasdel colorante y procurandoque ésteestéen contacto

con la rejilla sólo unossegundos.Retirar cuidadosamenteel PTA sobrantetocandola

rejilla tangencialmentecon trozos de papel de filtro, dejar secar y observar al

microscopioelectrónico.

11.7.3.2. AVM (Antiserum Virus MixtureV

- Se tritura en el tampón apropiadoy en la proporción 1:10. Centrifugar en microfuga

durante10 minutos.

- Prepararun porta parafinadocon divisiones para cadarejilla y ponerlo en una placa

de Petri con 3 papelesWhatmannhumedecidos,poner sobreél pequeñasgotas (de 10

jil) de antisuerodiluido 1/500 en tampón Sórensens66 mM pH 6,5 junto con 10 pl de

muestray mezclarcon la mismamicropipeta.Sobreestasgotas colocar las rejillas

- Incubar 1 hora a 37e c~

- Lavar las rejillas durante10 minutos en el mismo tampón y a temperaturaambiente,

Situar las rejillas de tal manera que la parte que haya estadoen contacto con el

antísueroestéhacia el tampón.

- Poner en otro porta parafinado con las adecuadasdivisiones gotas de 10 ~sl de la

muestra.Colocar todo en una placa de Petri con papel humedecidocomo en 1).

- Poner las rejillas nadandosobrela muestracon el tapizadohaciael antígenoe incubar

2 horasa 37’ C.

- Lavar dejandocaer 10 gotas de aguadestiladasuavementesobrela rejilla.

94

- Teñir con PTA dejandocaer 1 ó 2 gotas del colorante y procurandoque esté en

contactocon la rejilla sólo unossegundos.

- Retirar cuidadosamenteel PTA sobrantetocandola rejilla tangencialmentecon trozos

de papel de filtro.

- Dejar secar y observaral microscopioelectrónico.

11.7.3.3.Decoracion

:

- Triturar la muestraen el tampón apropiadoy en la proporción 1:10. Centrifugar en

microfuga a 10.000 RPM durante10 minutos.

- Prepararun porta parafinadocon divisiones para cada rejilla y ponerlo en placa dc

Petri con 3 papelesWhatmannhumedecidos,sobreeste porta ponerpequeñasgotas (de

10 pl) de antisuerodiluido 1/500en tampónSórensens66 mM pH 6,5. Sobreestasgotas

colocar las rejillas.

- Incubar 1 hora a 37’ C.

- Lavar la rejilla durante 10 minutos en el mismo tampón y a temperaturaambiente.

Situar las rejillas de tal manera que la parte que haya estadoen contacto con el

antisucroestá hacíael tampón.

- Poner en otro porta parafinado, con las adecuadasdivisiones, gotas de 10 ml de la

muestra.

- Colocar todo en una placa de Petri con papel humedecidocomo en 1).

- Poner las rejillas nadandosobrela muestracon el tapizadohacia en antígeno.

- Incubar 2 horas a 370 C.

- Lavar dejandocaer 10 gotasde aguadestiladasuavementesobre la rejilla. Sobreeste

porta ponerpequeñasgotas (de 10 jsl) de antisuerodiluido 1/500 en tampón Sórensens

66 mM pH 6,5. Sobreestasgotas colocar las rejillas.

- Incubar una hora a 37 C.

95

- Lavar dejandocaer 10 gotasde aguadestiladasuavementeen la rejilla.

- Teñir con PTA, dejandocaer 1 ó 2 gotas del colorante,procurandoque éste esté en

contacto con la rejilla sólo unos segundos.

- Retirar cuidadosamenteel PTA tocandola rejilla tangencialmentecon trozos de papel

de filtro.

- Dejar secary observaral microscopioelectrónico.

NOTA Siempre que se utilice acetato de uranilo en cualquiera de estos tres métodos,

es imprescindiblelavar la rejilla con aguadestiladaparaarrastrarel tampónfosfato,que

es incompatible con eí acetatode uranilo y produce fuertesprecipitadossobre la rejilla.

11.7.3.4 Tamnonesy colorantesnecesarios

:

- Tampón FosfatoSórensens(Prepararpreviamentelas solucionesmadreA y B):

A) 1/15 M KP04. H20. Pesar9,06 g y llevarlo hasta 1 litro de aguadestilada.

B) 1/15 M Na2PO4H. 2 H20. Pesar11,8 g y llevar hasta 1 litro con aguadestilada.

Para un pH 6,6: 73,2 ml de A y añadir 26,8 mldeB

Paraun pH 7: 39,2 ml de A + 60,8 ml de B

- ColorantePTA

-2 g de ácido fosfotúngstico

- disolver en SO ml de aguadestilada

- ajustar el pH a 6,9 con NaOH o KOH 1 N

- completara 100 ml con aguadestilada

96

11.7.4.SECCIONESULTRAFINAS.-Parael estudiode las variacionesultraestructurales

provocadastanto en células de plantas indicadoras como de vid infectadascon GFLV,

se han examinadoseccionesultrafinas de estos tejidos por microscopiaelectrónicade

transmisión,así como de controles sanospara su comparacion.

- Fijacién:

Paraevitar la destrucciónde la arquitecturacelular al separarlos tejidos de la planta

y por procesosquímicos y físicos por los que tienen que pasar las muestrasal ser

procesadasy examinadaspor microscopiaelectrónica,esnecesario‘fijar’ estaestructura.

Hemos utilizado glutaraldehidoal 5% en tampón “palade, a una temperaturade 5’ C

y durante45 minutos, introduciendoen este fijador trozos pequeñosde tejido de unos

1 mm cúbicos (como una cabeza de alfiler) para que se produzcauna fijación rápida y

u ni forme.

Despuésde un lavadoen el mismo tampón paladese efectúauna segundafijación con

tetróxido de osmio al 2% en aguabidestilada,durante2 horas y a 5 C.

- Deshidratación:

Por estar el microscopio electrónico en condiciones de alto vacio, es necesario

deshidratarlas muestraspara evitar unaevaporaciónrápidaque destruiríael material

biológico ademásde contarminarel microscopio.Paraelfo se hacenpasossucesivospor

concretacionescrecientes de acetona desde el 30% al 100% introduciendo sales de

metalespesadoscomo el acetatode uranilo y el sulfato de Cu en la acetonade 70% y

100%respectivamente,para aumentarel contrastede la muestra.

97

- Inclusión:

El material fijado y deshidratadose pasados vecespor óxido de propileno para extraer

la acetona y posteriormentese introduce la resma ARALDITA en la que se ha de

mantener e “incluir” las piezas para ser cortadas después de una polimerización

adecuadaen estufa 24 horasa 50’ C y 48 horas a 70’ C.

- Secciones:

En ultramicrotomoLKB III, se procedecon cuchilla de vidrio o de diamantea cortar este

materialen seccionesde aproximadamente400 A y montadosen rejillas de 200 mesh.

- Tiución:

Una vez cortadosy montadoslos cortessobre rejilla se tienen con citrato de plomo o

uranil acetato,dejando flotar las rejillas sobre gota de estecolorante unos 10 minutos

y posteriormentebañadoscon aguadestilada dejandounas gotas con pipeta Pasteur.

Una vez secas las rejillas a temperaturaambiente o en vacio son examinadasen el

microscopioelectrónico.

11.7.5. METODOS SEROLOGiCOS.- Recientementese han desarrollado técnicas

serológicasde inmunoensayocomo la ELISACEnzyme-linkedinmunosorbentassay’)que

son de gran utilidad en diagnósticosvirológicos, son sensibles,específicasy fácilmente

aplicablesa un gran númerode muestras.Por estascaracterísticas,la técnica ELISA

se ha utilizado en nuestros trabajosde detecciónde virus de forma general, tanto en

planta como en vector.

98

De los diversostipos de test ELISA existentes,los tres más utilizadosson: -EUSA-DAS

(double antibody sandwich). (CLARK y ADAMS, 1977); - ELISA indirecto - ELISA

indirectosandwicho TAS (triple antibodysandwich)(KOENING eL al. 1982,CHU et al

.

1989). En este casose ha elegido ELISA-DAS por su gran especificidady sensibilidad

(Fig.22).

113.5.1. ELISA-DAS.- Previamenteal desarrollode estatécnica se hizo una placa de

condiciones para determinar las concentracionesideales de antígeno, antisuero y

conjugado,así como un estudiode diluciones del antisuero.

- Desarrollo de la técnica:

- Marcar en la placa de ELISA, los pocillos que se vayana rellenar, según un esquema

previo.

- Diluir las gamma-globulinas(lgG) del virus correspondientecon tampón carbonatoen

la proporcion mas adecuada,haciendoun estudioprevio de diluciones.

- Añadir 200 pl de IgO diluida a cadapocillo.

- Tapar la placa con un plástico para evitar evaporaciones.

- Incubar a 37’ C durante4 horas.

- Preparaciónde muestras:

Para extraer el jugo vegetal de las muestrasse pueden utilizar diferentesmétodos:

morteros y manos,un polítrón, introducir el material vegetal en bolsas de plástico

resistentesy homogeneizarcon un rodillo, procesadorautomáticode muestras.Utilizar

el tampón de extracción más adecuado,según seael material vegetal (generalmente

PBS-Tween)en la concentraciónmás adecuada.

LIU1=ti

LILI7Sf

Sustrato de la Enzima

Anticuerpo antiiunrnuneglobulinoo

Ádel animal ca el que ce obtuve elnuero 2Avidina — Stroptsvidlna

o

o

Anticuerpo marcado conb jo tina

Anticuerpo conjuftudo con unaenzima

Antigene virol

Anticuerpo especifico del viruoobtenido en un animo) <2)

LI-ET1 w380 691 m428 691 lSBTLE=1

’

III11fF

LIILiiLtrREII’

YAnticuerpo copecifico del virusobtenido en un animal <II

Fig.22 Cuatro modificaciones de las técnicas ELISA n&s empleadasen virologia vegetal: 1 = ELISA DAS (Doble anticuerpo sandwich); 2 ELISA indirecto; 3 = ELISA triple anticuerposandwich; 4 = ELISA amplificado.

100

Lavar la placa e incubar durante cuatro horas. Transcurridaslas cuatro horas de la

incubación,se lava de nuevo con PBS Tween,con cuidadode no sobrepasarlos pocillos.

Repetir la operación3 veces dejandocada vezel tampón al menos 3 minutos.

Vaciar la placa.Añadir 200 pl de cada muestraal pocillo correspondiente.Anotar en un

croquis la posiciónde cadauna de las muestras.Tapar la placa con plástico.

Incubar a 4’ C de 12 a 20 horas (sesuelendejar toda la noche).Lavar la placa con PBS

Twecn tres veces como en el lavadoanterior

- Conjugado:

- Diluir el conjugado correspondientecon tampón conjugado en la proporción más

adecuada.

- Añadir 200 pl del conjugadodiluido a cada pocillo.

- Tapar la placa con plástico.

- Incubar a 37’ C durante4 horas.

- Lavar la placa con PBS Tween 3 veces del modo descrito.

- Sustrato:

- Prepararel sustratocon tampón sustratoen la proporción 1 mg/ml. Despuésde tres

lavados, añadir a cada pocillo 200 pl de solución sustrato, rellenando también los

pocillos de la primera columna de la placa que nos servirán de testigo al medir

posteriormenteen el lector automático.Mantenera temperaturaambienteen oscuridad

y esperara que aparezcacolor. Medir las absorbanciasabsolutasy relativas a tiempos

fijos <por ejemplo a la media hora,a la hora, a las 3 horasy al día siguiente despuésde

dejar la placa toda la noche a 4’ C).

101

11.7.5.2.Sistemasde amplificación de ELISA.- Paraamplificar la sensibilidaddel ELISA

se vienen utilizando fundamentalmentedos métodosdiferentes, basadosel primero

(Eiotin~treptavidina)) en introducir más moléculas de enzima por cada molécula de

anticuerpo y cl segundo (Ampak) que utilizan enzimas unidos a la molécula dc

anticuerpoactivandoun ciclo de oxidación-reduccióndcl sustrato,para este trabajose

ha elegido el primero que, a continuaciónse describeen detalle:

- Método Biotin-Streptavid¡na:

Para detectarvirus en un nUmero pequeñode nematodosvectoresse lía utilizado tina

técnicaELISA modificadapara incrementarsu sensil)ilidad. La modificación consisteen

marcarunosant ictí e r poscon biol ma y otrosa n muerJ905 conpi gadoscon los fa ¿isa :í ca ini

a la que se han unido ademásía Streptavidina,que forma puente con la biotina dando

com o resu It ado la posib 1 ida d de un Un dc más m(Iléen las de E por anticuerposobre las

que reaccionaránmás moléculasde sustratodandomayor coloración (Fig.23).

Fig.23 -— Método ELISA amplificado con biotina—streptavidina.

102

11.7.6.- HIBRIDACIONES DE ACIDOS NUCLEICOS. SONDAS RADIACTIVAS Y

COLORIMETRICAS.- En estos últimos años se han desarrollado técnicas de

diagnósticoen virología vegetal, que utilizan la hibridación del ácido nucléicodel virus

con sondascomplementariasdel mismo, bien marcadasradiactivamente(normalmente

con P32) o bien con sondas,no radiactivas,colorimétricas(biotina). Estas hibridaciones

inicialmente se hicieron en soluciones (SOUTHERN, 1975) y hoy se realizan sobre

membranasde nitrocelulosao de nylón, por su capacidadde fijar ácidosnucléicos.Estas

hibridacionessobremembranas(HULL, 1984)suponenunagranventajafrenteal ELISA

por su mayor sensibilidad,unas 100 veces mayor para virus purificado (CHU et al..

1989). Otra gran ventajaes el que es capazde detectar el genoma o una parte dcl

mismo según la longitud y de la naturalezade la sonda que se utilice, mientras que el

ELISA solamentedetecta la proteínade la cápsida,que estátan solo determinadapor

un 10%deJ genomadel virus, quedando, por tanto,oculta gran parle de la información

genéticacon el método ELISA.

Con ambas técnicas se pueden procesar gran número de muestrasde una manera

rápida, sensible y específica. No obstante, las hibridaciones presentan algunas

desventajasfrente al métodoELISA, como son: mayor complejidaden las instalaciones,

al manejar material radiactivo, y necesidadde mayor especializaciónen el personalde

laboratorio. Parte de estos inconvenientesse soslayancon la aparición de sondas no

radiactivas (DONOVAN et al. 1987).

103

11.8. METODOLOGíA PARA EL ESTUDIO DE LOS VIRUS EN EL INTERIOR DE LOS

NEMATODOS VECTORES

Debido al pequeñotamañode los nematodosy, por lo tanto, a la escasaconcentración

de virus en ellos fué necesariodiseñaruna técnicade preparaciónde los vectorestanto

para su estudiopor microscopiaelectrónicaen seccionesultrafinas e IEM, como para la

aplicación en ellos de las técnicasserológicas.Los distintos procedimientosse describen

a continuación:

11.8.1.METODOLOGíA PAPA LA DETECCIONDEL VIRUS EN EL NEMATODO POR

MICROSCOPIAELECTRONICA-Sehace unaextracciónde nematodosdel suelo

donde existe una planta presuntamenteinfectada de virus por los métodos antes

indicados.La suspensiónresultantese lleva al estereomicroscopiodonde se seleccionan

los nernatodosquesc deseatestar, cuidandodc elegirlos vivos, que muestrenactividad

y que presentenel cuerpooscuro, lo que indica que estánalimentados.

- Poneren 2 ó 3 pocillos una gota de aguay sobreella 10 nematodos.

- Fijar con glutaraldehidoal 2% en tampón fosfato0,1 M a pH 7,4.

Siemprecon la ayuda del esereomicroscopio,se seccionala región labial del nematodo,

con un bisturí de oculistao una cuchilla enmangada,a fin de que penetreel fijador en

el interior, lo que se nota por el cambiode color quese advierte.Mantener30 minutos

a temperaturaambientey lavar con fosfato 0,1 M, a pH 7,4, tres veces,dos seguidasy,

la tercera, a los 15 minutos.

104

Pararetirar el glutaraldehidoy realizar los correspondienteslavadossin arrastrar los

nematodosse utiliza una pipetaPasteur,estiradaal fuegopara conseguirunapunta muy

fina y ligeramentecurva.

- Tras el tercer lavado, procurandoretirar todoel líquido, se añaden5 gotasde tampón

y 5 de tetróxido de osmio al 2% (con lo que quedaal 1%).

-Dejar unahora a temperaturaambientey retirar el osmio, bajo campanacon aspirador.

- Lavar con el tampón una vez y dejarlo de nuevo en tampón duranteuna hora.

A continuaciónse procedea la deshidratación.Paraello, se ponende nuevo en tampón

durante una hora, se deja enfriar un poco y se agregaal pocillo tras haber quitado el

tampón.

Se dejaenfriar de nuevoy con unaagujaenmangadafina se levantanlos nematodosdel

fondo del pocillo a fin de que permanezcanen el centrodel agar,con un espesordc 2-3

mm. Una vez frío el agar,bajo el estereomicroscopiose procedea cortarlo en bloques,

los nematodoslargos (tnngidoridos) se cortanpor la mitad antesde incluirlos en agar.

- Poner los bloques en tubos y añadir etanol al 70% durante5 minutos, al cabode los

cuales se pasaa alcohol de 90% y, a los 5 minutos al de 100% que contenga una

sustanciahigroscópicaparaabsorbertoda el agua(“Molecular Steve”= silicatoaluminico

potásico cristalizado). Con este alcohol de 100% se repite el lavado tres veces,

manteniendolos bloquesen el liquido 5 minutos cadavez. A continuaciónse lava 2 veces

con óxido de propileno, con un intervalo de 5 minutos, también bajo campanacon

aspirador.

105

- La inclusión se realiza en una resmacomercial,“Exin Resin Kit”, para ello se retira el

óxido de propileno con las debidas precauciones,se agregala resmay se mantiene la

muestra girando mecánicamentedurantedos horas a 37’ C. Al cabo de los cualesse

llena un bloque de silicona con la resma.Volcar sobreun Kleenex y separarlos bloques

que se distinguen por aparecerblancos. Colocarlos en el extremo del recipiente de

silicona y orientar bajo el estereomicroscopioel nematodopara procedera su corte.

Dejar en estufa a 70’ C toda la noeche.Al día siguiente procedera cortarlos. Para

cortarlosprimeramentese tallan los bloques en forma de pirámide con la ayuda de un

bisturí, procurandoque la secciónseapequeña.Colocaren el ultramicrotomo y cortar.

- Tinción de los cortes:

- Colocar en papel parafinadouna gota de acetatode uranIo y dejar sobre él la rejilla

flotando, durante 2 minutos.

- Lavar con aguadestiladaa chorro con el frascolavador.

- Secar cuidadosamente.

- Teñir de nuevo con 2-3 gotas de citrato de plomo durante7 minutos.

- Secar cuidadosamentey llevar directamente al microscopio electrónico para su

observación.

11.8.2. PREPARACION DE NEMATODOS PARA LA DETECCION DE VIRUS EN SU

INTERIOR PORELISA e ISEM.- Mediante estastécnicases posibledetectarel

virus en 1, 5, 10, 15 o 20 nematodos,para ello es imprescindible homogeneizarlosy

triturarlos perfectamentepara lo que se han utilizado tres procedimientos:

106

a) En pocillo con 500 pl de tampón de extracción FRS - T - PV)’, se trituran con la

ayuda de una varilla de vidrio con uno de sus extremos redondeadoal fuego. Su

inconvenientees que al precisarmucho volumen de tampón por nematodo,se alcanza

gran dilución del virus, lo que lleva a la diminución de la sensibilidad,máxime para

pequeñonúmerode nematodos(1-5).

19 En esteprocedimientose utiliza parahomogeneizarel nematodoun minitaladro como

el torno de un dentista con un mondadientespartido a la mitad. Para ello en tubo

eppendorfse ponen 25 pl de tampón FRS - T - PV?, los nematodosa homogeneizary

una pequeñaporción de carborundo;se hacegirar la máquinadurante30 segundos.al

cabode los cualesse añaden25 pl de tampón y se homogeinizahastaque el contenido

esté perfectamentelíquido, lo que ocurre en unos 30 segundos.Se golpea suavemente

el tubo con los dedos a fin de arrastrarlas gotitas que quedanen las paredes.Toda la

operaciónse realiza dentro de hielo, para evitar el calentamientodel tubo.

- Centrifugar 10 minutos en microfuga a 10.000rpm y depositarlos los tubosen nevera

a 4’ C, mientras se carga la placa ELISA o se preparanlas rejillas del microscopio

electrónico.

Con esteprocedimiento,en ocasiones,quedannematodospor triturar o en fragmentos

bastantegrandes,lo que tambiéncausaproblemasde sensibilidadcuandose trabajacon

pocos nematodos.

c) A fin de soslayarestos problemasse ha diseñadoun “micromortero”, adecuadoal

tamaño de los nematodos,que consiste en introducir un microémbolo de diámetro

adecuadoen un tubo de pipeta (Fig.24); este procedimiento permite trabajar con

volúmenes de 10 pl y un solo nematodo y seguir el proceso bajo microscopio y

10?

comprobar la completa trituración del nematodo.Para introducir el tampón en ci tubo

y retirar el homogeneizado,se utiliza una geringaHamilton dc 10 ~xí,o tambiénpipetas

Pasteurestiradasal fuego hastaconseguirun extremo capilar.

Fig. 24.— Micromortero empleado para la adecuada trituración denematodos

2 3

108

11.8.3. METODOLOGíA PARA DETECTAR EL VIRUS EN EL NEMATODO POR LA

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (“POLIMERASA CHAIN

REACTIONI <PCRV- En la actualidad se están emplendo técnicas de gran

sensibilidad en el diagnóstico de virus. Así para CLRV, BORJA y PONS, 1991,

comparandotres técnicas (ELISA, Dot-blot y PCR) encuentranque Dol -Blol es 100

veces más sensible que ELISA y PCR es veces más sensible que Dot-Blot, en

tabaco.Por esta técnicase amplifica el númerode copias de un frgamento del DNA o

cDNA del virus (CHU ÉL.4, 1989) elevándolahastaniveles detectables,empleandouna

enzima, la DNA polimerasa,establea altas temperaturas.Este métodoes conocidocomo

reacciónde la polimerasaen cadena“PolimeraseChain Reaction o PCR (SAI Kl ct al.

,

1985 y 1988). Hastaahora eranecesariopartir de virus purificado, perorecientemente

se ha publicadosu aplicación a extractos de savia bruta (BORJA et al., 1991). Para

aplicar esta técnica a virus RNA es necesariohacer previamente una reacción de

transcripción inversa para obtener los cONA. Este método es de gran sensibilidad y

especificidaddebido a su capacidadde hacercopiasde secuenciasde forma fiable y eficaz

(WEIER y GRAY, 1988), fácilmente automatizablee ideal para aplicarla a la detección

de virus en solo nematodovector o en aquellos casos en que la titulación del virus es

muy baja o se presentade forma irregular en una planta.

11.9. METODOLOGíA PARA EL ESTUDIO DE LA TRANSMISION PORVECTORES

.

Para la determinacióninequívoca de transmisión de virus vegetalespor el nematodo

vector,TRUDGILL £.t~i. (1983) establecieronlos siguientescriterios:

1.- Tanto el virus como el nematodo deben estar perfectamenteidentificados y

caracterizados.

109

2.- La infección por el virus a estudiaren las plantascebodebecomprobarsemediante

test adecuados(ELISA e ISEM).

3.- Los nematodosutilizadosen el test debenser los únicos posiblesvectoresde virus

en el experimento.

De acuerdocon estos criterios establecidos,dichos autoresdiseñaronuna metodología

a seguir para la correcta determinaciónde la transmisiónque es la que se ha seguido

en esteestudio (Fig.25).

- Método de transmisión(Fig.26):

- Se extraennematodosde tierra procedentede rodalescon vides infestadascon GFLV.

Elegir plantas de Ch. quinoa con 3-4 hojas y ponerlasen macetasde 25 cc con arena

esterilizaday de un tamaño< 150 pmg> de 250 pm, llenandode forma inclinada en la

maceta.Humedecer ligeramente el fondo y poner la planta de Ch. quinoa lavando

previamente,cuidadosamentesu sistemaradicular.

Poner los nematodosen 10 cc de agua y añadirlos al fondo del tiesto. Completar con

arenadel mismo tamaño que la del principio. Colocar las macetasen invernaderoen

batea sobre arena humedecida.Añadir agua con frasco lavador a las macetas y

humedecerla arenade la batea para crear una cámarahúmeda.

Al cabode 3-4 semanasobservarla sintomatologíay comprobarla presenciade virus por

ELISA o 15EM.

Paracompletarel ciclo de transmisiónse inocularánplantasde Ch. quinoa con GFLV

procedentede las mismas plantas de las que se tomó tierra para la extracción de

nema todos.

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-4

1500c 1>2503or./ltv.

Fig. 26.— Metodologia seguida para transmisión

112

Cuando estas plantas de Clx. quinoa tienen síntomas y testadascon ELISA , son

positivasse haceun procesode transmisióninverso, así:

a) En macetas,como en el procesoanterior, con Ch. quinoa infestadoscon GFLV se

introducen nematodos que han sido mantenidos en batea con higuera y se ha

comprobadoque estánlibres de virus.

b) Se les tienen alimentándoseen esta planta enfermaalrededor de una semanay se

compruebamediantetest que han adquirido el virus.

c) Se extraenlos nematodosy se ponenen macetasde la mismamaneracon Ch. quinoa

sanay se sigue el procesocomo se describeanteriormente.

11.10. METODOS PARA EL ESTUDIO DE LAS CARACTERISTICAS EDAFICAS

En la determinación de las texturas y contenido de carbonatos del suelo se han

utilizado los métodos usualesdel Instituto de Edafología y Biología Vegetal, el de

Boyoucospara las texturas,ligeramentemodificadopor GARCíA LOZANO y GONZáLEZ

BERNALDEZ (1963) y el de ALLISON y MOODIE (1969) para los carbonatos.

La determinación del pH se ha realizado en suspensiónde agua,tras pesar 10 g de

muestra, se añaden20 cc de agua destilada y se remueve, se espera 15 minutos y

despuésse vuelve a remover,midiéndosea continuacióncon el pflmetro.

113

11.11. METODOS ESTADíSTICOS UTILIZADOS PARA EL TRATAMIENTO Y

CARTOGRAFIADO AUTOMATICO

.

Para la planificación de los muestreosen fincas experimentalesy el cartografiadode los

datos se ha utilizado el programa“EXPAN-1” elaboradopor Rey (REY et al 1983) que

resuelveel problemade las zonasde compensaciónque planteael sistemaUTM en la

PenínsulaIbérica, basándoseen el método de CAMARGO DE PARADA (1973) para la

transformaciónde una coordenadaUTM a coordenadageodésicade su propia zona y,

a partir de ésta calcular la coordenadaUTM de la zona adyacente.Este tipo de

cartografiadoautomáticofacilita la elección correcta de las áreas de estudioy puntos

de muestreo.

La cartografíade los datos edáficos y climáticos se ha llevado a cabocon programasdel

mismo autor según las técnicas descritaspor REY (1988) y LAZARO y REY (1990>,

mediantelos que se bah elaboradomapasde suelos basadosen las de FAO-UNESCO

(1985) de temperaturasmediasas’ comodel indice hidrico anual(DLI VER MOSCARDO

y GIL CRIADO, 1985).Para su realizaciónse ha utilizado un microordenadorHP 9020

A.

Les datos del muestreo previo se sometieron a un análisis de correspondencias

mbltiples, los niveles de significación de los distintos muestreosse sometieron a la

prueba del X2.

IlIRESULTADOS

115

En este capítulo se recoge,en primer lugar, los resultadosobtenidosen el muestreo

previo llevado a cabo en diferentes zonas vitícolas, cuyos datos se sometieron a un

análisis factorial de correspondenciasmúltiples. A continuación se dán los resultados

de los ensayosefectuadospara comprobarel grado de fiabilidad de la técnica ELISA,

utilizada para la detección del virus, en la que se comprueban los tampones de

extracción idóneos a tal fin, las partes de la planta más adecuadaspara la realización

del test, la sensibilidaddel método a distintas concentracionesde muestra, la variación

de la concentracióndel virus en los diferentes tejidos vegetalesa lo largo del año,así

como la correlaciónentre la sintomatologíaobservaday la presenciade virus.

Posteriormente,se dan los resultadosacercade la incidencia de GFLV en La Mancha

y la de virus-nematodosvectores,para finalizar con la deteccióndel virus en la planta

y en los nematodosy con la realizacióndel test de transmísion.

111.1. MUESTREOPREVIO

.

Los resultadosobtenidosdel muestreoprevio en las zonasvitícolaselegidas(La Mancha,

Galicia y Murcia) se encuentranreflejados en la Tabla V, en ella se indica el númerode

muestra,numerode nematodosencontradospor cadauno de los métodosde extracción

utilizados (Flegg y centrifugación>,excepto para los endoparásitosen que sólo se

estudió la presencia-ausenciade nematodos formadores de nódulos del género

Meloidogyne. Les ectoparásitostransmisoresde virus se relacionana nivel especie,los

restantesectoparásitosa nivel de género, y los libres, a nivel de grupo trófico.

Asimismo aparecenen la tabla los datosde presencia-ausenciadel virus GFLV en cada

116

muestra,así como los datos resultantesde los análisis del suelo (pH, porcentajesde

arena,limo, arcilla y carbonatos).Hay que teneren cuentaque solamentese relacionan

en dicha tabla aquellasmuestras en que ademásde material vegetal se recogió y

estudiémuestrade suelo,ya que por cada una de ellas se tomaba una media de 2 a 4

plantas, lo que supone un total de 540 muestras de material vegetal testadas

serológicamenteen este muestreoprevio y 260 de suelo.Los resultadosde los análisis

serológicos (Tabla VI) indican que solamente 64 muestras revelaron la presencia de

GFLV lo que representaun 11,8% de cepas infectadas,mientras que la presenciade

nematodostransmisoresde virus estáen aproximadamenteun 30% de las muestrasde

suelo estudiadas.(X.index en 31 y X.italiae en 60 muestras).

Se observaque la Nematofaunaen estasmuestrases pobre, con poca variabilidad de

formas y poblaciones, en general, pequeñas, sobre todo para las especies fitoparásitas,

con la única excepciónde los Hoploláimidos,presentesen el 82% de las muestrasy con

poblacionessuperioresa los 2000 individuos /100<> cc de suelo(basta 2200 en Murcia,

8000 en Galicia y 1850 en La Mancha). De los restantesgrupos tróficos, los más

frecuentesson los omnívoros(Doriláimidos), seguidosde los micófagos (Rabdítidos) y

en último lugar los depredadores(Monónquidos),si bien las poblacionesno fueron muy

numerosasno superandola cifra de 500 individuos 1 1000 cc.

De las especiesdel género Xlphinema, la mas frecuente,una vez más resulté ser

Xpacbtaicum, especie no comprobada como vectora de virus pero frecuentemente

asociadaa la presenciade virosis, que aparecióen el 83,3% de las muestrasde suelo

estudiadasy en 52 de las 64 positivas de GFLV (81,3%),en 14 de ellas (17,4%)asociada

a Xindex, en 7 (11%) a Xindex y X.italiae y en 5 (7,8%) a Kitaliae

.

117

Xitaliae, especiecomprobadacomo transmisorade GFLV al viñedo pero considerada

pocoefectiva como vector en el campo,aparecióen el 23,8%de las muestras,13 de ellas

positivas de virus en 7 de las cuales se hallaba en asociación con Xiindex y

X.pachtaicum

.

Kindex, la especiemás importante como vector de GFLV en viñedo, se encontróen el

14%de las muestras(32>, 18 de ellas positivaspara eí virus, lo que representaun 29,6%

de incidencia,en ochoocasionesaparecióasociadoa Xitaliae y en siete de ellas también

a )Cpachtaicum

.

Por último en el 4% de las muestrasse hallaronotras especiesde Xiphinema (Xrivesi

,

X.turcicum y Xvuittenezi), L.vineacola, especie tambien frecuente en viñedos, se

encontróen el 27< (6 muestras)y Trichodorus spp. en el 1.5%.

Por otro lado, sc han encontrado25 focos con fuertes infestacionesde Meloidogvne

causando serios problemas en viñedo, así como la presencia de nematodos

vanillados~(Criconemátidos)en más de 50 puntos, que bien pudieran ser causa de

aparición de clorosis. En cuanto a los factoresabióticos del suelo destacala presencia

de carbonatosy, en consecuencia,elevadopH, en unos 200 puntos de suelo, lo que

tambiéndá lugar a amarilleosen las plantas,sobretodo en zonasde poco suelo,como

pequeñaslomas en los viñedos, por otro lado, fáciles de diferenciar de las clorosis

amarillas producidaspor GFLV.

118

Respectoa la utilización de uno u otro método de extracción, hemos encontradoque

Xpacbtaicumaparecióen un 54,2%de las vecesque se extraía por ambos métodos,con

poblacionesvariablesen uno y otro, dependiendoque se tratara de adultos y juveniles

de los últimos estadios,que aparecieronen mayor númeropor el método de Plegg, o

de los primerosestadoslarvarios más numerososcuandose extraíanpor centrifugación.

En un 24,6% se encontró al aplicar el método de Flegg y, en el 19,4%, por

centrifugación._)Cindexaparecióen el 1100 % de los casospor el método de Flegg y en

el 28%por centrifugación.X.italiae, en el 90% por el método dc Flcgg, en el 29% por

el de centrifugación. L.vineacola solamenteapareciópor el método de Flegg, por el

contrario los 1-loploláimidos aparecen en el 89% de los casos por el método de

centrifugación y, en general, por este método se obtienen las poblaciones más

numerosas,aunquepor Fleggse extrajeronen el 64,6%de las muestras.Con respecto

a los restantesgrupos tróficos, Dorilaimidos y Monónquidos se extraen por ambos

métodospero mejor por Flegg. dado su tamaño y movilidad, sobre todo en los adultos

y últimos estadosjuveniles, y, por el contrario, Rabdítidos y Tilénquidos se extraen

mejor por centrifugación.

En cuanto a la incidencia de virus y sus nematodos vectores en las distintas zonas

estudiadas,encontramosque en La Mancha de 473 muestras de material vegetal

estudiadas,56 fueron positivaspara GFLV, el 11,9%, )Cindexaparecióen el 28,6% de

las muestras de suelo estudiadas,Xitaliae en el 12,5% y ambas en el 5,4% de las

muestras de GFLV positivas. En Galicia, apareció GELV en menos del 6% de las 143

muestrasde material vegetaltestadasy los nematodostransmisoresde virus en el 20%

de los casos,X.index en el 9% y Kitaliae en el 13,6%. Por último, en Murcia apareció

titaliae en 15 muestras de las 21 de suelo estudiadas (71%) y en 10 puntos positivos

de GFLV (50%), no SabiéndoseencontradoXindex

.

Fig. 27 a

Flg. 27.— Distribución del virus del entrenudo corto y surelacion can E index CA) y X. italfae (6)

Fig. 27 b

12 tI

Respectoa la distribución (Fig.27) a pesar de la relativamente baja frecuencia de

incidencia del virus, estese encuentradispersoen todas las zonasmuestreadas,sin que

parezcaninfluir en supresencialos factoresambientalesni las variedadescultivadasen

cadazona.En cuantoa los nematodosvectores,)Citaliaeestáigualmentedistribuido en

todas las zonasexcepto Castilla-León,donde solamentese encontróXindex y, por el

contrarío en la Región Murciana solo Xitaliae. En Galicia y Castilla-La Mancha se

encuentranlas dos especies,siendo mucho más frecuenteX.index en estaúltima.

En Castilla-U Mancha,dondeel ntimero de muestraspermitió estudiarsu distribución

respectoa los factores ambientales,tipos de suelo y clima (Eigs. 31, 32, 33 y 34 del

apéndice), encontramos que X.index aparece distribuido en cambisoles (cálcicos y

gleicos) y en un punto de luvisol cromo cálcico, estáigualmentedispersoen los climas

(E) arido y (D) semiáridode Thornthwaite (gradientede -40 a -20 y -20 a O ) del Indice

Hídrico Anual (INI) y en las zonascon temperaturasmediascomprendidasentre 132C

y 16~C. Xlaliae, se localizó únicamenteen suelos de cambisol,en clima (E) árido, no

apreciándose diferencias de su distribución respecto a las temperaturas medias ni los

tipos de suelosde esta Región.Se aprecianfocos de mayor intensidadde infección vírica

en las zonasde Socuéllamos,Ossade Montiel y Valdepeñas,dondeexisten las mayores

poblacionesde nematodostransmisoresde virus de la zona.

En la Tabla VII se dán los resultados del muestreo realizado en Castilla-León,

ordenadosde acuerdo con las denominacionesde origen e indicando el número de

parcelas muestradas,numerode muestrastestadaspor ELISA, numerode muestras

positivas de GFLV, porcentajey número de muestraspositivas de Xlndex, el único

nematodotransmisor de virus que aparecióen estaRegión.Teniendoen cuenta que las

muestrasde sueloparael análisis nematológicose tomaron,trás comprobarla presencia

121

de virus, solamenteen cepas que resultaronpositivas para GFLV, que el número de

plantas testadasfué de 1703 y que resultaronpositivas204, el porcentajede incidencia

del GFLV es del 11,9% (±0,015),prácticamenteel mismo obtenido en el muestreo

previo. Se observan grandes diferencias de los resultados entre las distintas

denominacionesde origen,así por ejemplo,en Rueda,de 382 muestrasestudiadasfueron

positivas 74 lo que suponeaproximadamenteun 19% (±0.039)de muestraspositivas,en

Ribera del Duerode 187 muestras,resultaron35 viróticas (el 18 % ±0.055),en Toro de

183, 32 (17%±0.054),en Cebreros22 de 125 (17%±0.066),en Cigales 28 de 327 (8.8

±0.031)y, por último, en El Bierzo 13 de 500 (2.5% ±0.014),quizásdebido a que este

muestreose realizó en función de los viñedosen que los técnicosde SEA y viticultores

de las distintas zonas habián comprobadola presenciade problemas. En cuantoa la

presenciade nematodos transmisoresen las muestrasen que se realizó el estudio

nematologico,solamente24 fueron positivaspara Xindex, aproximadamenteun 30% de

las viróticas.

Los datos de 251 muestrasde la prospecciónprevia (Tabla XIII), tras eliminar aquellas

que contenían datos incompletos o no representativos,se sometieron a un análisis

factorial de correspondenciascon diferentesestados(clases)de las variables,a fin de

conocer las direcciones principales de la variabilidad, definidas por las variables

indicadoras.

Se estudiarondos nivelesde análisis,el primero incluyendotodas las variedadesde vid

procedentesde las diferenteszonasvitícolas, aunqueel pesomayor, con gran diferencia,

estabaen la variedadAirén. Por ello, en el segundoanálisis se trataron solamentelos

datos correspondientesa dicha variedad(196 muestras).

122

En ambos análisis se han obtenido resultados muy similares, descubriéndosedos

dirección de variabilidad o tendencias,definidas, una por los componentesedáficos

(porcentajesde arena, limo y arcilla> y la sintomatologíaobservada,y, la otra, por la

presenciade virus y las poblacionesde los nematodosvectores.

En el primer análisis (251 muestras)(Tabla IX, Fig.28 y 29), el eje 1 aparecedefinido

por las variedades de vid, ‘no conocida’ (contribución C~ 13,4), Airén (C= 3,2) y

Albariño (C= 2,0) y el pH (Contribución total CT= 19,7); encontrándoseuna asociacion

clara entre los valores más altos de pH con la variedad Airén, mayoritaria en La

Mancha, y los más bajos con la Albariño. El eje II está definido por los componentes

edáfleos, porcentajede arena(CT= 20,2), de limo (CT= 16,0), carbonatos(CT= 10,1) y

arcilla (CT= 8,6). El eje III está en relación con las sintomatologias de fasciación

(Ca 3,4), maderadeformada(C= 3,2), síntomasgeneralesde virosis (C~ 3,1) y mosaico

amarillo (Ca 2).

Dicho eje se relacionaasimismocon la presencia(C= 10,6) y ausenciade virus (0= 3,6)

y con los nematodostransmisores,poblacionesde 25 a 50 individuos/1000cc de suelo de

)Cindex (Ca 7,6), de 5 a 25 indv/l 000 cc de dicha especiey de Kitaliae ambascon la

misma contribución (C== 1,6).

Como ya se ha indicado, el análisis efectuadoconsiderandosolamentelas muestras

tomadasen la variedad .A.irén (Tabla X, Fig.30 y 31), confirma la existencia de las

direccionesde variabilidaddel primer análisis relativasa los componentesedáficos(eje

1), sintomatología y presenciade virus (eje 11). En cuanto al eje III, parece estar

relacionadocon los nematodos,cuya presenciase encuentracondicionadapor los valores

de pH, y contenido de carbonatos. Del análisis se deduce,en particular, que las

a. rt9. zg.— Resultados del AnAlisis de Correspondencias considerando todasOír.. — ~22ct

~ — las muestras (Ejes 1 y 2).IA> -LII .3.32 -2.13 -L62 1.64 -1.61 1.33 -¡.30 -242 -LO) .1.11 .tt .1.61 4.14 -OIl •13 6.01 022’ 6.55 6.64 •a =20 =0.

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dl~11., ¡ *400TIL&- 2 Fiq. 30.— Resultados del Análisis de Correspondencias considerando todasOtra siam ~ las muestras (Ejes 1 y 3)

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4.212

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0~ 1

%0I2as s Fig. 31.— Resultados del Análisis de Correspondencias considerando las muestras0eS~7IS MS S2135 ~~-I> de la variedad Airen (Ejes 1 y 2)

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1.222 0)0 3)2 53.920 £0 1 0-lS0-1001 flj.S fl 00> 0727) ¡ 0.2044.55 Iooo9000.o o0•oo0o>.¡000o0o.o.oo00ooo»oso¡o0O~0~.¡J¡0o0C2oo00COOo•JiboROOoo00oOo0o¡o0o¡0J00O0O¡ooo000014oo00ooO¡ibOoo004OO>¡Joo0oo0*o0oo¡Oo00Joooo0oOOJJJ4o000oo0OJ04o000oo0¡Jfl0O0¡0o¡O00¡O0o0oOJJ0OO¡¡Jo)0OOOO¡flJO0O”O”O0OO¡1-4V4.252$ 034 77)23 — 7.9? 332 II’ J .4.52

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127

poblacionesmás altas de Xindex aparecenasociadasen generala sueloscon contenidos

de arenaentre 50-70%, por otro lado, dichas poblacionesdisminuyenal aumentar el

contenido de carbonatos.Por el contrario, las poblacionesde X.italiae se muestran

relacionadascon suelosde contenidosmediosde carbonatosy arena.Xpachtaicumy los

nematodos“anillados”, Criconemoidess.l., parecenestar asociadosa suelos con mayor

contenido de areilla, mientras que se confirma que la presenciade Meloidogyneestá

condicionadapor altos contenidos de arena (alrededordel 70%). Las sintomatologías

“falta de vigor’, “cepasimproductivas”y “clorosis” aparecenligadasaconcentracionesaltas

de carbonatos,mientras que las restantes clases de sintomatologíaobservada, no

muestran una relación clara con los demás parámetros considerados.

llI.2.DETECCION DEL VIRUS DE LADEGENERACION INFECCIOSN

Dado que en el muestreoprevio, el porcentajede vides infectadaspor GFLV resulté

muy inferior al estimadoen los trabajosprecedentesy el que empíricamentese deducia

de la sintomatologíaexistente en los viñedos, se pensé que estas diferenciaspodian

debersea alguna de las causassiguientes:

- Algún fallo en las técnicasde diagnósticoque se venían utilizando.

- Posibles efectos de termoterapiaen zonas muestreadascon temperaturasextremas

(Castilla-La Mancha o Murcia), sobre todo las tomadasen verano o diferenciasde la

concentracióndel virus en las distintas partes de la planta y en las diferentesépocas

del alio y del estadovegetativode la planta.

- Dificultad en discernir entre los sfntomas propios de la infección del virus y las

característicasfisiológicas o varietales,así como la influencia de otros patógenosy las

debidasa alteracionesclimáticaso factoresedáficos.

128

111.21. COMPROBAClON DE LA FIABILIDAD DEL METODO -- A fin de comprobar

la bondad del método se aplicó el test a material procedentede las cepas 1 y II de La

Higueruela,que habíanresultadopositivas en repetidasocasionesy que se mantienen

estaquilladasen invernaderodesde1988,así como en Ch.Quinoainoculadopreviamente

con virus de estas cepas.Setomaron como controles positivos Vrupestris de Lot y

negativovides tratadaspor termoterapiay Ch.quinoa de semillero.

Se utilizaron tamponesgeneralespara todas las etapasdel ELISA y se ensayaron

simultáneamentedistintas partesde la planta (raíz,tallo y hoja) a tres concentraciones

diferentes (1/10,1/20 y 1/40) así como homogeneizadospor tres métodosdistintos (N

liquido, mortero o maceradoa temperaturaambientede laboratoriodurante4 horas).

Se realizaron 6 repeticionescon 6 plantas distintas todas ellas procedentesde la cepa

1 de La Higueruela (Toledo 1 = Tol). Los resultadosobtenidosaparecenen el Cuadro

lía donde se observaque existe claramentemayor sensibilidad a concentracionesde

extracto de planta de 1/10 que a 1/20 ó 1/40 para cualquier planta,cualquier parte de

la misma y con cualquiera de los métodos de extracción utilizado, y que, en las

condicionesde experimentaciónseguidas,la partede la planta quemejoresresultadodió

fue hoja, en cinco de los casosfrente a uno, en que con pequeñasdiferenciasdió mejor

resultadoen tallo. En todo momento, para esteensayose utilizó hoja joven. El mejor

método de extracción resulto ser el de triturar directamenteen mortero con tampón,

frente a los de N liquido o macerado.Porel contrario, cuandose utiliza hoja adulta (mes

de septiembre),aúnempleandoELISA amplificadocon biotina-streptavidina,apreciamos

lecturassimilares en hoja y tallo y menoresen raíz <Cuadrolib); repitiendoel test con

hoja más vieja de la misma planta se aprecianlecturas considerablementemenoresen

hoja que en tallo (CuadroIle).

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3 han. 0,857 0,380 0,401 0,831 0.637 0,450 0,588 0.518 0,352 0,096

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0,536 1,836 1,flO 0<240 2 1,760 0,266 1,942 1,073 1 2 0O208 0,17$

1 hora

3 horas

131

111.2.2.COMPARACION DE TAMPONES DE EXTRACCION .-En estesegundoensayo

comparamos el comportamientode la cepaTol del experimentoanterior, tomandotres

partes de la misma (raíz, tallo y hoja) y utilizando como tampón de extracción FRS-

Tween y FRS-Tween + PVP (polivinil pirrolidona) al 2,5% y ovoalbéminaal 0,2%,

utilizando dos métodosde extraccióin (morteroy maceradodurante6 h a temperatura

ambiente).Los resultadoobtenidosse indican en el Cuadro111, donde se observaque

FRS-Tween no dié lectura en ninguna parte de la planta y a ninguna concentración,

mientras que FRS-Tween + PV? lo detectéa concentración1/10 en cualquierade las

partes de la planta, utilizando el mortero como método de extracción y siendo la lectura

mayor en hoja, que en tallo o en raíz.PorÚltimo, por el procedimientode maceradosólo

se detectéGFLV en hoja, dandomayor lectura a la concentraciónde 1/10 que a la de

1/20.

El experimcntose repitió con las cepasTo4 y Toá y con vides con clara sintomaología

de virus, procedentesde dos consultas,testándosedel mismo modoraíz, tallo y hoja en

las vides To4 y To6 y tallo y fruto (uva entera)y semilla en una de las consultas.Los

resultadosse recogenen el CuadroIV en la que se observalecturassimilares en todos

los casos,detectándoseademásel virus tanto en uva entera como en semilla.

Para comprobar la fiabilidad del suero que se venía utilizándo, se comparé con otro

procedentede un lote nuevode Ja misma firma comerciai,que dieron lecturasidénticas

(Cuadro y).

La obtención frecuentede resultadosdudososo negativos al aplicar el test ELISA a

hojas de plantas estaquilladasde la cepa Tol y observar que los resultados eran

irreproduciblessegÚn las hojas envejecían,mientrasque los resultadoseran más é

RESULTADOSDE LUISA COMPARANDOTRES PARTES DETALLO, RAíZ> A DOS CONCENTRACIONESDIFERENTESTAMPONESDE EXTRACCION (PBS—T y PBS—1 +PVP) YDISTINTOS DE EXTRACCION, MORTERO

LA PLANTA <HOJA,(1/104/20). DOSPOR DOS NETODOS

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cu~nao iv -— VALORES DE ELISA EH FRUTO (UVA EHTERA Y EHDE LA PLANTA Y A CONCENTRACIONESDISTINTASDE CONSULTA COt¿ SINTOMATOLOGYADE VIROSIS

PEPITA) CDHPARAHDO DOS PARTES DIFERENTESDE LA VID To 4 yTo 6 Y DE DOS MUESTRAS

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QN 1.-)0.452 0.245

CUAO~O V: — CDXPARACION DE LECTURAS OBTENIDAS UTILIZMDO DOS LOTES DIFERENTES DE SUERO. MTICUO YHUE?O, A TRES CONCEHTRACIOJ~ES DIF¡REHTES DE MUESTRA (1/10, ~/jfl, 1/40>

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T.mp6n Suero b—

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1/20 0,725 0.028 0.0.0 0.805 0,022

1/40 0,010 0,028 0.00 0,578 0.022

CUADROIII.

—

133

menos constante en otras partes de la planta (tallo y raíz), unido al rápido

oscurecimientodel extracto de hojas de vid, mientras que permanecíanverdes los de

Clvquinoa y los de hojas jovenesde vid nos llevó a consultar la bibliografía y contactar

con otros centrosque veníanaplicandoesta técnicade diagnostico,concluyendoseque

aparecíanvariacionesdependientesde la naturalezadel tampón de extracción.

De acuerdocon todoello se planteéun experimentoen que manteniendoconstanteslos

tamponesde tapizado,conjugadoy sustrato,seensayaronparahojas de las mismascepas

de los experimentosanterioreslos siguientestamponesde extracción:

a) PES-T + PVP 2%; b) PVS-T + PV? + 2,5% de nicotina; c) AFT (agua fisiológica

tamponada)+ 2% de PV!’ + 0,2 de DIECA d) AFT + 2% de FVF + 2,5% de Nicotina

y e) Tris-HCI 0,5 molar, pH 8.2 + 2% de PV? + 0,05% de Tween 20 + 1 % de PEG

(Polietilen glicol) 6000 -± 0,8 % de CLNa + 0,02 % de NaN3. Los resultadosobtenidos

se reflejan en el CuadroVI dondese observaqueel tampón a) no fué capazde detectar

ninguna de las cuatromuestraspositivas,el c) no detectéla número 1 y las 3 y 5 con

niveles muy bajos,mientras que los tamponesb), d) y e) leyeron todos los positivos con

niveles parecidosy en todos los casosaltos, cualquiera de los tamponesdetectaronel

virus cuandose tratabade Chgu;noa.Las diferenciasentre estos tamponesconsisten

en que mientrasb) y d) contienenNicotina, que producesíntomasde toxicidad en los

usuarios,el e) no contiene Nicotina y dá niveles de lectura similares a los anteriores,

lo que representauna ventaja.

El ensayose repitió con 8 plantas procedentesigualmente del estaquilladode la cepa

Tol, frente a los mismos cincotamponesy con diez hojas de la propia cepaTol tomadas

desdela baseal brote final, procesadascon los tamponesa), c) y e) <Cuadro VII). Los

resultadosson similares a ¡os del experimentoanterior, con el tampón a) no se

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136

detectaronvirus en cuatrode los ocho casosplanteadosy con el c) no se leyó en tres

de los ocho, y dieron lecturasbajas. Con los tamponesb), d) y e) los resultadosfueron

siempre positivos, de lecturas similares y elevadas,en cualquier caso con los cinco

tamponesse pudo detectar el virus en Ch.quinoa de modo similar al experimento

anterior. En cuantoa los resultadosen hoja se pudo leer con los tamponesa> y e) en

cualquierade las 10 bojas, con lecturas más bajas en a) que en e). Con el tampón e)

dieron negativoscuatrode los diez casos.Hay que señalar que el test de hoja se hizo

con materialjoven, hojas tomadasa los dos mesesde haber brotadoen invernadero.

De todo lo anterior cabe destacarque es imprescindible utilizar como tampón de

extracción para vid Tris-HCI ó cualquiera de los descritoscon Nicotina, con los que

cualquier hoja de la baseal ápice y cualquier parte de la planta (hoja, tallo, raíz) dan

resultadospositivos. Cualquierade los tamponesensayadoses adecuadopara detectar

virus en Chquinoa.

111.2.3. VAJUACION DEL DH EN FUNCION DEL TAMPON UTILIZADO -Debido al

fuerte cambio de coloración observadoen los extractos de hoja y el fallo de alguno de

los tamponesde extracción en el test ELISA se prepararonmuestrasde hoja dc la

misma planta lo!, en los mismos tamponesy a las mismas concentracionesde los

ensayosanteriores.Se realizaronde estemododos experimentosel primeroencaminado

a comprobar la variación del pH de una misma muestraen los diferentes tampones,

comparándolacon dicha variación en el propio tampón y en el segundoen hoja tallo y

raíz de vid y hoja de Ch.quinoacomparándolasigualmentecon las variacionesde pH en

los tampones(CuadrosVIII y IX).

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CUADROIX.—COMPARAUONDE LA VARIACTON DE pH ENTRE DIFERENTES EXTRAY SUS TAMPONESDE PARTES DISTINTAS DE VID (HOJA, TALLO,INFECTADAS Y SANAS, Y EN PLANTAS HERBACEAS

Taap&Parte

Plant, planta

Ti capo

12 h 13 h 0/N

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7.06

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7,09

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Vid Hoja

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6,77

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¡Ch. quinos Hoja 9,38 9,32 9,01

Vid Hoja

Raíz

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9,38

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Tallo

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9,50

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Tallo

6,63

7,32

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7,33

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Teapón 9.06 8,97 8.90

Ch. quinos Hoja 9,22 9,13 8,82

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Vid Hoja

<*~ Raíz

8.75

9,32

8,70

9,27

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Tallo

8,72

9.15

8,67

9,15

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8.96

Taap.Sn 9,40 9,51 9.37

Ch. quinos Hoja 7.96 7,91 7,83

E

Vid Hoja

1..) Raíz

7,95

8,00

7,89

7.93

7,70

7,90

Vid Hoja

Tallo

7,86

8,04

7,75

7,95

7,85

7,94

Taap6n 8,00 7.97 7,97

CTOSRAIZ)

139

Las muestrasde vid preparadasen los tamponesa) y c), que presentabanmayores

dificultades en la detección de virus mostraron, variacionesde 3 a 4 unidades de pH

respectoal tampón,por el contrario las de Ch.quinoa no mostraronvariación del pH

respecto a dichos tampones. Estos valores de PH en los distintos extractos se

mantuvieron constantesa lo largo de varias horas incluso pasadauna noche. Las

variacionesde pH en extractosde tallo y raíz de vid fueron mínimas con cualquierade

los tamponesutilizados, De todo ello se deduceque aquellos extractos que sufrieron

variacionesmínimas de pH tuvieron siempreun resultadopositivo en el test ELISA, por

el contrario aquellosque sufrieron fuertesvariacionesen el pH dieron resultadosbajos,

negativos o con fallos ocasionales,sin duda debido a que los grandesdescensosdel pH

dan Jugara una desnaturalizaciónproteica en los extractosde hoja dc vid, ocasionada

posiblementepor polifenoles de la planta que son contrarrestadospor la acción de la

Nicotina y del Tris -H Cl.

Test de wncentraciones.Para calcularla concentraciónideal en nuestrascondicionesde

ensayo,tanto de los anticuerposdel tapizadocomo de los antígenos(muestraproblema)

y del conjugadose realizó la siguiente placa de condiciones(Cuadro X). En el Cuadro

puedeobservarsequelas concentracionesde anticuerposde tapizado1,2000,de antígeno

1/20 y de conjugado1/4000 dieron lecturas aceptablesdespuésde 12 b, pero para

tiemposmenores,evitar problemasde fondo y, en casosdudosos,en muestrascon títulos

de virus muy bajos, es convenienteutilizar concentracionesde 1/10 para antígenoy

1/1000 para anticuerpo y conjugado que serán utilizadas de forma standarden los

ensayosposteriores.

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141

111.2.4,ENSAYOS DE COMPROBACION ENTRE DISTINTAS PARTES Y ESTADOS

DE LA PLANTA FRENTE A DIFERENTES TAMPONES .- Con la planta 8 de

la vid Tol se ensayamaterial fresco y congeladoa -2Do durante72 h, de hoja, tallo y raíz

procesadastodas ellas de la misma manera en los cinco tampones anteriormente

ensayados(Cuadro XI). En los resultadosse observan grandesdiferencias entre las

lecturas de hoja de vid fresca y del material congelado,en cualquierade los tampones

b), d) y e), apareciendonuevamenteresultadosnegativoscon tampón de extraccióna)

y c) tanto de material fresco como congelado.Estos resultadosmuestrande nuevo la

menor repercusióndc la naturalezade los tamponesen algunaspartesde la planta de

vid, tallo y raíz, así como en Ch.quinoa donde las lecturas son similares con cualquier

tampón que se utilice para la extracción.

Para comprobarlo con material procedentedirectamente del campo se realizó un

segundo experimentocon tres muestras procedentesde la finca de La Higueruela

(Toledo) de las cepas5’(To5’), 22 (To22), 27(To27) y 29 (To29), positivas,así comootras

negativas, 1 (Tol), 2 (To2), etc., haciendodos bloquesde cadauna de las partesde las

plantas (hoja y tAlo), uno de los cualesse congela durante48 b a -209C y el otro sc

mantienea 49C, en frigorífico, posteriormentese procesaronambosJotes de muestras

en el tampón de extraccióne) (CuadroXII). Los resultadosindican queen las muestras

To22, To27 y To29 varian las lecturasde > 2 en hoja frescaa 0,341,4en hoja congelada,

siendo buenaslas lecturas,> 2 también en tallo. De todo ello podemos concluir que la

hoja presentadificultades si se utiliza congeladaen el test ELISA, tanto más cuanto

mas vieja sea la hoja en el momento de la congelación,a no ser que se triture

directamenteel materialsin descongelarcon lo que se consiguemejorar ligeramentelos

resultados.Las muestrasprocedentesdel primer muestreode La Manchase procesaron

en Agosto,Abril y Septiembre.En la Tabla XI se reflejan los resultadosdel ELISA de

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143

las muestras que inicialmente resultaban positivas. Por procesosde congelación y

descongelacién,ya que no estabanalicuotadaslas muestras,los resultadosfueron cada

vez menosreproducibles.

CUADRO XII COMPARACIONDE LECTURAS EH LA DETECCIONDE GFLV DE HOJADE MUESTRASPOSITIVAS DE LA FiNCA <LA IIIGUERUELM DEMATERIAL FRESCOY CONGELADOEN MEDIO DE EXTRACCION CE)

Estado Fresco Congelado

>2 0,312

27 1,931 0,301

29 >2 0,401

1 1,650 0,295

Tampón . 0.000

vid <-1 0,028

144

111.2.5.SENSiBILIDAD DEL TEST ELISA PARA DISTINTAS CONCENTRACIONES

DE MUESTRA ,. Una vez establecida la concentración más adecuada de

anticuerpos,interesa comprobar hastaque concentración de antígenoes sensible el

método,tantoen extractosde Ch.guinoacomode vid, paraello se prepararondiluciones

en ambasfuentesde material de 1/5 a 1/10240 (Cuadro XIII), resultandoclaramente

positivas en Ch.guinoa las dilucciones hasta 1/2560, mientras que en vid la máxima

concentración con resultado positivo fué entre 1,80 y 1/160 . El experimento se repitió

con las mismas dilucciones pero utilizando tapizados de placa de 200 y 100 ul, no se

apreciaron diferencias significativas en los resultados, aunque se tardó mas tiempo para

conseguir las mismas lecturas (Cuadro XIV), con el riesgo que supone la aparición de

fondos más altos a tiempos más largos, que dificulta por lo tanto la lectura de

titulaciones débiles, (Eig.32).

Debido a la aparición de fondos muy altos en los controles negativos se penso que algtin

tampón actuaba incorrectamente ose deterioraba con facilidad, a fin de comprobar esta

hipótesis se ensayaron los tampones a>, b), e) y e’) de extracción, siendo el e’ ) igual

al e) más Nicotina frente a otros tampones conjugados y tampones sustrato procedentes

de distintos Kids o los preparados en el laboratorio en momentos diferentes (Cuadro

XV). Las muestras utilizadas fueron la planta 2 de la To!, tomando hojas de la 1 a la 8

desde la base del tallo a la parte apical del mismo, y Ch.guinoa, inoculado con virus de

dicha planta. Los extractos se prepararon a la concentración 1/10 en el correspondiente

tampón.

CUADROXIII y XIV VARIACION DE LA D.O. A DIFERENTES CONCENTRACIowEsDEMUESTRADE C. quinoa Y VID. LECTURAS TOMADASA 1 HORADE INCUBACION DE SIJETRATO

200 pl

Ch. quinos (.4>

Concentración

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1/10

1/20

1/40

1/Be1/160

1/320

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1/25601/5120

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0.495

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1/20 > 2 1.330 1,207 0,112 0,089

1/40 2,000 1,030 0,943 — 0,089

1/80 1.500 0,860 0,725 0,123 0,089

1/160 0,970 0,605 0,478 — 0,089

1/320 0,550 0,280 0,257 0,130 0.089

1/640 0,340 0.175 0,160 — 0,069

1/1280 0.233 0,135 0,130 0.130 0,089

1/2550 0,180 0.127 0,120 — 0.089

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Fig. 32 — Variación de la 0.0. en Ch. quinoa , O O , y enhoja de vid, A A 7iifEñción de la concentraciónde la muestra. Lecturas tomadas a 3 horas de incubación de

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¶49

Asimismo, se comprobé si el tampón Tris (tampón e) mejoraba su acción antioxidante

al añadirle nicotina al 2,5%, utilizandolo en bojas que habían estado sometidas a

temperaturas altas (Fig33) en invernadero. Se midieron y comprobaron la composición

y pH de todos los tampones así como el pH de los distintos extractos utilizados,

obteniéndose resultados coincidentes con los de los Cuadros VIII y IX, así el pl-l fué de

4,2 en el tampón a>, 8,7 en el b), 8,2 en el e) y 8,44 en el e,>. Los Cuadros XVI

muestran los resultados de los test ELISA efectuados en este material y con los citados

tampones, donde se comprueba que la adición de nicotina no mejoré los resultados

obtenidos con el tampón e). Las hojas jovenes dieron lecturas muy superiores a las

viejas, más próximas a la base del tallo (Cuadro XVII). Las muestras extraídas en el

tampón a) dieron resultados negativos en dos de las cinco muestras testadas y, las

positivas, siempre con lecturas muy inferiores (menores del 50%) a las obtenidas con los

otros tampones. En el caso de Cb.quinoa los resultados fueron similares con todos los

tampones. Los tampones conjugados, preparados con ESA (Seroalbúmina bovina) con

anterioridad mostraron peores resultados que los reden preparados o los que no

contienen ESA.

U~Semana de Agosto

pr ¡> l~ u ¡4 II —

Fig.33 .— Curva de temperaturas del termohidrógrafo durante la primerasemana de Agosto y en Invernadero. Gráficas similares se hanregistrado de mitad de Julio a mitad de Agosto y a lo largode cuatro afios de seguimiento

400C300C20C

150

ÉuÁnRoxv’í .— COMPARACIONDE D.D. EN HOJAS DE VID To 1 EN FUNCION DESU POSICIÓN EN EL TALLO NQ 1 EN LA BASE A NQ lOEN ELBROTE FINAL

floja Lectura Vid (—) T~~~P6n

3. 0,461

2 0,478

3 0,675

4 0,803

5 O.C03

Cd<9 09-4 9-4

6 1,200 0 0

7 >2 ¡

3 >2

9 >2

10 >2

152

‘UADRO XVIII,— COMPARACIONDE D.O. EN CONTROLESPOSITIVOSY NEGATIVOS, FRENTE ATAMPON DE EXTRACCION (E) CON Y SIN NICOTINA Y CUBRIENDO O SINCUBRIR LOS POCILLOS CON 50 pi DE BUTANOL O VASELINA

Ta~p6n vid To~p6n vid Tasup~n vid Tas,p6n vidcon nicotina sin nicotina con nicotina sin nicotina

0,734 0,838 <y) 0,360 0.663 CV) 1,677

0,533 0,574 (Y> 0.485 0,439 Lv> í,c&s CD>

1,415 CV)

2

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0,405 CD) 0,637 (U) 0,350 (U) 0,312 (II) 0,100 CV)

1,112 CV) 0,434 0.637 CV) 0.376 0,100 CV)

0,100 CD)

0,100

‘Oa

1,178 (7) 0.383 0.532 CV> 0,365 0,120 CD)

1,232 tUI 0,609 (U> 0,755 (U) 0,074 (ti) 0,120 (vi

0,134

0,112 (y)0

V, Pocillo cubierto con vaselina

U. Pocillo cubierto con butanol

Al cambiar de lote de sueros> es aconsejable comparar el lote antiguo con el nuevo,

frente a los controles que se vengan utilizando como positivos y negativos, así como

sobre las plantas herbáceas utilizadas en los ensayos de transmisión, tanto mecánica

como por vectores. El Cuadro XIX muestra los resultados obtenidos al comparar dos

lotes de sueros con dos tampones de extracción (e y e’ ), sin cubrir y cubriendo con

butano! y vaselina respectivamente, donde se aprecian notables diferencias entre los

resultadosobtenidos con el suero antiguo y el nuevo, pequeñasdiferencias en los

cubiertos con vaselinafrente a los testigossin cubrir, no apareciendodiferenciaalguna

en l¿s cubiertos con butano!, así como ligeras diferenciasrespectoa los tamponesde

extracción, con o sin nicotina,

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154

En ocasiones al utilizar lotes nuevos de sueros frente a plantas de Ch.quinoa

procedentes de semillero o de testigos negativos en experimentos de transmisión en

invernadero, se han obtenido lecturas muy elevadas, inclusó a nivel de positivos d~bilcs,

unas tres veces superiores al control negativo de vid (Cuadro XX), probablemente debido

a que dicho suero reconoce proteínas de la planta , quizás utilizada para su obtencién.

Esto representa un grave probleta para la deteccién del virus en los experimentos dc

transmisión a planta herbácea , ya mecánicamente o a trav&s de vectores.

CUADROXX .— OBSERVACIONES DE FONDOS ALTOS Y POSITIVOS EN Ch. qylnoa DESEMILLERO SIN INOCULARXOMPARACION DE D.C. ENt~rC1cjaTnoaTESTIGO, INOCULADA CON VID DE TERMOTERAPIA COMO CONTROL (—)

Y TAMPON

Tiempo i hora 2 horas O/NMuestra

Ch. guinoa de semillero 0,487 0,825 1,429

Ch. guinoa inoculado conGFLV de vid To ¡ 0,872 1,450 , 2

Ch. guirioa Inoculado conGFLV de Vid To &narilla 0,505 0,733 1,218

Vid —) de termoterapia 0118 0,148 0,197

Tampón 0,900 0,102 0,118

155

111.3, VARIACION DE LA CONCENTRACION DEL VIRUS

.

Durante los años 1988 a 1991 se realizó un seguimientoperiódico de las plantas que,

en el muestreo relizado en La Higueruela, según el diseño al azar antes descrito,

resultaronpositivas (To5’, Toé’, To8’, Toil’, Tol5, To22,To27 y To29).Comocontroles

negativosse utilizaron las Tol y To2, mientrasque para el positivo se eligieron las Tol

y ToII, que habían sido detectadascomo fuertementepositivas en 1988. El material

procedentede la cepaTol, estaquilladoen invernaderodesde 1988 y que se utilizó en

la comprobacióny puesta a punto del test ELISA en laboratorio, fué también objeto

de seguimientoa lo largo del periodoindicadoa fin de comprobarque partede la planta

y qué época del año eran las más indicadaspara utilizarse como fuentes de virus.

Asimismo se realizó el mismoseguimientoen La Mancha,en focos claramentepositivos,

en las zonas de Socuéllamos(dos focos), Ossade Montiel (uno) y Valdepeñas(dos).

Los resultadosdel muestreode La Higueruelase reflejan en los CuadrosXXI, XXII y

XXIII, Tabla XII y Figs. 37, 38, 39 y 40 de los que se deduce que en raíz y tallo las

absorbancias obtenidas se mantienen constantesa lo largo de todo eí año, siendo

inferiores en raíz que en tallo. En hoja las lecturas son superioresa las detectadasen

tallo y en raíz durante la primavera y principio de verano, decreciendopaulatinamente

hastano ser detectablesa finales de otoño en campopero sí en invernadero(Cuadro

XXV, Fig 41> siendo las de hoja joven muy superioresa las obtenidasen el resto de la

planta. En fruto, puededetectarseel virus en cualquiera de sus partes(piel, pulpa,

pepita e incluso en mosto)(Fig. 42), destacándoseque la pepita dá lecturas muy

superioresa las otras partesdel fruto, muy similares a las obtenidasparahoja joven.

CUADROXXI.— DETECCION DE GFLV EN CEPAS CONTROLDE LA FINCA EXPERIMENTALLA HIGUERUELA”. SEGUIMIENTO PERIODICO Y ESTUDIO DE LA PRE

SENCIA DE VIRUS EN DISTINTOS TEJIDOS DE LA PLANTA.

Muestras compuestas

por cuatro brotes

final.. da tallos

d. 10 ca. Hoja jdvan

3 aucatras por cepa.

Hoja — Tallo — Raíz

Muestras do hojamuy j6ven

Hoja jáven —

Tallo baso

Hoja j.— Tallo v.- RaízLuan do cuatro orientaclones do la plantaHoja y.— Hoja j.

Brote final — Suma ndeit

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Control do hojo.s auyj¿venss nocidan cosifuertes tea¡peratura.s

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Hoja jdven

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Cuatro muestras maderopor cepa

Raíz de vid TOI y TOiI a40,80,120 y 150 ca deprofundidad (5 sara.Iplarita tAs raíz a 60 cm.)

Cuatro aarmiantos/planta2raíz e dos profundidades

cuatro Muestras madera¡ SAS raíz y yen

Dos muestras de maderay ¿Os yea.s pOr cepa

Material eat.quillado.Madera y yemas

¡ cuatro auestras de hojaade puntas de tallos,brotes y tallos base

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Fig.38a -— Comparacián dc 0, 0. entre hoja jóven—vieja; tallo jáven— viejo;raíz vieja—blanca. Material vegetal procedente de la vid lo 1(planta nQ 3). ComIenzo de otoflo

A405

pl .7

Fis. 38V— Comparaclári de Absorbancla de y E vieja y i ~l jáven en plantaestaquillada en Invernadero, procedentes de la vid To 1 (nQ 1,

3, 5 y 7)

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A405

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Ffg.fla~— Detección de G~LV en hoja y tallo muy jóven (Febrero>Invernadero) en distinta posición en tallo — 1 en labase a 5 en el brote —. Lecturas tomadas a 1 hora deincubación de sustrato.

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F’ig.39b.— Detección de GFLVdistinta posicióna 10 en el brote.

en hoja de vid lo 1 (3) enen tallo, de 1 en la baseLecturas tomadas a 1 hora

eMT 111 MI iii MT0.

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de incubación de sustrato (Marzo 1991)

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Fig. 40a .— Histograma de Absorbancias de hoja y tallo deAgosto. Comparación de D.0. según su posición

1 enla base a 6 próxImo al brote fir~al 1

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la vid lo 1 enen el tallo

rig.40b.— 0.0. de muestras de hoja de vid lo 1 <planta 8)según su~posici6n en el tallo nQ 1 cerca de labase a 9 en brote. lieja 1--u--U--; hoja 3—O—---—O-;hoja 5—Q--Q-; hoja i.—t-—t-; hoja 9...—.—; vidcontrol <~-‘-0--f~—~ vid control <—~-0---~—Y tampón(Septí embre)

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Fig~4l .— Histograma de Absorbancias de la nuestra vid

cepa Panarllla, en diciembre, estaquillada en

Invernadero. Comparación de Absorbanclas entre

hoja, tallo y raíz. Lecturas tomadas a 1 horaC~) y D/N de inoculación de sustrato

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FIg. 42.— DIferencIas de Absorbancla en distintas partesde la uva (piel, pulpa, pepita y raquis) de lavid lo 1

Hoja Tallo Pat Tampón Vidtr2

CUADROXXV DETECCIONDE GFLV EN CEPA AMARILLA ESTAQUILLADA EN INVERNADEROCOMPARANDOTRES PARTES DE LA PLANTA (HOJA, TALLO, RAIZ Y ADOS CONCENTRACIONESDIFERENTES (1/10, 1/20) EN DICIEMBRE.LECTURASTOMADASa 1 HORA Y O/N DE INCUBACION DE SIJSTRATO

Concentración

Muestra

1/10 1/20

Lectura

1 h 0,166 0,080Hoj a

OJN 0,953 0,281

Tallo1 h 0,655 0,127

O/N > 2 (3) 0,608

Raiz1 h 0,350 0,093

O/N 1,710 0,268

Tampón1 h

OIN

0,071

0,081

0,070

0,064

Vid 1 h 0,081 0,064

(—1 O/N 0,152 0,109

167

Los trabajos iniciales efectuados sobre el material estaquillado de la cepa Tol (ocho

plantas), mostraron que las lecturas eran tanto más fiables cuanto más jovenes eran las

hojas utilizadas en el test dc tal manera que cuando se empleaba hoja vieja las lecturas,

en muchas ocasiones, no eran reproducibles, siendo necesario utilizar tampones de

extraccién con nicotina o a base de Tris-dM 0,5M, pH 8,2, con PVP y PEG. Afin con

estas precauciones las lecturas eran menores que empleando estos mismos tampones con

material joven, mientras que permanecían constantes cuando el material vegetal era tallo

o raíz. Para establecer la causa de estas variaciones en la absorbancía con la edad de los

tejidos o la parte de la planta, así como la influencia que la temperatura pudiera tener

en dichos tejidos de acuerdo con la época del año, se realizaron test con hojas, desde

su nacimiento en el mes de febrero hasta su agostamiento en noviembre. Los resultados

obtenidos se expresan en la Tabla Xl en la que puede observarse que los test realizados

en febrero con hojas de 15 días de edad yen talios de unos 50 cm de longitud, muestran

lecturas similares, cualquiera que sea la posición de la hoja a lo largo del tallo. Por el

contrario, ya en esta época, se encuentran grandes diferencias entre las lecturas

proporcionadas por hoja, tallo y raíz. En marzo, abril y mayo ya se aprecia una

diferencia de lecturas entre hoja joven y hoja vieja, asimismo se observaron mayores

absorbancias en raices jovenes (blancas), similares a las de hoja joven, que en las viejas

(marrones), en los tallos las lecturas permanecieron constantes.

En Junio se testaron las ocho plantas tomando un disco de cada hoja de la 1 a la 10

desde el ápice, y del mismo modo se mezclaron raices de distintas edades de cada planta.

Los resultados obtenidos fueron similares en todas las plantas, tanto en el material verde

como en raices. Hay que tener en cuenta que estas plantas no fueron injertadas, puesto

que proceden de estaquillas.

168

A mitad de verano (Agosto) se apreciarongrandesdiferenciasentre las lecturasde hoja

vieja y joven, incluso en hojas jovenes nacidas y mantenidas en las épocas de máximas

temperaturas se obtuvieron lecturas de absorbancias del doble que en hoja vieja,

permaneciendo constantes los resultados en tallo y raíz. Con el material de esta época

se comprobé el comportamiento de distintos tampones de extracción con resultados

similares a los discutidos en el apartado correspondiente. A finales de verano y

comienzos de otoño se acentua la tendencia a disminuir la absorbancia en hoja vieja,

llegando en algún caso, en octubre, a resultar negativa, mientras que permanencen

claramente positivos los resultados de hoja joven, cuando es posible tomarla,

permaneciendo prácticamente constantes los resultados de raíz y tallo. Como resumen

del comportamiento frente al test ELISA de las distintas plantas control de La

1-ligueruela, reflejamos las medias de las absorbancias resultantes de los distintos

controles efectuados en la cepa Tol por semanas parte y edades de la planta (Fig. 43 y

Cuadro XXVI)

CUADRO XXVI.— Variación de la absorbancia en función de la edadpar½ de la-planta. Vid To 1 de La Hi<’ueru~le=

Semana Parte de la planta Lectura

3 Raíz 0,907

7 U, 0,892

11 0,882

31 II 0,517

38 a, 0,927

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46 UU 0,569

CUADROXXVI (Continuación)

Semana Parte de la planta Lectura Semana Parte de la planta Lectura

Tallo jáven

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1,056

0,644

0,713

0,832

0,592

0,458

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1,020

0,607

0,639

0,663

30

31

32

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34

35

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0, 931

0,918

1,115

1, 270

0,968

1, 277

1 ,086

1 • 010

1,096

0,900

0, 750

0,724


Semana Parte de la planta Lectura Senana ¡ Parte de la planta Lectura

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Hoja jáven

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1, 267

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¡ 1,249

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1, 320

1, 296

1, 339

0,914

1 , 040

0,893

1,021

¡ 1,104

1, 312

1,237

0,824

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Hoja vieja

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0,600

0,622

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0,470

¡ 0,757

0, 526

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0,526

0,574

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0, 305

0,210

0,209

0,077

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SEMANA UVA TRITURADA DISTINTAS PARTES DEL FRUTO

Piel Pulpa Pepita Raquis Mosto

31 1,524 — — — — —

35 — 0,375 0,800 1,653 0,369 —

36 — 0,385 0,421 0,989 0,421 —

37 1,254 — — — — —

38 1,467 — — — — —

39 — 0,520 0,740 1,484 0,575 0,740

CEPA 1 Lectura

Semana 14

Sarmientoaflo anterior 0,750

Yema >2

Semana 27

HoJa 1,000

Brote 1, 025

Tallo 0,724

Sarmientoaflo anterior

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5

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Fig. 43.— Evolución de 0. 0. a lo largo de distintas épocasdel aflo y difere’ntes tejtdos y edades de la planta.Muestras de plantas control de La Higueruela

50

2 • Hoja JQvt~ *• Ho>o Ví.jo

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• Reíz

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173

Los resultadosobtenidoscon material de los focos positivos de La Mancha,testadosa

lo largo de 1991, se recogenen el Cuadro XXVII, donde se observaque se obtienen

lecturas positivas en todos los puntos de muestreo, en cualquier parte de la planta

testada,en cualquier orientación, profundidad de raices y época en que se tomé la

muestra,aunquecon variacionesen los valoresde absorbancia.Es importantedestacar

que en todos los casosen que se utilizó yema o racimo recien nacido, como fuente de

virus, el nivel de absorbanciafué considerablementemayor que con cualquierotro tejido

de la planta (Fig. 44 y 45, CuadrosXXVIII y XXIX). Se observan también, en estos

focos, grandesdiferenciasen las absorbanciasdebidasa hoja, tallo y raíz.

A 4.0405

MQ.44.— Variación de 0.0. en yema y madera de vidTo 1 y en cepa amarilla a distintos tiemposde incubación de sustrato. ~e~#——---5yemaTo I;—D...-.—D-... , maderaTo I;~ •O•-.,Q..yema cepa amarilla; ~ madera cepaamarilla; —U-————U.-....control vid; (—) ‘t-’-

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111.4. CORRELACION ENTRE SINTOMATOLOGíA Y VIROSIS

.

Paraesteestudiose ha utilizado cl material recogidosegún los diseñoselaboradospara

la UUEscueIa Musco d& la Vid y del Vino, Finca Experimental ‘La Higueruela, las

muestras recogidas en los campos de variedades de Ja “Escuela de Enología y Viticultura

de Tomelloso y la Finca Experimental del Centro de Investigaciones Agrarias de La

Rioja, así como las procedentesde los focos positivos de La Mancha,en Socuéllamos,

Ossade Montiel y Valdepeñas,que fueron analizadosa lo largo del año.

I1I.4.l.CORRELACIONSINTOMATOLOGIA-VIROSIS EN DISTINTAS VARIEDADES.-ET1 w443 234 m518 234 lSBT

En resultadosobtenidos en la ‘Escuela Museo de la Vid y del Vmo 116 muestras

tomadasal azar de las variedadesexistentes,en un primer muestreo, solamente4

resultaronpositivas. Los siguientesmuestreosse centraronen las variedadesAirén y

Tinto Fino, en aquellas cepas que mostrabanclaras alteraciones,equiparablesa las

descritascomo debidasa virosis, todasellas resultaronnegativas.

181

Los resultados de las muestras recogidas en los camposde variedadesde Tomellosoy

La Rioja fueron similares a los obtenidos en la “Escuela Museo de la Vid y el Vino”, a

pesar de que las muestras fueron tomadas en aquellas cepas que mostraban menor vigor,

en ausencia de una sintomatología que indicara la presencia de virus. Del material

estaquilladoen invernadero,procedentedaamboscentros,se realizarontest en distintas

épocas del año con resultadosigualmentenegativosen todos los casos.

111.4.2. CORRELACION SINTOMATOLOGíA-VIROSIS EN GARNACHX- En La

Higueruela” se testaron 259 cepas de la variedad Garnacha, recogidas radialmente

tomando como centro las Tol, To2, To5”, Toe,’, ToS’, Toil’, Tol5, To22, To27, To29, Tol

y Tolí, antes referidas, sin tener en cuentala sintomatologíaque presentaban,de ellas

(Fig 46, CuadroXXX), resultaronpositivas 104, lo que representaun 4DUIt5 % del total,

Paralelamentese realizó un estudiovisual de las 3.830 cepasque contiene la parcela,

llevadaa cabopor tres observadoresdistintosen Julio, Agosto y Septiembre,cadauno

de los cualesrealizó tres repeticionescon intercambiode bloques.Se tuvo en cuenta la

sintomatologíade aquellascepasen que coincidieronlos tresobservadoresestableciendop

gradosde O a 3, dándoseel valor O a la planta sin síntomas,1 con sintomatologíaligera,

2 para síntomasclaros y 3 para casosmuy claros. Los parámetroselegidos para definir

estasintomatologíafueron tan sencillos como: mosaicoamarillo, bandeadoen venas,hoja

muy dentada,uva corrida o con defectode coloración o maduración,maderaaplanada,

dobles o triples nudos y entrenudocorto. El resultadoobtenido (Fig.47, Tabla XII) fué

el de que, igualmente 104 de las cepasse consideraroncon síntomas,con coincidencia

entre sintomatología,presenciade virus en 82 de los casos,porcentajessimilares a los

obtenidosmediante la aplicación del tesÉ ELISA a 35 muestrastomadasal azar. Ello

indica que en la variedad Garnacha, la infección vírica parece provocar una

sintomatologíaclara, no así en las y otras variedadesestudiadas.

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184

AUn así hemos de tener en cuenta que en esta parcelaexperimentalencontramosgran

cantidad de cepascon anomalíastales como, cepasjovenes, raquíticas,renovadas,sin

injertar, patronesbrotadoso marrasque dificultan el establecimientode porcentajesde

plantascon síntomasrespectodel total (CuadroXXXL).

Cepas totales 3.830

Cepas nuertas U’U’UUUUUUU’U’U’U•’U’U~’U 191 4,7 t

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Cepas con síntomas 925 29,2 í

CUAO~U XXI -— La Hlgueruela’ verano 1990. Anotación de anomalías

Cepa por cepa

Al comparar los resultados de 259 plantas estudiadaspor ELISA y por observación

directa (Cuadros XXXIí y XXXIII) se aprecia que por ambos métodos resultaron 104

plantas positivas, pero hay 20 casos positivos del observador que fueron negahvos para

ELISA y 19 a la inversa; en 82 casos coinciden cii valor absoluto, claramente positivos

o negativos, los dos métodos, lo que representa un 78,8% de aciertos del observador

frente al ELISA. De estos resultados se podría deducir cierta seguridad en la predicción

por ci observador en esta variedad y en estas condiciones sobre la sanidad de una cepa.

Por el contrario, al intentar establecer correlaciones entre los datos reales,

proporcionadospor cl ELISA, y los cuatrogradosestablecidospor el observadoren las

259 plantas,resulta una recta de regresión(Fig.48):

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y un R2 = 0,383.

lo que implica que ei coeficientede regresiónno es significativo, es decir, en términos

generaleslas observacionesdirectasson subjetivasy por lo tanto no son suficientemente

buenasfrente a la seguridadproporcionadapor el test ELISA. Esta falta de correlación

185

se acusa cuando se hace el tratamiento por corros independientes, en aquellas zonas de

la finca en las que hay otras deficiencias debidas a problemas del suelo. Por el contrario

los coeficientas altos correspondes a zonas en que el viñedo es más uniforme. Es

necesariodestacarque de los 22 casosde no coincidencia entre el observadory el

ELISA, con frecuencialos resultadossonopuestos.De todo estose deducelo dificil que

resultaen la mayor partede los casosla dificultad de inferir porcentajesde enfermedad

en función de la sintomatología.

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Fig. 47 . — Representación de cepas positivas por ELISA C e ) y positivas por observaci6n

directa ( Q ) en los corros con centro en las cepas control < 1 y 2, 5. 8’.1V, 22, 26, 21, 29, Yo 1, fo 1! y Amaril1~ ) de la Finca Experimental La

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111.4.3. CORRELACIONSINTOMATOLOGIA-VIROSIS EN LA MANCHA .- En

Socné11.amn~, Ossa de Montiel, Valdepeñas y en el Km 11 de la carretera de Valdepeñas

a Daimiel se localizaron rodalesque presentabanmosaicoamarillo en gran númerode

cepas, que se manifestabadesde el nacimiento de la hoja, principios de mayo,

progresivamentese observaroncepascon clarasintomatologíade bandeadoen venas,así

como otras,en las proximidadesde estos rodalesamarillos, con fuertes alteracionesde

madera (dobles nudos,entrenudocorto, fasciación,maderaaplanada)o sintomatología

en hoja (muy dentada o asimétrica) en fruto (uva corrida), pero sin alteraciones

cromáticas (Fig.49, 50 y 51).

Asimismo se encontraron frecuentemente cepas que presentaban toda esta

sintomatología conjuntamente, así en la misma cepa podía verse un sarmiento totalmente

verde pero con clara Líntomatología de GFLV en madera, hoja o fruto junto a otro

sarmiento con hojas totalmente amarillas u otros que mostrabanbandeadoen venas,

incluso en un mismo sarmientose podian observar las tres sintomatologíasdescritas,

presentándoseestos casos con mas frecuenciaconforme avanzabala estación.En ULa

Higueruela’ la cepaTau, marcadadesde 1988 como con sintomatologíade bandedoen

venaspermaneciócon estasintomatologíaa lo largo de todo el estudioy una situación

similar mostró la cepa ToAm, siempre amarilla pero sin ninguna otra manifestación

cromática, aunque ambas presentabandeformaciónde madera.Testadaspor ELISA

todas estasvariaciones dieron los mismos resultadospositivos a lo largo de todo el

tiempo (Cuadros XXXIV y XXXV).

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111,5. INCIDENCIA DE GFLV EN LA MANCHA

.

Una vez comprobada la sensibilidad del test ELISA, se aplicó al material vegetal

recogido al azar en La Mancha, así como a hojas brotadas de su etaquillado en

invernadero,en distintas épocas(Tabla XIV). De las 257 muestrastestadassolamente

17 resultaron positivas de GFLV. es decir el 6.6% ±0.03.Estos resultados fueron

verificados por el equipo del Dr. COOPERdel “Department of Plant ScienceUU, de la

Universidadde Oxford, UK, con resultadoscoincidentesen 16 de las 17 positivas, con

la única excepción de una muestra, la número 38, positiva débil en nuestro test y

negativa en el del otro equipo.

En el análisis realizado sobre el material estaquillado, se llegó a resultados coincidentes

en cualquier parte de la planta testada (tallo, raíz u hoja), destacándoseque todas las

plantas positivas de virus mostraron dificultades para el enraizamwnto,presentando

menor vigor (Fig. 52) y , de las 17 viróticas, 2 % murieron antesde 8 meses,si bien del

resto, 242, murieron 33 (13%).

A fin de comprobar en campo, este porcentaje de incidencia, se testé nuevamente

material verde recogidoen la primaverade 1990, en que se tomaron2 muestrasen cada

punto, una que presentasela sintomatologíamás acusada(muestraimpar) y, otra, al

azar (muestra par). El resultado (Tabla 2(V), fué que de 300 muestras testadas

resultaronpositivas 35 (el 11,6% ±0.036),13 dc las 150 que se habíantomado al azar

(8,6 % ±0.045),y 22 de las 150 que presentabansÍntomas(14,6 % ±0.057),resultados

coincidentescon los de los muestreosanteriores en madera.

198

Para comprobar,una vez más, los resultadosobtenidos y a fin de estimar la relacción

del virus con los nematodos vectores, se analizaron 123 muestras de cepas que

presentabanfuertes deformacionesde madera,recogidasen diciembre de 1990, y de

cada 5, una de tierra. Los resultados(Tabla XVI) fueron de 15 muestraspositivas de

GFLV, el 12.2% ±0.058del total, hay que teneren cuentaque las muestrasde Daimiel

y Socuéllamosfueron tomadasen plantasmarcadascomo positivas, lo que indica que el

porcentaje real esta en los límites obtenidosen las pruebasanteriores.Posteriormente

se repitió el test en hoja del materialestaquillado,obteniéndoseresultadoscoincidentes

al 100%con los anteriores.

El material procedentede “La Higueruela”, La Mancha y el Valle del Duero, fué

también testado con sueros contra “Arabis Mosaic Virus” (AMV). Las 1000 muestras

testadaspara Castilla-LaMancharesultaronnegativas,de las 1700 del Valle del Duero,

dos fueron positivas, una en Cigales (Valladolid) y otra en Km. 174 Ctra. Madrid-Irún

(Burgos).

111.6. INCIDENCIA VIRUS -NEMATODOS VECTORES

.

A lo largo del trabajo se realizaronestudios,en la Finca Experimental“La Higueruela

y en diversos puntos de La Mancha, encaminadosa comprobar la incidencia de los

nematodosen las virosis, su distribución vertical y horizontal, a fin de conocer su

importancia en la epidemiologíade la enfermedad.

La Cuadro300<VI refleja los resultadosobtenidosen ULa Higueruela”,donde se observa

que, en el muestreo realizadoal azar, según diseño,en 1989, en que se tomó material

vegetal(30 muestras)y suelo en 12 de ellas intercaladas,16 muestrasresultaron

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201

positivas para el virus y la incidencia virus-vector fué nula, puesto que en las dos únicas

muestraspositivas de GFLV, de las que se tomé suelo, no aparecieronnematodos

vectores,mientras que la Tos, en que se encontróXlndex y las To4 y To6, que

contenían Kitaliae resultaronnegativaspara el virus.

En los muestreosrealizadosdesdeoctubrede 1990 a marzode 1991,tomandomuestras

de suelo en las cepas positivas de virosis, así como en los controles negativos,

encontramosque en el muestreode octubre¡a incidencia virus-vector fué del 58%(siete

muestrasde 12 positivas))apareciéndoademásel vector en los controles negativosdel

virus (Tel y To2); sin embargo en los muestreosde enero y febrerodel 91 no apareció

ningun nematodo transmisor de virus, volviendo a encontrarseen el muestreode marzo,

con muchamenor incidencia (25%) que en octubre,en dos muestrasde las docepositivas

se encontróXindex y en una X.italiae, apareciendoestaÚltima especieademásen un

control negativo (To2).

En las muestras tomadas a distintas profundidades,según el diseño descrito, no

aparecieron nematodos vectores y la presencia de X.pachtaicum,especiemuy frecuente

en el cultivo en toda la zona, resulté indiferente al nivel muestreado.

Los resultadosdel muestreoal azar realizadoen La Manchaen diciembre de 1990, en

que setomaronmuestrasde suelopor aproximadamentecadacinco cepasque mostraban

síntomasde maderadeformada,entrenudocorto, etc., figuran en la CuadroXXXVII, en

la que seobservaigualmentequela incidenciavirus-vectoresprácticamentenula (2,9%),

una muestrade las 34 estudiadasfué positiva de virus, Xindex y X.italiae, a pesar de

ocho de las estudiadasfueron positivaspara GFLV, X.index aparecióen 4 y Xitaliae

en dos.

CUADROXXXVII.— CORRELACIONV¶RUSU.’UNEMATODOSVECTORESEN LA MANCHA

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203

Entre enero y mayo de 1991 se realizaron una serie de muestreos en distintas zonas de

La Mancha que presentaban diferentes síntomas de virosis junto a fuertes infecciones

víricas, así en Socuéflamos en la que denominamos “zona de mosaico amarillo, se

observabamosaico amarillo, “bandeadode venas” y deformacionesde madera;en Las

Hoyas fuertes síntomasde deformaciónde maderasin alteracionescromáticas,ambas

zonas positivas de GFLV; en la zona del camino de Matallana que presenta tambien

claros síntomasde deformaciónde maderapero siempreresulté negativaparael virus.

En Ossa de Montiel en otra zona de mosaico amarillo, bandeado de venas y madera

deformada, positiva de GFLV. En Valdepeñas en la finca “Les Córdobas” existe

deformaciónde maderapero no se detectaGFLV, mientras que en “La Encomienda”,

en que se apreciadeformación de madera y mosaico amarillo y en el Km 11 de la

carretera de Valdepeñas a Daimiel, que muestra mosaico amarillo, UUveinbandingUU y

madera deformada, revelan fuertes infecciones víricas.

En el Cuadro XXXVIII figuran los resultados obtenidos, donde se aprecia que la

incidencia virus -nematodo es del 100% para )Cindex y del 60% para Xitaliae, hallándose

ambos vectores incluso en los puntos negativos para GFLV, aunque no aparecieron en

todos los muestreos. En los muestreos diseñados para conocer su distribución espacial

en estas zonasen quese analizaronmuestrasde distintasprofundidadesy orientaciones

respecto a la planta infectada, se comprueba (Cuadro XXXIX) una vez más, la

distribución aleatoriade estosnematodos,en estecasoapareceXindex en todo un rodal

que abarcados cepasafectadasde virus, mientrasque Xitaliae solamenteaparecióen

dos orientacionesde la cepa1 (Este y Oeste),encontrándoseambasespeciesen todas

las profundidadesmuestreadas,exceptoen la costracaliza,dondeno apareciónematodo

a]guno. El Cuadro XL muestra los resultadosde los estudios realizadosa distintas

profundidades (entre 5 y 75 cm) en mayo, cuandolas poblacionesde estosnematodos

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eran más numerosas,en ella se observaque X.index se presentadistribuido a lo largo

de todo el perfil aunque sus mayores concentraciones se encuentran, en general, en las

capas mas profundas, asimismo 5titaliae solamente apareció a profundidadessuperiores

a los 50 cm.

Para estudiar la evolución de las poblaciones se realizaron muestreosde enero a junio

de 1991 (Cuadro XII), encontrándose que en enero solamenteaparecieronalgunas

hembras de Xindex, a partir de marzo las poblacionesde estaespeciese incrementan

considerablemente, hallándose hembras y larvas de los distintos estadioshasta finales

de mayo y no apareció ninguno de estos nematodos en el muestreo de junio. El

comportamiento de X.italiae es similar aunque con poblaciones mucho menos

abundantes.

111.7. ESTUDIOS ULTRAESTRUCTURALESDE PLANTAS INDICADORAS Y

DE Kindex

.

En estudios de seccionesultrafinas de células de Ch.guinoa,ponen de manifiesto la

presencia de viriones,tanto dispersos en el citoplasma,como asociadosa membranas,en

el interior de túbulos, formando estructuras más o menos complejas de túbulos

paralelos con viriones en su interior o dentro de plasmodesmos,formando complejos

multivesicularesque encierrandiversosorgánuloscelulares(Fig.53). Posteriormentese

comprobé que lo descrito como túbulos en el núcleo de las células, son acumulaciones

pseudocristalinas posiblemente de cápsidas vacias, estructuras similares se encontraron

en el citoplasma junto a formacionestubulares con viriones completos en su interior (Fig.

54). Hasta el momento no se conoce el significado de esta gran acumulo de partículas

vacias tanto en el citoplasma como en el núcleo de estas células.

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FAq. 53’ Secciones ulLrafinas de células de Ch. quimba infectadascon GFLV. A. Partículas vh’icas en el interior de unplasmodesmo. B. Particulas viricas en el interior deformaciones tubulares parúl el os. C . Formaciones pseudocris--LaUnas de acúmulos de par-ticulas. Ii. Complejos multivesicolares enqiobando particul os víricas y formando porcel os de vTclones en el citoplasma.

t.

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4.

211

Eliminando los ribosomas,que en todos los trabajosde ultrastructuraresultan dificiles

de diferenciar de las partículasvíricas de estosnepovirus,se consiguieronconsiderables

reduccionesde los mismos,sin llegar a eliminarlos totalmente(Fig. 55), lo que permitio

una mejor diferenciaciónentreviriones y ribosomas.

Al examinar preparacionesde tinción negativahechasdirectamentede savia de vid, se

presentaronlos mismosproblemascjue con el métodoELISA, no se detectanvirus. Sin

embargo, añadiendonicotina al 2.5% a los tamponesgeneralesde tinción negativaes

posible visualizar las partículas. Por el contrario, empleandomuestrasde Cb.guinoa

infectadas con GFLV es muy fácil visualizar gran cantidad de partículas en un solo

campo de la rejilla (fig.56>. Estos resultados aparecenconsiderablementemejorados

utilizando ISEM. con las ventajasde la sensibilidady especificidadde estemétodofrente

a la tinción negativa (Fig. 57). Por ambos métodos, se observan gran cantidad de

particulas vacias, que se observan en estas preparaciones,por ambos métodos, que

posiblemente tengan relaccién con las partículas vacias observadasen secciones

ultrafinas.

En seccionesultrafinas transversalesy longitudinales,a nivel del estilete de Xíndex se

aprecianpartículasvíricas asociadasala pared interna del mismo (Fig. 58).

- Electromicrografia de GFLV mirificadodo un 70% de partículas T penetradas(O).

de Ch. quinoa mostran--por e os otungstico

Fig. ~ ISEM de partículas de GFLV tranmistido de via a Ch. guinoa

.

Rejillas sensibilizadas con suero especifico contra elvirus (tipo E, penetradas por el fostotunstico y partículasintactas (tipo M y B).

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215

111.8. TRANSMISION DEL VIRUS DE LA DEGENERACION INFECCIOSAPOR

Kindex. DETECCIONDEL VIRUS EN EL NEMATODO VECTORVEN PLANTA

HERBACEA

En los procesosde transmisióndirecta e inversa,se obtuvieron resultadosclaramente

positivos tanto por ELISA como por ISEM, presentandoademásfuerte sintomatología

vírica las plantas herbáceas indicadoras (Fig. 59 y 60, Cuadro XLII). En los

experimentosde transmisiónutilizando diferente numerode nematodos,se apreciaen

la absorbanciaun gradiente en función del número de nematodosutilizados en un

tiempo dado (Fig. 61, Cuadro XLIII). Con la técnica de micromortero y utilizando un

ELISA modificado, a fin de incrementarsu sensibilidad, como se ha descrito en el

capítulo de material y métodos,se ha conseguido detectar virus con un mínimo de 5

individuos de Xindex, en buennúmerode pruebas(CuadroXLIII), y en el 100 % de los

casoscuandose utilizaban 10 o más ejemplares.Se han encontradotambiéndiferencias

en la adsorbancía al testar la transmisión a plantas indicadoras, según el número de

nematodos vectores utilizado, 6, 10, 30 ó 47 (Fig. 62). Asimismo, se han llevado a cabo

estudios de transmisión inversa con resultados positivos, alimentando nematodos,

mantenidosen higuera, libres de virus, en plantas indicadoras de Ch.guinoa y vid,

infectadasde virus. Estos nematodosfueron capacesde transmitir el virus a plantas

indicadoras, comprobándosesu capacidad de transmisión directamente por la

sintomatologíao medianteELISA e ISEM. La presenciadel virus en los diferentespasos

se comprobé igualmente por dichos métodosde detección,serológicosy de microscopia.

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Fig. 61 -— D~a. en 1, 5, lay3 horas y 0/N de incubación de sustrato

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6 10 30 47

IV. DIS CUSION

223

Para una mejor comprensióndividimos la discusiónen tres apartados.En el primerode

ellos se analiza la incidencia del virus de la degeneración infecciosa en las zonas

estudiadas,los problemasque planteasu detección,relación de la presenciadel virus

con la sintomatologíaobservadaen distintas variedades;concentraciónen los distintos

tejidos vegetales a lo largo del año y, en consecuencia su significación en el diagnóstico

para concluirlo con los estudios estructurales en plantas herbáceas indicadoras y en

nematodos

En segundo lugar se trata de la problemática que plantean y distribución de los

nematodos fitoparásitos en las zonas estudiadas,así como el comportamientode las

especies transmisoras de virus, Xlphinema index y Xiphinerna italiae, frente a las

condiciones ambientales de La Mancha y, finalmente, se analiza la correlación virus

nematodo U

lvi. INCIDENCIA Y DETECCION DEL VIRUS DE LA DEGENERACION

INFECCIOSA

.

El virus de la degeneracióninfecciosade la vid (GFLV) se encuentradispersoen todas

las zonas vitícolas estudiadas, independientemente de las condiciones climáticas y

variedadescultivadas en cada una de cijas, con una incidencia máxima en torno al 12%

(±0.025),porcentajeconsiderablementeinferior al que se venía estimandoen estudios

anteriores, posiblemente debido a que las estimaciones se venian realizando en gran

medida en base a diagnósticosvisualeso medianteinoculación a plantas hospedadoras

sensibles (PEPEZ CAMACHO,1981; PEÑA-IGLESIAS, 1972 y 1989).

224

Los diagnósticos visuales no son fiables, ya que manifestaciones sintomatológicas

similares a las descritas pueden darse como consecuencia de la fisiología de algunas

variedadesde vid, serdebidasa determinadescondicionesgenéticasy medioambientales

(climatología, tipo de suelo,etc.), tal y como manifiestaWALKER s.LM.(1985), o como

resultado de la acción de otros patógenos (filoxera u otros nematodos).Así, se han

detectadoconcentracionesaltas de carbonatosy comoconsecuenciapl-! elevadosen unos

200 puntos, frecuentesen pequeñaslomas de la llanura manchega,lo que produce una

serie de amarilleos, fáciles de diferenciar de las clorosis debidasal virus cuandose está

familiarizado con el cultivo. Tambien se observaronalteracionesde color debidos al

ataque de nematodos ectoparásitos del sistemaradicular del grupo de los “anillados”, que

se han encontrado en más de 50 focos. Otra sintomatología que se ha observado es la

que los agricultores de la zona denominan cepa “rula” o “esparraguillada” que consisteen

la aparición de brotes enanos con gran proliferación de hojas de pequeño tamaño, así

come la aparición de raices con nódulos, gran cantidad de raicillas en cabellera en la

zona del injerto, por lo que se le da el nombre de esparraguillado a dicha manifestación

sintomatológica. Esta alteración observada en más de 25 puntos de La Mancha se

presenta en rodales de considerableextensiónque llevan a la tota! degeneracióndel

viñedo y son debidas al ataque de nematodos endoparásitos del género Meloidogyne.

La inoculación a hospedadoressensibles , ya sea mediante nematodosvectores,por

injerto (BOVEY, 1980; JIMENEZ y GOHEEN, 1980, entre otros) o por inoculación

mecánicade savia (HEWITT y CORY, 1965; VUITTENEZ,1965),tienen el riesgo de la

existenciade infeccionescruzadas,lentas e inespecíficas,que ademáspuedeninducir a

error; por lo que es preciso utilizar métodos más seguros y rápidos, como son los

serológicos y más concretamente la técnica ELISA, en programasde indexaje y mejora,

que permitan su aplicación en la detecciónde virus en mezclas de muestrassanasy

225

enfermas y en aquellas plantas en que los porcentajesde infección seanpequeños,tal

y como indican LISTER (1978) y NOLASCO(1982) y como complemento y confirmación

de la selección visual (BOVEY, 1980; NOLASCO, 1982; RUDEL et al., 1983; WALTER

et al.1983).

De este modo, hemos encontrado que en las variedades Airén, Albillo, Cavernet-Franc,

Cavernet-Souvignón,Cencibel, Coloraillo, Chadornnay, Graciano, Macabeo, Malvar,

Malvasía, Mazuelo, Merlot, Messeguera,Monastrel. Moscatel, Pinot Noir, Riesling,

Sauvignón, Tempranillo, Tinto Fino, Tinto Velasco, Tintorera, Torrontes,Ugni-Blanc y

Viura, no aparece correlacciónalguna entresintomatologíay presenciade virus, ya que

todas las plantas testadas en los distintos campos de variedades, dieron resultados

negativos frente al test ELISA, a pesar de que se tomaron aquellas que, aparentemente,

presentabanuna sintomatologíaclara o, en su defecto,mostrabanuna patentefalta de

vigor.

En los estudios de campo sobre la variedad Airén, la correlacción entre una

sintomatologíaaparentementeclara y la presenciacomprobadadel GFLV fué cuando

mas del 14% (±0.058).Por el contrario,en Garnachala infección virica pareceprovocar

una sintomatología más clara, puesto que la correlacióncon la presenciadel virus fué

del 80%.

En cuanto a la evolución de la enfermedad, en los estudios efectuados en focos positivos

de virus sobre la variedad Airén, se detectó una sintomatología muy variada,

prácticamentetodas las manifestacionesdescritaspara las distintas estirpes del virus

(DIAS, 1970; HEWITT, 1970; VUITTENEZ, 1970; MARTELLI y SAVINO, 1988). Así,

se han encontrado zonas de mosaicoamarillo que se manifestabandesdeel nacimiento

226

de la hoja, apareciendoprogresivamenteen la mismazonacepascon bandeadode venas

y/o fuertes alteraciones de madera; sintomatología de deformación de hoja y corrimiento

de fruto, sin alteracionescromáticas;cepasque presentabantoda estasintomatología

conjuntamentee, incluso, distintas manifestacionesen un mismo sarmiento, Asimismo,

se localizó un puntocon síntomasclarosde maderaaplanada,dondeen ningúnmomento

se detectó la presencia de virus, a pesar de haber sido testadas varias plantas y en

diversas ocasiones. Todas estas observaciones coinciden con los resultados obtenidos por

GOLINO et al, (en prensa) en vides de California, en que la severidad de la

sintomatología en cepas de una misma viña, afectadas por GFLV, mostraba predominio

de uno u otro síntoma en las distintas cepas, con la presencia de los tres tipos de

sintomas descritos para las tres estirpes consideradas del virus, conjuntamenteen la

mayoría de los viñedos. Estos autores, además encuentran, en el test serológico,

diferente titulación del virus entre las distintas cepasde una viña y entre las mismas

cepasen añosdistintos, lo que les lleva a plantear la necesidadde establecerniveles de

confianzaen trabajosde rutina.

Planteamientossimilares nos llevaron a la comprobaciónde la técnica ELISA que se

venía utilizando en nuestro laboratorio y que en ocasiones daba resultados

contradictorios; los resultadosobtenidos revelaron que si bien para Ch. quinoa, P.

hibrida, otras plantas herbáceasindicadoras,tallo y raiz de vid era indiferente la

naturalezadel tampón de extracción que se utiizara, para hoja de vid presentaba

dificultades que aumentabancon la edad. Estas irregularidades,quizás debidas a la

naturalezaácida de sustejidos, como indica ROWHANI (en prensa),o bien a que los

descensos del pH observados en el trancurso del test que dán lugar a la

desnaturalización proteica de los extractos de la hoja, se obvian utilizando tampones de

extracción que mantengan los valores de pH en el transcurso del test entre 7U0 y 7.5;

227

a tal propósito son adecuados el Tris-HCI ó aquellos que contengan nicotina, que

posiblemente contrarresten la mencionada desnaturalización proteica, resultados

similares obtienen HIUUJSS etal. (1986) utilizando anticuerposmono y policlonales y

ROWHANI (en prensa) con la modificación del ELISA indirecto F(ab’» ELISA

(BÁRBARA y CLAURK, 1982).

De acuerdo con estos autores y nuestros resultados, las condiciones más favorablespara

la detección del virus en hoja de vid sobre todo en hoja vieja, son:

- Utilización de tamónes de extracciónTris -HCI 0.5 Molar, pH 8.2 + 2 % de PVP +

0.05 %de Tween20 + 1% de polietilen glicol 600 + 0.8 %de CINa 4- 0.02 % de NaN3

o cualquiera que contenga nicotina( PVS-T + PVP + 2.5% de nicotina ó AFT + 2 %

de PVP + 2.5 % de nicotina), con la ventaja del primero de no ser tóxico para el

operador.

El material a testar preferiblemente debe ser fresco, ya que con hoja congelada se

obtienen absorbancias muy inferiores que puedeninducir a error, tanto más cuantomás

avanzada es la edad de la hoja en el momento de la congelación, mejorándose

ligeramente los resultadossi se tritura el material directamentesin descongelar,no

consiguiendosemejorescuandose intenta impedir la oxidación cubriendolos extractos

con butanol saturadoen agua o vaselina.

Respectoa la variación de la concentracióndel virus en los distintos tejidos de la planta

a lo largo del año, los resultadosmuestranque las absorbanciasobtenidasen hoja, en

primavera y principios de verano son superiores a los proporcionados por otros tejidos

de la planta (madera y raiz), incluso se comprobó que, hojas nacidas en épocas de

temperaturasmáximasdieron lecturasconsiderablementealtas,tampocose observaron

228

variacionesentre hojas de la misma edad situadasen diferentes tallos y a diferentes

alturasde una mismaplanta, lo que descartala posibilidad de erroresdebidosa efectos

de termoterapia,por un lado,o a la zona de la planta donde se tomé la muestra.

Por otro lado, se ha observadoque segúnla hoja maduray envejecelos valores de la

absorbancia van decreciendo,pero manteniendoseclaramente positivos hasta las

primeras heladas en que llegan a limites prácticamente no detectablesdebido a la

destrucciónde los tejidos, sin embargoen invernaderose consigue detectar virus en

hojas totalmente amarillentas, incluso a mediados de diciembre. Esto explica las

aseveraciones de BOVEYet al. (1980), NOLASCO (1982) y RUDEL £.LAI.. (1983) que

consideran que la detección del virus depende de la época del año, aunque según

nuestra experiencia,el virus es detectable por ELISA en cualquier época del año,

siempre que el test se aplique a un tejido funcional, bien sea hoja o cualquier parte de

la planta e inclusoen invernaderose ha detectadoel virus en hoja desdeenero-febrero

hastamediadosde diciembre,prácticamentedurantetodo el año completo.

Los valores obtenidos en tallo son muy constantesa lo largo de todo el año, incluso

sarmientosmantenidosa 4 0C durante un año dán resultadosclaramente positivos,

observaciónéstade gran interésparael control sanitariode maderadestinadaa nuevas

plantacionesy para el control en

fronteras. Las raices secundariaspresentantambién valoresconstantesa lo largo del

año, mientras que las raices muy jóvenes (blancas) dan lecturas muy superiores,

similares a las de hoja joven.

Las absorbanciasobtenidasen racimosy yemasen desarrolloson muy superioresa los

229

de cualquier otro tejido. En fruto también es detectableel virus, tanto en pulpa como

en piel, pepita,escobajoó raquis e inclusoen mosto, siendomuy superioreslos valores

obtenidosen pepita,comparablesa los proporcionadospor hoja joven.

Además, en los focos positivos de GFLV detectados en La Mancha, se obtuvieron a lo

largode todoel año,siemprelecturaspositivas,independientementedel tejido utilizado,

en cada época, la orientación, posición y profundidad muestreados,encontrándose

variacionesde unosa otros en cuantoa los valores de absorbancia,de acuerdocon las

consideracionesanteriores.En los análisis efectuadosa lo largo de los años 88 a 91 en

cepasviróticas de La Higueruela,seguidosmes a mes en invierno y semanaa semana

en primavera-verano,siempre seobtuvieron resultadospositivos,todo ello contrastacon

las observacionesde GOLINO etal. (en prensa)que encuentrandiferenciasde titulación

entredistintas cepasde una misma viña y entre las mismascepasde un añopara otro.

En el seguimientoen invernadero,con material estaquillado,a lo largo de 2 años se

comprobóuna vez más las variacionesde estosvaloresen los distintos tejidos y edades.

Asimismo se observaronlas dificultadesde enraizamientoya citados por VUITTENEZ

(1970), así como el porte menor, deformacionesde hoja y madera y mayor mortandad

de las plantasviróticas.

Mediante la aplicación de la técnica ELISA amplificada se ha conseguido,asimismo

detectar el virus un número mínimo de 5 nematodos vectores (Xivhinema index)

,

utilizando como controles negativos ejemplaresde Xlphinema comprobadoscomo no

virulíferos (X vachtaicum y X. mdcx mantenido en higuera). Con este método se

consiguieronlecturasmuy elevadascuandoel númerode individuos utilizadosen el test

se aumentóa 10 6 15. En las mismascondicionesde experimentaciónno se consiguió

230

detectarel virus en X italiae en ningunode los focos positivos lo que pareceexplicar

las orbsevacionesde MARTELLI et al. (1978) sobresu pocaeficacia como vector en el

campo. Sin embargose consiguieronllevar a cabolos test de transmisión para ambas

especies,siguiendorigurosamente los postulados de TRUDGILL et al. (1983), con

resultadosmuy positivos, utilizando 6, 10, 30, 45 y 50 individuos.

Hay que resaltar que la técnica utilizada consigue detectar el virus a grandes diluciones,

lo que garantiza su detección en pequeñas concentraciones y su utilidad en el testado

de plantas agrupadas, como observaronLISTER (1978) y NOLASCO (1982).

Para el estudio del virus directamente en savia de vid por tinción negativa,se presentan

los mismos problemasque con la aplicacióndel test ELISA Mientras que en savia de

Ch. quinoa es fácil visualizar las partículas virales cualesquieraque sea el tampón

utilizado, en vid no lo es a menos que se añada 2.5 % de nicotina a los tampones

generalesde estatécnica,en cuyo casoes posiblevisualizargran cantidadde partículas

en un solo campo, como observaronMENDOQA et al. (1980). Estos resultadosse ven

mejoradosutilizando ISEM con mayor sensibilidady especificidad.Hay que resaltarla

grancantidadde partículasvaciasque apareceny que posiblementetenganrelación con

las observadasen seccionesultrafinas.

Los estudios ultraestructurales del virus en plantas indicadoras en secciones ultrafinas

de Ch. guinoa revelan la presenciade ultraestructurasde túbulos con viriones en su

interior formandocomplejosmultivesiculares,de acuerdocon los resultadosde GEROLA

eta]. (1965 y 1969), SAURIC et al.(1975),HONDA et al. (1972), PENA-JGLES]ASet al.

(1971 y 1978), FRESNOet al. (1976), ROBERT et al.(1970) y RUSSO(1985).

231

Posteriormentese comprobóquer dichos túbulos son acumulacionespseudocristalinas

al parecerde cápsidasvaciasque aparecentanto en el citoplasmacomo en el nucleo de

las células, sin que se conozcasu significado.

IV.2. INCIDENCIA DE NEMATODOSFITOPARASITOS Y TRANSMISORESDE

VIRUS

.

La nematofauna de las zonasestudiadas es pobre tanto en número de especies como en

tamañode poblaciones.Dentro de los nematodosfitoparásitosla especiemás frecuente

es Xiphinema pachtaicumque aparecióen más del 83 % de las muestrasy en más del

80 % asociado a plantas viróticas; es una especie muy dispersa en ambientes

mediterráneosque aparecefrecuentementeasociadaa viñedos ( ALPHEYy TAYLOR,

1986; LAMBERTI y SIDOIQI, 1977) y anteriormentecitadoen estecultivo en España

por ARIAS y NAVACERRADA (1973) y ARIAS et al. (1986). Se ha encontrado

frecuentementeasociadoa GFLV, al extremode que ALFARO (1971) la considerancomo

posible vector del mismo; asimismo GIUNCHEDI y TACCONI (1974) la encuentran

asociadaa otro virus del melocotonero,el “stem pitting, pero en realidad no se ha

logrado comprobarexperimentalmentesu papel de vector, quizás debido a la dificultad

de mantenerloen condicionesde laboratorio.

Por otro lado, las pruebasde deteccióndel virus de la degeneracióninfecciosa,llevados

a caboen poblacionesde X. pachtaicumextraidos de la zona perirradicular de vides

infectadas,dieron siempre resultadosnegativos hastael punto que las poblacionesde

estos nematodosse han venido utilizando como controles negativosen las pruebasde

ELISA amplificadoqueseaplicarona la deteccióndel virus en otros nematodos X mdcx

y X italiae yen las pruebasde transmisión.Tampocoseobservaronsíntomasde virosis

232

al infectar con estos nematodos plantas herbáceassensibles al virus, pero se ha

comprobadoque se alimenta de Chenopodium guinoa puesto que en las raicillas

secundariasde esta planta se han observado engrosamientoso pequeñas agallas

próximas al ápice de las mismas, más numerosas que las que provocan X. index o X

italiae. El estudiodel efectopatogénicoestáen curso.

El siguiente grupo de nematodos en frecuencia y los que aparecieron en poblaciones más

numerosas son los ectoparásitosmigratorios del grupo de los Hoploláimidos,géneros

Helicotylenchus y Rotvlenchus, que se encontraron en el 82 % de las muestras

estudiadasyen menor frecuenciaTvlenchorhynchus~4 que de acuerdocon la revision

de TACCON! y MANCINI (1987) son muy frecuentesen suelosde viñedo perose sabe

muy poco sobre su efecto patogénico.

Los ectoparásitossedentariosdel grupo de los IUanilladosUU (Macroposthonia xenoplax

)

aparecióen más de 50 puntosfrecuentementeasociadoa alteracionesde color (clorosis),

falta de vigor y cepasimproductivas.También se encontraronaunque con frecuencia

muy baja algunos ejemplaresdel géneroParatylenchus,pero tampocose sabe mucho

sobre el efecto de estos nematodos en la sanidad de la planta.

En más de 25 puntos de La Mancha se localizaron focos del endoparásito sedentario

Meloidogyne incognita (BELLO et al. 1989) produciendo graves alteraciones en las

plantas que llevan a su degeneración y muerte en rodales de gran extensión y que

llegan a afectar a todo el viñedo, especialmente en zonas donde se han incorporado

sistemas de regadío y en presencia de suelos arenosos.

233

No se han encontradosemiendoparásitosde los géneros Rotylenchulusni Tylenchulus

semipenetrans,especie que constituye un grave problema en viñedos de Australia

(TACCONL y MANCINI, 1987) y a pesar de que en España es muy frecuente,

ocasionandoproblemasde interés económico,en cultivos de cítricos, solamentese ha

citadouna vezpor NAVACERRA.DA (1975) en seis localidadesen Almería, Cádiz, Jaén,

Murcia y Valencia en zonas próximas a dichos cultivos.

Pero sin duda los nematodos de mayor importancia desde el punto de vista de nuestro

estudio son los ectoparásitos vectores de virus de la familia Longidoridae, y más

concretamentelas especiesXiphinema mdcx y X. italiae ya que ademásdel daño

directo que puedan ocasionar al alimentarse de la planta, son vectores del virus del

entrenudo corto comprobados experimentalmente. X. italiae aparecióen torno a! 24 %

de las muestras, si bien solamente en el 18.5 %de las positivas para GFLV, estando en

el 5.7 % de los mismos en asociacióncon X. mdcx, lo cual parececonfirmar la teoría de

MARTELLI (1978) de su poca efectividad como vector en el campo. Por su parte. X.

mdcx solamente se encontró en el 14 % de las muestras estudiadaspero en

aproximádamenteun 30% de las positivas, lo que indica su importanciacomo vector de

dicho virus.

Por otro lado, especies como X rivesi, X turcicum y X. vuittenezi así como Longidorus

vineacola frecuentes en viñedo aparecen en baja frecuencia y no parecen tener

importancia para el cultivo en las zonasestudiadas,a pesar de que existe la hipótesis

de que X vuittenezi es el principal vector de GFLV en Alemania y Francia (RUDELL

1971, 1980 y 1985; WEISCHER, 1973 y VUITTENEZ et al., 1972) en zonasdonde el

virus se transmite a través del suelo en ausencia de las especiesvectorescomprobadas,

X. index y X. italiae, aunque la hipótesis está por confirmar (BERCKS ~ 1977).

234

Hay que destacarla ausencia en las zonas estudiadasde 5<. coxi europaeum y X

.

pseudocoxi frecuentes en Europa (STURHAN, 1985) y que ARIAS et al. (1987)

encontraronasociadosa viñedosen la RegiónCentral.

La relativamentebaja frecuenciaen que aparecenestasespeciestransmisorasde virus

en las zonasestudiadas así como el pequeño tamaño de sus poblaciones, nos llevaron a

cuestionarlos métodosde muestreoy extracciónque venimos utilizando o considerar

la idea de BELLO et al. (1990) de que en La Mancha existen limitaciones

medioambientalesque dificultan el desarrollo de plagas, idea que explicaría que en

estudios anteriores solamente exista una cita de X. index en viñedo en El Provencio

(Cuenca) (ARiAS y NAVACERRADA,1973).

La comprobación del método de extracción de FLEGG (1977) que se viene utilizando

para la extracción de nematodoslargos y de gran movilidad, frente al de centrifugación

de NOMBELAy BELLO (1989) confirmó que el primero es el más adecuadopara la

extracción de las especies transmisoras de virus de la familia Longidoridae,ya que con

él se consiguióextraer 5<. index en el 100 % y 5<. italiae en el 90 % de los casos,el de

centrifugación permite la extracción de los estadosjuveniles, Jj en 5<. mdcx y Ji U ¾

13 en 5<. ítaltae al ser de menor tamaño.

Respectoa su distribución 5<. mdcx aparecedisperso en todas las zonas estudiadas

excepto en Murcia, siendo la única especie transmisora de virus en los viñedos de

Castilla-León,dondese encuentraen el 30 % de las cepasviróticas.Quizássusfactores

limitantes son la temperatura y sobretodo la humedad,ya que seencontróen pH desde

ácidos en Galicia (5.25) a los alcalinosde la Mancha (8.2), aunque en casi el 90 %de los

casosse encuentraen márgenescomprendidosentrepH = 7.4 a pH = 8.2; asimismo

235

apareció en suelos con texturas desde arenosos a arcillosos aunque suelen encontrarse

en las clases texturalesFranco-Arenosay Franco-Arcillosa-Arenosa,lo que indica una

gran toleranciaa la textura y pH del suelo,de acuerdocon las observacionesde ARIAS

y NAVAS (1986), SCOTTOde La MASSESE et al. (1988) y las referenciasanteriores

recogidaspor SiDOIQI (1986), que consideraronsu gran tolerancia frente a la textura

y pl-? del suelo a pesar de que se desarrollamejor en suelosarenososy limosos que en

los arcillosos,toleranciaquepor otro lado y de acuerdocon WEISCHER (1975) explica

su distribución mundial.

En consecuencia,tambiénse muestratolerante respectoal contenidoen carbonatodel

suelo.Se encuentratanto en los suelos de Galicia, sin carbonatos,como en los de La

Mancha, con más del 54 %, si bien de los resultadosdel análisis discriminante se infiere

que sus poblaciones aumentan con el contenido de la arena, encontrándoselas

poblaciones más numerosasen contenidos comprendidosentre 59 % y 70 %, y

disminuyenal aumentarel contenidode los carbonatos.

En La Mancha se encuentradispersoen suelos de Cambisol gleico y cálcico, los más

frecuentesen la zona de viñedo, y aparecióuna vez en Luvisol, pero nunca en los

restantes suelos de la zona donde existe este cultivo, Solochaks y Vertisoles. A este

respecto,hay que considerarque los suelos así tipificados por la FAO, han modificado

sus propiedades como consecuencia del laboreo continuado a que han sido sometidos y

que los han convertido en antrosoles,por Jo que la influencia que puedantenersobre

la fauna edáfica, depende más de sus características texturales, químicas y de

hidromorfía que a ningunaotra. Asimismo apareceúnicamenteen los climas semiárido

(D) y de secosubhúmedo(C1) de Thornthwaite,gradientesde lm de (-40 a -20) y (-20

a 0) y en zonas con temperaturasmediascomprendidasentre 13 y 160C. Si bien las

236

mayorespoblacionesaparecenen Socuéllamosasociadosa virosis, en un Cambisol con

un clima seco subhúmedo (C1) y temperaturamedia de 13 a is0C, siendo las

poblacionesmenoresen Ossade Montiel con un suelode Luvisol crómico,semiárido(D)

y TV media de 13 a 14 0C y en Valdepeñasy Daimiel con lm (-40 a -20) y temperaturas

comprendidasentre 14 y 16 0C.

Su distribución espacialen estas zonasmuestrauna vez más la distribución aleatoria

y contagiosade estos nematodos,apareceen zonas en torno a cepas viróticas y a lo

largo de todo el perfil, entre 5 y 75 cm a partir de donde comienzala costracaliza de

estossuelosen la nuncaaparecennematodos.Sin embargolas mayoresconcentracwnes

se hayan en las capasmás profundas(30 a 75 cm) en las zonasde máxima densidadde

raíces, de acuerdo con las observaciones de WEISCHER(1975) ySCOTTOLa MASSESE

~ (1988).

En cuanto al ciclo biológico, en estas zonas parece tener una sola generación al año que

va desde marzo a mayo, coincidiendo con las observaciones de ALLEN et al. (1988) y

SCOTTO La MASSESE gj...4 (1988) que comprobaronque en zonas templadaseste

nematodotiene una sola generaciónal año con un ciclo que se completaen 2.3 meses.

5<. italiae está, asimismo, dispersoen las zonas estudiadas,siendo la única especie

transmisorade virus en Murcia y no habiéndoseencontradoen Castilla-Lean. Está

consideradacomo una especiede ambientesmediterráneosmuy dispersaen Europa

Central y Meridional, preferentementeen suelosarenosos,ALPHEY y TAYLOR,, 1986;

COHN, 1977; HEYNS, 1974; KHAN, 1988; LAMBERTI et al., 1985; NAVAS et al., 1986;

estosúltimos autoresla encuentranasociadaa suelosareno-limososy limo-arenososcom

pH ácido (5-5.5). En nuestroestudioapareceen todo tipo de suelos,incluso arcillosos,

237

con valores de pH desde4.6 en Galicia a 8.3 en La Mancha,si bien en el 66 % de los

casosestáen suelosFranco-arenososy franco-arcillo-arenososy, en el 96%de los casos,

en pH comprendidoentre 7.4 y 8.3. En La Manchase había citadodos veces asociado

a viñedo, en El Provencio(Cuenca)y Quintanar de la Orden (Toledo). En este estudio

apareceen Cambisolesy una vez en Luvisol, soportandobien contenidos medios de

carbonatos,el 40%de las vecesse ha encontrado,en sueloscon contenidosde carbonato

entre 40 % y 70 %, mientras que Xindex no pasa del 57 % y sólo un 15 % está en

sueloscon másdel 40 %. Respectoa la humedad,5<. italiae sólo apareceen el clima (O)

Semiárido, no apreciándosediferencias en la zona respecto a la temperatura. Su

distribución horizontal se muestra asimismo aleatoria y, aparece generalmete a

profundidades superiores a los 50 cm; debido a la exiMencia de la costra caliza que

caracterizaestossuelos.

Al igual que X index parece tener en la zona una sola generacióncon un ciclo biológico

que se completaentre finales de marzo y finales de mayo, lo que está de acuerdocon

los resultados de COHN y MORDECHAI (1970) que compruebanque esta especie

compíctasu ciclo en menosde seis semanasa 28 0C, peropuedetardar más dc 12 meses

cuandola temperaturaes de 24 0C o inferior.

IV.3. CORPUELACION BIOECOLOGICA ENTRE VIRUS Y NEMATODO VECTOR

La incidencia virus-nematodovector muestrauna gran variabilidad,sin duda,debidaa

las característicasque se han señaladoanteriormentesobresu distribución aleatoria y

contagiosa,a que sus poblacionesson en general poco numerosasexcepto el corto

periodoen que se completasuciclo biológico en estaszonasya su capacidadde alcanzar

grandesprofundidadesen función de la disponibilidadde aguaen el suelo.

238

Así lo reflejan los estudiosflevados a caboen la finca experimental “La Higuerucla”

donde en los muestreosrealizadosen el veranode 1989 la incidencia entre la presencia

del virus y el nematodovector fué nula, mientras que en el otoñode 1990 la incidencia

fué del 58 %, volviendo a ser nula en enero-febreroy encontrandoseen marzo.

Del mismo modo en los muestreosde La Manchaen diciembre de 1990 la incidencia

encontradafué pequeña,mientrasque en la primavera de 1991, en estudiosrealizados

en los focos nositivos de virus, se encontréuna incidenciadel 100 %. No hay que olvidar

que existenestos nematodosen la zonaen vides libres de virus.

Por otro lado, hay que tener en cuenta que es sufuciente un solo nematodo que se

alimentede una planta infectaduna sola vez y durantecincominutos para que adquiera

el virus y esté en disposición de transmitirlo de acuerdocon los estudiosde TAYLOR

y ROBERTSON (1975) y ALFARO y GOHEEN (1974); asimismoes de interésel hecho

de que el nematodopuedaretener la infección y por consiguientesu capacidadinfectiva

hasta 8 mesesen presenciade hospedadoresinmunesal virus y varios años si se

alimenta de restos de raices de vid que puedan quedaren el suelo. Esto significa que

la implantación de una sola cepa infectada en un suelo donde existe una población

pequeñade estos nematodos,asegurala infección del viñedo completoen unos años y

por otra parte que tras la erradicación de un viñedo infectado en un suelo con

nematodosvectores,la infección puede mantenersevarios años, lo que debe tenerse

muy en cuenta antes de la implantación de un nuevo viñedo, máxime con las

característicasde los suelos de La Mancha,dondelas raices del viñedo puedenalcanzar

grandesprofundidades,incluso por debajode la costracaliza, al penetrarpor grietas o

hendidurasde la misma, donde puedenencontrar condicionesadecuadasde humedad

para su mantenimientoy el del vector.

239

De lodo ello se desprende que en estudios epidemiológicos de este virus, deben tenerse

en cuenta las característicasde los nematodosvectoresy su ciclo biológico de acuerdo

con los distintos ambientes de cada zona, para una correcta planificación de los

muestreos,que deben repetirseen distintas épocasestacionalesantesde considerar

épocasestacionalesantesde considerarun suelo libre de estos nematodos.

En cuanto a las pruebas de transmisión, se han conseguido llevar a cabo con las dos

especiesencontradas,5<. index y 5<. italiae, de manera inequívoca de acuerdo con los

criterios establecidospor McELROY (1978) y TRUDGILL et al. (1981 y 1983), lo que

indica que la asociaciónvirus-vector-plantaha seguidoun procesointeractivo paralelo

en el desarrollo de sus relacionesespecíficasde acuerdocon las manifestacionesde

BROWN eta!. (1988).

Por último, consideramos que conforme se avance en el estudios físico químicos de las

interacciones virus-vector y vector-planta, y se conozcan los mecanismos íntimos de la

especificidad, se descubrirán nuevas asociaciones y asimismo se encontrarán las

solucionesadecuadasque bloqueendicha especificidady permitan un control adecuado

de la enfermedad.

VtONCLUS IONES

241

Del análisis y discusiónde los resultadosy consideracionesrecogidasen el mismo hemos

obtenido las siguientesconclusionesgenerales:

1. - El virus de la degeneracióninfecciosa de la vid aparecedisperso en las zonas

estudiadas con una incidencia máxima del 12 %, encontrando que por ello la

sintomatologíano siemprese correspondecon la presenciadel virus, pudiendoser debido

a condicionesgenéticas,medioambientaleso a la acción de otros patógenos.Segúnesto

los diagnósticos visuales y la aplicación del test de plantas sensiblesen programasde

indexaje y mejora, debenapoyarsecon los test serológicospara que seanfiables.

2. - Para la obtención de resultados correctos con el método ELISA deben utilizarse

como tampones de extracción Tris-ECl o aquellos que contengannicotina,con la ventaja

del primero de no ser tóxico para el operador.

3. - Durante el periodo vegetativo de la vid el virus es detectableen cualquier tejido de

la planta, siendo las absorbanciasobtenidasen hoja en primaveramuy superioresa las

conseguidascon cualquierade los otros tejidos.En tallo y raíz los valoresson constantes

a lo largo del año, no así en hoja, dondedecrecendichos valoressegbnenvejecellegando

a valores mínimos,estoes de gran importanciapara el control sanitariode madera.En

raíz joven (blanca),yema y pepitase consiguenvaloresequiparablesa las de hoja joven,

pudiendodetectarseel virus tambienen racimo y fruto (piel, pulpa ó pepita).

242

4. - La técnica de ELISA DAS y/o ELISA amplificadopermite la detección del virus a

grandes diluciones en planta, lo que garantiza su eficacia en el testado de plantas

agrupadas; con ELISA amplificado se puede detectar el virus en un número mínimo de

5 nematodos.

5. - En estudios ultraestructurales del virus en plantas herbaceas indicadoras revelan

la presenciade túbulos que parecenser acumulacionespseudocristalinasde cápsidas

vacias, presentes en el citoplasma y nucleo de las células, y de las que no se conoce su

significado.

6. La nematofaunade las zonasestudiadases pobreen númerode especiesy tamaño

de poblaciones, siendo la especie más frecuente 5<. oachtaicum, que se presenta asociada

a virosis pero sin que se haya podido comprobar su papel. El nematodo ectoparásito

sedentario Macronosthonia xenonlax aparece asociada a clorosis, falta de vigor y cepas

improductivas.Los endoparásitos sedentarios del género Meloido2vne producen graves

alteracionesen los viñedosespecialmenteen suelosarenososy en regadíodc apoyo.No

han aparecido semiendoparásitos,Tvlenchulus semioenetrans,de gran repercusion

económicaen viñedos de Australia, y que existenen todas las zonascítricasespañolas,

ni X coxi coxi y 5<. nseudocoxi frecuentes en viñedos de Centroeuropay citados

anteriormenteen la Región Central,por otro lado, las especiestransmisorasde virus

5<. rivesi y X vuitteneziaparecenen muy baja frecuenciay no parecentenersignificado

en las zonasestudiadas.

243

7. - El método de Flegg que venimos utilizando para la extracción de los grandes

nematodoses el más adecuadoa pesarde que por el de centrifugaciónpuedenextraerse

los estadosjuveniles.

8. - X. mdcx es la especiede mayor interés como vector del GFLV, aparecedispersa

en todas las zonasestudiadasexceptoen Murcia, mostrándosetolerantea las distintas

texturas y pH de los suelos aunque parece preferir los Franco-arenososy Franco-

arcillo-arenosos,así como a los de alto contenido de carbonatos,aunquesus poblaciones

decrecensegúnestosaumentan,por lo que consideramosque su factor limitante es el

clima, especialmenteel contenido de agua en el suelo. Su distribución espacial es

aleatoria y contagiosay aunquese distribuye en todos los horizontes del perfil, tiende

a encontrarseen las capasmás profundas.En estaszonasmuestrauna sola generación

al año y su ciclo biológico en clima subhúmedo (C1) y a temperaturas medias de 13 a

150C se completaen dos mesesy medio.

9. - 5<. italiae aparecióen todas las zonas excepto Castilla-Leon, igualmente aparece en

todo tipo de texturas y ph, aunque prefiere las Franco-arenosasy Franco-arcillo-

arenososy pH 7.4 a 8.3. También aparece en las capas más profundasy complera su

ciclo biológico en menosde 2 meses,teniendo una sola generación al año.

244

10.- La incidenciavirus-vector en los grandesfocos de virosis es muy elevadaaunqueen

los muestreos al azar es muy inferior (de 58 % a nula) dependiendo de la época de

muestreo,por lo que es convenientetomar las muestrasen las distintasestacionesantes

de aventurardiagnósticosen estesentido.

11,- Es imprescindible tener en cuenta la presencia de ambos patógenos (virus-

nematodo), puesto que, aún en el caso de que la transmisión del virus se haya producido

a través del injerto la existencia de un solo nematodotransmisir de virus en el suelo

garantizala persistenciade la infección.

Por último, dadas las características del cultivo y la relación con el suelo de estas

enfermedades,consideramosnecesarioabordaren un futuro estos problemasdesdeun

punto dc vista multidisciplinar y profundizaren el estudiotanto de la morfología de las

distintas variedadesde vid, su fisiología y requerimientosmedioambientales,como las

características agroecológicas de los patógenos implicados, mejorando el conocimiento

de los mecanismosde transmisióny sobre todo de la especificidadvirus-nematodo,dc

tal modo que se puedallegar a un control de la enfermedadque sea ecológicamente

compatible.

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1 *

UNIVflSIDAD COMPLUTENSE

CORRELACION BIOECOLOGICAENTRE NEMATODOS TRANSMISORES DE VIRUS<XIDh’nema spp.) Y EL VIRUS DE LA ‘DEGENERACIONINFECCIOSA” DE LA VID -

ENTRENUDO CORTO - (GFLV)

11Memoria que presentaJesusFRESNOPEREZ

paraoptar al gradode Doctor en Ciencias BiologicasEnero1992

APENDI CES

Directora: Dra. Dña. Maria ARIAS DELGADOPonente:Prof. Dr. O. BenjamínFERNANDEZ RUIZ

Facultadde Ciencias Biológicas. UniversidadComplutenseMadrid

ARC-$tVO

INDICE

TESIS DOCTORAl.

CORRELACION BIQECOLOGICAENTRE NEMATODOS TRANSMISORES DEVIRUSCXivhinema_spp.)Y EL VIRUS DE LA DEGENERACION INFECCIOSA”

DE LA VID - ENTRENUDO CORTO - (GFLV)

JesusFRESNO PEREZ

Enero 1992

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DEMADRID

CORRELACION BIOECOLOGICA ENTRE NEMATODOS TRANSMISORES DE VIRUS<Xlohinema spp.)Y EL VIRUS DE LA “DEGENERACION INFECCIOSA”

DE LA VID - ENTRENUDO CORTO - (GFLV)

Jesus FRESNO PEREZ

La memoria que lleva por título CORRELACION BIOECOLOGICA ENTRE

NEMATODOS TRANSMISORES DE VIRUS (Xiuhinema spp.) Y EL VIRUS DE LA

‘DEGENERACION INFECCIOSA’ DE LA VID - ENTRENUDO CORTO - (GFLV), que

presenta Jesús FRESNO PEREZ, para optar al grado de DOCTOR en Ciencias

Biológicas, ha sido realizadaen el Departamentode Agroecologiadel Centro de Ciencias

Medioambientales(CSIC), bajo la dirección de la Dra. Oña. Maria ARIAS DELGADO

con la supervisióndel ponenteProf. Dr. O. BenjamínFERNANDEZ RUIZ, Profesordel

Departamentode Zoología de la UniversidadComplutensede Madrid.

Madrid, Enero de 1992

JesusFRESNO PEREZII

‘IP’

&4ict2~t~ ~ ---7 /Dra. Dha. Maria ARIAS DELGADO ¡

Prof. Dr. O. BenjamínFERNANDEZ RUIZ

RESUMEN

VII

Se pretende contribuir con este trabajo al conocimiento de la incidencia del virus de ladegeneracién de la vid y de sus nematodos vectores en los viñedos españoles, así comosu correlación con la sintomatología que producen y la influencia de los factoresambientales en el desarrollo de los patógenos.

Se realiza en primer lugar una recopilación de los estudios a nivel mundial sobre lavirosis en el viñedo, centrándose en aquellos referentes a la degeneración infecciosa~~de la vid; de igual modo se revisan los trabajos existentes sobre la incidencia eimportancia de los nematodos litoparásitos en el viñedo, con especial énfasis en lasespecies transmisoras dc virus. En el capítulo de material y métodos, tras la indicacionde los planteamientos para la realización de las muestras, se hace una descripcióndetallada de la zona de estudio y de las fincas experimentales donde se llevó a cabo eltrabajo. A continuación se expone la metodología utilizada en la detección del virusestudio dc la nematofauna, caracterización en el estudio de los parámetros edáficos,tratamiento estadístico y cartografiado automático de los datos.

Los resultados obtenidos indican que la incidencia del virus alcanza el 12 91- y que lacoincidencia del virus con los nematodos vectores es variable, puede ir de próxima al 100

a prácticamente nula dependiendo de las zonas. Se indica la importancia de losfactores medioambientales, especialmente el contenido de agua en el suelo, en eldesarrollo de estos nematodos y por lo tanto la importancia de realizar los muestreos enlos distintos horizontes del suelo y en épocas del año adecuadas, dada la distribuciónaleatoria y contugiosa de estos organismos. Se resalta, asimismo, la baja correlaciónentre la sintomatología que muestran algunas plantas y la presencia de virus,indicándose que, en muchos caso, se debe a la acción de otros nernatodos fitoparásitosó, incluso, algunos focos de filoxera, condiciones ambientales o a característicasfisiológicas de la pJanta, observándose que dicha sintomatología muestra una relaciónmás clara con la presencia del virus en unas variedades que en otras.

Por último, sc destaca la necesidad de tener en cuenta la presencia de ambos patógenos,puesto que aún en el caso de que la infección se haya producido a través del injerto,la existencia de un solo nematodo transmisor de virus garantiza la persistencia de lainfección; así como la importancia de abordar estos problemas desde una órbitainultidisciplinar profundizando en el conocimiento tanto de la morfología y fisiología dela planta como en las características agroecológicas de los patógenos implicados y de laespecificidad de transmisión a fin de conseguir un control de la enfermedad que seaecológicamente compatible.

INDICE

Ix

PáR

.

RES UMEN Vi

INTRODUCCION 1

PLAN DE TRABAJO 4

1. ANTECEDENTES 10

1.1 Enfermedades víricas de la vid 121.1.1. Nepovirus 131.1.2. Virus de la degeneracion infecciosa o del entrenudo corto

de la vid (GFLV) 161.1.2.1. Caracteristicas generales 191.1.2.2. Acidos nucléicos 191.1.2.3. Ultraestructura 221.1.2.4. Mecanismos de transmisión 231.1.2.5. Técnicas de diagnóstico del GFLV 24

1.2. Nematodos asociados a la vid 271.2.1. Nematodos ectoparasitos y transmisores de virus 28

1.2.1.1. Sistematica y taxonomia de la familia Longidor¡dae 281.2.1.2. Características morfológicas 29

1.2.2. Nematodos de la familia Longidoridae asociados al viñedo 341.2.2.1. Xiphinema index 371.2.2.2. K italiae 40¡.2.2.3. Otras especies de nematodos de la familia Longidoridae 42

¡.3. Relacion virus-vector 45

1.4. Metodología para el estudio de la transmisión 47

¡.5. Estado actual de los estudios sobre GFLV y los neniatodosasociados a la vid en España 48

1.5.1. Virus de la degeneracion infecciosa de la vid 48I.5.2. Nematodos de la vid 49

x

Pág

.

11.MATERIAL Y METODOS 52

11.1. Planificación de muestreos 53

11.2. Descripción de las zonas de estudio 5411.2.1. Zonasvitícolas. La Mancha 5711.2.2. Fincas Experimentales 65

II .2.2.1. Finca Experimental “La Higueruela” 6511.2.2.2. Finca de La Escuela Museo de la Vid y el Vino

de Madrid 67

11.3. Muestreos realizados 6711.3.1. Muestreos previos 69¡1.3.2. Muestreo en la región de La Mancha 7011.3.3. Muestreos en Fincas Experimentales 71

11.4. Recogida y preparación de muestras 7611.4.1. Muestras de suelo 7611.4.2. Muestras de material vegetal 79

11.5. Metodos de extraccion y estudio de nematodos del suelo 7911.5.1. Preparacion de muestras de suelo 8011.5.2. Método de sedimentación-decantación 8111.5.3. Método de centrifugación 8211.5.4. Métodos dc estudio cuantitativo y cualitativo de

los nematodos 841l.5.4.1. Recuento, aislamiento, fijacion y montaje 8511.5.4.2, Conservación del extracto de la muestra 8711.5.4.3. Observaciones microscopicas 87

11.6. Técnicas para el estudio del material vegetal 89

11.7. Técnicaspara la detección del virus 8911.7.1. Transmisión mecánicaa planta herbácea 8911.7.2. Tinción negativa (MicroscopiaElectrónica) 9011.7.3. ínmunoelectromicroscopía 91

11.7.3.1. ISEM (Inmunosorbent Electromicroscopy) 9211.7.3.2. AVM (Antiserum Virus Mixture) 93¡1.7.3.3. Decoración 9411.7.3.4. Tampones y colorantes necesarios 95

11.7.4. Secciones ultrafinas 9611.7.5. Métodos serológicos 97

XI

Pág

.

11.7.5.1. ELISA-DAS 9811.7.5.2. SIstemas de amplificación de ELISA 101

11.7.6. Hibridaciones de ácidos nucléicos, sondas radioactivasy calorimétricas 102

11.8. Metodología para el estudio de los virus en el interior delos nematodos 103

11.8.1. Metodología para la detección del virus en el nematodo porMicroscopia Electrónica 103

11.8.2. Preparación de nematodos para la detección del virus en suinterés por ELISA e ISEM 105

11.8.3. Metodología pra detectar el virus en el nematodo por la reacciónen cadena de la polimerasa (“Polimerasa Chain Reaction”) (PCR) 108

11.9. Metodología para eí estudio de la transmisión por vectores 108

11.10. Métodos para el estudio de las características edáficas 112

11.11. Métodos estadísticos para el tratamiento y cartografiado automático 113

III. RESULTADOS 114

111.1. Muestreo previo 115

111.2. Detección del virus de la degeneración infecciosa 127111.2.1. Comprobación de la fiabilidad del método 128111.2.2. Comparación de tampones de extracción 131111.2.3. Variación del pH en función del tampón utilizado 136111.2.4. Ensayos de comprobación entre distintas partes y estados

de la planta frente a diferentes tampones 141111.2.5. Sensibilidad del test ELISA para distintas concentraciones

de la muestra 144

111.3. Variación de la concentración del virus 155

111.4. Correlación entre sintomatología y virosis 180111.4.1. Correlación sintomatología-virosis en distintas variedades 180111.4.2. Correlación sintomatología-virosis en Garnacha 181111.4.3. Correlación sintomatología-virosis en focas de La Mancha 191

111.5. Incidencia del GFLV en La Mancha 197

111.6. Incidencia virus -nematodos vectores 198

XII

Pág

.

111.7. Estudios ultraestructurales de plantas indicadoras y de Xindex 207111.8, Transmisión del virus de la degeneración infecciosa por X.index

.

Detección del virus en el nematodo vector y en planta herbácea 215

y. DISCUSION 222

IV.1. Incidencia y detección del virus de la degeneracion infecciosa 223

IV.2. Incidencia de nematodos fitoparásitos y transmisores de virus 231

IV.3. Correlación bioecológica entre virus y nematodo vector 237

V. CONCLUSIONES 240

VI. BIBLIOGRAFíA 245

VII. APENDICES

VIII. Relacción de muestreos

VII.2. Tablas y matrices de resultados.

VII .APENDI CES

VII.1. RELACCION DE MUESTREOS.

TABLA 1

RELACION DE MUESTRASRECOGIDASEN LAS ZONAS VITíCOLAS ELEGIDAS

TABLA 1. RELACION DE MUESTRAS RECOGIDAS EN LAS ZONAS VITíCOLAS ELEGIDAS

Fecha N5 Lab

.

Localidad UTM Var. SmI. Mal. Ve9

.

9—y ¡—1989

2 9—VI—IgaS

3 9—VI—1989

4 9-VI—1989

5 9—VI-1989

6 9-VI—1989

7 lO—Vi—1989

8 ID..VI—l989

9 lO—VI—1989

10 lO—VI—1989

10—y 1—1989

12 i0—VI—1989

la 10—VI—1989

14 l0~VI—1989

15 IO—VI—1989

16 10—VI—igAS

37 I0—Vl—1989

18 10—VI—1989

19 14—VI—igaD

20 14—VI—1989

21 14—VI—l989

22 14—VI—1989

23 14—VI—1989

24 14—VI—1989

25 14-VI—1989

26 14—VI—isaS

10263

10264

10266

10267

10268

10269

10271

10276

30278

10279

¡0280

028?

10282

10283

10284

30285

1 0286

10287

10345

0346

10347

10348

10349

‘0353

‘0352

‘035.4

El Toboso

Campo de criptana

Campo de Criptana

Campo de Criplana

Campo de Criptana

Campo de Críptana

Torralba de Calatrava

Torralba de calalrava

Fuente del Fresno

Villarrubia de los Ojos

Vijlarrubia cje los Ojos

Daimiel

Daimiel

Daimiel

Daimiel

Manzanares

Vilíarta de San juan

Villaca ñas

Ciruelo

Cabas5as Oc Yepes

Nos lejas

km 83 CIra. Albacele

Corral de Almaguer

km 147 Ctra. Albacele

3cm 157 Ctra. Albacete

Cases de Luna

Variedades;

1. Aíren; 2. AlbarilSo; 3. AlIcante;

9. Monastrel del ReIno; 30. San9re

4. cenclbel; 5. ch~lva~ 6. Don Mariano; 7. Doña BIanca; 8. Macabeo;

de Toro.

Sinto.nas:

0. No slnlocias; 1. Cepas muertas; 2. cepas no productivas; 3. Cepas deprimidas, falta de vigor; 4. Clorosis;

5. Corrimiento; 6. Entrenudo corto; 7. Fasciaci¿n; 8. FIloxera; 9. Fltotoxicidad por herbicidas; 10. Flojas de-

femadas; 13. Madera deformada; 12 Meloidogyne; 13. Meloldogyne y clorosis; 14. MosaIco amarillo; ‘5. Sínto-

mas discretos de virosis; ¶6. Srnto.nas acusados 0e virosis.

N’ orden

4 15

16

35

3

3

2

12

12

13

13

12

4

.4

32

o

2

2

2

2

2

3

2

Vi9772

WJDO6 3

Vi99Úl

Vj9859

Vi9657

Vj9552

Vi 372 9

Vi 3623

Vi 36 36

VJ4 735

Vi5445

Vi 564 4

Vi 564 4

Vi 57 34

Vj60 35

Vi7í 36

Vi 674 7

VK4825

y 1< 56 Ib

VK6823

VK7BI 5

VK939$

VK1477

Wi3073

Wi 5830

‘4

II

2

35

4

15

8

8

13

8

327 74-VI—>989

28 14—VI—1989

29 14—VI—1989

30 ¡4

32 74—VI—1989

33 14411-7989

34 14.-VI--1989

35 14—VI—1989

36 26—VI—1989

37 26—VI—1989

38 26-VI-1989

39 26—VI--1989

40 26—VI-1989

41 26—VI—¶989

42 26—VI—1989

43 2641—1989

44 26-VI-lOSO

.45 22-Vl.-1989

46 27-VI—lOBO

47 27—VI—lOSO

48 27—VI-lOSO

49 27.-VI—lOBO

50 213-VI-lOSO

51 28-VI-lOSO

52 28—VL—1989

53 28—VI-l9S9

54 28—VI—¶989

55 28—VI—1989

56 29—VI—1989

57 29-VI-1989

58 29—VL-1989

59 29—VI—lOBO

60 29-VI—1989

61 29—VI—1989

62 29—VI—lOBO

¡0355

¶0356

10357

0358

0389

70360

¡0361

10362

10363

10421

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SoIu~lamos a Osa

Ruklera a Carrizosa

Carrizosa a Villahermosa

Juan Abad a tozar

Manzerares a La Solana

TomeIleso a Villarrobledo

Casas Eugenio

Vil larrobledo

Casas de Los Arbolas

Tobarra

Tobe rra

Albatana

Albatena—Jumilla

Concaril,

Calasperra a Muía

La Copa de Bullas—Bullas

Cieza

Wcoir

fluí laS

fluí las

Bu’ las

Tniana

Tolano

Blanca

MurcFa a lunilla

Jumilla a Yecla

Yacía a Almansa

Almansa a Albacete

Sta. M’ de los Llanos

Socué liarnos

Socué liamos

SoCu¿llamos

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Villa Mercedes

Valdepeñas

Valdepeñas

Sta. Cruz de Mudela

Moral de Calatrava

Da ir, el

Las Aberturas

Casa Crktales

Valdepeñas a Daimiel

Manzanares a Rolaños de Calatrava

Almagro a Po,uelo de Calatrava

Aldea de ¡ley a Calzada de C.

Almnoradiel a Castelar de Santiago

La Guadianeja

Alhambra a La Solana

Vilanova de Arosa

Vilanova de Arosa

Solobe ira

Ba nr a nl es

Prandel a

Oran dela

Y remoedo

Cambados

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Ber¿n

Duinza

Arroyo Freixaclura

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Trance los

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Daimiel

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Los Cortijos de Abajo

Villamayor de Calatrava

Manzanares a Bolaños

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¶0787

Manzanares

Manzanares a Villerrubia de

Manzanares a Villarrubia de

Villarrubia a Manzanares

Santuario Níra. Sra. Alaren

Perales a Malaw5n

Fuente del Fresno

Fuente del Fresno —

Marga liza

Arigoslo a Casagordo

los Ojos

los Ojos

Los Vebenes

Aln,on sc Id

Mora a Consítegra

Moran Tc,ríeque

Guintanar a Los Hinojosos

SarI ces a Almonacid del Marquesado

Vil larejo

La Alrnarcha

Honrrubia a Torrubia del Castillo

Atalaya de Cañada a Sisanle

La Rada a Sarra,<

Villarrobíedo a Las Mesas

Villarrobíeda a Las Mesas

Villarrobíedo a Minaya

Sao Clemente a La Alberca de 7.

Carrascose a Villaescusa de Haro

Tarancán a Cuenca

rara ocon

Sta. Cruz de la ¿arsa

Villa don fa dr que

Villacañas

Pedro MuA¿z

Tomeltoso a Socuéllarnos

Tornel loso a Socuéltarnos

Tomel toso a Socuéllarnos

Tomelloso a Argamaslíla de Alba

Tamal jaso de Alameda de Cervera

Mora a Tembleque

corral de Almaguer

Villa tobas

Lezusa

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¶ 0889

El Banillo

Mun era

La Ginela

Buenav isla

Casas de Guijarro

El Barco de Valdeorras

A Aun

Larouco

Puebla de Trives

Seque iras

Noque ira

Ti xci ra

floade

Sobe r

VIII aoscura

Monforte

Na0ueira da Mi4a

Argerni 1

U o íes

Crecen íes

Arbó

As Neves

Salvatierra

Paramos

Salceda

Ribadoouro

Tomiño

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Oimbra

Mourazos

Cabreras

Madridejos

Puerto L¿pice


Malagón

Malagón

Daimiel

Daimiel

carrión de Calatrava

Al magro

Rolaños de calatrava

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Arenas dr San Juan

Llanos del Caudillo

Manzanares

Manzanares

Manzanares

Manzanares

Villanueva de Franco

Caserio Abertura Consolación

Moral de Calatrava

Sta. Cruz de Mudeta

Sta. Cruz de Mudela

Valdepeñas

Valdepeñas

Valdepeñas

Valdepeñas

Valdepeñas

Pozo de la Serna

Alcubillas

Villanueva de ¡os Infantes

Carrizoso

Alhambra

Los Almendros

La Solana

La Solana-Valdepeñas


Membrilla

Navaloscuentos

Los Paquires

Vi?lar~a de San Juan

Llanos del Caudillo

Llanos del Caudillo

Arga~nasilla de Alba

Toniel loso

Tome1 ¡oso

Socuéllan,os—EI Provenc¡o

Socuel amos

Las Mesas

Laguca de Manjavacas

Mola del Cuervo

Pedro Muñóz

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2

222 10-XI—¶9B0 10930 Campo de Criptana Vi9262 1 11 2

223

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241

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244 12—XI—1989

245 ¡2—XI—1989

246 12—XI—¶980

247 72-YI-¡980

248 U—YI—1980

249 ¶8-XI—1980

250 78-XI—¶989

257 1B—XI—1980

252 1B-XI—7989

253 78—XI—¶989

254 ¶8-XI-1980

255 ¶8—XI—1989

256 18—XI-1089

25? 78—XI-7989

258 18-XI—¶989

250 ¡8—1<1—1*9

260 184<1-7989

¡0937

10932

10033

¶ 0034

10935

¶ 0036

¶ 0937

¡0938

10930

¶ 0940

>0945

¶ 0946

10047

109413

10040

¶ 0950

70957

¡0052

¶ 0953

10054

10055

70956

10057

¡0958

¶ 0959

¶ 0960

10088

70980

10990

10007

10992

10993

10994

¡0995

>0996

10907

¡0908

10990

Campo de Criptana

El Toboso

Miguel Esteban

Alcazar de San Juan

Ilerenc ia

Consuegra

Mora

Mor a

Tembleque

ViII aca ñas

Ocaña

ViII a lobas

Ermita de

V i 1 a tobas

Corral do AIn,aguer

Vi 1 1 anueva de Alcaudele

Quintanar de la Orden

Quintanar cje la Orden

Sta. Catalina

a Corral de Almaguer

Venía de 0. Quijote

Mata del Cuervo

El Pedernoso—Las Pedroñeras

Las Pedroñeras—EI Provencio

FI Provencio

Ctra. N. 310, km 7

Círa. N. 370, 3cm 17

Ctra. R. ¶50, 3cm 27

Casa de Marta

Alameda de Cervera

Alcarar de San Juan

Villafranca de los caballeros

Villafranca de los Caballeros

Vil lacañas

Lillo

Lillo

La Guardia

Tembleque

Turleque

Madridejos

V19464

Vi*72

Vi738O

VJ7463

VJ6577

VíaS?’.

VJ3389

Vi3385

Vis 392

VJ6788

VK6122

VK?7 1?

VKTSIO

VKA 205

Vi8602

Vi9¶92

VJ9584

VJBOOO

Wi0676

VIi ¶ 572

*12470

WJ 3452

VIi 3657

VIi 274 1

VII 1836

WJ0835

VIS144

VJBB49

Vi8456

Vi7463

Vi7O7D

Vi7¶81

VJ7 794

VJ6900

ViOlO>

VJSAO’

VJ4985

VJSI 75

2

2

2

2

2

2

11

1 17

1 17

1 ¶1

¶ 17

1 11

1 77

1 ¶1

1 11

7 ¡1

¶ 11

7 17

¡ ¡¡

7 17

1 11

¶ 11

1 11

1 77

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

¶7 2

71 2

17 2

1 ¡7 2

¡ ¡¡ 2

7 71 2

11 2

71 2

¶1 2

2

7 11

1 11

¶ 11

1 11

1 ¡1

7 >7

1 11

1 71

1 71

2

2

2

2

2

2

2

2

TABLA II

RELACION DE MUESTRASTOMADASEN CASTILLA—LEON

TABLA II.- RELACION DE MUESTRAS TOMADAS EN cASEILLA-LEON

Denoniinaci.Snde origen Munfripio UTM

El Barraco

cebreros

Hoyo de Pinares

San Bartolomé de Pinares

San Juan de la Nava

El Tiemblo

coros del Valle

Cl ya les

CubUlas de Santa Marta

Fuensa ¡dañe

Muelen tes

Trigueros del Valle

Arga nra

Cabañas Raras

CaCabelos

Campelo

Canipon nra y a

canedo

Ca rracede ¡ o

Cast ropoda roe

CorIl quera

CubilLinos

Cubillos del Sil

cueto

Iglesia del campo

Parandories

P¡eros

Ponferrada

Ou ¡ 1 ós

Saucedo

San Juan

San Lorenzo

San Mart<n

San Miguel

UK6182

UK7579

t1K7984

UK6989

UK5782

UK6561

dM5930

dM5824

UL 1490

dM5318

UM7228

dM6232

29 1 —PH9023

PIl9823

PHS71 9

PI-18824

PHSí 17

PIl8824

PH86 14

0H07¶7

PH94 19

PH9923

0H0022

PH9223

PH8417

PH82 16

PH8419

PH9S1 1

PH8722

PH9426

PHS1 24

PH97 10

PHS?33

PH8924

NC parcelas N9 muestras

CEBREROS

CIGALES

EL BIERZO

1<3

25

25

25

¶5

25

50

32

3D

15

50

50

19

[¡3

¶1!

7

68

2

5

5

5

3

5

4

13

3

2

5

5

¶9

12

55

6

414

3

2

2

6

4

3

16

¶0

2

22

2

6

4

16

¶0

78

12

‘7

78

26

12

16

9

16

2

9

Toral de los Vados PH8212 2 2

EL BIERZO

RIBERA DEL DUERO

RUEDA

TORO

Valtuille de Abajo

Valtuille de Arriba

Vil ladecanas

Villafranca del Bierzo

Villar de los Barrios

Alcubilla del M

Atenta

castillejo

La llorra

Pedrosa de Duero

Peñaranda de Duero

Pesquera de Duero

Roa

San Esteban de Gormaz

So> i 1 lo

Terrodillos de Esgueva

Valbuena de Duero

Vill¿lvaro

La Seca

Rodil ana

Rueda

Arguijilro

Casaseca de las Chanas

Morales de Toro

El Pego

El Piñero

San Miguel de la Ribera

Tagarabuena

Eolo

29 E —PHBSIO

PI-1B320

PH 83 ¶ 6

PHBO¶9

0H01 09

30 T —VM8B11

VL8229

VM 5 90 1

VM2722

VM ¶ 8 ¶ 7

VMSS¶5

VMO31 O

VM23 ¶ 6

VM8303

VM31 25

VM2920

UM92¶ ¡

dM82 ¡2

30 T —UL4OB6

UL43B¶

UL 3686

30 T —TL8376

TL7690

UMO7O ¶

TL9378

TLB3S ¶

TL8479

UMOOOl

UL0099

22

22

34

20

8

22

22

38

20

12

6

52

3

9

LI

9

¶6

38

84

6

123

¶0

18

5

‘5

6

182

50

¶ 50

6

6

54

42

O

¶3

4

49

53

28

8

11

2

36

TABLA III

MUESTRASDE MATERIAL VEGETAL (SARMIENTOS) RECOGIDASENTRE NOVIEMBRE

DE 1989 Y MAYO DE 1990.

TABLA III.- MUESTRASCE MATERIAL VEGETAL <SARMIENTOS> RECOGIDASENTRE

NOVIEMBRE DE ~990 y MAYODE ¶990

N5 Fecha Loca lidad UTM N5 Fecha Localidad

9-Xl—1989 Madridejos

Puerto Lápice


Mala g¿n

Malagón

Daimiel

U DaimIel

Carrión de Calatrava

Alnaqro

Bolsñas cío Cale? raya

Pa miel

Arenas dr San Juan

Llanos del Caudillo

Manzanares

Manzanares

Manzanares

Manzanares

U Villanueva de Oraneo

Caserio Aherlura Consolación

U Moral de Calatrava

SonIa Cruz de Mudela

Santa Cruz de Mudela

Valdepeñas

Valdepeñas

Valdepeñas

Valdepeñas

Veldepenas

Pozo de la Serna

U Alcubillas

Villanueva de los Infantes

Carrirosa

1O—XI-1989 Alhambra

Los Almendros

La Solana

La Solana—Valdepeñas


Membrilla

Vi 5665

Vi 5848

Vi4843

Vi 2834

Vi3628

VJ4025

Vi4422

Vi32¶ 5

VJ3? ¡0

Vi44¶6

Vi5330

ViSS3S

Vi6032

Vi6422

Vi6S¶ 8

Vi 582 3

Vi63¶ 5

VJ6680

VIl6B02

VIl 5096

VII 5286

VH6465

VH7086

y 58 93

VHSB8B

VH639¶

VIl? 192

VH7692

VI18590

VH9688

VH9995

Vi9804

Vi 9007

ViSí lO

Vi7403

VJ7099

VJ66l0

38

39

40

42

43

.41.

45

46

40

50

52

53

54

55

56

57

58

59

60

67

62

63

64

65

66

67

68

69

70

72

73

7.4

1O—YI-¶989 Navaloscuenlos

Los Pequines

U Víllarta de San Juan

U Llanos del Caudillo

U Llanos del Caudillo

Argamaslíla df Alba

Tome1 loso-

Torne loso

Socu¿llan,os—EI Provencio

Socu¿llarsos

Las Mesas

Laguna de Manjavacas

Mola del Cuervo

Pedro Muñóz

Campo de Criptana

Campo de Criptana

El Toboso

Miguel Esteban

Alcazar de San Juan

Herencia

Consuegla

Mora

Mora

Tembleque

Villacañas

1l—XI—¶9B9 Ocaña

Villa lobas

Ermita de Santa Catalina

Villatobas—Corral de Almaguer

Corral de Almaguer

Villanueva de Alcardele

Quintanar de— la Orden

Quintanar de la Orden

Venta de Don QuIjote

Mata del Cuervo

El Pedernoso

Las Pedroñeras

UTM

4

5

6

7

8

O

10

¶¶

12

¶3

¶4

¶5

¶6

17

IB

¶0

20

22

23

24

25

26

27

28

29

30

3’

32

33

34

35

36

3?

Vi7924

VJ763¶

Vi64-42

VJ6735

VJ7¶ 30

ViB728

VJ9735

VIi0742

W42755

*1255.4

VIi2[ 57

*1 ¶ .562

VIi t 370

VIi0664

Vi9262

Vi 9464

VJ9672

Vi7489

Vi7463

Vi6577

Vi4574

Vi3389

Vi338S

VJ5392

Vi6788

VK6¶22

VK7I 17

VK 78 lO

VKB2OS

Vi8692

Vi9192

ViS 584

Vi8000

*10676

*11572

*12470

*27462

1¶-XI-1980 El Provenr ¡o

kn 7 Ctra. FI 3¶0

3cm 17 Ctra. FI 3¶0

3cm 27 Ora. R 250

To<neí loso

Casa de Marte

Alameda de Cervera

Alcazar de San Juan



Vil lacanas

LilIa

Lillo

La Guardia

Tembleque

Tur legue

Madr de jos

TomelIoso

¶6—XI—lO09 Casa de María

Caso de Angora

Alcazar do San Juan

Villa franca dr los Caballeros

Quera

Villacanas

Villacanas

Lillo

La Guardia

Romera?

Turlequr

Ventas de Pando

Madrid ej os

Puerto L~pice

Las Labores



Malagón

Eslación Fern¿ncaballero

Carrión de Calatrava

Almagro

174<1—1989 Moral de Calatrava

Valdepeñas

Valdepeñas

*13657

*i274¶

Wi ¡836

*10835

Vi9937

VJ9 144

VJ6849

Vi8456

Vi7463

V17070

VI? ¡ 8 ¶

V17494

Vi6900

V161 Dl

Vi5894

Vi4QBS

VIS¶ 75

Vi9937

Vi9443

Vi885D

ViBSSS

Vi7366

V17¶ 70

Vi7280

Vi7392

Vi7099

VK6202

Vi5992

Vi4984

Vi5274

Vi5764

ViS8S¶

Vi 5347

Vi464 1

Vi394D

V12940

Vi2424

Vi291 8

Vi3902

VH4897

VIl 5892

VH6397

224

225

226

227

228

229

230

231

232

233

234

235

236

237

238

239

240

24¶

242

243

244

245

246

247

248

249

250

251

252

253

254

255

256

257

258

259

260

26 ¶

262

263

26k

265

¶7—XI—1980 Valdepeñas

Valdepeñas

La Peana

DaimIel

flaimíel

Arenas de San iuan

Casas Alías

Manzanares

La Solana

La Solana

San Carlos del Valle

Valdepeñas

Valde~eñas


Manzanares

Monjas

Herencia

Villarla de San Juan

Los Taguines

Llanos del Caudillo

Llanos del Caudillo

Tonel loso

¡B->01—¶9B9 Tonielloso

SocuéIla nos

Casas de los Arboles

Arenales de la Moscarda

Campo de Criptana

Campo de Criptana

Villa de Don Fadrique

El Toboso

Pedro Muñóz

Las Mesas

Las Mesas

Socu4llamos

Soc ué lía mes

18—XI—1989 Ton,e¡loso

Casas de Eugenio

Villarrob ledo

Villa rrob ledo

El Provencio

El Pedernoso

Mota deí Cuervo

75

76

77

78

79—105

106

lo?

lOS

109

lb

hl

112

¡¶3

¶ ¡4

‘¶5

¶ ¡6

¶ ¶7

118—199

200

201

202

203

204

205

206

207

208

200

2¶0

2¶ 1

2¶2

2¶ 3

214

215

216

217

2¶B

2¶ 9

220

221

222

223

V1-16686

VH6.496

Vi6300

Vi4933

VI3827

VlSI 36

Vi5829

VI622 3

Vi78¶ 1

Vi7 904

VH7898

VH699¶

VH6693

Vi6604

V16825

Vi6538

Vi6857

VJ6847

Vi 6538

Vi7329

V17225

Vi9S35

W10541

*11448

*10349

ViS9S¶

V19¶6¶

Vi8969

Vi8684

*i0¶7¶

*i0462

*11462

*1 1855

951

*11541

*11432

Wi2S4C

VII3245

*i4153

*13363

*12072

*10974

¶B-XI—1989 Quintanar de la Orden

Villanueva de Alcardete

Villanueva de Alcardete

Corral de Aln,aguer

Ermita de Santa Catalina

28-V-¶990 Dos Barrios

La Guardia

Tembleque

Venías de Pando

Ventas de Pando

Ma dr dei os

Puerto LóPice

Puerlo LAnce

Puerlo LApice

Puerlo LApice

Las Labores


Vilíarrubia de los Ojos


Malaqón

FamAnca b a Ile re

CarriAn de Calatrava

Tnrmn Iba de Calatrava

Torralba de Calatrava

Beleños de Calatrava

Moral de Calcírava

Moral de Calalrava

Valdepeñas

Valdepeñas

Valdepeñas

Valdepeñas

Valdepeñas

Caserío Corral Rubio

Caserto Corral Rubio

Caser’., Encomienda

Caserío Encomienda

Caserro Encomienda

Caserío Encomienda

Caserío Encomienda

Valdepeñas

Caserro Encomiande

Valdepeñas

Pozo de la Serna

VIOSBO

ViOSBE

V19 290

V18898

VK7B¶0

VI<601 8

VK59 10

V15899

VJSOB2

Vi5577

Vi5566

VJS?60

V15858

V15953

VJSSSO

Vi5549

Vi 5044

VíaS’.?

Vi4040

VJ2939

Vi2329

V12625

VI33 ¶ 9

Vi37¶ 5

V14505

VII 5098

VH5397

VN589 3

VI-l6¶92

VH6291

VIl6 389

VH6395

VH6¶82

VH648¶

V146784

VH5685

VH6383

VH6ÁB4

VH6383

VH6794

VH6SS¶

VH7¶91

l/H 7892

309

310

31 ¶

312

3¶ 3

3,4

3,5

3¶ 6

3¶ 7

3¶8

3¶0

320

32 1

322

323

324

325

326

327

328

329

330

33’

332

333

334

335

336

337

338

339

3.40

341

342

343

344

345

346

34?

¡ 348

349

350

~35>

28—V-1990 San Carlos del Valle

San Carlos del Valle

Membrilla

Manzanares

Manzanares

Manzanares

Manzanares

Caserto Abertura

Caserío Abertura

Valdepeñas

La Peana

La Peana



Qainiel

Daimiel

• Casas Altas

Villarrubla de los Ojos

Casas Altas

Casas Altas

Manzanares

Manzanares

Manzanares

Llanos del Caudillo

Vil arta de San Juan

Villarta de San Juan

Herencia

Herencia

Herencia

Villarta de San Juan

Los PequInes

Nava

Nava oscoentos

Manzanares

Manzanares

Le Solana

Amgan,asilla de Alba

Tome1 loso

Tomel loso

Tome lioso

Case de Marte

Alameda de Cervera

Alcazor de San Juan

266

267

268

269

270

271

272

273

274

275

276

277

278

279

280

281

282

283

284

285

286

287

288

280

290

201

292

293

294

295

296

297

298

299

300

301

302

303

304

305

306

307

306

VH7908

VII 790k

V17 132

Vi6820

ViBSiS

Vj6S 14

ViB6 lO

VJ6602

V16598

VIl 679 1

VIl 6397

VJ6207

V16¶05

ViSBO9

Vi’. 922

Vi5029

Vi 5035

V14938

ViS 532

VJ5926

Vi6223

Vi6.420

Vi6626

Vj68¶ ¶

Vi6440

Vi6347

Vi67S¶

Vi6955

Vi69S0

Vi7045

Vi7538

V18535

Vi8227

Vi782k

VJ8222

VJ7914

Viii 28

VJ9635

*i0736

VJ9442

VJ8946

VJ8553

29—V-1990 Alcasar de San Juan

Alcozar de San Juan

Villafranco dc os Caballeros

Quero

III Calaminar

Vil 1 acañas

ViII acanas

Lillo

iii o

Ermita Sanía Calalina

Ocaña

Vil latobas

Eneral de

Corral de

Corral de

Quintanar

Alrnanuer

Almaguer

Alma guer

dr la Orden

Quinlanar de lo Orden

Villa de Don Fadrique

Ciir en

Miqurí Esírban

MHjuel [sIroco

Compo de Criotana

El Tobooci

Venía de El Toboso

Mata del Cuervo

Pedro Muñóz

Eslación do Rio Uncara

Arena los ele la Moscarda

ToneL 1050

Tomel loso

Casa de Eugenio

Villar rob ledo

Villarrob ledo

VIlla rrob ledo

Socuéllamos

Socuéilamos

Socuéllamos

Socuéllamos

TomelIoso

Las Mesas

Las Mesas

Las Pedroñeras

Las Pedroñeriss

V18456

V17861

Vi726B

Vi7772

Vi7175

V17¶82

Vi7288

VJ7393

V17399

VK72¶ ¶

VK642 1

VK73¶ 6

VK7918

VK8503

VK8802

Vi929 1

VI 9684

V18584

Vi7O78

V18574

Vi8O70

V19463

V19870

*10276

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29-V-¶990 El Provencio

El Provencio

San Clemente

La Alberca de Z¿ncara

La Alberca de Z¿ncara

Rada de Haro

Rada de Haro

Belmonte

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Ose de la Vega

Los Hinojosos

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Santiago

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394

TABLA IV

RELACION DE MUESTRASDE SARMIENTOSY SUELOS RECOGIDAS EN INVIERNO DE 1990

TABLA IV.- RELACION DE MUESTRAS DE SARMIENTOS Y SUELOS RECOGIDAS

EN EL INVIERNO DE ¶990

Fecha Localidad UTM Suelo

72-XII—7990 Cabañas de Yepes VX5978

2 Dosbarrios VK5912

3 La Guardia VK5903

4 Tembleque Vi5792

5 Ventas de Pando V15683

6 Madridojos V15672

7 Can,uñas Vi5762

5 Puerlo L~pice ViSOSS

9 Puerto L~pice ViSBS¶

¶0 Las Labores V15357

11 Villarrubia de los Ojos V1454¶

¶2 Fuente El Fresno V1324¶

13 Fern¿ncaballero Vi2332

14 Carrión de Catalrava V12818

5 Carrión de Calalrava V13215

¶6 AI,nngro VJ?808

¶7 Moral de Calatrava VI-44808

¶8 Moral de Calatrava VH5199

9 Valdepeñas VH5794


2¶ Valdepeñas VH6492

22 Valdepeñas VH6J,90

23 Caserío Encomienda VH6385

24 Corral Rubio VH628 ¶

25 Caserío Encomienda VI-16485

26 ‘ Caserío Encomienda VH6884


28 Valdepeñas VH6k98

20 La Peana VIl6399

30 La Peona V16202

Caserío Abertura Vi63O¶

32 Daimiel ViS¶ 19

33 Daimiel Vj5026

34 Arenas de San loAn Vi5634

35 Arenas de San JuAn Vi6¶42

36 Villana de San JuAn Vi6342

37 ¶2—YII—¶990 Llanos del Caudillo Vi6629

38 Manzanares Vi65¶ 5

39 Membrilla V166¶0

40 Valdepeñas VI46597

Valdepeñas VH6692

42 ‘ Valdepeñas VH709¡

43 Pozo de la Serna VH7893

44 San Carlos del Valle VH7807

45 San Carlos del Val le V17904

46 La Solana Vi7O¡ 1

47 La Solana ViB2¶9

46 Navaloscuenlos VJ8326

40 Argamasilla de Alba VISOSO

50 Tonel loso V19634

51 Tomelloso V19638

52 El Minguillo Vi9O45

53 Casa de Bailio V18854

54 Alcasar de San Juan V18456

55 Alcazar de San Juan V17959

56 Herencia V17059

57 Villafranca de los Caballeros Vi6963

58 Villafranca de los Caballeros Vi6968

59 Villacañas Vi7079

60 Villacañas Vj7287

61 Lillo V17497

62 Lillo Vi7693

63 Villa de Don Fadrique VJ8¶85

64 Villa de Don Fadrique ViS¶83

65 Puebla de Almoradiel Vi9084

66 Quintanar de la Orden Vi928¡

67 Miguel Esteban Vi9377

68 El Toboso Vi9876

69 El Toboso V19973

70 Campo de Criplana Vi9463

Pedro Muñ¿z Vi9862

72 Pedro Muñúz *10558

73 Casas de los Arboles Wi035¶

74 Tomelloso Wi0¶ 40

75 Tomelloso *10338

76 ~ Tomelloso *10844

VII ¶ 64877 Socuel amos

78 ¶2—XII—¶990 Socu¿Ilamos *11847

79 Socuéllamos W1lB5¶

80 Socuéllamos *12251

67 Socu¿Ilamos *12186

82 Socuéllatnos *12160

83 Las Mesas *11855

84 Las Mesas *11059

85 Las Pedroñeras *12566

86 El Provencio *13656

87 ‘ Villarrobledo *33448

80 Villarrobledo *í¶ ¶43

89 Casa de Eugenio *12740


a Tonelloso *11536

92 Tomelloso *10036

93 Tonelloso *10333

94 Tonielloso *11130

95 Tomelloso *11620


97 Ossa de Monte *12416

98 » Munera *13822

99 Munera *14222

IDO Moharras *15335

101 La Roca *17234

¶02 La Roca *17141

103 La Roca *17141

104 Sonta María *16445

¶05 Casas de Roldón *15550

106 Los Estesos *14953



109 Las Pedroñeras *12964

I¶0 Las Pedroñeras *12867

111 Santa Marie de los Llanos *11872

112 Mota del Cuervo *11174

113 Mola del Cuervo *10576

114 Venta de El Toboso *10378

115 Quintanar de la Orden V17683

¶16 Villanueva de Alcardete VJ9290

Vi909 5

¶24<11-1990 Corral de Almaguer

lIB Corral de Almaguer VK8402

119 Corral de Almaguer VK8¡07

¶20 Ermita de Santa Calelina VK77¶¶

¶21 Villatobas VK73¶7

¶22 Ocaña VK6420

¶23 Ocaña VK631 9

VII.2. TABLAS Y MATRICES DE RESULTADOS.

TABLA Y

RESULTADOSDEL MUESTREOPREVIO: NEMATODOSENCONTRADOS,PRESENCIA/AUSENCIA

DE GFLV Y CARACTERíSTICAS DEL SUELO.

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TABLA VI

RESULTADOSDEL MUESTREOGENERAL. VALORES DE ELISA TOMADOSA 1 HORA.

FONDO DE PLACA ENTRE 0,070 y 01,100. TESTIGO NEGATIVO ENTRE 0,086

Y 0,120.

Resultados del muestreo general. Valores de ELISA tomados a 1 hora.

Fondo de placa entre 0,070 y 0,100. Testigo negativo entre 0,086 y

0,120.

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—3 0,013

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24— 1 0,020

— 2 0,450

—3 0,017

- 4 0,025

25— 1 0,010

— 2 0,029

—3 0,018

26— 1 0,010

— 2 0,015

—3 0,010

27— 1 0,012

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—2 0,030

— 3 0,002

2— 1 0,010

— 2 0,015

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4— 1 0,020

—2 0.030

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5— 1 0,010

6— 1 0.010

7— 1 0,015

7- 2 0,618

7— 3 0,012

8— 1 0,020

9— 1 0,025

9- 2 0,021

13 0,010

14— 1 0,010

-2 0,010

—3 0,007

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16— 0,425

17— 1 0,020

— 2 0,020

18- 1,200

19— 0,025

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33- 0,020

35— 1 0,006

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N~ de Valor Valor N~ de Valor Valor N~ de Valor Va il.)r -

Muestra ELISA

43— 3 0,013

44— 1 0,011

— 2 0,015

3 0,010

45— 1 0,015

¡ — 2 o,o18

—3 0,010

46— 1 0,515

— 2 0,030

—3 0,026

47— 1 0,012

— 2 0,014

—3 0,011

48— 1 0,015

— 2 0,012

¡ — 3 0,016

49— 1 0,012

— 2 0,014

—3 0,011

50— 1 0,011

— 2 0,013

—3 0,015

51— 1 0,020

— 2 0,032

—3 0,019

52— 1 0,011

— 2 0,009

— 3 0,013

53— 1 0,014

— 2 0,010

—3 0,018

59— 1 0,714

—2 0,325

— 3 0,040

vid(—)

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0.011

0,01).

0,011

0,011

0.011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

Muestra ELISA

60— 1 0,014

— 2 o,oí8

— 3 0,013

61— 1 0,010

— 2 0,016

— 3 0,004

62— 1 0,612

— 2 0,026

—3 0,018

63— 1 0,312

—2 0,018

—3 0,011

64— 1 0,027

— 2 0,028

- 3 0,650

65— 1 0,046

— 2 0,042

-— 3 0,032

66— 1 0,013

2 0,314

- 3 0,029

67— 1 0,175

— 2 0,016

— 3 0,012

68— 1 0,011

-— 2 0,009

—3 0,003

69— 1 0,0í6

— 2 0,012

—3 0,013

70— 1 0,216

— 2 0,012

— 3 0,003

vi d ( -)

0,011

0.011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

71— 1 0,318 0,021

Muestra [lISA vid<-)

71— 2 0,012

—3 0,010

72— 1 0,021

— 2 0,450

3 0,009

73— 1 0,250

— 2 0,012

—3 0,019

74— 1 0,036

— 2 0,019

— 3 0,021

75— 1 0,610

— 2 0,821

—3 0,341

77— 1 0,612

— 2 0.011

—3 0,015

78— 1 0,021

— 2 0,027

—3 0,017

79— 1 0,914

— 2 0,012

—3 0,017

80— 1 0,021

— 2 0,809

— 3 10,312

8— 1 0,013

— 2 0,017

— 3 0,012

82— 1 0,803

— 2 0,313

—3 0,905

83— 1 0,051

— 2 0,040

0,021

0,021

0,016

0,0í6

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

O , 0 1 6

o , 0 1 6

0, 0 1 6

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O , 01 6

0 , Ci 6

0.02

O , 02 1

0, 02 -L

O . 02 .1

O 02 .1

O , 01 6

0,016

0,016

0.016

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0.016

0,016

¡ ¿ -91 —

1N~ de Valor Valor N~ de Valor Valor N0 de Valor Valor

Muestra ELISA vid(-) Muestra ELISA vid(-) Muestra E1.iS-A vid(-)

o,Sao0,950

0,247

0,020

0,010

0,017

0,750

0,760

0,350

0,021

0,850

0,375

0,010

0,012

0,016

0,017

0,450

0,010

0,010

0,006

0,009

0,010

0,020

0,025

0,030

0,010

0,325

0,015

0,004

0,010

0,010

0,015

0,022

0,022

0,556

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

83—?

84— 1

—2

—3

85— 1

—2

—3

86— 1

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87— 1

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- 39— 1

—2

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—3

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—2

—3

93— 1

—2

—3

94- 1

95— 1

—2

—3

q6— 1

—2

0,027

0,026

0,022

0,019

0,011

0,016

0,015

0,014

0,021

1,215

0,010

0,883

1,512

0,615

0, 041

0,027

0,036

0,400

0,0í8

0,022

0,015

0,621

0,017

0,031

0,031

0,022

0,415

0,037

0,035

0,361

0,335

0,402

0,035

0,010

0,0í6

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0 024

0,024

0,024

0, 024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0 024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

3 0,370 0,024

97— 1

—2

—3

98— 1

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1 11 — --1

— 2 0,012 0,024 -

111— .3 0,011

112— 1 0,020

— 2 0,041

— 3 0,022

¡ liii —1 0,019

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¡ —3 0,017

112—1 0,026

—2 0,027

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113— 1 0,030

— 2 0,027

—3 0,030

116— 1 0,013

— 2 0,012

— 3 0,027

117— 1 0,051

— 2 0,020

—3 0.020

~8— 1 0,041

— 2 0,023

—3 0,017

119— 1 1,171

2 0,027

— 3 0,017

120— 1 0,570

— 2 0,012

— 3 0,017

121— 1 0,006

— 2 0,006

— 3 0,004

122— 1 0,002

— 2 0,001

—3 0,010

123— 1 0,009

2 0,012 0,014

0,024

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0.016

o , 01. 6

0. 0 6

0. 0 :i 6

O , 0.1 6

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0,016

0,016

0.016

0,016

0,016

0,016

0,0í6

0,016

0,0í6

0,016

0,016

0,016

0,016

0, 0-1 6

0,114

0,114

0,114

0,114

0,114

0,114

0, 114

N~ de Valor Valor N9 de Valor Nalor N9 de Valer ValerMuestra ELISA vid( —) Muestra ELISA vid(—) Muestra ~ vii df—)

123—3 0,010 0,114 135—2 0,005 0,016 151—2 0,019 0,016

124—1 0,007 0,114 —3 0,006 0,016 —3 0,027 0,016

—2 0,009 0,114 136—1 0,017 0,016 151—4 0,251 0,016

—3 0,012 0,114 —2 0,013 0,016 153—1 0,010 0,016

¡ 125—1 0,012 0,114 —3 0,017 0,016 —2 0,425 0,016

—2 0,026 0,114 137—1 0,012 0,016 —3 0,012 o,Oió

¡ —3 0,010 0,114 —2 0,019 0,016 —4 0,016 0,016

126—1 0,013 0,114 —3 0,004 0,016 154—1 0,010 0,016

—2 0,012 0,114 138—1 0,003 0,016 —2 0,012 0,016

—3 0,014 0,114 —2 0,003 0,016 —3 1,119 0.016

127—1 0,010 0,118 —g 0,ooó o,oíó —4 0,016 0,016

—2 0,010 0,118 139—1 0,012 0,016 155—1 0,018 0,016

—3 0,011 0,118 —2 0,012 0,016 —2 0,013 0,016

128—1 0,012 0,118 —3 0,012 0,016 —3 0,017 0,0í6

—2 0,011 0,118 140—1 0,482 0,016 —4 0,012 0,016

128—3 0,011 0,íí8 —2 0,010 0,016 156—1 0,020 0,016

129—1 0,019 0,118 —3 0,012 0,016 —2 0,020 0,016

—2 o,oíy 0.118 —4 0,013 0,016 —3 0,012 0,016

—3 0,017 0,118 143—1 0,631 0,016 —4 0.015 0.0í6

130—1 o,oz o,íí8 —2 0,450 0,016 157—1 0,021 0,016

—2 0,012 0,118 —3 0,016 0,016 —2 0,026 0,016

—3 0,017 0,118 —4 0,016 0,016 —3 0,025 0’.Oi6

131—] 0,015 0.118 144—1 0,023 0,016 —4 0,0í6 0,016

—2 0,016 0,118 —2 0,019 0,016 vS-~í 0,Oío o.oió

—3 0,023 0,118 —3 0,020 0,016 —2 0,013 0,016

132—1 0,019 0,016 —4 0,020 0,016 —3 0,023 0,016

—2 0,014 0,016 148—1 0,019 0,016 —4 0,023 0,016

—3 0,014 0,016 —2 0,019 0,016 159—1 0,029 0,016

133—1 0,013 0,0i6 —3 0,020 0,016 —2 0,023 0,0i6

—2 0,017 0,016 —4 0,017 0,016 —3 0,041 0,016

--3 0,017 0,016 149—1 0,612 0,016 -.4 0,267 0,016

- 134—1 0,013 0,016 —2 0,010 0,016 160—1 0’.0l0 0,012

—2 0,013 0,016 —3 0,010 0,016 —2 0,010 0,012

—3 0,011 0,016 —4 0,009 0,016 -3 0,009 0,012

135—1 0,006 0,016 151—1 0,030 0,0i6 —4 0,007 0,012

>.7< -< ~~1

1 82a.3

¡ -4

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—2

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—4

íES —í

—2

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-4

N~ de Valor Valor N0 de Valor Valor N9 de Valor Valor

Muestra ELISA vid(-) Muestra ELISA vid(—) Muestra ELISA xid(—)

170— 4

171— 1

—.2

—3

—4

172— 1

—2

—3

—4

173— 1

—2

—3

—4

177— 1

—2

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¡ —4

178— 1

—2

—3

—4

179— 1

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—4

181— 1

—2

—3

—4

1 g2a~1

—2

0,021

0,017

0,017

0,011

0,016

0,014

0,013

0,022

0,019

1,512

0,013

0,013

0,047

0,232

0,017

0,021

0,021

0,020

0,020

0,019

0,016

0,010

0,010

0,315

0,012

0,025

0,019

0,019

0,021

0,006

0,003

0,002

0,004

0,002

0,009

o,oí8o,oí8o,oí80,0180,018

0,01 8

o,oí8o,oí8

o,oí80,018

o,oí80,01-8

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o,oí80,018

o,oí80,018

0,018

0,0180,0180,018

0,0180,118

0,118

0,íí8

0,118

0,118

0,118

162—1

—2

—3

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163—1

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164—1

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-4

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—3

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—2

-—3

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167—1

—2

—3

—4

168—1

—2

—3

—4

169—1

—2

—3

-4

170—1

—2

—3

0,019

0,017

0,014

0,013

0,018

0,017

0,017

0,021

0,015

0,015

0,022

0,017

0,375

0,016

0,016

0,015

0,023

0,022

0,026

0,019

0,015

0, 025

0,016

0,012

0,017

0,021

0,020

0,019

0,022

0,022

0,019

0,025

0,029

0,020

0,031

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0.012

0.012

0,012

0,012

0,012

0, 01 2

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,012

0,018

o,0í80,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,003

0,010

0,740

1,230

0,020

0,020

0,600

0,007

0,807

0,012

0,014

0.014

0,021

0, 013

0,0050,003

0,004

0,010

0,015

0,012

0,013

0,017

0,023

0,022

0,018

0,023

0,0180,031

0,017

0,023

0,118

O , 11 8

0,118

0,118

0,11 8

0,1180,í8

0.1180,1í8

o,íí80,1 18

0,íí8

o,uí8

o,ii8o,íí8o,ííS0, ii-E

o ,i~ 8o ,i ~

o , 118

O , u 8

0, u 8O , 1180, 113

0,11 8o o, 11 6

o ,íí 3

O , 118

TABLA VII.— RESULTADOS DE LOS MUESTREOS REALIZADOS ENCAST 1 LLA—LEON

Deno.ssnación NS de uestras N~ demuestras Presencia dede orisen >1unicipio estudiadas positivas pureen taje X jode’

CEflE ROSEl Barraco 10 2

Cebreros 25 2

Hoyo de Pinares 25 6

San Bartolomé de Pinares 25 1

San Juan de la flava 15 6

El Tiemblo 25 5

125 22 176

CIGALES

Coros del Valle 40 8

Cigalea 132 8

Cubllloe de Santa Maria 30 2

Fuennaldat¶a 15 1

Mucientes 50 5

Irigueron del Valle 50 3

317 25

£1. BIERZO

Arganza 10 2

Cabañas Raras 1>1 0

Cacabelos 71 13

Cajnpelo -/ 0

Cazsponarsya OIl

Canedo 4 0

Carracedelo 2 1

Castropodaae 22 0

Cortiguera 2 0

Cortigosa 2 0

Cubillinos 6 0

Cubillos del SIL 4 0

Cueto 4 0

Iglesia del Canpc 16 0

ParaMoneo 10 0

Plazos 1 0

Ponferrada 78 0

Quilés 26 0

Sancedo 12 0

San juan 1 0

San Lorenzo 16 1

San MartIn 2 1

San MIguel 9 0

Toral de loe Vados 2 1

TABLA vi: (ContinuaCión)

Denoeinaci6n 1.7’ de murnt ras N~ dr suen UÑís l>-cscr:.c a dede origen Muríi cipio estudmsol» pos> ti ‘a’.; Portent a ¡ r - i r;drí

E?. BIERZO

Valtuilie dr Arriba 22 0

Valtuille de AbaJo =2 0

Villadecasíes 3d O

Villafranca del Bierzo =0 0

Villar de los Barrios 12 0

501 13

RIBERA DEL DUERO

Alcubilla del Marqués 6 0

Atauta 5 0

Castillejo 1 0

La Morra II? 13

Pedreas de Duero 3d

Pe6arsnda de Duero 1 0

Pesquera de Duero 8-4 16

¡ka 6 0

San Esteban de Gortsaz 4 0

Cotillo 12 2

Terradillos de Esgueva 3 3

Valbuena de Duero 7.0 0

1 0

187 35 18.2

RUEDA

La Seca :82 35

llodilana 50 1=

Rueda 150 22

382 74 15>3

Tollo

ArguJillo 6 2

Cesasaca de las Chanas 6 0

Morales de Toro 54 11

El Pego 42 10

El Piñero 0 5’

San Miguel de la Rivera 13 5

Tagarabuena 4 4

Toro 49 2

183 30 13,4

TABLA VII.— MATRIZ Y TRATAMIENTO DE DATOS PARA EL ANALISIS DECORRESPONDENCIASMIJLTIPLES, CONSIDERANDOTODAS LASMUESTRAS

r~1t~7sT¡aLs mj FID4IER A>JESISTITE u

OI~ D06~RVAT2~6 251 IO92~ LE V~1AKtS ¡4

C~T~¡S1I~.ES fi FI041~ A>JtStST¡T~

OtILE 00EGE?4AT10~S> 251

lOtwflEweIaLs: IIF¡O~l~ ¡E ¡U*EES A?lISIS

IDHIE~ ¡E £Ú#IEES AiJESS

¡ 2 3 4 5 6 7 9 ¡0 IIVM 9114 116 ¡IT 1~ ~EI. ~I 101 VV 814 MC

12 13 ¡4¡AM ML CM

1 4.00 ¡5.002 1.00 ¡6.003 ¡.00 15>004 ¡.00 ¡.005 ¡.00 ¡2.006 1.00 ¶2.00

1.00 ¡LOO9 ¡.00 ¡3.00

1.00 12.0020 2.00 4.00II ¡.00 ¡2.0012 ¡.00 0.0013 1.00 4>00II ¡.00 4.0015 1.00 15.00¡6 1.00 4,0017 1.013 9.00

lB 1.00 9.0019 ¡.00 13.0020 ¡.00 8.0021 .1.00 8.00

22 2.00 LOO23 ¡.00 9.0024 1.00 9.0025 ¡.00 LOO

26 1.00 15.0027 2.00 ¡5.0028 10(1) 25.0029 1,00 15>00

30 ¡.00 4.0032 2.00 22.0032 1.01) 4.0033 1.00 1.0034 1.00 7.0035 ¡‘.00 4.0036 ¡‘.00 3.0037 2.00 4.0033 9,00 0.0039 9.00 ¡5.0040 9.00 15.0041 9.00 15.0042 6,00 15.0043 6.0.7) 25.0044 6,00 ¡5.0045 6.00 7.00

46 9.00 ¡5.0047 4.00 15.0048 ¡.00 ¡5.0049 LOO ¡5.0050 1.00 31.00Sl ¡.00 02.0052 1,00 0.0053 1.00 ¡3.0054 1.00 0.0055 1.00 ¡4.0056 1.00 25.0057 ¡.00 9.0058 1.00 16.0059 ¡.00 26.0060 ¡.00 15.0061 1.00 11.00¿2 ¡.00 7.0063 ¡.00 0.0044 1.00 14.00¿5 2.00 24.0046 1.00 ¡5.0067 1,00 11.00¿8 2.00 8.0069 1.00 0.0070 1.00 14.0070 ¡.00 02.0072 2,00 ¡4.0073 2.00 9.0074 2.00 25.0075 0.00 0.0016 0.00 2.00

0.000.000.000.000.000.000.000.00

0.000.000.000.000.000.000.005.00

0.000.000.00

0.000.00

0.00¡0.00

0.000,000.000.00

30,00

0.000.00

95.000.000.000.000.00

0.000.000.000.000.000.00

0,000.000.00

0.000.00

0.000.000.00

10.000.00

15.0020.000.005.00

20.000.00

0.00¿0.000.005.00

30.000.000.00

20.000.000.000.000.00

0.000.000.000.000.000.00

10.00

0.00 5.0020.00 15.005.00 15>000.00 10.00

¡0.00 10.000.00 15.000.00 5.000.00 10.000.00 90.000.00 20.000.00 255.000.00 220.00

310.00 275.000.00 40.000.00 35.000.00 45.00

0.00 5.000.00 30.000.00 190.00

0.00 5.000.00 53.000.00 5.000.00 2L000.00 45.000.00 30.00

15.00 60.0040.00 125.000.00 0.00

0.00 E.0035.00 0.00

205.00 70.0035.00 20.00

¡25.00 110.0020.00 320.000.00 340.00

¡5.00 ¡¡5.0010.00 ¿0.00

0.00 70.000.00 45,000.00 ¡70.000.00 ¡40.000.00 40.00

33.03 0.000.00 0.000.00 0.000,00 65.0015.00 65.005>00 25.000.00 2~000.00 0.000.00 40.00

¡0.00 5.000.00 0.000.00 0.000.00 ¡5.000>00 5.000,00 ¡5.000,00 10.000.00 25.005.00 20.000.00 5.00~00 20.000.00 15.000.00 20.000.00 20.000.00 20.000.00 10.000.00 5.000.00 10.000.00 35.000.00 25.000.00 0.00

35.00 640.000.00 ¡0.000.00 50.005.00 20.00

2.002.002.002.001.00¡.003.002.001.002.00¡.00¡.002.002.00¡.002.002.002.00L002.002.002.002.002.002.002,002.002.002.002,002.002.00

2.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.00

2.002.002.00

2.00¡.00¡.00

2.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.00

2.001.002.002.00

0.00 45.000.00 ¡70.000.00 35.005.00 ¡10.000.00 0.000.00 20.000.00 5.000.00 405.000.00 ¡5.000.00 5.000.00 35.000.00 ¡0.000.00 30.000.00 20.000.00 ¡0.000.00 215.000.00 25.00

¡0.00 120.000.00 6~000.00 45.000.00 115.00

0.00 225.000.00 ¡00.000.00 ¡00.000.00 5.000.00 25.000,00 20.000.00 5>00

5.00 25.000.00 230.00

35.00 30.000.00 0.00

60.00 0.000.00 0.000.00 0.000.00 40.000.00 25.000.00 0.000.00 65.000.00 60.000.00 20.000.00 465.000.00 ¡213.030.00 6050.000.00 70.000.00 40.000.00 35.000.00 15.000.00 ¡5>000.00 0.000.00 55.000.00 10.000.00 15.00

5.00 290.0070.00 65.000.00 140.00

440.00 45.005.00 20.000.00 20.000.00 ¡0.000.00 5.000.00 160.000.00 0.000.00 60.000.00 65.00

¡0,00 60.000.00 90.00

lOmOO 30.002.00 0.00 ¡00.002.00 0.00 350.002,00 0.00 45.002.00 90.00 415.002.00 440.00 200.00¡.00 5.00 5.002.00 ¡00.00 460.002.00 5.00 505.00

0.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.00

¡.00

2.002.00¡.00

2.002.00

2.002.002.002.002,003.00

2.002.002.002.00¡.002.002,002,002.002.001.002.002.002.002.03¡.00

¡.00¡.00

1.00¡.00¡.00

1.001.00I.002.00¡.00¡.001.00

2.000.001.00¡.002.001.002.00¡.001.00¡.001.001.002,001.001.00¡.00¡.002.002.00¡.00

LOt 45.608.06 58.007.93 30.008.07 74.003.03 80.009.09 90.00L06 7~009.26 71.60L02 57.007.90 50.00L¡3 46.009.12 60.009.33 64.007.93 46.007.93 34.007.65 25.007.97 31.008.04 53.207.91 32.208.15 51.208.11 41.208.14 22.203.04 29.209.06 33.003.09 49.609.20 57.008.07 43.608.27 42.606.30 57.607.99 60.00oía 72.009.17 56.007.97 64.008.25 20.008.20 24.009.01 26,40LOA 28.409.09 26,407.86 04.807.92 20.407.90 ¡6.007.98 64.307.99 5Z837.67 42,408.14 64.408.05 76.409.11 62.40OdIO 56.407,92 34.909.28 88.409.09 64.408.11 76.909.19 72,409.09 60.809.06 32.40Iii 34.009.09 2t001.14 46.005.15 50.007.71 36.007.74 48.007.94 42.40LOS 56.407.99 60.40L03 54.009.03 56.003.06 64.007.93 58.007.79 34.007.93 46.407.81 30.404>71 71.604.58 69.606.43 75.604.99 57.606,90 67.60

¡ 33.20 21.20 27.402 ~E0 19.20 3~203 28.90 41.20 ¡3.704 ¡0.60 ¡5.20 17.605 6.80 11.20 ¡9.606 9.90 ¡¡.20 ¡9,607 12.80 07.20 25>509 ¡7.20 11.20 11.709 30.60 15.20 0.60

¡0 30.80 ¡9.20 45.00II 43,20 ¡2.80 13.70¡2 25.20 14.80 8.6011 23.20 22.80 1.00¡4 31.20 22.60 21.40¡5 39.20 26.30 1.2025 49,00 26.00 2t5017 37,00 32.00 ¡1.30

¡8 25.20 ¡7.60 27.4039 39.20 29.60 3.1.4020 27.20 21.60 39.2020 29.20 29.60 40.2022 37.20 42.60 37.2023 35.20 35.60 51.2024 31.43 35.00 28.4025 27.40 23.00 21.6026 23.40 ¡9.00 37.6027 35,40 20.00 43.1028 ¡5.40 43.00 ¡2.9029 23,40 ¡9.00 23.3030 29.20 ¡0.90 ¡5.3032 ¡5,20 22.80 27.7032 35.20 9.80 72.5033 23,20 ¡2.60 35.9034 ¡7.20 22.83 36.3035 32.20 42.60 75.9036 37.20 36.40 14,9037 29,20 42.40 64.5038 36.60 36.80 40,1039 33.20 52.00 25.5040 35>40 44.23 SOJO41 33.60 50.40 27,3042 ¡4.60 20,40 25.7043 25.60 ¡8.40 30.5044 33.20 24.40 40.6045 21.20 ¡4.40 55.3046 9.20 ¡4.40 30.6047 17.20 20.40 45,0046 ¡9.20 24.40 22.1049 37,20 28.00 57.43

50 5.20 6.40 7.60Sl ¡7.20 16.40 ¡0.6052 ¡0.80 ¡2.40 7.6053 13.20 ¡4,40 4.9054 ¡9.20 20.00 24.3055 30.20 36.40 44.40¡6 21.65 44,40 12.6057 21.60 46.40 13.0059 21.60 29.40 49.1059 25.65 24.40 14.3060 31.60 32.40 29.6061 29.60 24.40 9.9062 27.20 30.40 ¡.5063 23.20 20,40 45.0064 23.20 26.40 17.6045 ¡9.60 26.40 15.6066 25.60 ¡6.40 ¡1.0067 ¡5.60 20.40 30.5063 ¡7.60 24.40 20.5069 27.60 30.40 ¡9.7070 25.20 28.40 30.3071 67.20 2.40 29.4072 ¡¡.80 9.60 0.0073 20.60 9.60 0.0074 28A0 ¡>00 0.0073 24.40 ¡6.00 0.0076 24.40 9.00 0.00 —

TABLA VIII (ContinuaCión)

2.00 20.00 500.002.00 0.00 ¡25.002.00 0.00 5.002.002.002>002.002.002.002.002.00¡.002.002.00

2.002.00¡.002.00LOO2.002.002.002.002.002.002.002.032.00¡.002.032.002.002.002.002.002.002.002.00¡.002.002.002>002.002.002.002.00¡.002.062.001.002.062.00¡.002.002,032.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.00

0.00 55.000.03 5.00

¡5.00 65.0070.00 ¡75.0010.03 20.00

0.00 40.000.00 15.000.00 30.000.00 ¡0.000.00 60.000.00 20.000.00 ¡5.000,00 200.000.00 25>000.00 ¡60.000.00 55.00

30.00 10.000.00 240.000.00 5.000.00 ¡5.000.00 50.000.00 0.000.00 1970.005.02 ¡90.005.00 015.000.00 ¡0.00

10.03 60.0020.00 45.0010.00 ¡90.000.00 150.000.00 15.000.00 75.000,00 70.000,00 ¡25.00

0.00 35.000.00 ¡5.000.00 55.000.00 ¡25.005,00 ¡200.000.00 60.00(¡.00 ¡5.00

5.00 35.000.00 5.000.00 00.000.00 35.000.03 0.000.00 0.000.00 ~.00

15.03 5.000.00 5.00

315.00 0.000.03 65.00

40.00 ¡¡5.0030,03 ¡5.000.00 ¡00.005.00 250.00

¡0.00 225.000.03 20.000.00 5.000.00 255.00

25.00 10.005.00 ¡05.000.00 205.00

>050 2050¡5.00 0.00

2.00. ¡¡0.00 0.002.00 0.00 45.03LOO ¡50.00 ¡5.002.00 35.00 420.002.00 25550 640.002.00 50.00 00.002.00 0.00 330.00LOO ¡00.00 2210.00¡.00 25.00 35.000.00 5.00 30.002.00 40.00 5.002.00 0.00 105.001.00 2050 45.00¡.00 0.00 0.002.00 0.00 30.002.00 0.00 0.002.00 0.00 5.032.00 5.00 15.002.00 0.00 0.002.00 80.00 IS.00

2.001.002.002.002.032.002.002.03¡.00¡ .002.032.002,002.002.001.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.00¡.002.00¡.002.00¡.00¡ .031.002.002.002.002.00¡.002.002.002.002.001.001.002.00¡.002.002.00¡.00¡.002.002.002.002.00¡.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.062.002.062.002.002.002.062.00

7,02 ¡¡.60 77 30.40 6.005.95 65.60 79 24,40 ¡0.004.69 59.64 79 34,40 6.005.28 55.60 80 29.40 ¡6.003.99 55.60 él 22,40 72.004.94 75.20 82 ¡4.80 ¡0.005,23 55.20 13 38.00 6.004,60 ~5.20 84 22.60 ¡2.004,13 55.20 80 32.00 ¡2.804.90 73.60 86 ¡¡.00 9.407,92 46.00 87 23.60 26.409,08 6¡.60 U ¡9.00 20.403.12 52.00 99 ¡9.60 29.406.25 66.40 90 31.20 22.405.76 60.00 91 23.60 ¡6.407.99 52.40 92 27.60 20.007,96 48.80 93 29.60 2¡.t07.39 27.20 94 2120 4~07.99 35.20 93 29.60 35.200.05 71.20 96 ¡3.20 15.607,61 45~6O 97 21.20 33.205.41 73,60 99 ¡4.93 11.606.65 49.40 99 24.00 27.606.61 50.40 ¡00 32.00 ¡7.60732 32.00 101 - 19.60 47.607.90 32.90 ¡02 20.00 47.209.01 58.80 103 22.00 ¡9.207.19 56.80 ¡04 ¡6.00 27.20I.0¡ 25.20 ¡05 13.60 2¡.206.01 52.90 ¡06 30.00 51207,94 35.20 107 31.60 33.207.72 59.20 ¡00 ¡3.60 27.207,99 4dM ¡09 23.60 35.609.07 38.80 líO ¡4.00 47.209.09 40.90 III 28,00 31.207.92 47.20 ¡¡2 31.60 21.207.37 75.20 ¡13 ¡3.60 11.207.73 69.60 ¡¡4 17.20 ¡3.201.79 57.60 lIS 21.20 2¡.207.96 74.80 lIb 7.20 18.007.95 38.90 ¡¡7 33.20 29507.99 26.90 ¡¡8 29.20 44.006.05 29.20 129 37.20 33.608.00 55.20 ¡20 27.20 ¡7.606.12 59.20 122 ¡9,20 21.609.20 39.20 ¡72 37.20 23.607.99 69.20 ¡23 ¡9.20 ¡1.609.09 45.20 24 27.20 27.607.91 68.80 125 17,65 13.609.07 68.80 ¡26 ¡6,00 05.209.15 60.80 ¡27 22.00 ¡7.208.24 ¿7.20 12.9 15,60 17.207.43 99.20 129 5.60 5.207.90 73.60 ¡30 ¡3.20 ¡3.207.75 39.60 251 25.20 35.208.11 41.60 ¡32 31.20 27.207.65 26.00 135 32.40 41.607.63 42.00 ¡34 29.40 29.607.97 39.80 135 10.60 9.607.33 37.80 ¡36 24.60 37.602.91 45.80 ¡51 32.60 21.604,44 2¡.90 ¡28 56.60 21.605.76 21.80 ¡39 52.60 22.604.26 53.60 ¡40 2t60 17.605,29 57.60 ¡4¡ 32.80 9.604.67 73.20 ¡42 7.20 ¡9.604.82 45.00 143 42.20 12.805.21 55.00 ¡44 34.20 ¡0.804.31 59.00 145 32.20 9.805.11 79.00 146 20.20 0.804.50 5550 ¡47 28.20 ¡6.804.57 72.80 ¡48 ¡6.40 ¡0.804.58 53.00 ¡49 54.20 22.803.95 61.00 ¡50 30.20 6.805.70 79.00 ¡SI ¡6.20 4.803.63 75.00 >12 18.20 ¿.805.49 91.00 ¡13 ¡4.20 4.805.25 67.00 ¡54 26.20 6.605.23 5t00 (55 26.20 14.805.80 49.00 ¡56 34.20 06.905.54 67.60 157 24.80 7.603.21 52.60 ¡58 34.60 23.605.09 5¡.60 159 36.80 9.604.16 45.80 ¡60 44.60 9.604.62 31.80 ¡Al 50.60 ¡7.605.06 45.60 ¡62 36.90 >17.604.92 6¡.60 165 28.90 9.607.12 55.60 ¡64 iLBO 21.60

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28.40

TABLA vii: Continuación)

7.89 51.60 165 30,40 ¡9.03 0.009.05 47.60 ¡66 30.80 21.60 33.50¡.04 79.60 167 8.40 22.00 7.805.05 52.60 268 24.46 22.03 19.609.19 51.60 ¡69 26.40 22.00 17.609.06 55.60 ¡70 22.40 22.06 59.20¡¡5 59.60 171 22.40 ¡8.66 16.908.27 59.60 272 24.40 26.00 25.409.07 55.65 ¡73 24.40 20.00 50.91)3. ¡6 55.60 ¡74 29,40 ¡9.00 ¡¡.809.20 6¡.60 175 20.40 ¡6.00 ¡9.608.10 53.20 ¡76 26.90 20.00 45.103.14 51.20 277 26,90 22.00 39.209.10 57.20 ¡70 22.80 20.00 47.069.50 53.20 ¡79 26,90 20.00 45,109.6¡ 5¡.20 190 20,90 29.00 31.40L2¡ 47.20 ¡91 28.80 24,06 25.509.24 49.20 ¡Rl 24.90 26.06 3.90Lii 52.20 203 22.80 26.03 25.709.15 49.20 154 20.90 30.00 3.107.94 45.20 165 20.40 54.40 12.507.82 53.20 186 22.40 24.40 21.607.95 51.00 197 10.60 30.40 ¡0.407.85 52.20 23 22.40 26.40 24.307.92 5¡.20 099 26.40 22.40 23.506.63 77.20 ¡90 ¡0.40 ¡2.40 0.007.05 39.20 ¡9¡ 24.80 36.06 24.607.77 35.20 192 30* 34.03 ¿LIC7.92 43.20 193 16,90 40.03 1.907.99 53,20 194 29.80 38.06 25.507.70 ¡9.00 ¡95 29,60 52.40 ¡7.607.76 40.40 ¡96 29.20 30,40 58,80LOS 48.40 29? - 22.20 30.40 31.407.68 54.40 ¡99 17.20 28.40 0.008.04 31.40 ¡99 29.20 32.40 39.209.04 42.40 200 29.20 25,40 45.109.11 60.40 201 19.20 20.40 2¡.609.06 60.40 202 ¡9.20 20.40 ¡9.609.17 50.40 203 ¡9.20 30.40 11.807.79 62.80 204 27.20 20.03 NAO7,95 65.06 205 11.00 24.00 62.407.66 57.00 206 17.00 26.06 74.907.99 6dM 207 11.20 20.06 31.208.09 79.03 208 7.00 14.00 0.037.98 63.06 209 19.03 18.03 5.507.90 61.00 210 15,00 24.00 47.907.77 77,06 2¡I 3.00 20.00 ¡2.507,66 49.00 2¡2 ¡7.00 54.00 5¡.208.11 67,03 215 12.00 22.00 06.607.93 49.00 214 27.06 24.06 43.707.98 50,9) 225 27.20 22.06 56.2<;7.99 50.90 216 ¡9.20 30.06 33.309.0¡ 54.80 217 21,20 24,00 22.907.97 79,00 228 2,00 20,03 0,608.06 31.06 219 39,00 30.00 54.107.96 33.06 220 37.00 50.06 25.009.03 53.00 VI 25.00 22.00 6.209.01 63.00 222 ¡7.00 20.00 16.609.03 33.00 225 37.00 30.00 45.907.91 33,00 224 39.00 26.0<; 35.407.49 36.06 225 37,60 26.4(1 25.007.50 52.20 226 42.40 26.40 45,907.65 74.90 227 ¡0,80 ¡4.40 ¡2.507.62 41.00 228 27.00 32.00 1.707.70 43.00 m 25.00 52.0<1 56.207.68 45.03 230 31.03 24.03 25.007.22 35.00 231 27.00 58.00 25.007.70 61.00 232 ¡5.00 24.00 54.007>71 63.00 233 17.06 20.06 19.707.71 69.06 254 15.00 16.06 ¡6.667,71 44.90 253 25.20 30.00 57.407,50 70.90 236 03.20 06>00 12.507.75 79.00 237 9.06 12.30 3.507.71 65.00 239 15.06 20.00 43>701.62 54.03 239 25.20 20.00 62,402.74 42.03 240 29.00 30.00 27.00L17 76.93 241 ¡0.00 13.20 22.909.15 52.90 242 26.00 21.20 27.002.94 80.90 243 9.00 ¡2,20 ¡4.609.12 44.36 244 36.06 ¡9.20 60.301.16 39.20 245 35.60 25.20 47.307.75 51.20 246 45.60 3>20 64.507.66 39,20 247 57.60 3.20 36.208.17 33,90 243 32.65 29.60 39.507.90 40.80 249 31.60 27.60 12.509.19 59.20 250 35.20 23.60 49.903.27 35.20 251 29.20 30.60 16.60

¡65 ¡.00066 1.00167 ¡(s)¡65 1.00¡69 ¡.03¡70 ¡.00272 2.03172 2.0<’¡73 ¡.06¡74 ¡.00075 ¡.06(76 2.03¡77 ¡.00170 ¡.00¡79 ¡.06¡36 1.06¡II ¡.061(2 1.00183 1.00¡84 1.06¡65 ¡.00196 ¡.06[57 ¡.0023 1.00¡69 ¡.06¡90 ¡.06¡91 ¡.03292 2.00293 1.06[94 [.00¡95 ¡.00¡96 1.06297 2.00199 2.00¡49 ¡.06206 [.0020¡ 0.00202 [.0021)3 ¡.00204 2.03205 ¡.00206 1.06207 ¡.00236 2.00209 1.00220 ¡.002¡¡ 4.00222 ¡.00213 2.03224 2.00245 ¡.00216 ¡.002¡7 ¡.00219 1.00219 2.00220 ¡.00221 4.00222 ¡.00223 2.00224 1.06~ ¡.00226 1.010227 1.00~ 1.00229 ¡.06230 ¡.06232 2.03232 loO233 ¡.00234 1.06235 ¡.06236 2.03237 1.06238 1.06239 ¡.06

240 ¡.03241 1.00242 [.06243 ¡.00244 2.06245 ¡.00246 ¡.06247 ¡.06248 ¡.00249 2.06250 ¡.06nl ¡.00

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6.006.006.066.006.006.06

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20.030.060.000.000.030.000,000.000.000.030,000.000.060.000.000.060.060.000.060.060.030.066.000.000.00

20.000.000.060.06

0.000.030.000.000.000.060.060.000.000.000.000.060.005.005,065.000.005.000.000.000.000.000.030.000.06

0.00(1.000.000.000.060.000.000.000.000.060.030,0643.060.060.000.00

620.060.000.000.065.030.060.06

0.060.06

0.000.000.000.060.060,00

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10.00 25.0050.00 ¡00.000.06 ¡30.00

25.00 ¡0.000.00 30.000.00 5.00

¡0.00 36.000.00 ¡50.030.00 10.06

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15.00 55.005.00 ¡35.000.00 65.03

¡5.66 ¿5.060.00 50.060.00 260.030.00 30,000.03 ¡5.000.00 20.000.06 390.00

15.00 230.060.06 40.060.00 ¡0.000.00 406.000.06 2(1.030.06 20,000.00 3.060.00 5.00

15.00 ¡0.000,00 40.000.00 40.000.00 55.000.00 550.060,06 70.00

15.00 0.060.00 ¡0.00

65,00 30.030.00 25.00

40.00 ¡25.060.06 5.000.00 0.060.03 26.0’)

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12~00 0.005.00 70.000.00 25.005.06 50(’)0.00 0.00

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50.00 50K1015.00 35.0)20.00 75.yI)

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15.00 55.000.00 40.000.00 420.060.00 20.06

40.00 0.000.06 60.000.00 70.00

20.00 00.0020.06 25dI045.00 0.000.06 ¡706.000.06 45.065.03 2OSO0.06 20.060.00 210.000.00 5.0<)

25.00 75,060.00 ¡30.06

45.00 50.065.00 55.06

55.03 200.0<)0.00 SOSO0.00 75.000.00 ¡0.03

2.002,002.00

2.002.002.002.062.00

2.0<12.0<;2.002.032.002.002.002.062.002.002.032.002.002.062.062.032.002.062.002.002.062.002.002.002.03

2.062.002.002.002.002.002.002.002.002.002.0132.002.002.00

2.062.00

2.002.002.00

2.002,002.062(10

2.002.002.002.002.002.002.002.062.002.002.002.062.002,. 002.602.002.062.032.002.032.002.002.002.002.002.002.002.000.062.002.06

u~ 300.000.00 [5.005.00 20.000.00 70.00

¡30.06 220.06165.00 75.00

0.06 35.000.00 25.000.00 ¡70.000.00 ¡5.006.00 Ok>0.00 20.000.00 106.000.00 0.000.00 125.000.00 ¡5.000.06 36.000.00 ¡5.00

35.03 220.000.00 35.000.00 45.000.00 35.000.00 240.000.00 20.000.06 5.000.00 55.000.00 0.060.00 ¡0.000.00 45.005.00 65.000.06 412.000.00 0.06

¿5.00 7dM0.00 35,000.06 0.000.00 295.000.06 80.000.06 0.000.00 20.000.00 25.030.06 ¿0.060.00 45.060.00 66.030.00 20.000.00 0.006.06 5.060.00 30.000.00 25.06

30.00 30.000.00 0.000.00 40.00

¡5.00 45.060.06 ¡60.005.03 ¡5.000.00 120.060.00 215.000.00 25.000,06 45.060.1)6 20.000.0<’ 0.06

45.00 55.000.00 45.030.00 5.005.00 [70.000.00 55.060.00 ¡5.060.00 SoSO

45.06 80.060.06 55.060.00 ¡00.060.00 ¡65.030.00 15.060.06 0.060.00 0.060.00 0.000.00 ¶85.030.06 00.000.00 20.060.03 0.000.00 0.000.00 ¡06.060.00 5.065.00 5.000.03 0.00

10.00 225.000.06 70.000.06 ¡05.06

2.002.002.002.002.002.002,062.002.002.062.002.032.062.062.062.062.062.002.032.002.00¡.062.002.002.002.002.002.002.002.062.062.062.061.002.062.002.002.002.002.032.062.002.002.002.062.002.06

2.00¡.002.002.002.062.062.032.002.002.062.002.002.002.002.032.062.002.062.031.002.002.062.002.002.06¡.002.002.062.06¡.002.002.062.002.002.002.002.032.062.03¡.06

TABLA VMI ContinUaCión)

tea” M~LY~ DES CORRESPB~¿O~4CES NULTIPLES *111*

C~CTER1STIQUES 0(1 FICHI~ : A~ .JESUSCMT1TP~ V~IAELES A CLASES

O¶E¡RE D0BSERVAT1f~S : 252 iO¶E>RE Df V~¡4KES 14

•4fi4* NO DES V~IABLES El NO~S ifl*t*

1. V~ / 2. S¡N 1 3, YIN ¡ 4, ITT ¡ 5. ¡SF/ 6. P~L/ 7. CPu E. NLM¡ 9. SFV¡I0, P$/

V~1Ak.E Ma de CI.ASSESCPUS

CL45Sf5Sto Ddfin¿tion LibeI¡É Ma. mndivídus

II ¡ V~flfOAflNOCO4.2 AíREn3

4 ALICANTE5 ~NCI2EL

6 Q*LYP

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9 mCABEO¡O MO>~STSS.¡1 ~NBREDE Imo

¡5 1 9~ SINTOMAS

2 ~24S NLERTAS3 CEPAS 1r~C5UE.4 PALTA Of VIGOR5 CL~OSIS6 ENTREF&JDO C~TO7 FASCI~¡O~JE FILOXERA

9 TOI.}ERSICIDAS

10 ~OEP~DEFOFÚCII $ELOIL~YNE12 ~EL.’ CL~OS¡S¡3 MOSAICO N~ILLO¡4 SIÑ.DIE.Y¡AIJS15 SIN. AQIJ.VIRJS

6 1 11>4 de Oc2 XIN de 1 a

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3>9 4ESA 55366 ¡1350 5BaO 5EE~ 54EEF 10

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003 II004 3005 3006 2

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5

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11>4

ITT

ISP

TABLA ~Ifl (Continuación)

ChI 6 ¡ CRí de Ca O2 Chi de la ~3 ChI de 5¡ a ¡004 ChI dc 101 a 2005 CR¡ de 202 ¿ 4006 Ch] dc 401 a 440

7 1 >01deOaO2 tEl de la 503 IEM de SI a lOO4 961 de ¡Ola 2005 11>4 dc 201 a 4006 90 de 401 a 10007 (EM de I0OI¡ 8050

LEV 2 1 PfiESENCIA2 A&SE>C1i~

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4 1 ME de ¡4.Ra 302 ME Y 30. 503 ME > 50a 7(14 ME Y 71)1 69.2

3 1 LIM de [í 02 LI~ Y lOa 403 LIII Y 40 a 67.2

4 1 ~ de .8e lO2 MC Y ¡Qa 203 Mt Y 20a 354 MC) 35a 52.4

5 ¡ CM de 01 02 cMde GaS3 CM Y 5. 204 CAP Y 20a 355 CM Y Z5a 66

>jíí 8>112 26

>113 6>114 II3>15 ¡98

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35

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*7 5

11¡ 64

¡12 187

PH

WC

e~ TOTAL DE CtASSES • 62

TABLA viii (ContinuacIón)

VALEIPS F~PRES ET ~¶CTELFSPROPREB

I>ERIIE TOIAL.E 4.857147

lere C~O*E ‘¿ALELES F~PRE5 <.¿r¡ances Sur les ares principaur)2e.e 00L~E O AI~JI1~ AL UERTIE TOTAL.E

<poi~rcentages erplíqués par les axes principauxí3e.e OOMNE Ca4TRIBUIION CIflJ¡IE A LINERTIE TOTALE

Cpa¡rcentages cutalés expíiqués par les ares principauxí

~ is~ mm0.30 6 6 1 ntft,..,.*,f*uu..,n**;*.,,,,*,I#fl-a*#,t*II,#,.*,

0.19 4 lO 1 ***4lt*a.*i*,fl,,**,,,,,,t****,0.17 3 ¡4 /

VECTELES PaOF’RES <c~fficien1s des axodalités des variables dM15 1 équatiwilinjaire des ares priricipaur)

MI -3.667 -1.264 -0,903 EE4 0.014 -0.822 -1.3VM2 0.754 0.203 -0. 244 EES 0.706 -0.091 —0.567M3 -4.791 ¡.500 4.910 Eh 0.581 -1.003 -1.355M4 —2.249 —2.361 —2.744 FF1 —0.660 2.844 —0.066MS 0890 -1.314 2.194 FF2 0.071 -0.315 0.003Mh —0.406 4.535 2.832 GOl 0.455 0.053 —0.051M7 0.011 -l .500 4.790 682 —1.121 —0.015 0.309ME —4.609 -2.418 2.531 683 —1.778 0.394 ¡.359MS -4.545 0.038 2.710 664 -2.288 -2.618 -4.404MB 0.926 -2.115 3.906 665 -0.313 5.235 3.032MB 0.208 —1.206 ¡3.434 686 —1.938 -1.177 3.236631 —0,910 —0.394 -0.532 lIHI 0.129 0.735 -¡.440832 —0,043 0.597 -0.479 l~I2 0.006 0.270 —0.163863 —4.355 -0.766 -1055 Hl 0.~$l —0.444 0.486684 1.866 -2.729 0.437 FF4 0.165 —0.639 1.033685 0.719 —¡454 —0.823 Hl-lS —0.787 —0.476 —0,779686 1.077 0.343 -1.015 6*46 —3.189 0.225 —0.084667 0.776 0.036 7.771 6*47 -0.600 —1.964 4.91966<8 1.065 -0.723 1.100 III -0.050 0.871 2.406339 -2.049 0.9~ 1.076 112 0.015 -0.298 -0.824SEA 0.461 0.039 —1.790 131 —3,152 —2.748 —2.216636 —0.025 5.221 0,073 .132 —3,840 -0.740 —0,3718K 0.336 3.021 -0.583 133 —2,526 -1.881 0.497360 <.391 0.869 3.731 .114 —1.874 1.956 1,471EBE —1.247 —0.975 1.420 JiS 0.836 0.176 0.036BEY 0.132 —0.777 ¡.723 KKI 0.828 -2.465 2h41CCI 0.012 -0.292 -0.241 KX2 0.212 -0.729 0.533002 ¡.026 1,504 0.300 «3 -0.341 -0.250 -1,105003 -0.146 2.858 2.264 ~X4 -1.408 3.938 0.714004 —0.515 —1.082 9.437 LLI -0.401 6.126 0.179005 -2.105 3.523 —0.346 LL2 0.079 -0.323 0.010006 —2.410 4.637 —í.o~ LL3 -1.042 —1.091 —0.392GOl —0.122 -0.076 0.341 pgií —3.289 —0.025 0,793002 0.521 —0. l0~ -0,082 ?tt2 -0.459 1.395 -1.043003 0.535 0.436 —1,411 1fl3 0.965 -0.627 -0,254004 0.618 0.071 -1.205 M4 1,067 -1.7V 3.012005 -¡.022 —1.111 -1.404 6141 —3.306 <.606 -0.4~006 0.504 2.250 -¡.374 6042 0.446 3.066 0.72?El -1.299 0.399 1.437 M43 0.556 1.467 <.172EU -0.023 0.003 1.392 6044 0.697 -0.372 0.522£63 0.104 0.642 0.141 FF5 0.979 -0.673 -0.079

TABLA VIII (Continuación)

£JWE res V~1A~LES

¡re CCW*E :2e C&Ct*~ CO~HLJS 0~RE (@JALITE DE LA REP~SEt4TATI~4)Se C0L~’NE C4T~1~JT1ú’J RaATIYE A LI~UTlE EIPtIQIE PAR LAXE

AJES PaltclPAaz

AlE 1 AlE 2 AlE 3

VARIAKES PRISZS Efl caeii 0A45 LW4PJ.YSE

Ml “-2.014 0.657M2 4’ 0.414 0.612MS it -2.631 0.064M4 ti -1.235 0.006MS “ 0.489 0.002MÓ e’ —0.224 0.000M7 4’ 0.006 0.000ME ti —2.53! 0.026MV ti —2.496 0.025~ 4’ 0.509 0,005MD ti 0.114 0.000

*4

RBI it -0.503 0.018¡92 II —0.023 0.000883 41—2.391 0.140894 ‘e 1.026 0.0062~ 4’ 0.395 0.00?666 ti 0,591 0.112227 ti 0.426 0.001828 ‘E 0.595 0.030289 1* -1,125 0.021BM 1’ 0.253 0.010828 4’ —0.014 0.000250 “ 0.184 0.001DE! it -0.215 0.00!SSE it -0.685 0.129fl~ u 0.072 0.000

‘4

CCL 4’ 0.006 0.000002 1’ 0.564 0.015003 ti -0.001 0.000004 41 —0.283 0.001CtS “ —1.156 0.016006 It —1.323 0.014

it

DII It —0.073 0.017002 .4 0.286 0.004003 4’ 0.294 0,011004 “ 0.340 0,005DOS ti —0.56! 0.006006 “ 0.277 0,002

it

El ti -0.708 0,095¡¡2 II —0.013 0.000¡¡3 mi 0.057 0.001E4 *1 0.008 0,000¡¡5 it 0.388 0.025¡¡6 it 0.319 0.014

ti

13.4’ -0.59! 0.0573.2’ 0.13! 0.0612.0’ 0,650 0.0050.!’ —1.022 0.0040.0’ -0.569 0.0030.0’ 1.964 0.0310.0’ -0.650 0.0070.6’ -1.047 0.0040.6’ 0.016 0.0000.14-0.916 0,0!?0.0’ -0.523 0.001

20.0’

1.9’ -0.371 0.0220.3’ —0,100 0.0360.2’ 2.015 0.0490.2. -1.126 0.0050.!’ 0.900 0.0071.2’ 1.162 0.0110.3’ 1.966 0.0630.2’ 1.039 0.0040.0* 1.112 0.0050.6’ 1.603 0,0520.0* 5.514 0.122

s.l *

0.4’ -0.!?! 0.002 0.1’ -0.218 0.0030.0’ 0.259 0.002 0.!’ —0.196 0.0013.2’ -0.332 0.003 0.1’ -0.450 0.0050.2’ —1.182 0.011 0.4’ 0.179 0.0000.2’ -0.630 0.018 0.7’ —0.340 0.0052.0’ 0.146 0.007 0.2’ —0.4!? 0.0560.0* 0.016 0.000 0.0’ 3.190 0.0820.6’ —0.325 0.009 0.3’ 0.45! 0,0180.5’ 0.404 0.003 0.!’ 0.442 0.0030.2’ 0.017 0.000 0.0’ -0.735 0.0670.0’ 2.261 0.234 8.5’ 0.030 0.0000.0’ 1.308 0.035 1.3’ -0.239 0.00!0,0’ 0.376 0.003 0.1’ 1.531 0,0482.4’ —0,422 0,049 [.5’ 0.583 0.0930.0> —0.536 0.005 0.2’ 0.70? 0.021

9,8 ‘ ¡3.5 1

0.0’ -3.127 0.116 0.5* -0,099 0.0720,31 0.651 0.019 0.?’ 0.123 0.00í0.0’ 1.238 0.010 2.6’ 0.929 0.0400,0* —0.468 0.005 0.!’ 3.673 0.1810.4’ ¡.526 0.029 1.1* -0.143 0.0000.3’ 2.008 0.032 1.2’ —0.445 0.002

1.1 ‘ 6.2’0.1’ —0.034 0.004 0.0’ 0.140 0.0620.1’ <.045 0.000 0.0’ -0.034 0.0000.2’ 0.189 0.004 0.2’ —0.579 0.0420.1’ 0.031 0.000 0.0’ -0.495 0.0100.1’ —0.481 0.005 0.2’ —0.576 0.0070.0’ 0.9?4 0.025 0.6’ -0.564 0.005

0.7’ 0.9’1.9’ 0.173 0.006 0.2’ 0,590 0.0660,0’ 0.001 0.000 0,0’ 0.57! 0.0460.04 0.278 0.034 0,9’ 0.058 0.0010.0’ —0.356 0.022 0.7’ —0.543 0.0510.5’ -0.039 0.000 0.0’ -0.233 0.0090.3’ —0.434 0.027 0.9’ —0.556 0.044

2.71 2.7’

0.8*0.3’2,1’0.2’0.3’0.5’2.6’0.240.2’2.2’5,1’

14.50.1’0.!’0.2’0.0’0.2’1.8’3.4’0.7’0.1’3.240.0’0.0’2,0’3, 1’0,8’

5.80.4*0.0’1.6’1.6’0.0’0.1’

9.7 *

0.6’0,0*1 • 6’0,4’0.3’0.2’

3.1 ‘

2.4’‘.7’0,0*2.8’0,3’1.6’

7,9 ‘


AlES F~1HDIPAJJí

AlE 1 AlE 2

FF1 *5 —0.365 0.015FF2 II 0.039 0.014

‘4

~l 4’ 0.250~2 “-0.616883 it -0.976854 E’ -1.256685 í* —0.172586 4’ —1.064

.4

H4I 1* 0.071nC mi 0.0031013 II 0.440H44 4’ 0.095I*c “-0,432H16 ‘4-1.7511017 “-0.330

4’

III •i —0.027 0.000122 1t 0.006 0.000

ti

Ji! ‘a -1,731112 it —2.1061.13 4’ -1367i14 U —¡.025115 4’ 0.419

4’

~I 4’ 0.454~X2 E’ 0.446>02 •*-0.187KXA II —0.773

‘1

LII 4’ —6.220LII it 0.043LL3 “ —0,572

4*

>911 “-1.806itM2 “-0,252>913 it 0.530>914 ti 0.566

4’

Mil *‘ —¡.617t’NZ *4 0.245>OD U 0.3051914 it 0.493WC 44 0.536

It

0.5’ 2.232 0.2680,04 -0.136 0.168

0.3 t

0.162 1.!’ 0.023 0.0020.085 ¡.6’ —0.006 0,0600.035 0.6’ 0.171 0.00!0.059 0.9’ —1.154 0.0320.000 0.0’ 2.26? 0.02!0.009 0.2’ —0.510 0,002

4,7 i

0.001 0.0* 0.318 0.0150.000 0.0’ 0.117 0.0120.039 0.6’ —0.192 0.0070.001 0.0* -0.277 0.0110.013 0.3* —0.207 0.0030.114 2.6* 0.097 0.0000.002 0.!’ -0.85! 0.015

3.? i

0.0’ 0.377 0.0490.0’ -0.125 0.049

0.0 i

0.09? 2.3’ -¡.270 0.0470.514 10.9’ -0.321 0.0120.063 1.5* -0.614 0.0220.049 1.!i 0,647 0.0330.767 3.9. 0.076 0.022

[9.? *

0,017 0.4’ -1.085 0.0950.105 ¡.6’ —0.326 0.0530.027 0.4’ -0.109 0.0090.057 2.0’ ¡.705 0.471

4.3 i

0.003 0.!’ 2.653 0.4160.016 0.0’ -0.140 0.1690.018 0.4’ —0.472 0,011

0.5 *

0.428 8.9’ —0.011 0.0000.033 0.5’ 0.604 0,1900.202 ‘2.8’ —0.27! 0,0530.046 LOt -6.746 6,078

¡3.2 4

0.800 15.3’ -6.349 0,0300,004 0.2’ 1.328 0,1040.029 0.5’ 0.655 0.1210,060 1,1’ —0.161 0.0060.135 2.2’ -0.379 0.06?

19.2’

5.9’ -0.029 0.0000.6’ 0.003 0.000

6.40.0’ <.02! 0.0010.0’ 0.127 0.0040.0’ 0.556 0.012¡.2’ —2.909 0.0600.8’ 1.244 0.0060.!’ ¡.328 0.014

2, 10.5’ -0.59! 0,05!0.24 -6.067 0.0040.2* 0.199 0.0060,4’ 0.424 0.028OIt —0.320 0.0070.0’ -0.035 0.0000.5’ 2.019 0.083

2.0 *

1.4’ 0.966 0.3340.5* —6.356 0.334¡.9’1.7* —0.920 0.0270.4t-0.152 0.0030.8’ 0.204 0.001¡.2’ 0.604 0.0170.2’ 0.015 0.001

4.3 *

3.3’ 2.004 0.096¡.3’ 0.219 0.0250.2’ —0.453 0.16015.41 0.293 0.014

20,2’¡4.9’ 0.073 0.0000.7’ 0.004 0.0600,4’ —0.161 0.001

¡6.0 4

0.0’ 0.325 0.0144.6’ —0.429 0.0951.2’ —0.104 0.0062.6’ 1.236 0.215

8.6 ‘

0,9’ —0.16? 0.0075.7* 0.279 0.0053.6. —6.071 0.0020.2’ 0.214 0.011[.7’ —6.035 0.000

10.1

AlE 5

0.0’0.0*

0.0 ‘

0.0’0.1’0.5’3,340.3’0.6*

4.6 *

¡.9’0.I’0.3’¡.0*0.3’0.0’3.4’

6.9 *

10.6’3.6’

14,2 u1.110,140.1*0.740.04

2.0 ‘

3.8’0.7’3.8’0.54

E.U0.0’0.0’0.l’

0. 2 1

O. Si2,7*0.2’8,0*

11.40,2’0.2*0.0’0.4’0.0’

0.9 U


ET1~E DES INOIYIDUS

ire CO.0~E: Ct~WWE2* WLOr01E COSIMJS C~E (@JALITE 06 LA REPNESENTAT1~4)Se COL04NE C~TR1&JT104 ~1,AT1YEA LIIERTIE EXPLIQLE P~ LAXE

MES P~1Ñc2p~uz

AlE 1 AlE 2 AlE 3

¡NO!V1005 pais EN C~~TE D~4S £ N4.4ÚSE

.1 u 0.255 0.006 0.!’ -0.26! 0.006 0.1’ 0.562 0.032 0.8*

.2 ** 0,239 0,017 0.1* —0.054 0.001 0.0* -0.146 0.006 0.1’

.3 4. 0.290 0.624 0.1’ —9.256 0.018 0.1’ 0.392 0.04,3 0.4*

.4 4’ —0.040 0.000 0.0’ 0,466 6.054 0.5’ —0.029 0.000 0.0’

.5 4’ 0.052 0.006 0,0’ 1,625 0.476 5.6’ -0.311 0.017 0.2*

.6 •‘ —0.025 0.000 0.0’ 1.555 0.526 5.1* —6.094 0.002 0.0’

.2 u 0.127 0.003 0.0* 0.461 0.039 0.5’ —0.144 0.004 0.0’

.6 *‘ —0.841 0.003 0.0* 0.108 0.077 1.1’ —0.142 0.003 0.0’.9 *‘ 0.12! 0.003 0.0’ 0.~7 0.171 ¡.6’ -0.223 0.012 0.!’

.10 it 0.304 0.039 0.1’ —0.309 0.005 0.0’ —0.172 0.012 0.!’.11 4, 0.119 0.006 0.0’ 0.537 0.056 0,6’ —0.209 0.009 0,1’.12 ‘u 0,057 0.00¿ 0.Oi 0.276 0.027 0.2’ —0.567 0.053 0.4’.13 4’ 0,27! 0,030 0.1’ 0.141 0.003 0.0’ -0.525 0.039 0.7’.14 ** 0.393 0.057 0.2’ -0.322 0.038 0.2* -0.177 0.012 0.1’

15 te 0.176 0.015 0.0’ 0.069 0.002 0.0* —0.071 0.003 0.0’.16 it 0.369 0.023 0.24 —0.223 0.007 0.1’ 0.250 0.009 0.1’.17 u 0.366 0.068 0.2’ 0.004 0,000 0.0’ 0.356 0.051 0.3*.18 44 0.182 0.012 0.0* —0.109 0,004 0.0’ —0.047 0.001 0.0’.19 u 0.411 0.030 0.2’ 0.859 0.004 0.14 —0,121 0.003 0.0’20 ** 0.334 0.054 0.1’ —0.129 0.008 0.0’ 0.225 0.024 0.1’

.2! it 0.465 0,104 0.5’ —<‘.319 0.045 0.2’ 0.057 0.001 0.04.22 el 0,441 0.056 0.5* —0.514 0.076 0.6’ 0.561 0.097 0.6’.23 u 0.484 0.051 0.3’ -0.250 0.012 0.1’ 0.632 0.087 0.9’.24 u 0,475 0.100 0.34 -0.321 0.046 0.2’ 0.007 0.000 0.0’.25 u 0.418 0.088 0.2’ —0.270 0.037 0.2’ —0.039 0.001 0.0’.26 ti 0.872 0.016 0.0’ —0.056 0.002 0.0’ —0.304 0.050 0.2*

.27 *. 0.333 0.040 0.2’ -0.326 0.035 0.2* —0.172 0.010 0.!’

.2? it 0.061 0.000 0.0’ —0.229 0.002 0.!’ 2.263 0.200 12.2’29 4’ —0.229 0.014 0.1* —0.244 0.016 0.!’ —0.120 0.004 0.0*

.30 *4 0.119 0.003 0.0* —0135 0.003 0,04 —0.351 0.024 0.3’

.31 u —0.141 0.001 0.0’ ¡.23! 0.098 3.2’ 0,099 0.00! 0.0*

.32 e’ 0.062 0,00! 0.0* —0.132 0.004 0.0’ —0.359 0.027 0.3’

.33 4* 0,091 0.Xí 0.0’ 0.262 0,007 0.2’ -0.253 0.006 0.2’

.34 “ 0.227 0.012 044 0,192 0,009 0.8* —0.594 0.062 0.8’.35 u 0.457 0.049 0.3’ —0,540 0.069 0.6’ 0.070 0.00! 0.0’36 u 0,578 0.029 0.4’ —0.627 0,034 0.6’ 0.127 0.001 0.0’

.37 4’ 0.500 0.056 0.3’ -0.388 0.034 0.3’ 0.324 0.023 0,2*

.38 u 0.361 0.019 0.2’ —0.572 0.046 0.7’ 0.444 0.026 0,5*39 *4 0.325 0.016 0.1* —0.630 0.061 0.8’ 0.941 0.136 2.1’

.40 t* 0.32! 0.021 0.2’ —0.727 0.062 1.14 0.708 0.078 1.2’

.4! *4 0.314 0.016 0.1’ —0.676 0.074 ¡.0’ 0.66! 0,071 1.0’.42 it —0.11! 0.002 0.0’ —0.386 0.020 0.3’ 0.232 0.007 0.1*.43 it -0.072 0.0(Y) 0.0’ -0.226 0.004 0.1’ 0.850 0.065 ¿.7’.44 u 0.064 0.000 0.0’ —0.441 0.021 0.4* 1.091 0.129 2.8’.45 *~ 0.125 0,00! 0.0* -0.062 0.000 0.0’ 1.055 0.076 2.6*.46 4. 0.015 0.0)0 0.0’ 0.614 0,057 0.8’ 0.554 0.043 0.7*.47 ti 0.2)6 0.007 0.1’ -0,232 0.005 0.1’ 0.157 0.002 0.1’.48 4’ 0.219 0.018 0.1’ —0.067 0.002 0.0’ 0.172 0.011 0.1’.49 ** 0.260 0.056 0.1’ -0.156 0.025 0,0’ 0.276 0.065 0.2’.50 it —0.235 0.014 0.1’ 0.957 0.226 1.9’ 0.14! 0.005 0.0’.5! *4 0.131 0.005 0.0* 0.723 0.139 ¡.1’ —0.064 0.00! 0.0*.52 *4 —0.031 0.000 0.0’ 0.993 0.181 2.1’ 0.224 0.009 0.1’.53 4’ -0.051 0.000 0.0’ ¡.053 0.143 2.3’ 0.188 0.005 0.1’.54 ‘u —0.1)4 0.009 0.0’ 0.045 0.001 0.0’ 0.061 0.002 0.0*.55 4’ 0.299 0.010 0.1* 0.020 0.000 0.0’ 0.860 0.086 1.7’.56 ** 0.229 0.013 0.1* 0.068 0.00! 0.0’ 0.856 0.863 [.7*.57 4’ 0.236 0.005 0.1* —0.200 0.004 0.1* 0.494 0.02! 0.6*.58 st 0.246 0.020 0.1’ -0.126 0,005 0.0’ 0.323 0.035 0.2*.59 u~ 0.3!? 0.023 0.1’ 0.27> 0.017 0.2’ 0.470 0.652 0.5*


.60 *4 0.30! 0.034

.6! tt 0.420 0.055

.62 “ 0.34! 0.007

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.66 “ —0.062 0.002.67 44 0.351 0.070.68 *4 0.216 0.019.69 it 0.366 0.049.70 it 0.252 0.081.7! 4* —0.094 0.062.72 ti —8.665 0.175.73 ti —1.408 0.078.74 4’ —1.263 0.152.75 *4 —1.245 0.225.76 ti —¡.469 0.890.77 4* —8.335 0.119.78 “-0.675 0.062.79 t’ —1.076 0.272.60 it -0.825 0.251.88 it —0.680 0.018.82 ‘t —1.372 0,089.83 4* —1,392 0,086.84 *1 —0,937 0,132.65 ti —0.930 0.209.86 it —0.626 0.165.87 u 0.406 0,060.88 4* 0.211 0,012.89 it 0.332 0,039.90 4* —0.295 0.016.92 4* —0.350 0,033

.92 4* 0.166 0.006

.95 1* 0.208 0.004

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.95 Ci 0.329 0.063

.96 4* —0.081 0.002,97 it 0.316 0.025.98 *4 —0.523 0.105.99 4* -0310 0.026

.100 *4 —0.494 0.067.10> it 0.867 0.007.102 *4 0.251 0.012403 “-0.035 0.000.104 4’ 0.068 0.00!.105 *4 0.294 0.017.106 ‘4 0349 0.033.807 4’ 0.306 0.043.108 it 0.217 0.020.109 *t 0.301 0.032

¡lO 4* 0.338 0.051.111 *4 0.437 0.110.112 *4 6.544 0.030.813 *‘ —0.452 0.012.114 II 0.066 0.008.115 It 0.207 0.013.116 ti 0.075 0.00!.117 it 0.272 0.046.116 II 0.104 0.002.189 ‘4 0.483 0.084.120 Ci 0.293 0.030.121 ** 0.111 0.005422 ‘4 0.299 0.065.123 4* 0.142 0.004.824 it 0.326 0.053.125 ** 0.255 0.033.126 ti 0.125 0.005.127 *4 0.039 0.001.829 it —0.131 0.088129 it —6.612 0.077

0.1’ —0.102 0.0040.2* 0.103 0.0030.2’ 0,09? 0.0080.1’ —0.110 0.0060.1’ 0,147 0.0040.!’ 0.372 0.0220.0’ 0.360 0.0580.2’ —0,044 0.0010.1’ -0.099 0,0040.2* -0.192 0.0130.1* —0.126 0.0030.0’ 0.557 0.0603.7’ 0.40! 0.0102.64 —0.241 0.0022.1’ 0,679 0.0442.04 —0.262 0.0¡02.9’ 0,184 0.0032.4’ 0.163 0.0021.0’ -0.479 0.019[.5* <.325 0.0250.9’ —0.376 0.0520.6’ -0.443 0.0082.5’ 0.0’34 0.0002.64 —0.455 0.0091.24 -0.550 0.046¡.1’ —0.297 0.0210.9’ 0.098 0.0030.2* —0.257 0.0240.8* 0,869 0.0100.14-0.196 0.0120.1’ —0.266 0.0130.2* -0.215 0.0>20.0* 0.172 0.0060.>’ 0.706 0.0410.2’ —0.384 0.0300.1’ —0.348 0.0710.0’ 0.659 0.03>04* 0.023 0.0000.4* 0.225 0.0190.1* -0.065 0.0010.3* 0.116 0.0040.0* 0.041 0.0000.1’ —0.402 0.0310.0’ 0.053 0.00>0,0* 0.068 0.0020.1* ~-0.1640.0060.2’ —0,455 0.0510.14—0.252 0.0280.1’ —0,070 0.0020.1* -0.425 0.0640.2* —0.297 0.0400.3’-0.302 0.0530.4’ —0.395 00>60.3’ 0.993 0.0590.0’ 0,39! 0.022Oh 0.603 0.1120.0’ 1.062 0.1940.8’ —0.208 0.025(*0’ —0.546 0.0470.3* —(‘.293 0.0380.8* -0.025 0.0000.0e-0.156 0.0090.1* -0.336 0.0620.0* 0.471 0.0450.1’ —0.135 0.0090,8* 0.010 0.0000,0* 0.661 0.1300.0* —0.109 0.0060.0* —0.063 0,0030.9. 1.709 0.342

0.0’ 0.269 0.0320.0* -0,063 0.00!0,0’ [.564 0.1420.0* -0.302 0.0430.0’ 0.364 0.0280.3. 0.543 0.0470.34 0.863 0.0110.0’ 0.019 0.0000.0’ 0.294 0.0340.14 0.128 0.0060.0’ 0.336 0,0190.7* 0.2k3 0.0130.3’ [.043 0.0690.1* 0.614 0.015I.Oe 0.83! 0.0660.!’ —0.365 0.0190.14 0.266 0.0060.1* -0.329 0.0070.5’ 0.944 0.0720.2. 0.018 0.0000.3’ -0.286 0.0300.4’ —0.459 0.0080.04 0.456 0.0100.4’ 0.427 0.0080.6* —0.804 0.0970.2* —0.036 0.0000.0’ 0.848 0.0060.1* 0.016 0.0000.14 -6.170 0.0060.1* 0.039 0.0080.2’ 0.012 0.0000.14 -0.453 0.0550.1* 0.478 0.0461.1* 0.255 0.0050.3’ 0.511 0.0530.3’ 0.525 0.0620.9’ -0.060 0.0000.0* 0.103 0.0020.1* —0.191 0.0140.0* 0.077 0.0020.0* —0.096 0.0030.0* 0.899 0.0100.2* 0.505 0.0480.0’ -0.074 0.0020.0’ —0.042 0.0010.1’ 0.271 0.0>50.4’ 0.279 0.0210.14 0.137 0.0080.0’ 0.010 0.0000.4’ 0.120 0.0050.2e 0.346 0.0550.2’ -0.242 0.0340.5’ 0.028 0.0002.1’ 0.702 0.0290.3’ —0.821 0.0020.8’ 0.100 0.0032.4’ —0.018 0.0000.8’ 0.3k1 0.0810.6’ 1.138 0.2010.2’ 0.450 0.0730.0* —0.161 0.0110.1’ -0.033 0.0000.2* —0.062 0.0050.5’ -0.277 0.0860.0* 0.346 0.0600.0’ -0,242 0.0290.9* —0.32> 0.03!0.0’ 0.08! 0.0000.0* —0,010 0.0006.2’ 0.625 0.046

0.240.045.6’0.2’0.3’0.7*0. le0.0~0.2’0.0*0.3’0.2i2.6’0.9’1.6’0,3’0.2’0.3’2.1*0,0*0.2*0,5’0.5*0.4’¡.5*0,0’0,1*0.0’0,1’0.0*0.0’0.5*0.5’0.2’0,6*0.2’0.0’0.0’0.1 *

0.0*0,0’0.2’0.6’0.0*0.0’0.2*0.2*0.0’0.0’0.0*0.3’0.1*0.0’1,0.040,0*0,0’0.3’3.8*0.5*0, 1*0.0*6.0*0.2.0.3’0.140.2’0.0’0.040.9*

TABLA VIII <Contfnuacfón)

.130

.131

.132

.133

.134835

.136.137.138.139.140.14!.142.143.144145

.146.847.148• 149¡50‘SI

• 152153¡54155

.156• 157

I58• 159

¿60161¡62163

.164165

.166• 167.168.169.170

171.172

173.174• 175.176

177.876

179.180• ¡81.182• 183

284

.186• 167.188

189.890

¡9!.892• 193.194

195.196

197

** —0.093*4 0.322U 0.306it 0.152‘4 0.462“-0.200it —0.135.1* 0.427*4 —0.734i< —0.83~*‘ —0.948‘~t -1.2354’ -1.001i’ -1.307i* -0.955‘4 —1.1914’ —1,253*4 —1.028Ef —1.392‘4 —1.265‘* -1.850*‘ -1.338u —1.262‘4 -1.3184’ —1681e* -1.162

** —0.930‘4 -1.2514* —1.018

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4* 0.342‘4 0.357it 0.294it 0.252e’ 0.376u 0.292‘4 —0.316u 0.4754’ 0.420u 0.400“ 0.367ti 0.400it 0.487*4 0.386

0.0000.0290.0240.0080.0820.0170.0040.0440.0670.0980.2050,3600.1820.2580.2530.1740.4970,8540.3970.2200.2760.2210.1620.4480.2110.2380.0820.4040.3010.4930.1300. 1990.3250.3800.0070.0110.0860,0000.0520.0010,0090.016aoo0.0270.0260.0 190.0060.0640.0380.0210.0750. 1030.0470.0070.0470.0960.0500.0250.0590,0~0.0290. 0990.0690.065.0.0550.0620. 1220.029

0.0* 0,9610.1< -0.3160.1< —0.1540.Oí —0.4720.3’ —0.3040.Ie —0.0360.0’ —0.0230.2’ —0.1450.7. —0.6260.9’ -0.73<>1.2’ —0.4142.0’ -0.289¡.3’ 0.4182.3* -0.3161.2’ -0.1501.9* -0.5812.1’ —0.0401.4e —0.6592.6’ 0.0542.1’ -0.5321.7’ -0.5152.4’ -0.1422.14 —0.2392.3> 0.1983.7’ 0,0681.8e —0.173¡.1* —0.5122.14 —0.1461.4* 0,0218.8’ -0.339¡.2’ —0.5971.04 —0.4141.14 —0.2591.5’ -0,2980.0’ —0.0760.0’ -0.1210.2’ —0.2150.0’ ¡.2160.2’ —0.0380.0’ -0.3070,1’ —0.3170.0* 0.0950.0’ 0.0190.1’ —0.1010.14 0.0820.0’ 0.2320.0’ —0.8590.1* -04770.1* 0.0500.1’ -0.1520.2i —0.1290.3’ -0.1260.2’ 0.0300.0’ -0.1210.2’ 0.0300.2* 0.0210.1’ 0.0070.!’ -0.1160.2’ —0.0740.14 -0.18!0.!’ 0.4120.3< -0.2520.2’ 0.1000.2’ 0.0760.2’ —0.2690.2* -0.2060.3’ —0.0550.1’ -0.220

0.0450.0290.0060.0790,0360.0000.0*0.0050.0490,0750.0390.0200.0320.0850.0060.0480.0010.0630.00!0.0390.0560.0020.0060.0100.0010.0050.0250.0060.0000.04!0.0500.0440.0270.0280.0020.0060.0290.2850.0000.0170.02 ¡0.0060.0000.0040.0040.0320.0050.0200.0010.0070.0880.0070.0000.0050.0000.0000.0000.0050.0020.0210,0460.0290.0040.0020.0300.0160.0020.014

2. 0’ 0.5090.2’ 0.4820.1’ 0.2840.54 0.5440.24 —0.0690.04 0.2750.0. 0.6760.0’ 0.0030.6’ —0.1061.!’ 0,1780.4’ —0.2450.2. 0.2130.4’ —0.3590.2* -0.2010.0* —0.4330.7’ -0.7700,0’ 0.1260.9’ —0.7750.0< 0.0260.6* -0.6400.64 —0.1140.0* -0.1280.1’ 0.5590.!’ 0.0540.04 —0.2180.8* -0.5070.6* —0.3880.0* 0.0130.0’ —0.2320.2* —0.0040.8’ —0.4780.4’ —0.2440.1’ —0.0650.2< -0.1880.0’ —0.2650.0’ -0.5290.1’ —0.2463.1* -0.1450.0. —0.4220.2* -0.7100.2’ —0.6910.0* -0.4690.0’ -0.2200,0* -0.5020,04 —0.471*3.1* -0.4550.1* —0.5890.!’ -0.2160.04 —0.6240.0* -0.4090.04 —0,3090.0* —0.3170.0’ —0.2310.0* -0.4330.0* ‘-0.23!0.0* —0.1910.0* -0.0270.0’ -0.4590.04 -0.2590.2’ -0.3630.4* —04020.8< -0.05!0.0* 0.0560.0’ 0.8620.2< 0.3090.1’ 0.3380,0< -0.3450.1’ —0.043

0.0>20.0660.0210.1050.0020.0230.0940.0000.0010.0040.0 140.0110.0230.0060.0520.0730.0050.0870.0000.0560.0030.0020.0320.0010.0040.0450.0 100.0000.0160.0000.0320.0150.0030.0 120.0 190.1 090.0 380.0040.05 10.1090.0960.1430.0140.1050.1360. 1220.0690.0300. 1610.0520.0610.0470.0210.0660.0210.0280.0080.0820.0290.0950.0030.00>0.0080.01100390.0440.06 10.00!

0.6>0.540.2’0.7*0.0*0.2’¡.1’0.0*0.0’0.1’0. It0.1’0.3’0.140.4’1.4’0.0*1.4’0.0’1.0*0.0*0.0*0.7*0.0’0.1*0.6’0.2’0.0*0. 1*0.0*0.5*0.1*0.0’0.!’0.2*0.7’0,1*0.0’0.441.4*1.1*0.540. 1 *

0.6’0.5.’0.5’0.8’0.! *

0.9’0.4’0.240.2*0.1’0.4*0.1*0.1’0.040.5*0.2’0.3*0,0*0.0<0.0*0.8*0.2’0.3*0.3.0.0*


.198 u’ 0.031 0.008• 199 it 0.483 0.840.200 •‘ 0.477 0.130.201 1* 0.443 0.121.202 4* 0.275 0.034.203 ** 0.318 0.099.204 *‘ 0.196 0.008.205 4’ 0.405 0.134.206 it 0.436 0.064.2<j7 4. 0.289 0.048.208 sí -0.002 0~00.209 *4 0.253 0.027.210 it 0.469 0.072.211 *4 0.225. 0.009.212 it 0.425 0.160.283 st 0.317 0.030.214 it 0.38k 0.025.215. 1* 0.438 0.077.216 *4 0.230 0.038.217 4* 0.395. 0.05!.218 ‘e —0.114 0.003.219 sí 0.484 0.807.220 4’ 0.402 0.067.221 4* 0.366 0.045.222 *4 0.256 0.036.223 ‘4 0.522 0.151.224 u 0.474 0.129.225 ‘4 0.219 0,014.226 u’ 0.148 0.005.227 st 0.185 0.020.228 it 0.383 0.041.229 *4 0.461 0.153.230 te 0.459 0.143.238 4’ 0.426 0.106.232 4’ 0.247 0.088.233 *4 0.316 0.062.234 it 0.386 0.062.235 it 0.490 0.124.236 .‘ 0.185 0.088.237 ci —0.116 0.001.238 ti 0.290 0.048.239 it 0.249 0.038.240 e’ 0.479 0.076.241 *1 0,196 0.009.242 *4 0.377 0.099.245 *4 0.101 0.003.244 4’ 0.429 0.082.245 te 0.522 0.869.246 ** 0.012 0.000,247 it 0,024 0.000.248 it 0,419 0.034.249 4’ 0.173 0.009.250 4* 0.538 0.184.25! tí 0.406 0.100

0.0’ —0.107 0.0070,3* —0.844 0,0120.3’ —0.307 0.0540.3* —0.858 0,0150,1* 0.829 0.0080.1* 0.076 0.0060,14 0.095 0.0020.2* —0,142 0.0160.3’ —0,199 0.0130.1* -0.007 0.0000.0’ 1.077 0.3050.3* 0.466 0.0680.3’ 0.074 0.0020.15 1.107 0.2250.2’ —0.089 0.0070.1’ 0.231 0.0160.2’ 0.057 0.0010.3-0.145 0.0080.14 -0.060 0.0030.2* -0.226 0.0170.04 1.073 0,2800.3’ -0.258 0.0300.24-0.260 0.0280.2* -0.087 0.0000.!’ 0.853 0.0130.4’ —0.140 0.0180.3’ -0.209 0.0250.8* —0.070 0.0080.0* —0.096 0.0020.0’ 0.466 0.1300.2’ 0.07! 0.0010.3*-0.288 0,0520.3í-0.207 0.0250.2’ —0.084 0.0040.14 —0.153 0.0070.1* 0.118 0.0090.1’ 0.118 0.0090.3*-0.153 0.0120.0’ 0.557 0.1570.0* 1.55.7 0.1620.1* —0.031 0.0010.1’ -0.018 0.000Q,3* —0.072 0.0020.8* 1.06! 0.2550.2’ —0.172 0.02!0.04 1.052 0.3110.2’ 0.037 0.0080.4’ -0.293 0.0540.0’ -0.196 0.0080.0* —0.896 0.0080.24 —0.288 0.00?0.0’ 0.105 0.0030.44-0.229 0.0340.2’ 0.061 0.002

0.0’ —0.143 0.0130.0* —0.271 0.0440.2’ -0, ¡50 0.0130.1* —0.207 0.0260.0* -0.376 0.0640.0* —0.252 0.0610.0’ -0.464 0.0490.0> —0.299 0.03.30.14 —0.463 0.0720.0’ -0. >23 0.0092.5’ —0.010 0.0000.5’ -0.130 0.0050.0’ -0.332 0.0362.6* -0,158 0.0050.0’ —0.086 0.0070,1’ -0.008 0.0000.0’ —0.250 0.0100,0* -0.327 0.0430.0* —0.177 0.0230,!’ —0.252 0.0212.4* 0.016 0.0000.14 -0.273 0.0340.1’ —0.237 0.0230.0*-0.467 0.0730.04-0.538 0.1550.0’ -0,305 0.0510.1’-0.327 0.0680.0’ 0.038 0.0000.0’ 0.034 0.0000.5* -0.229 0.0310.0* —0.136 0.005.0.2’ -0.187 0.0230.8* —0.893 0.0250.0* 0.378 0.0830.0* —0.192 0.0110.0* —0.313 0.0610.0’ —0.313 0.06!0.0’ —0.169 0.0150.7’ -0.304 0.04?5.1* -0.04! 0.0000.0’ —0.500 0.1440.0’-0.498 0.15!0.0’ 0.200 0.0132.4* 0.152 0.0050.1’ —0.310 0.0672.3’ 0,062 0.0010.0’ —0.452 0.09!0.2< —0.199 0.0220.1’ —0.415 0.0360.>’ -0.138 0.0040.1* -0.395 0.0300.0* -0.264 0.0220.1’ -0.13.3 0.0120.0* 0.181 0.020

0.0*0.2*0. 1*0.1’0.3*0.2’0.6’0.1’0.5’0.0*0.0’0.0’0.3’0.!’0.040.0*0,1*0.3’0.I’0.2*0.0’0.2*0. 1*0.5*0.7*0.240.3’0,0’0.0’0.!’0.0’0.1*0.1’0.3’0.1*0.2*0.2*0.1’0.2*0.0’0.6’0.6’0.8*0.140.2*0.0*0.5*0.!’0.4’0.0’0.4*0.2’0.040.8*

TABLA IL— MATRIZ Y TRATAMIENTO DE DATOS EN EL ANALISIS DECORRESPONDENCIASMULTIPLES, CONSIDERANDOLAS MUESTRAS CORRESPONDIENTESA LA VARIEDAD AíREN

£ARACTERJSJIaES 00 Y>0~1ER ~:JESL51íT~

P096R! D095ER,)ATIQOS lSb ~O*b~iDE V2¿I~1tES ¡

F¡0181R tE DÚ’#ES A~ JES*J~

2 3 4 5 6 7 6 9 *0 >2 12 13 ¡40~ SIN *1*6 ¿IT ¿SP tEl. ff2 *&JI &V PH ~E LIII Nt CMi

20,00 85.005.00 15.100.00 10.00

¡0.00 20.000.00 15.100.00 5.100.10 10.000.00 90.000,00 20X~00.00 255.000,00 220.00

110.10 215.100.00 40.000.00 35.100.00 45.000.00 5.100.00 »o.oo0.10 1*0.000.00 5.000,00 55,100.00 5.000.10 20.000.00 45,000,00 30.CX,~

¡5.10 60.0040.0,> 125.000.10 ~.00

35.00 0.00105.00 70.0035.00 20.00

>25.00 ¡20.00¡0.00 - 320.000,00 340.00

15.10 II5~10.00 60.005.00 25.100,00 2~000.00 0.100.00 40,00

¡0.10 5.000,00 0.000.00 0.000.00 15.100.00 5.000.00 *5.000.00 10.000.00 15.005.00 20.000.00 5.000.00 20.000.00 15.000,00 20.000.00 ¡0.000.10 20.000.00 10.000.00 5.030.00 70.000.00 35.000.00 ¡5.000.00 80.00

2.002.002.00¡.001,008.002.00¡.002.00¡.101.002.002.00¡.002.002.002.002,002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.102.002.002.102.002.002.002.00¡.00¡.102.002.002.002.002.002.002.002.007.102.002.002,002.00¡.002.002.102.102.00¡.002.00

0.00 170.000.00 35.005,00 ¡*0.000.00 0.000.00 30.000,00 5.000.10 405.000.00 25.000.00 5.000.00 55.000.00 10.000.00 30.100.00 30.000.00 ¡0.000.00 215.000,00 35.00

00.10 120.100.00 ¿0.000.00 45,000.00 115.000.00 25.100.00 *00.000.00 *10.000.00 5.100.00 25.000.00 20.005.00 2t~100.00 230.00

55.00 ¡0.100.00 0.00

60.00 0.000.00 0.000.00 0.000.00 40.000.00 15.000.00 85.100.00 ¡5.000.00 0.000.00 55.100.00 00.000,00 ¡5.005.03 290.10

70,00 65.000.00 ¡40.00

440.00 45.005.00 20.000.00 20.000.00 ¡0.000.00 5.000.00 *60.000.00 0.000.00 60.000.00 65.00

¡0.00 60.000.00 80,00

20.03 30,000.00 ¡00.100.00 350.000.00 45.000.00 30.10

2.002.002.002.002.002.102.002.002.002.002.002.002.002.002.00¡.002.102.101.102.002.002.102.002.002.002.002.002.001.002.002.002.002.002.00¡.008.00¡.002.00¡.001.002.002.00¡.00¡.002.001.001,00¡.002.008.102.008.00¡.00¡.00¡.001.002.001.00¡.002.00

8.06 51.00 22.80 29,207.93 30.00 28.80 41,2v1.07 74.00 ¡0.60 05.209.03 80.00 9.90 11.208.05 90.00 9.80 ¡¡.208.06 70.00 02.80 27,200.26 71.60 ¡7.20 11.208.02 57,00 30.80 ¡5.207,90 50.00 30.90 It 208.13 46,00 41.20 ¡2.909.12 60.00 25.20 ¡4.808.13 64.00 23.20 ¡2.907.93 46.00 31.20 25.907.93 34.00 39.20 26*07.65 2~00 49.00 26.007.87 31.00 37.00 32.009.04 53.20 29.20 ¡7.607,91 31.20 39.20 29.509.15 52.20 27.20 21.606.13 4*20 29,20 29609.14 21,20 31.20 41.608.04 29.2*3 35.20 35.609.06 33,60 31.40 35.008.09 49.60 27.40 23.009.20 57,60 23.40 ¡9,006.07 43.60 35.40 21.006.30 57.60 23,40 09.007.99 60.00 29.20 ¡0.809.16 72.00 ¡5.20 12.608.17 56.00 35.20 6.802.97 64,00 23.20 22.508.25 70,00 ¡7,20 12.606.20 24.00 32.20 42.608.01 26.40 37.20 26.409.04 29.40 29.20 42,409.00 56.40 ¡9,20 24.407.92 34.90 37,20 26.008.28 88.40 5.20 6.409.09 64.40 ¡7.20 ¡6.409.81 76,80 10.90 82.409.19 72.40 ¡3.20 ¡4.40

8.08 60.80 *9.20 20.009.06 32.40 31.20 26,406.81 34.00 22.60 44.408.09 32.00 21.60 46.408.14 46.00 21.60 29.409.05 50.00 25.60 24.407.71 26.00 31.60 32.40

7.74 48.00 2t64 24.407.94 42.40 27.20 30.40LOS 56.40 23.20 20.407.98 60.40 23.20 26,409.03 54.00 ¡9.60 26.409.03 56.00 25.60 18.408.06 64.00 15,60 20.407.93 58.00 17.60 24,407.79 34.00 27.60 38.40

7.93 44,40 25.20 29.407.81 34.40 67.20 2,407.92 48.00 23.60 28,40

1 .002 ¡.003 ¡.004 ¡.005 1.00¿ 1.037 ¡.109 ¡.00

¡.00lO ¡.00II ¡.0012 1.00¡3 2.00¡4 ¡.0015 8.00¡6 ¡.0017 ¡.00II ¡.00¡9 ¡.0020 1.002! .0022 .0023 ¡.1024 1.1025 ¡.0026 ¡.0027 1.002* 1.0029 ¡.0030 ¡.0031 0.0032 ¡.0037 ¡.0034 1.0035 ¡.0036 ¡.0037 1.0038 .0039 ¡.04340 1.1048 1,0042 ¡.0*343 ¡.0044 2.0045 ¡.1046 0.0047 0,0049 ¡.0049 1.1050 0.005> ¡.0052 ¡.0053 ¡.0054 [.00!~ ¡.0056 1.0057 ¡.0058 2.1055 ¡.0060 ¡.10

¡6.00¡5.000.00

12.00¡2.0023.0003.0082,104.00

¡2.000.004,004.00

¡5.004,008.109.00

13.009.006.108.008.009.008.10

¡5.00¡5.00¡5.004,00

¡2,004.002.001.0*34.003.004.10

¡5.0025.0011.00¡2.000.00

¡3.000.00

14.0025.009.10

¡6.00¡6.00[5.00¡¡.007.000.00

14.00¡4.00¡5.1011.008.000.00

>4.00¡2.0016.00

0.000.000.000.000.000.000.100.100.000.000.100.000.000.005.100.000.000.100.100.100.10

10.100.000.000.100.100.000.00

55.100.000.100.100.000.100.000,000.000.000.10

¡5.002*3.100.005.00

20.000.000.00

¡0.100.005.10

30.000.000.00

20.000.000.000.000.000.000.000.10

39.2013.70¡7.60¡5.6019.6025.5011.700.80

45. lO8 3.708.607.00

21,406.20

29.5011.6027,4031.4039.2041.2037.2037.2029.4022.6032.6043*035.3065.3027.7072.5035. 90¡6.3075.9044.9064.5022.1057.407.26

¡0.80

7.664,9(1

24,3044,4022.60¡3.0049.*0¡4.3’)25.o)

1.5045.00¡7.60¡5.60¡ 1.0030.5020.5019,7030.002*4044.50

TABLA IX (Continuación)

9.08 6¡.60 ¡6.108.82 52.00 ¡9.606.25 46.40 38.205.76 60.00 23.607.98 52.40 27.607.79 27.20 23.207.98 35.20 29.608.03 71.20 ¡3.207.88 45.60 21.205.41 73.60 ¡4.906.65 49.40 24.106.6¡ 50.40 32.107.72 32.80 ¡9,607.98 32.90 20.109.01 58.90 22.007,92 56.90 ¡6.009.0¡ 25.20 53.608.08 32.90 30.007.94 35.20 31.607,72 59.20 ¡3.607.99 40,90 23.606,07 38.00 ¡4.008.09 40,80 29.007.92 47,20 31.607.73 69.60 17.207.79 57.60 21.207.96 74.80 7,207.95 38.00 33.207.89 26.90 29.208.05 29.20 37,205.00 55.20 27.206.82 59.20 ¡9.209.10 39.20 37,207.99 69.20 ¡9.206.07 45.20 27.207,98 68.20 ¡7.609.07 68.00 ¡6.008.15 60.90 22.006.24 67.20 85.607.43 99.20 5.607.88 73.60 ¡3.207.75 39.60 25.209.11 41.60 j>.~o7,65 26.00 32,407.63 42.10 25.407.97 39.90 ¡0.607.33 37.80 24.607.98 45.60 32,607.82 55.60 22.807.89 5¡.60 30.408.05 47.60 30.809.04 79.60 9.406.05 53.60 24.408.86 50.60 26,408.06 55.60 22,408.85 59.60 22,409.17 59.60 24.409.07 55.60 24.40846 53.60 28,409.20 61.60 20.408.80 53.20 2~978.14 51.20 26.809.8V 57.20 22.8)9.30 53.20 26.908.01 58.20 20.80

él ¡.0062 ¡.1063 1.0064 ¡.0065 8.0066 ¡.0067 ¡.0068 ¡.0069 ¡.0070 ¡.00II 8.0072 ¡.0073 ¡.0374 ¡.1075 ¡.0076 1.0077 ¡.0076 ¡.0079 ¡.0000 ¡.0098 ¡.0082 ¡.1093 ¡.00¡4 ¡.0095 ¡.00

86 ¡.0097 ¡.0088 ¡.1099 ¡.0090 8,009> ¡.0092 ¡.0093 ¡.0094 ¡.0095 ¡.0096 8,1097 ¡.0098 ¡.1099 2.00

100 ¡.10¡08 ¡.00102 ¡.00>03 2.00lOO ¡.00¡05 ¡.00106 ¡.10¡07 ¡.00¡06 ¡.00¡09 ¡.00¡80 ¡.00>82 1.00¡¡2 ¡.10¡83 ¡.00¡¡4 ¡.00115 2.00¡¡6 ¡.00¡¡7 1,00¡¡8 8.10¡¡9 ¡.00¡20 ¡.0012¡ I.0’0122 ¡.00>23 8.00¡24 ¡.00¡25 8.00

¡.10¡6.00¡.00

¡1.10¡6.00

¡.00¡5.006.009.00

¡¡.000.000.000.00

¡¡.000.000.109.004.109.008.100.006.10

¡¡.003.009.00

¡2.00¡.00

¡5.0085.006.108.00

¡5.00¡5.0083.008.008.00

¡2.00¡5.00¡5.00¡2.00¡5.00¡6.00>6.00¡5.004.00

¡5.00¡5.00¡5,0088.00¡ 8.0022.00¡ ¡ .00¡¡.10¡ ¡.1022.00¡¡.0018.00¡¡.00>2,00¡¡.00¡¡.00¡¡.1012,00¡ ¡ .10¡¡.00

0.000.000.000.00

¡0.000.000.00

75.005.100.000.000.000.000.000.000.100.000.000.000.000.000.000.000.005.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00

¡0.000.000.000.000.100.000.000.005.030.000.000.00

20.000.000.000.000.100.000.000.000.100.000.000.000.000.00

0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000. (00.000.000.000.000.000.000,000.100.100.000.000.0430.005.005.000.000.000.000.000.000.000.0*30.000.000.00

10.060.000.000.000.005.000.000.000.00

¡0.0050.040.00

25.000.000.00

¡0.000.100.00

95.000.00

15. ~.>5.00.3.00

¡5.0020.000.00

45.005.005.00

¡5.0075.000.005.000.000.000.000.005.00

25.005.005.005.00

¡5.0045.000.00

35.0025.00¡0.00¡0.00¡0.0020.005.00

¡0.00¡0.00¡0.00

¡ ¡0.00¡5.000.10

¡0.00¡0.100.000.100.005.000.00

20.005.00

25.0075.005.00

¡00.0045.0050.0030.00¡5.00

¡00.00130. 1010.0030.00

5.1030.00

>50.00¡0.00

360.00¡0.0055.00

¡35.0065.00

¡.002.002.002.102.102.002.002.002.002.002.002.002.102.002.002.00¡.002.002(s)2.002.002.102.002.102.00¡.002.002.002.002.002.002.002.00¡.002.102.00¡.002.002.00¡.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.102.002.002.002.102.002.002.032.002.002.002.0v2.002.00

0.00 ¡0.000.00 60.000.0*3 20.0*30.00 ¡5.000.10 203.000.00 160.000.00 55.00

30.00 0.100.00 240.000.00 5.000.00 ¡5.000.00 30.000.00 0.000.00 ¡970.005.00 ¡60.005.00 ¡¡5.100.00 ¡0.00

¡0.00 60.1020.00 45.0080.00 ¡90.000.00 ¡50.000.00 ¡5.000.0*3 75.100.00 70.000,00 35.000.00 ¡5.000.00 55.000.00 125.005.00 ¡200.000.90 60.000.00 ¡5.00

25.00 35,000.00 5.000.00 ¡0.000~O 35.000.0*3 0.000.00 0.000.00 95.00

>5.03 25.000.00 5.00

315.00 0.000.00 65.10

40.00 1>5.0030.00 ¡5.000.00 ¡06.105.00 250.00

¡0.00 225.000.00 2<,h00

90.00 8&000.00 500.000.00 >5.005.00 ¡0.000.06 70.00

¡30.00 220.00>h~00 75.00

0.00 35.000.00 595.000.00 ¡70,000.00 15.000.00 0.000.00 20.000.10 05.000.00 0.100.00 025.000.00 ¡5.00

2.002(02.002.00¡.102.102.002.002.002.002.002.102.002.002.002.102.002.002.002.002.002.002.002.002.00¡.002.008.00¡.00¡.00

2.002.002.002.001.002.002.002.002.00¡ .001.002.102.002.062.008.00¡.002.002.002.0v2.002,002.002.002.002.002.002.002.002.002(s)2.002.002.002.00

20.4028.4022.40¡6.4020.0049.6035.2015.6033.20¡¡.6027.60¡7.6047.6047.20¡9.2027.202¡.2*337.2033.2*327.2035.6047.2038,2021.20¡3,2021.20¡6.0026.0044.0033.60¡7.602¡.6023.60¡¡.6327. 6383.60¡5.20¡7.20¡7.205.20

¡3.2035.2027, 2048.6029.609.60

37.602¡.6028.60¡8.0028.60¡2.1022.0022.0022.00¡6.00¡6.0020.0016.00¡8.0020.0022,1020.0020.0029.00

22.9o22.000.100,00

54.7<23.9<52.5<¡8.208.4>.’0.0v0.000.003.30)

39.2~’4,50>3.5<)

23.2>)56. ¡050.5)07.40

57.8046.8036.3048.30¡0.7025.30

¡.2054.6054.8036.Et37.¡021.9046.4036.[043, 5046.9046.9064.005.!. 00

0.1>02. LO

28.6059,0052.9060.80¡5.70¡9.6049.00¡6,400.00

33.707,60

09.60¡7.6039.20¡6.90254050.9010.80¡9.6043. ¡039.2047.0045.803¡.40


¿26 ¡.00 1h00¡27 ¡.10 ¡¿.00¡26 0.06 ¡¡.00229 ¡.00 >2.00¿30 bCO138 ¡.00 ¡¿.00¡32 ¡.00 ¡¡.00¡33 LOt) ¡¡.10¡34 ¡.00 ¡¿.10[35 ¡.10 11.10¡36 ¡.00 6.00¡37 ¡.00 6.10¡36 ¡.10 6.00¡39 ¡.00 6.00¡40 ¡.00 6.10341 LOO 6.00242 2.00 6.00¡43 ¡.00 *00¡44 ¡.10 6.00145 1.00 6.00¡46 ¡.00 6.00¡47 ¿.00 6.041>48 ¿.00 ¿.03>49 ¿.00 ¿.00¿50 ¡.00 6.00¿51 ¡.00 6.00¡52 [.00 ¿.00¡53 ¡.00 6.00¡5< ¡.00 6.00¡55 ¡.00 6.00¡56 ¡.00 6.00¿57 ¡.00 6.00¡53 ¿.00 6.00>59 2.00 6.00¡60 ¿.00 6.00¿61 ¿.00 6.00¡62 ¡.00 6.00¡63 ¡.10 6.00¿64 ¿.00 6.00¡¿5 ¡.00 6.00¿U 2.0) 6.00167 ¡.00 6(s)¡68 1.00 6.00¡69 ¿.00 6.00¡70 8.00 6.06¿71 ¡.00 6.043¡72 ¡.00 6.00¡73 ¡.00 6.00>74 2.00 ¿.00¡75 ¡.00 6.00876 ¡.00 6.00¡77 ¡.00 6.00273 3.00 6.10¡79 1.00 6.00¡03 1.00 6.00198 ¡.00 LOO¡82 [.00 6.00[93 [.00 6.00[64 [.10 6.00¡85 2.00 6.00186 1.00 6.00¡87 ¡.10 6.00¡~ ¡.10 6.00[99 ¡.00 6.00[90 ¡.10 6.0019¡ ¡.06 6.00[92 ¡.10 6.00295 2.00 6.0019* 2.00 6.00¡95 ¡.00 6.00¡96 ¡.00 ¿.00

0,000,000.000.000.000,000.000.000.000.000.10

¡0,000,100.000,10

0.000.000.100.000.000,00*7.100,000.000.000.100,060.005.005.005.000.005,000,000,000.000.000.000.000,000.000,000.000.0v0.100.000.00*3.000,000.000,000,000,000.000.000.00

620.000,000.000.0.)5.100,000.000.000.000.000.000.000.100.000.00

¡5.00 65.060.00 30.000.00 ¡60,100.06 30.000,00 25.030.00 20.000.00 380.00

¡5,00 ¡30.060.00 40.000100 >0.000.0v 410.000.10 20.100,00 20.100.06 5.000.00 5.00

35.00 ¡3.00O(s) 40.000.00 40.000,00 55.000.00 350.000.00 70.00

15.00 0.000.00 ¡0.00

65.00 W~000.00 25.00

40.00 825.0430.00 5.000.043 0.000.00 ¡0.10

25.00 ¡0.005.00 ¡5.000.00 20.000.00 60.00

¡20.00 0.005.00 70.100.00 25.005.00 50.000,00 *3.00

25.00 30.000.00 603.06

50.00 80.0325.04- 75.04320.00 75.000.00 ¡40.000.00 90.000.00 5.000,00 75.00

¡5.00 55.000.06 40.030.00 420.100.00 20.10

<0,00 *3.100.00 ¿0.000.00 70.00

¡0.00 [0.0020.00 25.0045.00 0.000.00 ¡700.000.00 45.005.00 20.000.00 20.000.00 2¡0.100.00 5.10

25.00 75.000.00 ¡30.00

45.06 SS.005.00 55.00

55.00 >00.000.00 30.00*3.00 75.000.00 ¡0.00

2,00 0.00 30,002.).>) 0.00 ¡5,002.00 35.00 220.002.00 0.00 35.002.00 0.00 <5.062.00 0.00 55.002.00 0.00 240.002.00 0.00 ¡0.002.00 0.00 5.102.04 0.00 55.0.32.00 0.00 0.102.0*3 0.10 ¡0.002.00 0.00 45.002.00 5.00 65.002.00 0.00 40.002.00 0.10 0.002.00 65.00 70,002,00 0.00 35.002.10 0.10 0.002.00 0.00 ¡65.002,00 0.00 03.102.00 0.00 0.102.00 0.00 20.002.00 0.00 ¡5.002.00 0.00 ¿0.002.00 0.00 45.002.00 0.00 60.002.00 0.00 20.002.00 0.00 0.002.00 0.00 5.002(o) 0.00 50.002.00 0.00 25.002.00 30.00 30.002,00 0.00 0.002.).>) 0.00 40.002.00 ¡5.00 45.002.00 0.00 ¡60.102.00 5.00 ¡5.002.00 0.00 ¡¡0.00

2.0*3 0.00 215,102.03 0.03 25.002.00 0.00 45,002.00 0(0 2t¾002.00 0.00 0.002.00 45.00 55.002.00 0.00 45,002.10 0.00 5.0432.10 5.00 ¡70.002.00 0.00 55.002.10 0.00 ¡5.002.06 0.00 30,102.00 45.10 90.002.00 0.03 55.002.00 0.00 >00.002.10 0.00 [65.002.06 0.00 ¡5.002.00 0.00 0.002.00 0.00 0.002.00 0.00 0.002.00 0.00 285.002.00 0.00 ¡0.002.00 0.00 20.002.00 0.00 0.102.10 0.00 0.102.00 0.00 [00.002.00 0.00 5.002.00 LOO 5,002.00 0.00 0.00¡.00 ¡0.00 225.102.00 0.10 70.002.0’.> 0.00 ¡05.00

2.00 8.2>2.00 9.242.06 6.212.00 9.¡52.00 7.94¿.00 1.822.00 1,651.00 7.852.00 7.922.00 6.632.00 7.852.00 7.772.00 7.922.00 7.992.00 7.792.00 7.762.00 tOS2.00 1.662.00 2.042.00 8.042.00 9.112.00 9.062.00 9.¡72.00 7.792.00 7.952.00 7.862.00 7.992.00 9.098.00 7.982.00 7.902.00 7.772.00 7,861.00 9.¡12.043 7.932.00 7.982.00 7.992.00 8.0¡2.00 7.972.00 8.002.00 7.962.00 6.052.00 6.022.00 8.032.00 7.992.00 7.492.00 7.502.00 7.652.00 7.622.00 7.702.00 7.68¡.00 7,722.00 7.702.60 7.702.00 7.712.00 7.712.00 1.801.00 7.752.00 7.702.00 7.622.00 7.741.10 9.272.10 9.05[.00 7.842.00 9.[22.00 9.162.00 7.752.00 7.U2.00 8.172.00 7.902.00 8.19¡.00 8,27

47.20 .:.t

49.20 24.8v5¡.20 22.6049.20 20.8045.20 20.4*353.20 22.4351.00 ¡8.605>20 22.4051.20 26.4077,20 ¡0.4059.20 24.803~20 50.6043.20 ¡6.80W2*3 29.8*3[8.00 29.604Q,40 29.2048.40 21.2054.40 >7.203t40 29.2042,40 29.2060.40 ¡9.2060.40 ¡9.2050,40 [9.20¿2.80 ¡7.20¿5.00 ¡¡.0057,10 27.0068.03 ¿8.2079,00 7.0063.00 ¡9.0060.00 ¡5,0077.00 3.0049.00 ¿7.0067.043 ¡¡.0049,00 27.0050,03 27.2050.80 19.2054,90 21.2079.00 ¡.0031.00 39.0*333.00 37.1053.00 25.0063.00 >7.0033.00 37.0035.00 39.0036,00 37,60

32.20 <¡.4074.60 ¡0,9048,00 27,0043.00 25.004L00 38,0035.00 27,1061.00 15.00¿3.03 ¡7.0069,00 >5,0044,90 25.2070.90 ¡3.2079.00 9.0065.00 ¡5.1054.90 25.2041.00 2~0076.90 20.0052.8) 26.0080.80 9.0044,60 36.1039.20 35.605¡.20 45.6039.20 57,&o39,80 3>6040.60 31.6039.20 53.2035.20 29.20

26.0026.0030.0034,4024,4030.4026.4022.4012.4*336.0054.0040.1038.0052,4030.403*3.4026.4032.4028.4020.4020.4030.4020.0024.0026.0020.10¡4.00¡6.0024,0020.0034.0022.0024.0022.0070.0024.0020.0030.0030.0022.0020.0030.00

26.0026.4026.40¿4.4052.0032.0024.0036.0024.04320.00>6.0030.00¡6.00¡2.002*3.0020.0030.00>3.2022.20[.20¡9.2025.203.203.20

29.6027.6027.6032.60

3. 9u¡5.703.10

¿2,5028.60¡3,4024,3023.500.00

2¿.6045. >0

¿ .9025.50¡7.6056.Ev3>4*30.00

39.2043,1028.60¡9.60¡¿.8016.6062.4074, 9031.20

*3,805.5<

47. 8).-¡2.5031,2<>86.6<>43,7056.2035.3022.900.60

54.’)25,006.20

16.6045.6035.4025.0045.60¡2.50¡.70

56.2025.0025.0054,00¡8.70¿¿.6037,40¡2.503.30

43.7062,4027,0022,9027,00[4,6060.3047.8064.5056.2039.5013h5049.90¡6.60


**u* ftdP.4.Y~ ES ~FffSPONfl~4CESPtLT[PtES *4*íí

C~CTtRISTIQLES £41 FIDIJER A¿JESUSQITITRE VARIAStES EN CLA&S

ICH88E OG8SERVATI~S ¿ 196 NO$RPE DE VARIABLES ¡ ¡3

mres vARí~cLs El tois

1. SIN/ 2. XIN/ 3, 111/ 4. ISPII. L1>~/l2. >SC/13. CAR/

VARIADLE It de O..ASSES

/ 5. IEL/ 6. ~1/ 2. ~EH/ 8. GFV/ 9. PH/lO. ZI

ciasLióclid At. individus

9 1 ~CSINT~S2 cEPAS NIERTAS3 UnOO~T1 VAS4 SIn vioop5 D4TRDtFA5CJ~D.6 FILOXERA7 HERBICIDASU IELOIDOGVNE9 S>NT.VIRDSIS

6 8 XIN de Os O2 1DM de la 53 uN de 6a 25.4 hM de

26a 505 XIJJ de SIa >006 hIN d¡ 101 a 620

6 1 XII de Os2 XII de 1 a3 [IT de ¿a4 1>7 de 26a5 [IT dc 51 a

6 XII de [0! a

6 1 1SF’ de Os2 X~ dc 1 a3 15? de ¿a

4 X~ de 26a5 ISP de SI a

6 15? dc 1(*la

Ml IIM2 7M3 24A4 10MS $6Mk 20

MS 15M9 34

881 171882 II253 10854865886

o525

5010<)

125

CCI

0C30C4CtsCt6

O525

SO1001700

2

‘44¡224

934

001 22002 25003 64004 28005. 3!006 2k

2 1 P&SE?4CIA2 AIMflCIA

6 1 CAl de Os O2 ~I de la 503 CAl de SIa 1004 CAl de lOja 2005 CE de 2U1a 4006 CAl dc 408a 440

SIN

UN

lOT

¡¡1 19¡¡2 177

FF1FF2FF3FF4FF5FF6

L563152

TABLA IX CContinuaicón)

7 1 1CM de Os O2 N~ de 5< 503 1CM de 51 a lIs)4 NEX de lOha 2005 lEN de 2*31 ¿ 404=6 ND~ de 40! ¡000

lEN de >00! a 1870

2 8 P~SEHClA2 NJsE~cIA

3 ¡ P14 de 5.41ia 6.42 Ffl 7 6.4 8 7.63 PH > 7.6* 8.3

4 1 MEde 18a3<>2 Mt > 30a 503 ARE > SOa 704 Mt 7 70* 89.2

4 1 1.8K dc ¡a 102 1.8K > lOa 203 UN> 20a 40

4 LIN 7 40a 67.2

5 1 ARE de 2.4a 102 Nt > lOa 203 ~C 7 20a 304 M~ > 30< 455 MC 7 45a 52.4

6 1 CM de (*a O2 lAR de Ea >0

3 CM 7 10* 204 CM 7 ZOs 355 CM 7 35a 506 lAR 7 SOa 75,9

35! 83352 783.13 82.1)4 23

1253

KI<3 1240<4 7

LiiLL2 66LL3 78Lt4 39LIS 6

Ii

>1>02>113 45fhA 43nc 451916 29

Ev

858 269!

563 3?884 2k665 12566 260? 2

PH

liii 47nC 849

III1121>3

47

LIN

!C15~ TOTAL OECLASSES~ 66


VALuE PR~RES El WCIE¡RS P~0?RES

UEATIE TOTALE 4.076922

jure CILO*¿E VALEIPS FfflP~S (varia,wes sur les axes principaux>2ee O0L~k~* W4TR180T1~4 A L I1CRTIE TOTALE

<p~srcentages expí iqués par les axes principaux>Sise C1~*E ¡ ~4TRl&>tIO~JaIIULEE A LIIERTIE TOTAL!

<pource~tages cuzul it expí iquis par íes ames prifleipautí

VAL.PF&) hEZ? XCIII0.5 6 6 1 ísísmíist*tííiíííí*íiítííí*t*íetu**n.íííítt*ííííi0.18 4 10 / 4***ii’eiiii’sit4itiiieítisiiii**5*i

0.86 4 15 / •ííutuí.ííísí,,.íst¡t,tu*u*¡tíuí

WOTEIES PaLrREs (c~tficients de[ sodalitós des variables da¡,s l’Équatiw¡

MIMSMSM4MS

MSMV861882863884BBS866ccl112Cts114cts116DII002013004LOS006al¡¡2FF1FF2FF3FF4

linÉsire des ames

0.886 -8.069 2.2821.446 0,979 —0.639

—2.689 0,529 -0.4>6—¡.248 -0.56> 2,643-0.096 1.062 0.680—0.907 -1.902 -1.167

8.992 1.880 -4.5923.461 -0.126 -2.71?

—0.820 -1.659 —0,954—0.237 0.230 0.1940.620 -0.330 -8.6481.896 -3.498 -0.566

-1.234 -4.815 -0.2804.375 ¡.958 -9.4207.299 <.452 9.7300.004 -0.528 -0.097

—0.779 0.088 -1.192—0.06.6 8.274 0.805

0.457 1.529 4.608—0.323 4.956 0.276

1.8>0 3.956 —4.1831.752 —1.040 5.454

-0.050 -3.011 -0.5730.886 -0.383 -¡.195.

-0.809 0,726 1.086—0.25.5 8,354 -0.667<.67? 2.322 0.8722.335 -0.620 -1.668

-0.250 0,067 0.1790.003 0.212 0.243

-0.077 -8.446 -0.2900.490 2.212 —5.345

—1.581 4.396 0.450

principauz>

FF5FF685’6628538648558065671141ff42

111>12113.351532513“4

XXI1.1.8LL211.3

—1.1.41.1.5fuNcMSNIAWc“eh

4.118-1.429

1.0230.348

-0.624-lASO-0.5342.350

—1.6640.479

-0.858¡.5408,714

-0.094-1.868-1.1290.1564.3434.9991.176

-0. 9950.8652.852[.748

-0.651-1,549-0.6012,3831.6810.663

-0.429—0.968-1.227

—4.010-4.027

1.424-o. 046

0.074-0.948-0.0240.675

-5.879—1.7760.5600.655

—2.676o. cei

-3. 513

—0.610¡ .378

-0.858-8. 367

0.547

0.008—1.945—2. 1050.855.0.659

— ¡.930-2.965—0.683-0.7750.0800.1070.900

-0. 600

-1.602—1.451

0.967-O.09¿-0.583‘-0.333

.454-2.927¡.130

—1.1470.3624.1744.005

-0.242-0.8350.373-0.865—0.832

.595-0.979

0.2480.2922.768

-0.3400.131

-0.5.4!¡.0224,9961.292

-1.251-1,884-0.292


ETIIQE DES V~IASLIS

me COLDt#E £OORDDNHEE2e C&0~t4E CÚSINUS C~RE (QIJALITE DE LA RERESENTATIOtUSe COLONNE CONTRISUTION RELAT1~E A LIIERTIE EXPLIQIE PAR L’AXE

AlES PRINCIPAUX

AlE 1 AlE 2 AlE 3

VAAIABLES PESES EN CONPTE DN~S LAN.ALYSE

0.4060.720

-1.304—0.621-6.048—6.4520.9921.722

—0. 408

—0.1180,3090.943

—0.6142.1763,633

0.002-0.387—0.033

O.V7.-0.161

0.901

0.872—0.045

0.093—0.403-0.127—0.337

0.0100.0190.0180.0210.0020.0250.0050,2460.035

0.0950.0060.0480.0020.0490.069

0.0000.0100.0000.0020.0000.017

0.0960.0000.0040.0270.0030.017

¡.162 0.145—0.125 0.145

0.002—0.038

0.244-0.767

2.050—0.711

0.5090.173

—0.311-6.576

0.0000.0000.0020.0060.0220.003

0,0400.0260.0220.051

0.3* —0.4540.6’ 0.4160.5* 0.2250.6*,-’0.1530.0* 0.4510.6* —0.8070.2* 0.7967.1’ —0.054oa’ —0.704

10.8 *0.4* 0.0970.2* —0.1401.4* —1.4950.1* —1.14?1.5* 0.6312.1* —0,192

5.6 4

0,0* —0,2240.3* 0.0370,04 0.5410.1* 0,6490,0* 2.1030.5’ 1.619

0,9 *

2.7* —0.4410.0* —1.2760.1* —0.1620.7* 0.3060.1* 0,5750.5* 0.965

4.0 *4.1*0.4’

4.5 *0.0’ 0.0900.0* —0.6140.0’ 0.9390.2’ 1,8660,7* -1.1020.1* —1.709

1.0 *

1,1’ 0.6040.4* —0.0210,6* 0,0311.4* —0.402

0.0120.0060.0010.0010.1950.0740,0030.0000,104

0.0650.00 10.1190,0 160,0070.000

0.1390.0000.0410.0200.0690.059

o • 0250.2390.0130.0160.0620.149

—0.263 0.0070.028 0.007

0.0310.0110.0250.0360.0150.0 15

0.0560.0000.0000.025

0.5* 0.9210.3* —0.2600,0* -0.1690.1* 6.6674,2* 0.2762.8* —0.4820,1* —1.8650.0* —1.1053.7* -0.387

11.7 *

0,4* 0.0790.0* —0.6694.6* -0.2300.7* —0.1140.3* —3.8260.0’ 3.952

6.21.6* —0.0390.0* —0.4841,54 0,0420.6* 1,8692.9* 0.1122.5* —1.671

9.3 *0.9* 1.4038.9’ —0.2330.4* —0.4810.6* 0.4412.2* —0.2715.5* 0.070

18.5 *

0.3* —0.6770.0* 0.073

0.3 *0.3* 0.09?2.5’ —0.1161.0* -2,1711.5* 0.1830.6* -0.6500.6* -0.589

6.6 *

2.1’ 0.3930.0* —0.0390.0* —0.2370.9* -0.135

AAlnAAIHAAZ**AA4 4’AA5**M6*’Ml 4*

MS **

M9**4*

Sf1 4*

882 **

883 4*

B~4 **

286 1*

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ccl”0t24*003 4*£04 **

005 u

006 4*

4*DOI **

002 ti

003 4*004 itDOS **

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El”LUn

ti

FF1 4*

FF2 4*FF3**FF4”FF5 **

FF6 **fi

661¡*

663664”

0.051 2.2*0.002 0.1*0.000 0.0*0.024 1,1*0.073 1.7*0.026 ¡.1*0.018 0.8*0.101 4.3*0.032 1.2*

12.7 *

0.042 0.3*0.027 1.2*0.003 0.1*0,000 0.0*0.151 7.0*0,080 3.7*

12.2 *

0.004 0.1*0.015 0.7*6.000 0.0*0.166 7.5*0.000 0,0*0.058 2,7*

10.9 *

0,249 10.3*0.008 0.3*0.112 3.5*0.032 1.3*0.014 0.5*0.001 0.0*

16.0 *

0.049 2.1*0.049 0.2’

2.3 *0.032 0.4*0.003 0.1’0,123 5.6*0.000 0.0*0.002 0.1*0.002 0.1*

6.3 *0.024 1.0’0.001 0.0*0.013 0.5*0.003 0.1*

665 *‘ —0.266 0.005 0.1* —0.010 0.000 0.0* 0.591 0,023 2.0*


~66 1.170 0.014887 —0.829 0.007

**

4*

**

mi”14Q**

**

III **

112 *‘

113 ti*4

3.11 **332 1*333*’3.14*4

**

¡(Xli’KI(2**¡0<3 ‘*

4*

LId *1

LL2 it

LL3 **

1.1.4 4*

i~L5 **4’

Hfl2 U

m4*i

NflS **5*

0.239 0.018—0.075 0.018

0.6670.853

—0.047

—0.940—0.562

0.0782.161

2.4880.585

—0.4950.082

1.0710.870

—0,423—0.771-0.299

1.1510,9360.330

—0.213‘0.482-0,611

0.0090.0270.036

0.0630.2090.0040.621

0.4040. 1270.4230.000

0.0420,3840.1190.1480. (‘03

0.0640. 1280,0320.0130.0690.065

0.4* 0.2970,2* —2.495

4,2 *

0.4*0.1*

0.6 *

0.3* 0.2910.8’ —1.1360.l~ 0.037

1.2 *

1.8* —1.4913.9* —0.259

•0.l* 0.58517.0* —0,364

22.8 *11.8’ —0.5802.9* 0.2324.8* 0.0040.0* —0.826

19.5 *1.3* —0,8947.9* 0.3632.2* 0.2803.7* —0.8190,1* -1.259

15,2 *

1.9’ -0.2903.5’ —0.32?0.8* 0.0340,3* 0.0451.7* 0.3821.7* —0.539

9.8 *

—0.754 0.1790.238 0.179

0.001 0.0’0.064 2,7*

5,7 *

5.8’1,6’

7.7 *0.002 0.1*0.048 2.0’0,023 0.1*

2.1 *0,158 6.3’0,044 1.1’0.246 6.1*0.018 0.7*

14.2 *0.022 0.9*0.020 0.6*0.000 0.0*0.025 1.0*

2.5 *0.030 1.2*0.067 1.9*0.052 1.3*0.167 5.7*0.050 2.1*

12.2 *

0.004 0.2*0.016 0.6*0.000 0.0*0.001 0.0*0.043 1,4*0.020 0.7*

2.9 *

—1.18? 0.0150.459 0.002

—0.466 0.0690.147 0.068

1.6951.627

-0.096

-0.3390.151

-0,075-0.054

0.650-0.3980.1010.114

1.124—0.1560.053

-0.1380.415

2.0290.521

-0,508-0.481-0.115

0.601

0.0600.0990.162

0.0080.0150.0040.000

0.0290.0590.0 170.000

0.0470.0100.0020.0050.005

0.1980.0400.07?0.0650.0040.063

0.7’0.1*

3,4 *

2,4*0.8*

3.2 *2.7*4.4*0.4*

7,6 *

0.4*0.4*0.1*0.0*

0.9 *

1.2*2.0*0.3*0.0*

3,5 *

2.1’0.3*0,1*0.2*0,2*

2.9 *

8.8*1.6’2.8*2.4*0.1*2.5*

18.2 *

TABLA IX (Continuación) ElUDE DES INDIVIDIJS

Ire CU.OWE ¿ CtORSONNEE2a CCLG#E C56INUS C~ W4LITE DE LA RE?~SENTATI~ilSi W.0N~ ~NTR1?é7I~RELMIW ~ LUERT>E EXPt>!ZLE P~ LAXE

AlES PRINCIPAUI

AlE 1 ME 2 AlE 3

INDIVWLS PRIS EN COt1~1E 0~¿S L’M~LYSE

.1 u —0.203 0,019 0.1’ 0.899 0.018 0.1’ <.169 0.013 0.15

.2 *4 -0.429 0.058 0.45 -0,477 0.064 0.64 —0.575 0.039 0.4’

.3 it 0.585 0.077 0.7* —0.058 0.001 0.0’ -0.366 0,030 0,4*.4 ti 1.401 0.386 4.0* 0.105. 0.002 0.0* -.0.313 0.019 0.3*.5 4< 1.354 0.442 3.6< —0.147 0.005 0.1’ —0.4>0 0.04! 0.5<.6 ti 0.633 0,130 0.8* -0.029 0.000 0.0* -0.560 0.102. 1.0*.7 u’ 1.016 0.105 2.1* 0,109 0.001 0.0’ —0.604 0.049 1,4*.8 st 0.658 0.130 0.8’ 0.199 0.013 0.14 -0.295 0,026 0.2’.9 ‘5 —0.214 0.020 0.>’ 0,076 0.002 0.0’ 0.077 0,003 0.0*

.80 ti 0,420 0.034 0.4’ 0,045 0.000 0.0* -0.406 0.052 0.5’

.1! II 0.395 0.044 0.3’ 0.201 0.011 0.1’ 0.166 0.009 0.1*

.12 •i 0.176 0.005 0.1’ 0.653 0.064 1.2’ -0.05.0 0.000 0.04

.13 ti —0.449 0.077 0.4’ 0.025 0.003 0.0’ 0.212 0.018 0.1’

.14 sí —0,040 0.001 0.0* -0,135 0.007 0.1* 0.066 0.002 0.Oi

.15 SU —0.336 0.015 0.2’ —0.582 0.045 1.0’ —0.153 0.003 0.14

.16 4< -0.299 0.036 0.2* —0.702 0.21! 1.4’ -0.294 0.035 0.34

.17 ** —0.203 0.016 0,1* —0.014 0,000 0.0* —0.273 0.029 0.2*

.18 4’ 0.047 0,001 0.0’ 0,123 0.0!! 0.1* -0,367 0.043 0.4k

.19 í. —0.262 0.032 0.1’ —0,297 0.039 0.2’ —0.2>7 0.022 0.14

.20 it —0.558 0.130 0.6’ 0.007 0.000 0.04 —0.083 0.003 0.0*

.2> 4< —0.637 0.116 0.6’ —0,752 0.162 1.6* —0.205 0.012 0.1’

.22 si —0,411 0.039 0.3* -0.758 0.151 1.6* -«330 0.025. 0.3’

.23 u —0.551 0.532 0.6’ —0.223 0.022 0.1* -0.073 0.002 0.0*

.24 ci —0.423 0.095 0.44 <.035 0.031 0.0* 0.001 0,000 0.0*

.25 ta —0.122 0.007 0.0* 0,401 0.079 0.5’ —0.1!> 0.006 0.0*

.26 *4 —0.4>3 0.054 O.4e 0.327 0.034 0.3’ 0,379 0.045 0.4’

.27 u —0.012 0.000 0.0* 0.181 0.006 0.1’ 0.173 0.005 0.1*.29 ti -0.049 0.0* 0.0’ 0.208 0.008 0.14 1.007 0.160 3,1*.29 4* 2.325 0.103 5.6* 0,64> 0,024 1.2* —2.016 0,239 12.6’.30 it -0.017 0.000 0.0* 0.842 0.003 0.84 0.852 0.813 2.2’.31 it 0.302 0,009 0.2~ 0,972 0.090 2.7’ —0.810 0.062 2.04.32 *1 0.365 0.030 0.3’ 0.770 0.134 [.75 -0.109 0.003 0.0*.35 *1 —0.560 0.01> 0.6’ —0471 0.001 0.1* 0.306 0.02> 0,3’.34 ti -0.703 0.048 8.05 0.053 0.000 0.Oi -0.055. 0.000 0.04.35 it —0.537 0.062 0.6* —0.400 0.014 0.5’ 0.059 0.001 0.0’.36 ‘e -0.085 0.003 0.0* -0.038 0.008 0.Qe —0.494 0.088 0.8*.37 u —0.352 0.075 0.3’ -0.149 0.074 0.3’ -0.067 0.003 0.0’.38 4’ 1.228 0.257 3.!’ —0.413 0.029 0.5’ 0.750 0.096 8.7’.39 *1 0.636 0.116 0.S~ 0.087 0.002 0.0’ —0.591 0.101 1.1*.40 si 1.136 0.204 2.7* —0,668 0.070 1.3’ -0.141 0.003 0.1’.41 tí 8.240 0.354 3.24 —0.350 0.027 0.3’ 0.027 0.000 0,04.42 4’ 0.347 0.021 0.2* —0.20> 0.009 0.11 0.231 0.0>3 0.2*.43 4’ —0.356 0.028 0.3* —0.298 0.015 0.3’ —0.848 0.116 2.24.44 ‘* —0.234 0.014 0.1* -1.039 0.290 3.!’ —0.343 0.031 0.4’.45 it —0.353 0.007 0.3* —0,726 0.028 [.5’ —0.24! 0.003 0.24.46 “—0.33? 0.062 0.2’ -0.346 0.065 0.3’ -0.244 0.032 0.2*.47 4* —0.043 0.008 0.0* —0.569 0.812 0.9’ —0.356 0.039 0.34.46 ¡9 —0.405 0.05.2 0.3’ —0.431 0.066 0.5’ —0.393 0.055 0.5’.49 tU —0.061 0.031 0.0’ —0.204 0.014 0.8’ 0.065 0.001 0.0’.50 í’ -0.304 0.005 0.2’ -0,741 0.032 2.6’ —0.048 0.000 0.0*<Sí 4* —0.104 0.004 0.04 0.273 0.029 0.2’ 0.208 0.016 0.8*.52 ti —0.183 0.020 0,1* —0.119 0.008 0.0* —0.358 0.075 0.4’.55 4’ 0.148 0.007 0.0’ —0.365 0.04> 0.4’ —0.5>2 0.079 0.8’.54 u 0.210 0.086 0.1’ —0.285 0.029 0.2’ -0.577 0.118 1.0*.55 si —0.044 0.00> 0.0’ 0.233 0.011 0.1’ —0.321 0.065 0.3’.56 4’ <.059 0.001 0.0’ -0.434 0.070 0.5’ —0.421 0.066 0.5*.57 it —0.292 0.030 0.2’ —0.183 0.004 0.0* 0.054 0.001 0.0*.58 4’.435 0.066 0.4’ <.195 0.085 0.1’ 0.022 0.000 0.0*.59 ti 0.557 0.046 0.6* —0.577 0,049 0.9’ —0.344 0.018 0.Ai

0.0’ —0.047 0.001 0.0*.60 *4—0.415 0.115 0.4’ 0,095 0.006


• 1.1.62.63.64.65.6667

.6186.9

• 70.71.72• 73• 74.75.76.77

.79

.88

.82

.813.84.85.86.87.89.89.90.9192

• 93.94.95

96$7

.96.99

.100• >0>

102.103.104.805106

.807

.106

.109

.110

.111

.812

.183

.184.1>5.116.117.110.189.120.121.122.123.824.125.126.127

828.829

ti 0.300“.148« 0.2764*, 0,260ti —0.027ti -0.348“-0.5295’ 0.840ti -0,804<4 0.804ti 0.2575* 0.556*i 0.32344 -0.1734’ 0.0265’ 0.108fi —0.118ti -0.596“-0,489*4 -0.025it -0.521‘4 -0.061“-0.530<e —0.594‘4 0,493*4 0.3364* 1.0205’ <.468e’ —0.647mm —0.5264* -0. 8495< —0.140it —0.447ti 0.613‘4 —0.289st 04314it 0.665it -0.0564* 0.179*5 [.595*5 2.0225* -0.346‘4 -0.46044-0.540it —0.509*i 0.0834* —>217ti —0,4094’ —0.215ci 0.082e’ —0.360

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.130 ti -0.254 0.056

0.2. 0.2450.04 0.¡040.2< 0.0380.14 0.3480.0’ —0.1400.2’ -0.6700.6’ —0.3601.5. 0.0560.0< -0.4771.3< -0.0700.1* -0.3790.6’ —0.2210.2< —0.2970.84 —0.5660.0* -0,2980.04 -0.8250.0* —0,7470.7í -0.5890,5’ —0.7170.0’ <.8890.6i -0.3070.0. -0.3460.6’ 0.0660.7< 0.1390.5’ 0.3370.2’ —0.0622.1’ -0.0650.5* -0.4190.9* —8.5500.6’ -0.6580.04 o.ísa0.04 0.0840.4* 0.1690.3’ 0.2360.1* —0.2880.0’ 0.2650.9* 0.3490.0< -0.0430.8* —0.1382.1* —1.16132.1’ —0.7240.24 -0.3400.5’ —0.4070.6’ -0,9220.Si —0.0680.0. -0,4450.1’ —1.0210.3’ 0.0990.1* 0,5090.0< 0.3040.34 0.1952,6* —0.3440.8* 0.5610.3’ 0,7920.4* 0.793Q.Oe 0.5680.0’ 0.8310.1* 0.3620.0* 0.483oi» o.38a0.0’ 0.9660.2* 0.2540.0’ 0.7240.8* 0,5250.1’ 0.3960.2’ 0.5820.1’ 0.1270.1* 0.3430.8’ 0.827

0.0860.0070.0000.0190.] 410.0640.0690.0000.0470.0010.0240. 0070.0850.0280.0250.0050.0990.0940.1910,0130.0290.02?0.0030.0020.0070.00>0.0080.0850.2200,1330.0090.0000.0180.0210.0370.0330.0390.0010.0060.1170.0290.0540.0560.2540.0080.0370,8870.0020.0590.0250,0300,0230.1050.0640.0690. ¿010.0020,0540.8760.8060.1500.0470.2410.0950.8290.0630.0110.0420.088

0,14 -0.052 0.007

0.2* -0.4180.0’ -o.ri0.0* ¿.0400,3’ 0.8801.5* -0.1761,3’ -0.1270.4’ —0.0250,0* -1.0690.64 0.3140,04 0.6620.4* 1.25204’ 1.17:30.2< 0.6950,9< 0.4640.2’ —0.0040.0* 0.086¡.6’ —0.3591,04 0.1811,54 0.0010,8* -0.8810.3< 0.4880.3’ 0.2260,04 0.8400.1* -o.oes0.3’ —0.7560.0’ -0.5930.0< 0.0490,54 -0.0866.6’ —0.0961.2’ -0.3870.8. -0.2620,0* -0.4890,8* 0.0160.2’ -0.5380,2’ 0.13k0.2’ —0.1960.3* —0.4560,0’ 0.2990.1’ 0.8913.6’ 0.619¡.5* —0.2650.3* 0.8270.5’ —0.1112.44 -0.0740.0’ 0.2110.6’ -0.0513.0’ 0.1380.0< —0.2730.7* —0.3710.3’ 0.6600,14 0.1440.3’ 0.1040.9’ 0.2851.8’ 0,1618.8’ —0.0>00.4< 0,0600.0’ -0.2800.4’ 0.2670.7’ —0.0800.4* -0,0332.7’ 0,0930.2’ -0.0228.5’ 0,0970.6’ -0.0380.4* -0.0340.4’ 0.0250.0* 0.3340.3’ 0.1040.0’ 0.3340.0’ -0.072

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0.5’0.3’3.3’2,4*~*.1*0,8*0.0’3.7’0.3*1.4*4.8<4.3*1.5’0.7*0.0<0.0’0.4<0.8’0.040.8*0.540.2’0.140.0’¡ .6’2.1’0.0’0.0’0,0*0.540.2’0.540.0’0.9’0.8*0.1’0.6’0,3*0.1*2.8*0.2’0,0*0.0’0.0*0.840.0*0.1’0.2*0.4’1.3’0,1’0.0’0.3’0.1’0.0’0.0*0.240.2*0.0’0.0*0.0*0.0*0,0’0.0*0.0’0.040.3’0.040.3*0,0*


.131 *4 —0.136 0,086

.832 it -0.122 0.005.

.2fl <1 —0.200 0.02>.134 si <.26] 0.054.135 *4 0.779 0.115.136 si -0,352 0.064.837 ti —0.215 0.012.138 it 0.007 0.000.139 si —0.440 0.089• 140 it —0.260 0.015.141 *4 —0.552 0.055..142 ti <.458 0,044.143 it 0.165 0.009.144 4’ —0.36> 0,072.845 ‘4 —0.500 0.150.146 ‘5 -0.127 0.0>0.147 si 0.233 0.022J48 *5 0,012 0.000.149 it 0.20? 0,0072350 t< -0.154 0,015.151 it —0.118 0.004.152 <4 0.066 0.004.153 <4 ¡.096. 0.363.154 *i 0.526 0,083.[55 “ 0,001 0.000.156 54 0.880 0.857.857 it —0.871 0.022.158 4* 0,140 0.006.859 4* -0.014 0.000• 160 4< —0.340 0.046.161 fi —0,024 0.000.162 ti —0.458 0.068.165 it 8.090 0.321.164 ti -0.543 0.124.165 “-0.488 0.073.166 si —0.049 0.001.167 1* 0.184 0,017-166 i< —0,365 0.077.169 *i.—0.340 0.047.370 ti —0.260 0.017.171 u —0.118 0.003.872 4* 0.554 0.164.873 ‘4 —0.328 0.034.174 ti —0.550 0.16!.875 i’ -0,350 0.093.476 t*-0.289 0.060.177 CI -0.005 0.000.178 <4 0,157 0.015.179 5* 0,157 0.015.188 *5-0.447 0.105.888 4* 0.583 0.158.182 *5 1.811 0.160.883 i* 0.826 0.008.884 *4 —0.078 0.003.185 i* —0.411 0.061.186 *5 0.912 0.203.187 4’ —0.258 0.048.168 it 0,961 0.25?.189 it —0.133 0.007.190 “-0.467 0.141.191 ‘4 0.032 0.000.192 4* -0.125 0.002.193 ‘i —0.353 0.017.894 ‘i -0.152 0.0072395 sí —0.434 0.830.196 U —0.321 0.058

0.0’ 0,065 0.0060,0’ 0,312 0.0360.2< 0.429 0.0900.8’ 0.548 0.095l.3t-0.117 0.003023’ 0.25! 0.0290.1’ -0.386 0.0390.0* -0.116 0.0090.4’ —0.410 0.0780.1< -0.597 0.0770.3’ 0.092 0.0040.4’ 0.159 0.0050.14 0.149 0.0070.13’ 0.218 0.0260.5’ 0.309 0,0560.05 0.447 0.1230.1* 0,503 0.1010.0’ 0.102 0.0060.1* 0.872 0.8200.04 0.243 0.0380,04 0.600 0.1120.0< 0.126 0.0092.5* —0.219 0.0040.6’ 0.141 0.0060.0’ 0.460 0.0731.6’ 0.002 0.0000.14 -0.049 0.0020.0’ 0.065 0.0020,0¡ 0.578 0.0610.2< 0.373 0.0550.0’ 0.176 0.0200.44 0.326 0.0372.4’ —0.246 0.0160.6* 0.194 0.0160.4i 0,319 0.0420.0’ 0.438 0.0620.8* 0.541 0,1480.3* 0.442 0.1>30.2* 0.492 0.1410.>i -0.4303 0.0020.0’ —0.395 0.0290.6* 0.279 0.0410.2’ —0.082 0.0020.64 -0.065 0.0020.3* 0.381 0.0760.2’ <.270 0,0520.0’ 0,224 0.0>30.1* 0.460 0.1290.íi 0.460 0.1290,4t 0.240 0.03*30.7i 0,285 0.0376.8* —0.080 0,0000.0’ 0.701 0.2580.0* 0.406 0.0870.5’ —0.092 0,0031.7* -0.223 0.0120.8* 0.470 0.1691.9< <.271 0.0200.0’ 0.440 0.0820.4’ 0.386 0.0970,0* 0.073 0.0080.0’ -0.270 0.0>!0.2* 0.639 0.1090.04 0.014 0.0000.4* 0.313 0.0680.2* —0.141 0.065

0.0< —0.889 0.0300.3< 0,014 0.0000.Si —0.070 0.0020,3’ 0.101 0.0060.0’ 0.565 0,0610.2* 0.189 0.0070.3* —0.056 0.0010.0< 0,029 0.0010.5’ —0.098 0.0042.0< -0,0113 0.0000.0* 0.235 0.0240.8* -0.359 0.0280.1* 0,366 0.0450.1< 0.124 0.0090.35 0.225 0.0090.6’ -0.165 0.0170.7< 0,281 0.0320.0’ -0.209 0.05~2.2’ —0.841 0.0030.2* -0.000 0.0008.0’ 0.503 0.0790.0< -0.194 0.02!0.0* 0.545 0.0900.1’ <.190 0.0110.6’ —0.225 0.0870.0’ -0.233 0,0110.0’ —0.168 0.0200.0’ -0.432 0.0570.9* 0.869 0,0050.4< 0.007 0.0030.1’ —0.209 0.0290.3* -0.00> 0.0000.2* 0.504 0.0690.14 0.346 0.0500.3* 0.193 0,0150.5* 0.65.2 0.1390.8* -0.019 0.0000.64 0.094 0.0050.7’ 0.225 0.0300.05 0.258 0.0170.4’ 0.415 0.0320.2’ —*3.165 0.0150.0* 0,119 0.0050.0’ 0.276 0.0400.3* 0.074 0.0040.2* -0.183 0.0240.1* 0.677 0.1160.64 —0.207 0.0260.6’ —0,207 0.0260.2< 0.036 0,0080.2’ —0.890 0.0870.0’ 8.606 0.126l.4i 0.052 0.0010.5< 0.35.2 0.0660.0’ —0,249 0.0220.8’ -0.259 0.0160.6’ 0.038 0.0010.2’ 0.006 0.0000.5* 0.275 0.0320.4i 0.106 0.0070.0’ 0.813 0.1090.2* 0.295 0.0>32.0’ 0.189 0.0050.0* 0.075 0.0020.3’ 0.048 0.0010.3’ -0.206 0.024

0.8*0.0’0,0<0.0*1.040.0*0.0*0.0*0.040.Os0.2*0.4*0.4’0.0*0.0’0.>’0.2’0.l’0. It0.0*0.8’0,1*0, ‘740.>’0.2’0.240.140.6’0.1’<3.0<0.8*0.0<0,8’0,4<0.!’1,3’0.0’0.0<0.2’0.2’0.5’0,8*0.0’0,2’0.0’0,8*1.4’0,140.1*0,0*0,1*8.0*0.0’0.4*0.240.2’0,0’0.0<0,2*0.0*2.4*0.3<0.1’0.0’0.040.Is

TABLA X.— COMPARACIONDE RESULTADOSDEL MUESTREOGENERAL DE MATERIALVEGETAL CONGELADOA ~2OoC. MUESTRASPROCESADASEN AGOSTODE 1989 Y EN ABRIL Y NOVIEMBRE DE 1990

Agosto 1989 Abril 1990 Noviembre 1990

Valores deElisa a 1 Ii.

>2

¡ 0,350

0,315

0,375

>2

0,615

0,371

0,721

0,625

0,425

0,348

0,820

0,286

0,230

0,315

0,231

1,122

>2

>2

>2

>2

1,255

0,990

>2

>2

>2

0.590

>2

>2

>2

>2

0,723

Valores decontrol devid ( -

0,017

0,017

0,017

0,017

0.017

0,017

0,017

0.017

0.013

0,013

0,013

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,006

0,006

0,006

0,006

0,006

0,006

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,013

0,013

0,013

ValoresElisa a

del

0,87 1

0,615

0,618

0,425

1,200

0,402

0,550

0,450

0,415

0,555

0,612

0,515

0,714

0,325

0,612

0,650

0,314

0,216

0,425

0,450

0,610

0,821

0,314

0,060

0,809

0,312

0,803

0,313

0,905

1,215

0,383

1,512

0,615

Valorescontrolvid ( -

dede

0,023

0,023

0,023

0,023

0,023

0,023

0,023

0,023

0,013

0,013

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,011

0,021

0,021

0,021

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0,016

0,024

0,024

0,024

0,024

Valores deElisa a 1 h

0,180

0,409

0,200

0,225

1,200

0,210

0,243

0,375

0,526

0,165

0,155

0,139

0,128

0,134

0,821

0,931

1,151

0,740

0,610

0,612

0,374

¡ 1,615

0,114

0,560

0,281

0,132

1,099

1,099

1,152

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TABLA X (Continuación)

Agosto 1989 Abril 1990 Noviembre 1990

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101-1 0,750 0,020 0,850 0,021 0,655 0,017

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177-1 0,315 0,011 0,232 0,012 0,139 0,014

179-3 0,395 0,023 0,315 0,018 0,560 0,017

182-1 0,590 0,023 0,740 0,018 0,132 0,017

2 1,286 0,023 1,230 0,018 0,500 0,017

183-1 0,402 0,023 0.600 0,018 0,151 0,017

3 1,509 0,023 0,807 0,018 0,136 0,017

209 1,212 0,023 0,715 0,011 0,86 0,017

TABLA XI.— SEGUIMIENTO PERIODICO DE LAS CEPAS CONTROLTa 1, To II YAMARILLA COMOCONTROL+ DE LAS 5’, 6’, 8’, 11’, 15, 22,27, 29 Y DE LAS NP 1 y 2 NEGATIVAS

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TABLA XII.— OBSERVACIONDE CEPA A CEPA EN LA FINCA EXPERIMENTALLA HIGUERUELA POR TRES OBSERVADORESDISTINTOS Y

REPETIDOS TRES VECES CON INTERCAMBIO DE BLOQUESVEZA VEZ (AGOSTO 1990)

Leyenda

TABLA XXXII

OBSERVACIONDE CEPA A CEPA EN LA FINCA EXPERIMENTAL LA HIGUERUELA POR TRESOBSERVADORESDISTINTOS Y REPETIDOS TRES VECES CON INTERCAMBIO DE BLOQUESVEZA VEZ (AGOSTO 1990)

Leyenda

— No sintomas (-1 — Planta jóven (.11)

— Sintomas de virosis (-,-)

— Falta de planta (14)

— Planta repuesto~ (R)

— Planta sin vigor (E)

— Planta muy vigorosa CV)

— Planta Amarilla CA) virosis

—Planta dudosa (?)

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TABLA XII (Continuación)

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TABLA XII (ContinuaiCóO)

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TABLA XIII.— MUESTREOEN CASTILLA—LA MANCHA. MUESTRASTOMADASAL AZARY PROCESADASPOR DOS EQUIPOS DIFERENTES

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TABLA XIV.— MUESTREODE CEPAS EN CASTILLA—LA MANCHA: IMPAR AL AZAR,PAR, EN CEPA CON SíNTOMAS DE VIRUS

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2 0,01 0,026 37 0,04 0,026

3 0,014 0,026 35 0,02 0,026

4 0,01 0,026 39 0,021 0,026

5 0,022 0,026 40 2,133 0,026

6 0,011 0,026 41 0,005 0,026

7 0,021 0,026 42 0,012 0,026

8 0,037 0,026 43 0,019 0,026

9 0,013 0,026 44 0,043 0,026

10 0,009 0,026 45 0,035 0,026

11 0,02 0,026 46 0,025 0,026

-12 0,035 0,026 47 0,024 0,026

13 0,035 0,026 48 0,014 0,026

14 0,03 0,026 49 0,018 0,026

15 0,042 0,026 50 0,019 0,026

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17 0,008 0,026 52 0,019 0,026

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19 0,025 0,026 54 0,024 0,026

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21 0,037 0,026 56 í,8~6 0,026

22 0,04 0,026 57 1,659 0,026

23 0,017 0,026 58 0,033 0,026

24 0,027 0,026 59 0,037 0,026

25 0,013 0,026 60 0,036 0,026

26 0,013 0,026 61 0,075 0,026

27 0,026 0,026 62 0,0 ~7 0,026

28 0,026 0,026 63 0,01 0,026

29 0,038 0,026 64 0,977 0,026

30 1,289 0,026 65 . 0,02 0,026

31 0,02 0,026 66 0,006 0,026

32 0,015 0,026 67 0,029 0,026

33 0,048 0,026 - 68 0,03 0,026

34 0,008 0,026 69 1,144 0,026

35 0,026 0,026 70 1,134 0,026

TABLA XIV (Continuación)

71

72

73

74

7576

7778

79So

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TABLA IXV (Continuación)

141 0,01 0,OiS 176 0,009 0,025

142 0>009 0,013 177 0,01 0,025

143 0,01 0,OíS 178 0,024 0,025

144 0,005 0,0:8 179 0,004 0,025

145 0,009 0,0:8 :80 0,005 0,025

146 0,016 o,oí8 iSí 0,009 0,023

:47 o,oo: 0,018 182 0,005 0,025

148 0,000 0,018 I8J 0,004 0,025

149 0,000 0,0:8 184 0,006 0,025

150 0,001 0,018 185 0,007 0,025

151 0,000 o,oíS :86 o,0o6 0,025

152 0,002 0,oí8 187 0,015 0,025

153 1,519 0,018 í88 0,002 0,025

154 0,181 o,o:8 í8q 0,01 0,025

155 0,005 0,0:8 190 0,018 0,025

156 0,006 0,018 191 0,013 0,025

157 0,006 0,018 192 0,011 0,025

i58 0,001 0,018 193 0,014 0,025

159 0,01 0,015 194 C,oiS 0,025

:60 0,005 0,018 195 0,013 0,025

161 0,003 0,0i8 196 0,009 0,023

162 0,003 0,018 197 0,023 0,025

163 0,002 0,018 198 0,008 0,025

164 0,006 0,018 199 0,011 0,025

í65 0,002 0,018 200 0,009 0,025

:66 0,005 0,0:8 201 0,009 0,025

167 0,017 0,018 202 0,0:6 0,025

:68 0,009 0,018 203 0,011 0,025

169 0,000 0,018 - 204 0,003 0,025

170 0,028 0,0:8 205 0,011 0,025

171 0,009 0,018 206 0,011 0,025

172 0,02 0,013 207 0,014 0,025

173 0,003 0,0:8 208 0,016 0,025

174 0,003 0,0i8 209 =2 0,025

175 0,022 0,018 210 0,017 0,025

TABLA IXV (Continuación)

211 0,012 0,015 246 0,004 0,015

212 0,0:7 0,015 247 0,036 0,015

213 0,017 0,015 248 >2 0.015

214 >2 0,015 249 0,014 0,015

215 O.OV 0,015 250 0.02 0~015

216 =2 0,015 251 0,022 0,015

-217 0,016 0,015 252 0,000 0,015

218 1,646 0,015 253 0,0:8 0,015

219 0,01 0,015 254 0,004 0,015

220 >2 0,015 255 0,038 0,015

221 0,006 0,015 256 0,011 0,015

222 0,01 0,015 257 0,026 0,015

223 0,027 0,015 255 0,004 0,015

224 0,024 0,015 259 0,021 0,015

225 0,025 0,015 260 0,017 0,015

226 =2 0,015 261 0,013 0,015

227 1,157 0,015 262 0,025 0,015

228 =2 0,015 263 0,008 0,015

229 0,019 0,015 264 0,02 0,015

230 0,013 0,015 265 0,003 0,015

23 0,011 0,015 266 0,002 0,015

232 0,007 0,015 267 0,017 0,015

233 0,022 0,015 268 0,00: 0,015

234 >2 0,015 269 0,009 0,015

235 1,156 0,015 270 0,032 0,015

236 >2 0,015 271 0,05 0,015

=37 0,004 0,015 272 0,025 0,015

=38 0,003 0,015 273 0,008 0,015

239 0,01 0,015 274 0,011 0,015

240 0,012 0,015 275 0,OiS 0,013

241 0,019 0,015 276 0,01 0,015

242 0,015 0,015 277 0,021 0,015

243 =2 0,015 278 0,025 0,015

244 =2 0,015 279 0,iS 0,015

245 0,005 0,015 280 e 0,072 0,015

TABLA IXV (ContThuación)

281 0,004 0,015

282 0,002 0,015

283 0,0:2 0,0:5

284 0,002 0,015

285 0,003 0,015

286 1,843 0,0L5

287 0,031 0,015

258 o,oíS o,oís

289 1,633 0,015

290 0,001 0,015

291 0,027 0,015

292 0,004 0,015

293 0,027 0,015

294 0,005 0,015

295 0,028 0,015

296 0,029 0,015

297 0,031 0,015

298 0,006 0,015

299 0,004 0,015

300 0,002 0,015

TABLA XV.— MUESTREOEN CASTILLA—LA MANCHA(DICIEMBRE 1990) EN CEPASCON MADERAMUY DEFORMADA

1 0,014 0,024 0,011 0,021 0,065 0,032

0,066

0,016

0,026

0,022

0,007

0,035

0,043

0,006

0,038

0,048

0,054

0,023

0,031

0,051

0,042

0,053

0,049

0, 051

0,051

0,054

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,005

0,005

0,002

0,031

0,018

0,022

0,009

0,033

0,004

0,01

0,002

0,003

0,001

0,006

0,008

0,033

0,023

0,009

0,001

0,022

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,063

0,066

0,08

0,051

0,065

0.047

0,056

0,061

0,064

0,063

0,053

0,038

0,049

0,043

0,068

0,033

0,050

0,065

0,053

0,058

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0.032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

TABLA XV (Continuación)

0,051 0,024

0,049

0,058

0,034

0,042

0,073

0,975

0,506

0,734

0,048

0,042

0,044

0,042

o * 051

0,046

0,056

1,179

1,185

0,574

o * 024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,024

0,027 0,021 0,053 0,032

0,005

0,013

0,038

0,037

0,002

1,389

0,243

2,963

0,002

0,034

0,043

0,033

0,003

0,001

0,031

2,783

0,022

0,143

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0, 021

0,021

0,021

0,021

0,058

0,068

0,000

0,013

0,04

1,46

3,07

2,865

0,007

0,017

0,006

0,032

0,006

0,009

0,051

2,551

0,003

0,737

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

0,032

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40


0,054

0,044

0,039

0,053

0,003

0,023

0,022

0,016

0,013

0,016

0,006

0.789

0,039

0,024

2,097

0,049

0,001

0,024

0,024

0,024

0,024

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,043

0,018

0,029

0,027

0,004

0,032

0,039

0,049

0,006

0,024

0,034

1,547

0,016

0,07

0,812

0,02

0,057

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,0

0,035

0,017

0,008

0,043

0,013

0,036

0,046

0,04

0,036

0,026

0,052

0,04

0,043

1,21

0,047

0,04

0,032

0,032

0,032

0,032

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

41 2,191 0,024 0,529 0,021 3,114 0,032

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59 0,008 0,018 0,027 0,021 0,044 0,017


60

-61

62

¡ 63

64

65

66

67

68

¡ 69

70

71

72

73

74

75

76

¡ 77

78

0,001

0,016

0,008

0,016

0,515

0,025

0,001

o * 004

0,018

0,018

0,015

0,011

0,01

0,021

0,011

0,011

0,014

0,016

1,577

o * 018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,064

0,051

o * 059

0,039

0,684

0,064

0,051

0,013

0,066

0,044

o ,049

0,029

0,047

0,051

0,047

0,033

0,062

0,047

1,533

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,036

0,044

0,036

0,04

0,494

0.033

0,043

0,045

0,039

0.036

0,027

0,046

0,044

0,032

0,036

0,045

0,036

0,033

1,143

0,017

0,017

0,017

0,017

0.017

0.017

0.017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0, 03,7

0,017

0,017

CJe 017


-79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

• 93

94

95

96

97

1,007

1,648

1.764

0,598

0,032

0,016

0,027

0,029

0,018

0,026

0,031

0,016

0,004

0,005

0,022

0,033

o * 003

0,023

0,006

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,018

0,015

0,015

0,015

0,015

0,015

0,015

0,015

1,412

1,75

1,39

1,438

0,024

0,035

0,033

0,007

0,046

0,035

0,055

0,043

0,008

0,006

0,001

0,031

0,033

0,01

0,009

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,021

0,019

0,019

0,019

0,0)9

0,019

0,019

0,019

2,06?

2,152

2,223

0,802

0,043

0,036

0,033

o * 032

0,033

0,041

0,042

0,027

0,005

0,043

0,046

0,024

0,021

0,049

0,056

0, 017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,017

0,023

0,023

0, u23

0,017

0,017

0,023

0,023


98 0,026 0,015

99 0,001 0,015 0,019 0,019 0,006 0,023

100 0,014 0,015 0,018 0,019 0,049 0,023

101 0,000 0,015 0,019 0,019 0,045 0,023

102 1,891 0,015 2,455 0,019 1,397 0,023

103 0,112 0,015 0,016 0,019 0,019 0,023

104 0,015 0,015 0,028 0,019 0,05 0,023

105 0,022 0,015 0,003 0,019 0,046 0,023

¡ 106 0,012 0,015 0,03 0,019 0,043 0,023

107 0,018 0,015 0,025 0,019 0,016 0,023

108 0,000 0,015 0,031 0,019 0,045 0,023

109 0,015 0,015 0,015 0,019 0,042 0,023

110 0,035 0,015 0,022 0,019 0,033 0,023

111 0,013 0,015 0,028 0,019 0,034 0,023

112 0,005 0,015 0,032 0,019 0,039 0,023

113 0,002 0,015 0,004 0,019 0,041 0,023

114 0,0J8 0,015 0,000 0,019 0,035 0,023

115 0,002 0,015 0,029 0,019 0,033 0,023

116 0,001 0,015 0,001 0.019 0,038 0.023

TABLA XI (Continuación)

¡ 117 0,001 0,015

118 0,003 0,015

119 0,006 0,015

120 0,001 0,015

121 0,005 0,015

122 0,002 0,015

0,013 0,019

0,004 0,019

0,023 0,019

0.004 0,019

0,011 0,019

0,011 0,019

0,049 0,023

0,034 0,023

0,035 0,023

0,032 0,023

0,047 0,023

0,043 0,023

123 0,009 0,015 0,023 0,019 0,022 0,023

T17642.pdf - E-Prints Complutense

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